ミニブタ体細胞クローン産子作出技術の確立と医科学研究への応用

ミニブタ体細胞クローン産子作出技術の確立と医科

学研究への応用

著者

若井 拓哉

号

860

発行年

2005

URL

http://hdl.handle.net/10097/16358

氏

名(本 籍)

学 位 の 種 類

学 位 記 番 号

学位授与年月 日

学位授与の要件

研 究 科 専 攻

学 位 論 文 題 目

わか い た く や 若 井 拓 哉 博 士(農 学) 農 博 第860号 平 成18年3月24日 学 位 規 則 第4条 第1項 該 当 農 学研 究科 応用 生命 科 学専 攻 (博士 課程) ミニ ブ タ体 細胞 ク ロー ン産子 作 出技術 の確 立 と医科 学研 究 へ の応 用 論 文 審 査 委 員K主 査) (副 査) 藤 原 口 田 々

佐

小

山

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授

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教

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助

英

明

嘉

昭

高

弘

比 呂志

論

文

内

容

要

旨

1.緒 言 ク ロー ン技 術 とは,核 移 植 に よ り遺 伝 的 に 同一 な複 数 の個 体 を 生 産 す る技 術 で,ド ナ ー 細 胞 と して初 期 胚 の 割 球 を用 い る受 精 卵 ク ロー ン と体 細 胞 を用 い る 体 細 胞 ク ロー ン の二 つ に大 別 され る。 前 者 の ク ロー ン個 体 は産 業 動 物 で は優 良 な家 畜 を増 産 す る こ とを主 な 目的 と し,1986年 にWilladsenが ヒツ ジ の8∼16 細 胞 期 胚 の割 球 を除核 した 成 熟 卵 子 に 核 移植 す る こ とで 作 出 す る こ とに成 功 し た。 一 方,体 細 胞 ク ロー ン個 体 の作 出 は 長 い 間哺 乳 動 物 で は 困難 と され て い た が,1997年 にWilmutら が ヒツ ジ の乳 腺 細胞 の核 を核 移植 して"ド リー"の 作 出 を報 告 した。 こ の報 告 は 乳 腺 細 胞 に ヒ トの治 療 を 目的 と した物 質 の遺 伝 子 を 組 み 込 み,動 物 工 場 の機 能 を もつ 遺 伝 子 改 変 動 物 を開 発 す る こ とを構 想 した も の で あ り,体 細 胞 ク ロー ン技 術 が 基礎 研 究 の み な らず,医 療 の分 野 な どで社 会 に 貢 献 す る可 能 性 を示 す も の で あ っ た。 しか しな が ら,ド リー の誕 生 以 降,こ れ ま で に様 々 な哺 乳 動 物 種 で 体 細 胞 ク ロー ン動 物 が作 出 され た もの の,い ず れ に お い て もそ の 出 生 率 は低 く,ま た,産 まれ た産 子 の 出 生 直後 死や 先 天性 奇 形 が 高頻 度 に観 察 され,こ の低 い 生 産 性 が遺 伝 子 改 変 動 物 を用 い た構 想 の 実 現 に お け る大 き な 障 害 とな っ て い る。 こ う した体 細 胞 ク ロー ンの異 常 の原 因 は現 在 で も解 明 され て い な い が,体 細 胞 ク ロー ン技 術 は核 移植 操 作 単 独 の 技 術 で は な く,レ シ ピエ ン ト卵 母 細 胞 の成 熟培 養,ド ナ ー細 胞 の 調 整,核 移植,活 性 化 処 理,胚 の発 生 培 養,仮 親 の発 情 同期 化,胚 移 植,妊 娠 仮 親 の管 理 と分 娩 と,一 連 の過 程 か ら な る総 合 的 な 技 術 で あ り,こ れ らの技 術 一 つ 一 つ を確 立 す る こ と が最 終 的 な ク ロー ン動 物 の効 率 的 な 作 出 に不 可 欠 で あ る。 ブ タ にお け る体細 胞 ク ロー ン技 術 は,ブ タ が ヒ トに 近 い 特性(体 サ イ ズ 、 代 謝 、食 性 な ど)を もつ こ とか ら,ヒ トへ の外 挿 を 目的 と したモ デ ル 動 物 の 開 発,あ るい は 異 種 移 植 を 目的 と した臓 器 生 産 ブ タ を作 出す る方 法 と して注 目さ れ て い る 。 し か し な が ら,ブ タ の 場 合,産 子 を 得 る た め の 基 盤 と な る 繁 殖 技 術 の 確 立 が マ ウ スや ウシ な ど他 の動 物 種 と比 べ 立 ち 遅れ て い る こ とが 大 き な問題 の 一 つ とな っ て い る。 特 に,核 移植 に供 す る レシ ピエ ン ト卵子 の 品 質 の 問題 が

