ニワトリ腰髄後角における cyclooxygenase-2 陽性細胞に
存在する mu opioid receptor 抑制系
青 木 航 洋
1），川 手 豊 子
2），坂 本 宏 史
3），
山 田 明 香
1），浜 田 良 機
1），熱 海 佐保子
2），
1）山梨大学大学院医学工学総合研究部整形外科学講座， 2）同・解剖学講座第 2 教室，3）健康科学大学理学療法学科 要 旨：脊髄後角表層での炎症性疼痛の発生や修飾に関係する cyclooxygenase-2（COX-2） 含有細 胞と，内因性疼痛抑制に関与する mu opioid receptor（MOR） を持つ細胞との関係について検討 した。complete Freund’s adjuvant（CFA） を足蹠に注射し，炎症を生じさせたニワトリ脊髄後角 表層のⅠ，ⅡおよびⅣ層の COX-2 陽性細胞と MOR 陽性細胞についての経時的な細胞数の変化は， COX-2 陽性細胞ならびに MOR 陽性細胞とも CFA 注射後時間経過とともに漸増したが，18 時間後 では MOR 陽性細胞数は一時的に減少した。COX-2 および MOR 共存細胞数は，12 時間後から増加 し，36 時間後が最高だった。いずれの層でも 18 時間後には一時的に減少していた。non-steroidal anti-inflammatory drugs（NSAIDs）の投与が COX-2 含有細胞を抑制し，また，MOR が substance P の放出を抑制するという事実から，この研究で COX-2 および MOR が共存する細胞の存在を証明 したことで，MOR を介した炎症抑制系が同一部位に存在する可能性が示唆された。 キーワード シクロオキシゲナーゼ-2，ミューオピオイドレセプター，後角，炎症，抑制 緒 言 急性および慢性の末梢の炎症では脊髄後角表 層の cyclooxygenase-2（COX-2）含有細胞が増 加し，prostaglandins（PGs）の合成および放 出を増加させる。このメカニズムは，炎症性疼 痛や痛覚過敏を引きおこす主要な要素である。 また，mu opioid receptor（MOR）アゴニスト が 末 梢 の 刺 激 や 炎 症 に よ り 放 出 さ れ る sub-stance P（SP）（侵害情報の transmitter あるい は modulator）を抑制する1）ことや， non-steroidal anti-inflammatory drugs（NSAIDs）の 投与が COX-2 含有細胞を抑制する2）ことが疼 痛の抑制性の経路に関わっている（図 1）。 疼痛にはさまざまな修飾やオピオイドなどに 〒 409-3898 山梨県中巨摩郡玉穂町下河東 1110 受付： 2005 年 6 月 24 日 受理： 2005 年 8 月 18 日原 著
図 1． 炎症性疼痛の刺激伝達および抑制における COX-2 と MOR の関連よる抑制のメカニズムが証明あるいは考えられ ている。炎症性疼痛に関わる COX-2 ならびに MOR について，細胞レベルでの存在や炎症後 の経時的な動態については，両者別々に報告は されているが，これらを同時に観察し，共存を 証明した報告はない。そこでこの研究では，侵 害情報伝達経路である PGs を合成する COX-2 含有細胞が，同一細胞内で MOR による抑制を 受けるメカニズムが存在するのではないかと仮 定した。つまり，炎症誘発後の脊髄後角表層の COX-2 免疫染色あるいは MOR 免疫染色が陽性 となる細胞の動態を経時的に観察し，これらが 同時に陽性となる細胞の存在を証明すること で，侵害情報伝達経路である細胞が内因性に MOR を介して抑制を受ける可能性を考察す る。 材料および方法 1．炎症の誘発 成熟したニワトリ（1,000–2,000 gm）を用い て 左 足 蹠 皮 下 に complete Freund’s adjuvant （CFA）（SIGMA Chemical Company, St Louis,
MO, U.S.A.）を 0.2 ml 注射した。 2．組織の準備
