Sympsium エ n セ the chemistry エ f natural ユ prducts 5 今回, 本酵素に化学合成した 一カルバモイル安息香酸の CA チオエステルを開始基質として作用させた場合, 分子し マ n = ル CA ( またはメチルマロニル CA ) を順次縮合の後,6

Symposium on the chemistry of natural products Symposlum on _theohemlstry of natural _produots

15

植 物 ポリケ_タイ ド合 成酵 素の_{潜 在 的触 媒能}力 を活用 し た

　　　

非天 然型

新

規ア ル カ ロイ ド骨格の

創

出 　 　　 　 　 （静岡 県 大 薬 1， 東 大院 薬 2 ） 山 下　誠 1， 鰐 渕 清 史 1 ， 史　 社 坡 2 ， 森 田洋 行 Z ， 野 口博司 1 ，

0

阿部 郁 朗 2

　

天然物の 基本 骨格を構 築す る二次 代 謝 酵 素の 中に は ， 活 性 部位の 微 妙な構造の 違 い で反 応様式 が大 きく変 化す るもの が あ り， これが天 然 物の 分子多様性 を 生 み 出 す 大 きな要 因の 一つ と なっ て い る．一方， 一 般に酵 素の 基質 特 異性 は厳 密で 自 由度が 低い もの と され てい るが， 植 物ポ リフ ェ ノ ー_{ル の 基本 骨格を構 築す る皿型 ポ リケ タ} イ ド合 成 酵素 （

PKS

） が 示 す 広範な 基

質

特 異 性 と触 媒 能 力は特筆に値す る 12）_． これ ら は， 反応の 立体化学が厳 密に制 御 された 「精巧な酵 素シ ステ ム 」 である とは 言い 難 く， む しろ単純 なア シ ル 基 転 移の 繰 り返 し に よ る 「炭 素 鎖伸 長マ シ ン」 と捉え る

こ とが で き る．

Cys

−

His

−

Asn

か らなる活性 中心触 媒残 基は ， 全て の 皿型

PKS

に おい

て 例外 なく保 存 され て お り， 同 一の ケ ミス ト リーで， マ ロ ニ ル

CoA

の 脱 炭 酸 を伴っ た

Claisen

縮 合の _{繰 り返} し に よる炭 素 鎖伸 長 反 応が進 行 するもの _と考え られ る．従っ て ， こ _うした酵 素が 示 す 寛容な 基 質特異性 と潜 在 的 触媒能 力 を活 用 し て，　 一 連の 人 工 基 質 を 作 用 させ るこ と に よ り，非 天然型新 規化合 物の 効 率的な 生 産 が可 能 に な る． また，

C

，　

H

，

0

原子 で構

成

され る

単

純 な 「カル ボニ ル の 化

学

」 を触 媒 する

m

型

PKS

に， さらに

N

など ヘ テ ロ _{原 子 を}導入 した人 工 基質を作用 させ れ ば ，

N

原 子の 塩 基性 を利用 した 新 た な

C

−

N

あるい は

GC

結合の 形 成 も 可 能にな る． 反 応 性 に富 む β一ポ リケ トメチ レ ン _{中間 体}か らシ _{ッ フ} 塩 基の _{形 成}を

介

した分子 内環 化 反 応が進 行 して， 複 雑なアル カ ロ イ ドの 骨格を 一挙 に 効率 的に構

築

す る こ とができれ ば_，

m

型

PKS

酵 素触媒機 能の 可能性を さら に大 き く拡張 す るこ と に なる と考え，本 研究に 着手 し た． （

1

）含 窒 素 人工

基

質 を用いた非天然 型 新規ア ル カロ _{イ ド骨 格}の

創

出

　

当研 究室で ク ロ ーニ ン グに成 功 し た トウゲシ バ

Huperzia

　serrata 由来

PKS

　