あ げ られ る。 核移植 に用 い る レシピエ ン ト卵子 として体 内または体外 で成 熟 し た もの を用い る ことが可能 で あるが,体 内成熟卵子 の利 用 は労力 ・経 費の面 か ら非効率 的で ある。一方,体 外成 熟培養 は食 肉処理場 で採取 した卵巣 を利用 す る こ とが可能 であ り効率的 であ るが,こ のよ うに して得 られた体外 成熟卵子 は そ の後 の発 生能力 が体 内成熟 した卵子 と比べ劣 るこ とが報告 されて い る。また, 良質 な クロー ン胚 を作出す るだ けでな く,仮 親 の条件 も産子 を得 るた めの重 要 な因子 であ る。 これ までに ミニブ タで クロー ン個 体 を作 出 した報告 では,胚 移 植 の仮親 に家畜 ブタを使用 してい るが,繁 殖 な どを試 験す る うえで家畜ブ タは 大規模 な管理 フィール ドを必要 とし,一 般の研 究所 での利 用が難 しい。この点, ミニブ タはそ の体 サイズか ら管理 が比較的容易 で,遺 伝 子改変動物 を含 めた実 験 ・医用動物 と しての利用 に適 してい る。 以上 の背 景下,本 研 究では遺伝子改変 ミニブ タの開発 を 目的 と した体細 胞 ク ロー ン技術 の確立 を行 った。 まず,第 一 に良質 な レシ ピエ ン ト卵子 を得 るた め の体外成熟培養 条件 を調べ,ミ ニブ タクロー ン胚 の発生能 の改 良を行 った。 次 に,胚 移植 す る仮親 に ミニ ブタ を選択 し,仮 親 の発 情 を安 定的 に同期 化す るた めの ミニブ タ発情誘 起法 の確立 を行 った。続 いて,確 立 した方 法 に よ り作 出 し た胚 を発 情 同期化 した仮親 へ移植 し,体 内で個体 まで発 生す るか を検 証 した。 最 後 に,ク ロー ン技術 の応用 として現在,医 科学研 究で求 め られ て い る遺伝 子 改変 ミニブ タの開発 を 目的 とした実験を行 い,そ の可能性 を検索 した。 2.最 適 な レシ ピエ ン ト卵 子 の体 外 成 熟 培養 条 件 の確 立 体 細 胞 ク ロー ン胚 が個 体 発 生 す るた め に は,分 化 した核 の 情 報 が レシ ピエ ン ト卵 細 胞 質 内 で 初 期 化 され 個 体 発 生 へ の プ ロセ ス に 再 プ ログ ラム され る必 要 が あ る。 こ の 正確 な機 構 にっ い て は未 だ解 明 され て い な い が,レ シ ピエ ン ト卵 子 に は 第 二 減 数 分 裂 中期(MH:)へ 成 熟 した 卵 子 を 用 い る こ と が 不 可 欠 で あ る こ と か ら,卵 細 胞 質 中 に は 高 い卵 成 熟 促 進 因 子(MaturationPromotingFactor,MPF) 活 性 が 必 要 で あ る こ とが指 摘 され てい る。 しか しな が ら,こ のMPF活 性 レベ ル