動物実験のガイドラインは US National Insti-tutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals に 基 づ い た 山 梨 大 学 Ani-mal Care and Use Committee による。CFA 注 射後 12，18，24，36 および 72 時間後のニワト リおよびコントロールのニワトリを sodium pentobarbital（60 mg/kg）で筋肉内注射を用 い深麻酔をかけ，左心室から少量の生理食塩水 の 後 ， 固 定 液 を 注 入 し た 。 固 定 液 は 0.1 M phosphate buffer（PB）4 ％ paraformaldehyde （pH 7.4）。潅流固定の詳細は以前述べられた方 法である3）。潅流後 L4 および L5 に相当する腰 膨大をすばやく摘出し，6 時間固定液に浸し， 5 ％ sucrose 含有 PB（pH 7.4）に 4°C にて一晩 インキュベートした。次に，組織をマイクロス ライサーにて 50µm に横断面に薄切した。 3．免疫組織化学 切片を，脱ホルムアルデヒド目的で 0.1 ％ NaHBO4により処理し，Blocking Kit（SP-2001, Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA, U . S . A . ） を 用 い 内 因 性 ビ オ チ ン の 除 去 後 ， 0.3 ％ Triton X-100 入り 0.1 M phosphate-buffe-red saline（PBS）入りの 3 ％ goat serum で 30 分プレインキュベートを行い，一次抗体として rabbit anti-COX-2 antibody （ 1： 500; Santa Cruz BIOTECHNOLOGY, INC, Santa Cruz, CA, U.S.A.）および Guinea Pig anti-MOR antibody （1：1,000; Neuromics, Northfield, MU, U.S.A.）
を混合して用い，4°C で一晩インキュベートし た。一次抗体の後，COX-2 は Cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG （ 1：200, Amersham Life Science, Amersham, UK）で赤に染色し，MOR は biotinylated anti-Guinea Pig IgG を用いて 1 時間処理後 FluoroLink Cy2 labeled streptavidin （1：1,000, Amersham）で緑に染色した。どの ステップの後も，10 分間 3 回の PBS 洗浄を行 った。
4．解析
免疫染色後，切片をスライドガラス上に Flu-oroguard（ Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.） で 包 埋 し ， 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 （ T C S4D , Leica, Germany）を用いて観察した。 コントロールのニワトリおよび足蹠に炎症を 生じさせたニワトリの脊髄後角表層（Ⅰ，Ⅱ， Ⅳ層）について，COX-2 陽性細胞および MOR 陽性細胞の局在を観察し，細胞数計測を行っ た。 用いたニワトリは 12 羽，225 対の切片につ い て 23,038 細 胞 を 計 測 し た 。 画 像 処 理 は ， Adobe Photoshop（CS, Adobe Systems Inc Sac Jose, CA, U.S.A.）を使用した。
統計処理には Mann-Whitney’s U test を用い た。
結 果 1．COX-2 および MOR 共存細胞の局在 ニワトリ脊髄後角の層構造については他の脊 椎動物同様Ⅰ∼Ⅹ層で構成されているが，後角 表 層 の 細 胞 は 大 き さ に よ っ て ， Ⅰ 層 は 小 型 （5 × 12µm），中型（12–15 × 30–40µm）と大 型 （ 1 2 – 1 5 × 7 0 – 8 0µm ） に ， Ⅱ 層 は 小 型 （6–8 × 15–20µm）と非常にまれに大型（長径 30–50µm），そしてⅣ層は小型（8 × 18µm） と大型（40 × 60µm）の細胞に分類される4）。 COX-2 および MOR 免疫染色がともに陽性とな る細胞はコントロールでも存在し，脊髄後角表 層（Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ層）の上記の細胞の大きさに関 わらず共存が観察された（図 2 ∼ 4）。 