I

は _， 比 較的 大 き な基 質 結合 部位を有 する新 規

III

型

PKS

であ り， クマ ロ イ ル

CoA

を開始 基 質 と し て

3

分子の マ ロ ニ ル

CoA

を順 次縮 合の _後， カル コ ン を 生 成 す る （

Fig

．　

IA

） 3・4）_．

（

A

） …

曹

ぴ

3

漕

♂

KS1

冗

葱

゜ 冊

濾

1

  　 O　 　 　 mabnyi −C納_{O　 O} O OH

　 c・uma 「°yic°A _{na・ing・nln齟 IC。n・}

　 　 　 　　 　 　　 　 　 　　 　 　 　 　H

（

B

）

〔

_〉

‡

1

：

い

2 漕

鳶

H 　 　 　 O 　　　　　　R3HorCH3 　 X＝C齟2伽 ゾbenzo屮く）oA 　 X＝N’3rearbarnoyipgeolinyl−CoA 　 　 　 o （

c

）

（

磯

急

・

2

漕

 

H 　 　 　 O

　 3rcarb臼rnoyl曹2．【aPhthoyiCeA

o

：



NH ’　n 　 _SEni X 　 oRo 　O 　 　 　 o

ζ 二

N同_2s ，、， 　 　 　 O　 　O　 　O 　 ON 　 　 　 　O n 　　NX 　　虹 I 　R 　 R　 　OH R＝H　or　CH3 　 　 　 o

ζ Σ

・ ° 　 　 　 弧l 　 　 　 　 OH

Fig

．

1



H

．・_serrata ・

PKS

・

1

が_{示 し}た潜 在的触媒能力 と非_天然 型新 規_{アル カ} ロ イ ド骨格の _創出

Symposium on the chemistry of natural products

NII-Electronic Library Service Sym os エum セ 　　chem エstry of natura ユroducts

15

　今

回， 本酵 素に化 学合 成した

2

一カル バ モ イル 安 息

香

酸の

CoA

チ オエ ス テル を開始

基

質

と し て

_作

用 させ た_{場 合，}

2

_分子し、マ n ＝_ル

CoA

（_{また は メ チル} マ ロ ニ ル

CoA

_）

を順 次縮 合の _後，

6

−

5

−

6

_{縮 合 環構 造}を有 する

3

環 性 非天然型新 規アル カ ロ イ ドを収 率

80

％で 単一生成物 として 与 え るこ と を 見 出 した （

Fig

．

1B

，

2A

）．一方， これ と は 対 照

的に， 後 述 する キ ダ チアロ az　

Aloe

　arborescens 由来オ クタ ケ タイ ド合成 酵 素 （

OKS

） では ，

2

一カル バ モ イ ル _{安 息香 酸}

CoA

は ほ とん ど開始 基 質 と して _受け 入 れ られ ず，

8

分子 の マ ロ ニ ル

CoA

の

縮合

によ りオ ク タ ケ タ イ ド

SEK4

！

SEK4b

が 主 生

成

物とし て

， また，

2

一カル バ モ イル 安 息 香 酸

CoA

に

3

分子 の マ ロ ニ ル

CoA

が縮 合 し た ラク トン が 副 生成 物 と して 得 られ るの みであっ た （

Fig

．

2B

）， 　 次に，

2

一カル バ モ イル 安 息 香 酸

CoA

の 芳香 環を， ピ リジン 環やナ フ タ レン 環で 置

換

し た

修飾基質

を化

学合成

し， トウゲシ バ 由

来 PKS1

に

作

用 させ た場

合

， 同様に し て，

2

分子 の マ ロニ ル

CoA

を順 次 縮 合の _{後，閉環反応}が進 行 し て ，

3

環 性お よ び

4

環 性 の 非天然 型 新 規アル カ ロ _{イ ドを}高_収 率_で単…生 成_{物 と して生}

成

_{す る こ と を見 出} した （

Fig

，　

IB

，　

IC

）．い ずれ の 場 合 も， トリケ タイ ド中間 体 へ 炭 素

鎖伸

長_の 後 ， シ ッ フ 塩 基の 形 成 を介 して， 酵 素 的 に

C

−

N

結 合 形 成 と閉環 反応 が 進 行 す る もの と考え ら れ る （

Fig

．

3

）．

（

A

）

　