は培養時 間や核移植 の顕微操 作 中に大 き く変 動す る可能性 が考 え られ る。 そ こ で本章では,捉F活 性の変動 に焦 点 をあて最適 な レシピエン ト卵子 を得 るための 体外成熟培養条件 の確立 を 目的 と した。 体外成熟培養後36時 間で約70%の 卵子 がM∬ 期 に達 した成熟卵子 であった (図1A)。 核移植前後 でのMPF活 性 の変化 を調 べ た結果 、培養 後44お よび52時 間の成熟卵子 を用いた場合,核 移植操 作 によ りMPF活 性 が大 き く低 下 し対照 区 の未操作卵子 と比べ低か った(図1B)。 一方,培 養後36時 間 の成熟卵子 を用い た場合,核 移植後 もMPFが 高 く維 持 され た。 この核移植後 の高いMPF活 性 を反 映 して,培 養後36お よび40時 間 の成熟卵 子へ移植 した体細胞核で高い割合 の 染 色体凝集 が観 察 された(図2)。 これ に対 し,培 養後44お よび52時 間では異 常な紡錘体 を形成す るものが多 くみ られ た(図2)。 次 に,ク ローン胚 の発生能 力 を調べ た結果,培 養後36お よび40時 間 の成 熟卵子 を用 いた場合,卵 割率お よび胚盤胞期への発生率が他 の時間 に比べ 高か った(表1お よび図3)。 以上,本 章の結果,成 熟後早期 の卵子(成 熟培養 後36お よび40時 間)を 用 い ることで ドナー核 を 裡F活 性 の高い卵細胞質 中に暴露す ることが可能であ る こ とが示 され,核 の初期化 や ク ロー ン胚 の発 生 能 を向上 させ るた めの最適 な体 外成熟培養条件が確 立 され た。 さらに,こ れ までの クロー ンブタ作 出 に成 功 し た報告では,体 外受精な どに適応 され る成熟培 養後44か ら48時 間 の成熟卵子 を レシ ピエ ン ト卵子 として用 いた報告 が多い が,本 章 の結果 は体外受精胚 と体 細胞ク ローン胚では最適 な体外成熟 時間が異 な る可能性 を示唆 した。 3.仮 親 の発情同期化 を 目的 とした ミニブ タ発情誘起法 の確立 胚移植 によ り産子 を得 るため には,仮 親 ブ タの発情周期 を確 実に制御 す るこ とが不 可欠 であるが,ミ ニブタで の発情 誘起 法 に関す る報 告が少 な く,胚 移植 のた めの効果的な方法が確 立 されてい ない。 そ こで,家 畜 ブ タの発情誘起法 の 中で最 も一般的で簡便 なPMSGとhCGを 投与す る方法 を基本 に種々の組 み合 わせ を行 い,最 適 な発情誘起法 を検 索 した。