2．炎症誘発後の COX-2 ならびに MOR 陽性細 胞数の経時的変化 Ⅰ，ⅡおよびⅣ層に存在する処置側および非 処置側間の COX-2 陽性細胞ならびに MOR 陽 性細胞数については，今回の結果では両群間に 有意差（p ＜ 0.01）はみられなかった。（図 5a） そのため，以下の解析は処置側および非処置側 を含めたものである。 COX-2 陽性細胞ならびに MOR 陽性細胞の切 片あたりの細胞数は，12 時間経過後から時間 経過とともに漸増していたが，MOR 陽性細胞 数は 18 時間経過後のみ一時的に有意（p ＜ 0.01）に減少していた（図 5b）。 層毎の細胞数の変化をみると，Ⅰ，Ⅱおよび Ⅳ層に存在する COX-2 陽性細胞ならびに MOR 陽性細胞とも 12 時間経過後から時間経過とと もに増加する傾向にあったが，Ⅱ層の MOR 陽 性細胞数は 18 時間経過後のみ一時的に有意 （p ＜ 0.01）に減少していた（図 5c,d）。 3．COX-2 および MOR 共存細胞の経時的変化 COX-2 および MOR 免疫染色がともに陽性と
図 2． CFA 注射 12 時間後のニワトリ腰髄の抗 COX-2 抗体および抗 MOR 抗体による免疫染色標本（炎症側）： Ⅰ層 Scale bars ＝ 20µm
矢印＝中型細胞 矢頭＝大型細胞 いずれも COX-2 および MOR が共存している細胞 a ）MOR（Cy-2:緑），b）COX-2（Cy-3:赤），c）merged image
図 3． CFA 注射 12 時間後のニワトリ腰髄の抗 COX-2 抗体および抗 MOR 抗体による免疫染色標本（炎症側）： Ⅱ層 Scale bars ＝ 20µm
矢印＝小型細胞 矢頭＝大型細胞 いずれも COX-2 および MOR が共存している細胞 a ）MOR（Cy-2:緑），b）COX-2（Cy-3:赤），c）merged image
d）MOR（Cy-2:緑），e）COX-2（Cy-3:赤），f）merged image
図 4． CFA 注射 12 時間後のニワトリ腰髄の抗 COX-2 抗体および抗 MOR 抗体による免疫染色標本（炎症側）： Ⅳ層 Scale bars ＝ 20µm
矢印＝小型細胞 矢頭＝大型細胞 いずれも COX-2 および MOR が共存している細胞 a ）MOR（Cy-2:緑），b）COX-2（Cy-3:赤），c）merged image
なる細胞数については，処置側および非処置側 の両群間に有意差（p ＜ 0.01）はみられなかっ た（図 5e）。そのため，以下の解析は処置側お よび非処置側を含めたものである。 経時的な変化をみると，Ⅰ，ⅡおよびⅣ層を 合計したものならびにそれぞれの層別のものに ついて，いずれも 12 時間経過後から増加がみ られたが，18 時間経過後に一時的に有意（p ＜ 0.01）に減少した。その後，再び増加し 36 時 間経過後に最高になり，72 時間経過後には増 加はみられなかった（図 5f）。 細胞の大きさを分類して経時的な変化をみる と，小型のものよりも大型の細胞で COX-2 お よび MOR の共存がみられる傾向がみられた。 大型の細胞は炎症の有無に関わらず 94.4 ∼ 100 ％と高率に共存し，小型の細胞では非炎症 時から共存する細胞が 51.0 ∼ 68.2 ％存在し， さらに経時的に増加し 36 時間経過後以降では 91 ％以上となった（図 5g）。 考 察 PG 受容体が脊髄後角表層に存在することが 明らかにされている5）が，NSAIDs の髄腔内投 与により鎮痛効果が見られる6,7）。つまり，脊 髄における侵害情報の修飾に PGs が関わり， 図 5． COX-2 ならびに MOR 陽性細胞数の経時的変化 結果は平均値±標準偏差 n ＝ 450（切片数） ＊ p ＜ 0.01 ：各層の 12 hr に対して a）処置側ならびに非処置側における片側切片あたりの細胞数 b）片側切片あたりの細胞数 c）層別 COX-2 陽性細胞数 d）層別 MOR 陽性細胞数
e）処置側ならびに非処置側における COX-2 陽性細胞と共存する MOR 陽性細胞の割合 f）層別 COX-2 陽性細胞と共存する MOR 陽性細胞の割合