H

．serrata 　

PKSI

　 　 　 　 o

　

　

　

磯

訟

・

2

避

窟

  　 　 　 　 0 戀 嘱 　 ON 　　　NH2 di　 　 　 　SEni 　 O　　O　　O 聖 4 膈 繭 騨 晒 山 o 　 oN 弧 〃 　 OH （

B

）

A

．arborescens 　

OKS

　 　 　 　 ロ

　

　

　

¢

島

・

3

廼

窟

　 　 　 　 0 　 　 　 0 　 　 　 o

　

　

　

　

　

 

c

_転

… 　 　 　 0　 　0　 　0　　0 　 　 　 SEK4b 、 NH2 ノ 　　 　 　 　　　 　o

　

o

　 lM

　 　 　 　EK4

　

　

　

，

1

！

＼証

畝

一

　

＿ 　 oN 　　　NH2 　 　 　 　 　h 　 　 　 みへ ．’、、 　 　 　 6卩n　　　　　　／の　　　　　　　if　　　　　　　．号　　　　　　　T　　　　　　騨　　　　　　　，弗rFtt十

Fig．2　 H ．　_serrrata 　PKS1_とA ．　arborescens 　

OKS

との酵素_反応生成物 （

HPLC

）の 比 較 　 　 　 O i 　t 　 　 ヤ 　 　 n 　 N、_貝 ＞ 　X_眠 〃O 　 　 　 o O 　 皿 証 ） o 　 　 　 O 酬 　 　 rH 、 ノ （ 　 ▼ oe 卿   　 　 　 Q　 O 　 　 O　 　 　 h ”髄噛「酬ゆ偽 「　　OH ／／”．＿

1

　 　 　 SEnz 　 　 　 enanima

Fig

．

3

予想 され る

H

．　_serrata 　

PKS1

酵 素_反応 _トリケ_{タイ ド中 間}体_{と 閉環反応機構}

86

N工 工一Eleotronlo _Llbrary

Symposium on the chemistry of natural products Symposlum on _theohemlstry of natural _produots

15

（

2

）結 晶構 造に基づ _{く非天 然型 新規}

C21

カル コ ン_および

Clg

ス チル ベ ン_骨格の

_創

_出 　上述し た キ _ダチ ア ロ エ _由来

OKS

は_，

8

_{分 子}の マ ロ ニ ル

CoA

の 繰 り_返 し_{縮 合}に よ り

Ct6

芳 香族オク タケ タ イ ド

SEK41SEK4b

の _骨

_格

を構

築

す る新規 皿型

PKS

である （

Fig

．

4A

）5）_{．既 に我々 は} ， 本 酵 素の

X

線 結 晶構造解 析に

2

．

6

　

A

の 分解 能で成功 し て お り， 同 じ く

8

分子 の マ ロ ニ ル

CoA

の 縮合を 触媒す る キ ダ チア ロ エ 由 来 ペ _{ン タ ケ タ} イ ド ク ロ モ ン合 成 酵素 （

PCS

）の

M207G

変 異 型 酵 素 と 、ほぼ同一の 大 き さ と形状か らなる 活 性 中心 キャ ビテ ィ を もつ こ とを明らか に した 6・D． ま た， 活性 中心

Cys174

を 起 点 とし て ポ リケ タ イ ド鎖が伸 張 し て い く際に壁 と な る

Asn222

残 基 に ラン ダム 変 異を導入 し た結果，

Gly

置 換 体で マ ロ ニ ル

CoA

縮合 数が

10

分 子 まで 拡大 して ，非 天然型

C

，。ベ ン ゾフェ ノン 誘 導 体

SEK15

を単 一_生 成物 と して与 える こ とを見 出し て い る （

Fig

．

4B

）9・”）_{． さ ら} に，　

OKS

　