供 試 ブ タ として,ク ラ ウン系(8ヶ 月 齢),中 国 系小 型 ブ タ(6∼9ヶ 月齢), メキ シ カ ンヘ ア レス(5∼10ケ 月齢)お よび三 元 交 雑 種(ク ラ ウ ン系 ×中国系X ゲ ッチ ンゲ ン系)(4.5∼9.5ヶ 月齢)と 対 照 と して家 畜 ブ タ(6ヶ 月齢)を 用 い た。 ホル モ ン投 与 法 と して,低 単位 投 与 法Aで は1日 目にPMSG2001U+hCG100 1Uを 投 与 し,4日 目にhCG1001Uを 投 与 した。低 単位 投 与 法Bで は1日 目にPMSG 3001U+hCG1501U,4日 目にhCGl501Uを 投 与 した。 高単 位 投 与 法 で は1日 目 にPMSG15001U,4日 目にhCG7501Uを 投 与 した。 最 終 ホル モ ン投 与 後40∼48 時 間 に麻 酔 下 で供 試 ブ タ を開 腹 し,卵 巣 の所 見 を観 察 した。 そ の結 果,低 単位 投 与 法Aで 最 も高 い発 情 誘 起 率 が 得 られ,推 定排 卵卵 胞 数 も他 の 群 と比 べ有 意 に 高 か っ た(表2)。 一 方,通 常 家 畜 ブ タで用 い られ て い る高 単位 投 与 法 で は卵 胞 の う腫 な どの異 常卵 胞 が観 察 され た(図4)。 本 章 の結果 か ら, 仮 親 ミニ ブ タの発 情 同期 化 法 と して低 単位 投 与 法Aが 最 も有 効 で あ る こ とが 明 らか とな った。 4.胚 移植 による ミニブ タ クロー ン個体 の作 出 前章 までに確 立 した方 法 を用 い,本 章で は作 出 した クロー ン胚 を仮親 へ胚移 植 しクロー ン産子 の作 出 を 目的 と した。 ブタは多胎で あることか ら妊娠12日 目 に4つ 以上の受胎 産物 が ない とその後 の妊娠 が成立 しない特性 を持 っ ことが知 られ て い る。 したが っ て,胚 移植 に よ り産 子 を得 よ うとす る場合,他 の産業動 物 よ りも多 くの良質 の胚 を用意す る必要 があ る。そ こで本研究 では,受 胎産 物 を増やす 目的で単為発 生胚 を同時 に胚移植 した。 体外 成熟培養後40時 間 の成 熟卵 子 を レシ ピエ ン ト卵子 として,胚 移植予定 日 の前 日ま で3同 間核移植 を行 い,ク ロー ン胚 を作出 した。胚移植 日に排卵が始 ま るよ うに仮親 ミニ ブ タを低 単位 投与法Aで 発情誘起 した。胚移植試験1で は 作出 した ミニブタ ク ロー ン胚 のみ を仮親 へ胚移植 し,胚 移植試験 皿ではクロー ン胚 と共 に仮親1頭 あ た り約40個 の単為 発生胚 を移植 した。妊娠判定 を発情周 期の回帰 を指標 とす るノ ン リター ン法 と超 音波診断で行 った。