抑制に NSAIDs が関わっている。また，Opioid 遺伝子発現の up regulation が実験的な末梢神 経の損傷や炎症によっても起こることが知られ ている8,9）。しかし，COX-2 あるいは PGs と MOR との直接的な相関は明らかにされていな い。そこで，これらの細胞レベルでの内在的な 関係を考察した。 層構造によるニューロンの特徴として，Ⅰ， ⅣおよびⅤ層に分布する大型ニューロンの大部 分は弱い刺激に対しても強い刺激に対しても反 応する wide dynamic range を持ち，C 線維を通 して入力される刺激の情報を受容し，上位中枢 に そ の 情 報 を 伝 え る 投 射 ニ ュ ー ロ ン で あ る10,11）。また，Ⅱ層を分布するニューロンは小 型の神経細胞で，これらは抑制的な介在ニュー ロンであることが知られている12）が，MOR-1 は興奮性ニューロンにあることが示唆されてい る13）。Ⅳ層を形成する小型の細胞からなるニ ューロンの多くは脊髄内で局所的な回路を形成 していると考えられ14），脊髄視床路を形成し ている大型ニューロンはⅡ層の介在ニューロン に よ っ て 抑 制 を 受 け る こ と が 推 測 さ れ て い る15）。今回の研究では，小型のものよりも大型 の細胞で COX-2 および MOR の共存がみられ る傾向にあった。また，大型の細胞は炎症の有 無に関わらず共存し，小型の細胞でも非炎症時 から共存する細胞が約半数存在し，さらに炎症 後経時的に増加する傾向にあったことより，炎 症時の疼痛抑制には小型の細胞の活動がより強 く関与していることが示唆された。 脊髄後角表層のⅠ，ⅡおよびⅣ層の COX-2 陽性細胞ならびに MOR 陽性細胞について経時 的に細胞数の変化を考察したところ，脊髄後角 表層では COX-2 陽性細胞および MOR 陽性細 胞とも CFA 注射後時間経過とともに漸増して おり，注射後 18 時間では MOR 陽性細胞数は 一時減少していた。経時的変化についての報告 では，COX-2 陽性細胞数は炎症誘発後 8 時間 で増加し，24 時間経過後に一時減少した後に 96 時間経過後再度増加する19）ことや，後根神 経節では，MOR 陽性細胞数は炎症誘発後 1 日 では増加し 3 日経過後では減少する20）とされ ている。時間経過によるこれらの動態には，今 回の研究結果と異なる部分があるが，ラットや マウスを用いた研究であるための動物種の違い による影響を考える必要があるかもしれない。 また，アジュバント刺激による末梢神経の炎 症では 6 時間経過後から 3 日経過後まで COX-2 mRNA の発現がみられる16,17）ことや，末梢神 経の炎症により後根神経節では 1-2 時間経過後 および 96 時間経過後に二相性に MOR mRNA の up-regulation が起こる18）ことが報告されて いる。COX-2 および MOR 共存細胞数は，12 時間経過後から増加し，36 時間経過後が最高 となっていた。いずれの層でも 18 時間経過後 には一時的に減少しており二相性がみられた。 過去に，MOR の mRNA の動向について脊髄レ ベルでは証明されていないが，mRNA の動態 と関係がある可能性が示唆された。 小型の細胞であるⅡ層の細胞はインターニュ ーロンとしての役割を担っており，その際に炎 症性疼痛の抑制に強く関わっていることが考え られる。また，COX-2 および MOR 共存細胞が 二相性に増加しているのは，上記 mRNA の動 態のほかインターニューロンにおいて神経栄養 因子が産生またはその抑制などによる神経の可 塑性，つまり侵害情報の修飾がおこることが関 係しているためだと考えられ，病態生理学的に は急性疼痛から慢性疼痛への時間的経過として 考えることができるかもしれない。しかし，こ の機序についての詳細は現在わかっていない。 モルヒネの投与が PGE2を抑制すること21,22） や，NSAIDs の投与が COX-2 陽性細胞を抑制す ること，さらに，MOR が SP の放出を抑制す るという事実を考えると，COX-2 免疫染色お よび MOR 免疫染色が同時に陽性となる共存細 胞が存在することを証明し経時的変化を検討し た結果，脊髄後角表層細胞では炎症性疼痛にお ける COX-2 を介した侵害情報伝達経路ととも に MOR を介した抑制性の経路が共存すること が示唆された。また，特に小型のニューロンに 抑制性のメカニズムがある可能性が考えられ
た。
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