N222G

変異型酵素につ い て も，　

X

線 結 晶構 造

解

析 に成功 し， 変異の 導入 に よ り実際に 活 性 中心キャ ビ テ ィ が拡 大 す るこ と も確 認 した ．

（

A

）

（

B

｝

Sx

　°“ASY 【

Y

（坩 　 　 　 o　　o 　 　 　 mebn 屮eoA

10x

螂

Y

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OKS

　 　 　 O　 　 　 　Sεn 署 　 　 　 0

0KS

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　 　 　 　 　SεK場5 　 　 偽 …

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　 　 　 　 O

熱

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町

〔

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。

　

・・ tu ・

Ct6

　 　 SEK　4　 　　 　　　 　　SεK　4b 瓢

l

l

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＿

丿

　 0　　　　　　　　　 9 　　　　　　　　　翩　　　　　　　　　稽

　

♀

H ° °w 鮒 ．

C

　

じ

H 　 　 　 　 CH3 HK）　　爆o

　

sεK15

　

C20

OKS

　

WT

　

Ye2N

し

＿

　 　 ‘籌．，馳　 　 脚　 　 　 　 η

OKS

　

N222G

V351 C143tT204

〔

r

ゾ

　 s．lvYe2 ．．”−ty： t6 _SubS町a竃e ε葡 an◎o 266F27SN21fi “

Fig．

4

　A ，arborescens ・

OKS

_野生型 及び

N222G

変異型酵素の 活 性部位 構造と 反応機 構_の比較

Symposium on the chemistry of natural products

NII-Electronic Library Service Symposlum on _theohemlstry of natural _produots

15

　今 回， 本 来

8

分子の マ ロ ニ ル

CoA

を縮 合 する

OKS

に クマ ロ イル

CoA

を開始 基 質

として 作 用 させ た 場合， クマ ロ イル

CoA

に

5

分 子 あ るい は

6

分子の マ ロ ニ ル

CoA

が縮 合， ポ リケ タイ ド鎖が伸 長の 後， アル ド ー_{ル 型縮 合 に よ り芳}

香

環 を形 成 した， これ まで に例の ない ，非天然型 新規

C21

カル コ ン 及 び

C

、g ス チル ベ ン骨 格が 生成す る こ とを見 出 し た （

Fig

．

5

）9）_{．た だ し} ， 収率は芳しくなく， さす が に 基質が これ だ け 嵩 高くなる と酵 素反応が うま く進 行 しない の も当然に 思 わ れ た ．し か し， 上述 した， 結晶構造に基づ _き活性 中心 キャ ビテ ィ を拡 大 した

OKS

　

N222G

点変 異酵 素 （マ ロ ニ ル

CoA

の み を基質 と した 場 合 に は

10

分子縮合 に よ り

C

_，。ベ ン ゾフ ェ ノ ン

SEK

　

15

を 生 成す る）に クマ ロ _イル

CoA

を開始 基 質 とし て作用 させ た場 合， 酵 素反応生成 物の 割 合が劇 的に変化 し て ，非天然型 新 規

C2

且 カル コ ン の 生成量 が 飛躍的 に増 大 し， 主 生成 物と し て与 える こ とを見 出した 9｝_． c・Asrv °

：



6

・ 鰯

窟

  　 　O　 　　 　 　　 　　 　　 　　malonyi く）o《 　 couma 「oyK ）QA 　 O　 O 　 　 　 C・7rt＞12 　 　 　 　 ジノ　 7

　　

°

_⊃

。、 　 　 　 OH 　 　 　 HO o OH　O ＋

5xc

°dS ）

1

一 ヘ ガOH 　 　 　 　 O　 O 　 　 　 mab 噸｛）畝 　 　 00 　 　 　 　 　SEni 　 　 Oo 　 　 　 　 OH C−6／C−11 　 　 　 　 黛 　 　 　 　 〃 　 　 HO OH