胚 移 植 試 験1で は計1,437個(卵 割 胚 数891個 を含 む)の ク ロー ン胚 を7頭 の仮 親 へ 移植 したが,妊 娠 個 体 は得 られ なか った(表3)。 一 方,胚 移 植 試 験 艮で は計756(卵 割 胚数398個 を含 む)の ク ロー ン胚 を4頭 の仮親 に移植 した結 果, 1頭 が 妊 娠 し,正 常 な妊 娠 期 聞 を経 て1頭 の正 常 な ミニ ブ タ ク ロー ン産 子 が 誕 生 した(表4,図5お よび 図6)。 本 章 の結 果,前 章 まで に確 立 した方 法 お よび 単 為 発 生 胚 を 共移 植 す る胚 移 植 法 が ミニ ブ タ ク ロー ン個 体 を得 るた め に 有 効 な方 法 で あ る こ とが示 され た。 5.医 科 学 研 究 に有 用 な遺伝 子 改 変 ミニ ブ タ開発 戦 略 前 章 ま で の研 究 に よ り確 立 され た 体 細 胞 ク ロー ン技 術 の 応 用 と して現 在,医 科 学 研 究 で求 め られ て い る遺 伝 子 改 変 ミニ ブ タの 開発 を 目的 と した 実 験 を行 い, そ の 可 能性 を検 索 した。 5.1GFP遺 伝 子 導入 トラン ス ジ ェ ニ ック ミニブ タの開 発 Green伽oresoenceprotein(GFP)遺 伝 子 導 入 ミニ ブ タ は細 胞 ・臓 器 移植 な どの 移 植 医 療 の研 究や 幹 細 胞移 植 をべ 一 ス と した再 生 医療 の研 究 の た め の ツ ー ル と して 有 効利 用 が期待 され て い る。そ こで本 節 で は,GFP遺 伝 子 導 入 体 細胞 ク ロー ン胚 の体 外 にお け る発 生能 を検 索 した。 そ の結 果,GFP導 入 体 細 胞 ク ロー ン胚 は体 外 で胚 盤 胞 期 ま で発 生 し,遺 伝 子 非 導 入 の 体細 胞 ク ロー ン胚 と同程 度 の発 生 能 を有 す る こ とが わ か った(表5お よび 図7)。 5.2肝 障 害 トランス ジ ェニ ック ミニ ブ タ の 開発 最 近,肝 障 害免 疫 不 全 マ ウス に ヒ ト肝 細 胞 を移植 す る こ とに よ りヒ ト肝 細 胞 を持 つ キ メ ラマ ウス が 開発 され て い る。 ブ タ で も同様 のモ デ ル が確 立 され れ ば, よ りヒ トに近 い前 臨床 モデ ル と して の利 用 が 可 能 で あ り,さ らに ヒ ト肝 組 織 を 生 産 す る動 物 工 場 と して の利 用 も構 想 され る。 そ こで 本 節 で は,あ らか じめ 導 入 遺 伝 子 が 目的 の 臓 器 で 機 能 す る か を 検 索 す る た め に,マ ウ ス ア ル ブ ミ ン プ ロ モ ー ター が ブ タ肝臓 に お い て特 異 的 に遺 伝 子 発 現 を誘 導 す る可 能 性 をGene-gun シ ス テ ム を用 い て'η 伽0に お け る評 価 を行 った。そ の結 果,CMVプ ロモ ー タ ー

がブ タ肝 臓 と膀 胱 粘 膜 の 両方 で 強 いル シ フ ェ ラー ゼ 活 性 を示 した の に対 し,マ ウス アル ブ ミンプ ロモ ー ター は ブ タ肝臓 で の み活 性 を示 した(表6お よび 図8)。 これ らの結 果,マ ウス アル ブ ミン プ ロモ ー ター が ブ タ肝 臓 に お い て も特 異 的 に 活性 化 す る こ とがわ か り,ト ラ ン ス ジ ェニ ックブ タ を 作 出 す る前 の プ ロモ ー タ ー の評 価 にGene-gunシ ステ ム が有 効 で あ る こ とが示 され た_。 以 上,本 研 究 で得 られ た 成果 を 総 括 す る と,医 科 学 研 究 へ の応 用 が 可 能 な遺 伝 子 改変 ミニ ブ タの 開発 を 目的 と した体 細 胞 ク ロー ン技 術 の 確 立 を行 い, 1.ミ ニ ブ タ ク ロー ン胚 の発 生 に最 適 な レシ ピエ ン ト卵 子 体 外 成 熟 時 間 を決 定 し,高 い発 生 能 を持 つ ク ロー ン胚 の 作 出 を可能 に した。 2.仮 親 ミニ ブ タの発 情 同期化 を可 能 にす る ミニ ブ タ発 情 誘 起 法 を確 立 した。 3.ミ ニ ブ タ ク ロー ン産 子 の作 出系 を確 立 した。 4.医 科学研 究 に有用 な遺伝子改変 ミニブ タ開発 の可能性 を示 した。 本研究 で得 られた成果 は,今 後,医 科 学研 究へ の応 用が 可能 な遺伝 子改 変 ミ ニブタを作 出す る うえで有効な技術 を提供す るもの と評価 でき る。

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36 4044 成 熟 時 間(h) 52 図1.核 移 植 前 後 で のMPF活 性 の 変 化. (A)体 外 成熟 培 養 後 の成 熟 率 とMPF活 性 成 熟 は第 一極 体 の 放 出 の 有 無 によ り判 定 した 。成 熟 率 は培 養 した卵 子 中の 成 熟 卵 子 の 割 合 で示 した。MPF活 性 は 成 熟0時 間 の卵 子 の活 性 を1と して相 対 的 に表 した。 値 は平 均値 ±SE.で 示 した(n=3)。 (B)核 移 植 前 後 でのMPF活 性 の 変 化 MPF活 性 は 成 熟36時 間 の 核 移 植 前 の 卵 子 の 活 性 を1と して相 対 的 に 示 した 。括 弧 内 の数 字 は成 熟 培 養 後 か らの経 過 時 間 を示 した。曲:同 じ成 熟 時間 において各 処 理 区 で有 意 差 あ り(P<0.05)。 榊*:同 じ処 理 区 にお いて各成 熟 時 間 で有意 差 あ り(P<0.05)。 値 は平 均 値 ±S且 で示 した(nr3)。

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図2.ク ロー ン胚 にお ける核 の 再 構 築. 体 細 胞核 移 植 後 の 核 の 形 態 パ ター ン。 (A)早 期 染 色 体 凝 集 (B)正 常な紡 錘 体(成 熟 卵子) (C)正 常な紡 錘 体(ク ローン胚) (D・耳)異 常 な紡 錘 体(ク ローン胚) :紡錘 体 の形 態 は 正 常だ が 、染 色 体 が 中 央 に整 列 して いな い(D」E);紡 錘体 の 形 態 が 異 常(F-G); 微 小 管 が 卵 細 胞 質 内 に 散 在(H) σ)早 期 染色 体 凝 集 に及 ぼす 体 外 成 熟 時 間 の影 響 距c:異 符 号 間 に有 意 差 あ リ(P<0.05)。 値 は平 均 値 ±S.E.で 示 した(nr3)。 (J)紡 錘 体 形 成 に及 ぼす 体 外 成 熟 時 間 の 影 響

表1.クローン胚の発生に及 ぼす体 外成熟時間の影響 成熟時間 h

培養胚数

n 卵 割 胚 数 血(%)* 胚 盤 胞 期 胚 数 n(%)*

胚盤胞細胞数

且 ±S.e. 36 107

50(46.'n$

9(8!り 釦 29±1.8訪

40 48

53(54.1}a

14(14.3)e

42ｱ4.9a

44 52 108 56

50(46.3)a

12(21.4)b

5(4.6)b

2(3.6)b

24±12.7ab 20ｱ10.4b *:%培 養 胚 数 a・c:異 符 号 間 に 有 意 差 あ り(P<0.05)。 図3.胚 盤 胞 期 まで発 生 したクロー ン胚.(Ba「=100μm) 成 熟40時 間 の 卵 子 を レシ ピエ ン ト卵 子 として 用 い 核 移 植 を行 い 、活 性 化 処 理 後 、体 外 で6日 間 発 生 培 養 した 。 (A)明 視 野 (B)UV照 射 下(:H㏄chst33342染 色)

表2.異 なるホルモン投与 によるミニブタの発情誘起

投与法

供試頭数

n 月 齢 ・

発情誘起率

%

_{(排卵 点,排 卵前卵胞 数)}推 定排卵数a

低単位A

低単位B

高単位

高単 位 (家畜ブタ) 18 al 5 6 13.4E1.6 9.3ｱ7.2 8.8ｱ4.5 5.8ｱ2.5 83.3 81.0 60.0 66.7

22.5ｱ1.8**

(7.5ｱ3.5,14.6ｱ3.3)

12.7ｱ2.8*

(4.2ｱ1.4,10.0ｱ5.3)

20±0.0串 (17,3)

14.5ｱ3.7*

(14.5ｱ3.7,4)

a:MeanｱS.E. ***:異 符 号 間 に 有 意 差 あ り .(P〈0.05) B 脳 陶』. 図4.hCG投 与後43-48時 間 にお けるの ミニブタの 卵 巣 の 所 見. (A)排 卵 中の 卵 巣(低 単 位A) (B)排 卵 後 の卵 巣(低 単 位A) (q卵 胞 嚢 腫(高 単位)