　　　

21 A ・ ° ⊃ ク

ζ

　 　 　 OH 　 　 oO 　 　 　 　 SEnz 　 　 O 　 fO HO　転 0 　 　 　 8

ζ

1 　 0H

　

C19

OKS

　

WT

　 　 　 SEK4b

／

＿

⊥

− 　 　 　 25　 　 　 go　 　 　 36剛n 　 　 　 唱 m 25 30

聖

Fig ．5



A ．arborescens 　OKS が示 _した潜在的触 媒能力 と非_天然型新 規ポ リケ_{タ イ ド骨}格_の 創_出

　

以 上， 皿型

PKS

の 異例 とも言え る

寛

容 な

基質

特 異性 と潜

在

的触 媒能 力 を活 用する こ とに よ り， ま た， 合理 的 な 人工基 質の 設計 と結 晶構 造に基づ く機能 改変 酵 素を組 み合わせ る こ とに よ り， 新規 生体 触 媒 と非天然 型 新規化合物 の 効 率 的な 生 産 が 可能 にな る．今 後，酵 素に よ る閉 環 ・芳香 環 形成反 応 機 構 の _解明 と制御 を進 める と と も に， さ らな る複 雑 骨格を有 する アル ン、 ロ イ ド分子の 創 製へ 挑 戦 したい ．

88

N工 工一Eleotronlo _Llbrary

Symposium on the chemistry of natural products Symposium on thechemistry ofnatural _products

15

rtl,

2.

3.

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nt

(a)

pofzzasra,

e,retzrie

y

tr

ty

yr

FaJatpt#ohentueneo$upmt,,

eree,stefz

t#E

es-A;Elf,

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preliminary

crystallographic analysis of an acridone-producing

novel multifunctional type

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_polyketide

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biosynthesis

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_plant

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chain

length

control

in

an octaketide-producing

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"Crysta11ization

and

_preliminary

c

_{lstallographic}

analysis of an octaketide-producing

plant

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polyketide

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insight

into

chain

length

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engineering of a

_plant

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"Enzymatic

formation

of unnatural novel chalcone, stilbene, and

benzophenone

scaffolds

by

_plant

Symposium on the chemistry of natural products

NII-Electronic Library Service Symposium

15

on the chemistry of natural _products

Enzymatic

Synthesis

of

Unnatural

Novel

Alkaloida1

Scaffolds

by

Plant

P(

lyketide

Synthases

Makoto

Yamashitai

,

Kiyofumi

Wanibuchii

,

Shepo

Shi2,

Hiroyuki

Morita2,

Hiroshi

Noguchii,

Ikuro

Abe2

'

School

ofPhar:maceutical

Sciences,

University

cvFShizuoka

2

Graduate

School

ofPharmaceutical

Sciences,

71he

Uhiversity

of

7bkyo

Plant

type

III

_polyketide

synthases

(PKSs)

exhibit unusually

broad,

promiscuous

substrate

specificities;

the

structurally simple

homodimeric

proteins

accept a variety of

nonphysiological substrates,

including

aromatic and aliphatic

CoA

thioesters,

to

_produce

an

array of chemically and structurally

divergent

unnatural

polyketides.

Here

we

_present

_most

recent examples

including

enzymatic

formation

of

(i)

tricyclicand tetracyclicunnatural

novel

alkaloidal

scaffolds

by

PKS1

from

Ehtperzia

serrata, and

(ii)

a

C,,

hexaketide

stilbene

and a

C2,

heptaketide

chalcone

by

octaketide synthase

(OKS)

from

Atoe

arborescens.

Manipulation

of the enzyme reactions

by

combination of the

_precursor

directed

biosynthesis

and structure-guided engineering of the enzyme would thus

lead

to

further

_production

of

unnatural novel

_polyketide

and alkaloid scaffolds.