表3.胚 移 植試 験1の 成 績 親 α 仮 N 仮親 の ドナー細胞の 系統 系統 移植胚数 (卵割 胚数)

妊娠状態

1 2 3 4 5 6 7 伽 t C C C KCG KCG K K C C C C C C C

116(55)

96(14)

84(41)

311(229)

217(148)

217(148)

396(256)

1437(891)

発 情 回 帰(21日 目) 発 情 回 帰(25日 目) 発 情 回 帰(22日 目) 発 情 回 帰(25日 目) 発 情 回 帰(25日 目) 発 情 回 帰(18日 目) 発 情 回 帰(18日 目) 表4.胚 移 植試 験Eの 成 績 仮 親 仮 親 の No.系 統 ドナー細胞 移植胚数 の系統(卵 割胚 数)

単為発生

卵子数

妊娠状態

1 2 3 4 5 6 K K K G G 即 ㏄ K C G C G C G C G C C

60(34)

84(55)

61(34)

82(54)

112(28)

131(57)

100(60)

126(76)

275(165)

257(143)

44 41 46 40 35 32 発 情 回帰(42日 目) 発 情 回 帰(46日 目) 発 惰 回 帰(21日 目) 115日 目に1頭 出 産 (妊娠 中) (妊 娠 中)

リ ヒ ひ

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一 "! 磁 寸 鯉 灘 、 ︾ 楼 毎 図5.胚 移 植 後 の 妊 娠 状 況. (A)超 音 波 診 断(胚 移 植 後91日 目) (B)妊 娠 ブタ(胚移 植 後105日 目)

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歴

卿 凱 躍一 灘 φ 図6.ミ ニ ブ タク ロー ン 産 子.

表5.GFP遺 伝 子 を導 入 した クロー ン胚 の体 外 発 生能 ドナー細 胞

培養胚数

卵割 胚 数(%)* 胚盤胞期胚数 (%)* GFP十 GFP= 46 376

20(43)

163(44)

2(4)

13(3)

*:%培 養 胚 数 官'曝 .鴇 一ゴ4羅 認 弩盤 〆 謬 岬:撫`'6… 「騒 アゆ が ギ マ ー ∫ 畿`' .1ξ!・ 翻 ず; 弩丁 曳 町 弗 ら 趨¥嚥 拶 箭.・ ㌻ 型 図7.GFP遺 伝 子 を導 入 したクローン胚. (A)GFP遺 伝 子 を導 入 したミニブタ線 維 芽 細 胞 (B)卵 割 期 のGFP導 入 クロー ン胚 (C)胚 盤 胞 期 のGFP導 入 クロー ン胚 表6.マ ウスアル ブミンお よびCMVプ ロモー ター のプロモーター 活 性71 プロモー ター の 種 類 ルシフェラー ゼ 活 性*(RLUx104)

肝臓

膀胱

マウスアル ブミン CMV 10.1ｱ1.4 1.8ｱ0.3 172.7ｱ18.3212.7.1ｱ100.1 *:平 均 ±SD _.(n=3) 鑓 、 鰍 灘 .難 ' 7 γ ピ 一 腱 畢 駄. 鮮 脚 蛋 、 、歓 蜘 ■ ﹁ り ど イ のサ   コ ロ , 記 ≧ 彰 o 司 > 2 0 駈 o 撰 肝繊 猷 図8.ブ タ肝 臓 および 膀 胱 にお けるマウス アル ブミンプロモー ター の活 性 の 比 較. データはブタ肝 臓 および膀 胱 にお けるマウスア ルブミンプロモー ター の ルシフェラー ゼ 活 性 を

論 文 審 査 結 果 要 旨

ブ タ に お け る体 細 胞 ク ロー ン技 術 は,ブ タ が ヒ トに近 い 特 性(体 サ イ ズ,代 謝,食 性 な ど)を もつ こ とか ら,ヒ トの 疾 患 モ デ ル 動 物 の 開発,あ るい は ヒ トへ の 異種 移 植 を 目的 と した臓 器 生 産 用 ミニブ タ を作 出す る方 法 と して注 目 され て い る。 本 研 究 で は,ミ ニ ブ タ体 細 胞 ク ロー ン 産子 作 出 技 術 の確 立 を 目的 と した 実 験 を行 い,以 下 の研 究 成 果 を得 た。 第1に,高 い発 生 能 を有 す る ミニ ブ タ ク ロー ン胚 の 作 出 系 を確 立 す る こ とを 目的 と して,MPF活 性 の 変動 に 焦 点 をあ て,良 質 な レシ ピエ ン ト卵 子 を得 る た め の 体 外 成 熟 培 養 条 件 を検 索 した。 そ の結 果,核 移 植 操 作 がMPF活 性 を低 下 させ る 一 因 とな る こ と,ま た通 常体 外 受 精 な どに適 用 され る よ りも体 外 成 熟 時 間 の 短 い成 熟 後 早 期 の卵 子 を レシ ピエ ン ト卵 子 と し て用 い る と核 移 植 後 も 高 いMPF活 性 レベ ル が維 持 され,正 確 な ドナ ー細 胞 核 の 再 構 築 が 起 こ る こ とを 明 らか に した 。 第2に,ミ ニ ブ タ ク ロー ン胚 を移 植 す る仮 親 に ミニ ブ タ を 選 択 し,安 定 的 に仮 親 ミニ ブ タ を発 情 同期 化 させ る条 件 を確 立 す る た め に,ホ ル モ ン投 与 に よ る ミニ ブ タの 発 情 誘 起 を行 っ た。 そ の結 果,低 単 位 のPMSG2001UとhCG1001Uを 同時 に投 与 す る方 法 が,高 い 発 情 誘 起 率 を示 し,多 くの排 卵 を誘 起 す る こ とが 分 か っ た。 第3に,本 研 究 に お い て 確 立 した方 法 を も とに ミ ニ ブ タ ク ロー ン産 子 の 作 出 を 目的 と して,作 出 した ミニ ブ タ ク ロー ン胚 が仮 親 の体 内 で 個体 ま で発 生 す るか を検 証 した 。本 研 究 で は,仮 親 の妊 娠 維 持 を 目的 と した 単 為発 生胚 を 同 時移 植 す る方 法 を試 み, 正 常 な ミニ ブ タ ク ロー ン産 子 を作 出す る こ と に成 功 した 。 第4に,GFPト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク ミニ ブ タ と肝 障 害 トラ ンス ジ ェ ニ ック ミニ ブ タ の2種 類 の 遺 伝 子 改 変 ミニ ブ タの 開 発 を 目指 した 実 験 を 行 い, そ の 可 能 性 を検 索 した 。GFPト ラ ンス ジ ェニ ック ミニ ブ タ に関 す る研 究 で は,作 出 したGFP発 現 ク ロー ン胚 が体 外 で 通 常 の ク ロー ン胚 と同程 度 の発 生 能 力 を有 して い る こ とを示 した 。 また,肝 障害 トラ ン ス ジ ェ ニ ック ミニ ブ タ に関 す る研 究 で は,Genegunsystemを 利 用 して,invivoに お いて肝 臓 特 異 的 プ ロ モ ー タ ー の評価 を行 い,導 入 遺 伝 子 が ミニ ブ タ の肝臓 で特 異 的 に発 現 す る可能 性 を示 した 。 本 研 究 は応 用 動 物 科 学 に お い て 高 く評 価 され る。 よ って 博 士(農 学)の 学位 を授 与 で き る も の と判 定 した 。