ミラクリン遺伝子の合成および大腸菌での発現

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(1)Sci. Rapts.,. Yokohama. Nail.. Sec. II, No.. Univ.,. 40, pp.. ll-18,. October,. 1993. ミラクリン遺伝子の合成および大腸菌での発現堀内正隆レ･栗原良枝. Synthesis. a. of. expression Masataka. gene. in Escherichia. HoRIUCHI. (Received,. 1.緒. Miraeulin. of. Yoshie. and. April. 5,. and. its. colt KuRIHARA. 1993). ロ. ミラクリンは西アフリカ原産の植物Richadella ミラクルフル-ツ)(Fig.. dulcijica (アカテツ科)の果実(通称. 1)に含まれる糖タンパク質で,すっぱいものを甘く感じさせ. る味覚修飾活性を有する｡ 1989年, Theerasilpらはミラクリンの精製法を確立し1),ミ Takahashiらはミラクリラクリンの191個すべてのアミノ酸配列を決定した2)｡また, ンの糖鎖構造を決定した3)｡さらに, Igetaらはミラクリンに含まれる7個のシステイン. 残基がポリペプチド鎖内に3個,ポリペプチド鎖間に1個のジスルフィド結合を形成していることを明らかにした4)0 以上のようにミラクリンのタンパク質化学的な研究は進展したにもかかわらず,ミラ. Fig.1.ミラクルフルーツ. 堀内正隆栗原良枝. 教育学部･大学院修士課程理科教育専攻教育学部･化学教室.

(2) 堀内正隆･栗原良枝. 12. クリンの立体構造や活性部位に関する知見はまだ得られていない｡ミラクリンの活性発現について,栗原らはミラクリンが味細胞膜の甘味受容部位の近傍に強く吸着し,酸により味受容膜のコンフォメ-ションが変化すると受容膜上に存在する甘味受容サイトがミラクリンの活性中心と結合できるようになり,甘味が発現するというモデルを提唱した5)0. 本研究において,我々はミラクリンの活性部位を解明することを目的に,遺伝子工学的手法により研究を進めた｡すなわち,ミラクリンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を化学合成し,この遺伝子により形質転換した大腸菌Escherichia. coliを用いて,ミラ. クリンタンパク質を生産する系の開発を試みた｡. 2.実験方法酵素は全て宝酒造製のものを用いた｡デオキシオリゴヌクレオチドの合成および精製:. ミラクリン遺伝子を構成する鎖長. 31から57塩基のデオキシオリゴヌクレオチド(M-1からM-28)杏,ホスホアミダイト法を用いたアプライド･バイオシステムズ社製DNAシンセサイ′ザ-310Aにより合成した｡合成のための試薬および固相カラムは全て同社のものを使用した｡合成終了後,各オリゴヌクレオチドを固相ビーズから切断し,. 56oCで一晩加熱して保護基を除去した｡次にポリアクリルアミドゲル(10%ゲル)によりオリゴヌクレオチド溶液の電気. 泳動を行った｡泳動後,最も鎖長の長いオリゴヌクレオチドをゲルから抽出し,エタノール沈殿によりオリゴヌクレオチドを精製した｡. 主えぇ且∠遣昼三三旦上之些運筆:オリゴヌクレオチドM-2からM-5を各100ng ずつリガーゼ緩衝液(66mMTris-HCl ジチオスレイトール)中で混合し,. (pH 7.5). ,. 6.6mMMgCl2,. 1 mMATP,. 10mM. T4ポリヌクレオチドキナーゼ10ユニットにより各. オリゴヌクレオチドの5'末端をリン酸化した｡この反応液にオリゴヌクレオチドM-1 およびM-6を各100ngずつ加え90oCで5分間加熱した後,室温になるまで2時間かけて放冷し2本鎖DNAを形成した｡これにT4 間の結合反応を行い,ブロックA. DNAリガ-ゼを加え, (5'-OH)を構築した｡このブロックA. 16oCで12時 (5'-OH)の. 5'末端をT4ポリヌクレオチドキナ-ゼを用いてリン酸化することによりブロックA (5'-P)を得た｡同様の手順でブロックB (5'-P)およびブロックC (5しP)を構築した｡次にブロックB(5しP). 4ngおよびブロックC(5'-P). 8ngをT4. DNAリガーゼを用. いて結合し,さらに制限酵素BamHIおよびKpn Iにより切断することによりブロックBC (5'-P)を構築した｡なお,いずれの酵素反応もDNA濃度が10ng/F11となるようにした｡. ミラクリン発現プラスミドの構築 trpプロモータ-およびその下流にtrPL'遺伝子を含む発現用プラスミドpTRP RIおよびBam IFLgを制限酵素Eco HIにより切断した｡得られたDNA断片pTRP. (Eco. RI-Bam. HI)をアガロ-スゲル電気泳動 (0.7%ゲル)により分離した後,ゲルから抽出および精製した｡ PTRP (Eco. BamHI). 100ngにブロックA. (5'-P)香long,ブロックBC. RI-. (5しP)を30ngずつ混.

(3) 13. ミラクリン遺伝子の合成および大腸菌での発現. 合し,. T4. TrpLしミ. DNAリガ-ゼにより各DNA断片の結合反応を行うことにより,. ラクリン融合タンパク質発現プラスミドpTRPMIRを構築した｡次にプラスミド 1 PTRPMIR Iにより切断し,アガロ-スゲル電気泳動(0･7%ゲ pgを制限酵素Cla (Cla I-Cla I)をtrpL'遺伝子と分離ル)により3.6キロ塩基対のDNA断片pMIR (Cla. した｡このpMIR. I-Cla. T4. I)を精製した後,. DNAリガ-ゼにより結合反応. を行うことにより,ミラクリン直接発現プラスミドpMIRを構築した｡ミラクリン融合タンパク質の精製:形質転換菌HBIOl/pTRPMIRを50FLg/mlアンピシリンを含むM9CA培地(1.5%, NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.5%カサミノ酸, チアミン塩酸塩,. Na2HPO4･ 1mM. CaC12) 1000ml中,. 0.1mM. 12H20, MgSO4,. 0.3%. KH2PO4,. 0･05% 0･03mM. 0･2%グルコース,. 37oCで振とう培養を行った｡波長600nm. における菌液の吸光度が0.5に達した時点で20mg/m1. 3-インド-ルアクリル酸を2. ml添加し,さらに16時間培養を行った｡培養後の菌体からNishiらの方法6)により封 NaH2PO4-Na2HPO4, mM 入体を分離した｡この封入体を7 M尿素を含む50 pH6･8緩 G-100ゲルろ過カラムに添加し, 衝液に溶解し,同様の緩衝液で平衡化したSephadex ミラクリン融合タンパク質を精製した｡得られたミラクリン融合タンパク質溶液を0･5 M. NaClを含む50mMリン酸緩衝液に4oCで2日間透析した｡. 1-long/mlのミラクリン融合タンパク質溶ミラクリンの味覚修飾活性の測定: KH2PO4-Na2HPO4 0.5M NaCl) 2･5mlを口に含み3分間味わっ液(50mM pH6.8, た｡その後0.1Mクエン酸1mlを口に含み甘味度を測定した｡甘味度は0･1-0･4Mのショ糖甘味度に換算した｡. 3.結果およぴ考察. ⊥え嘘旦塵墾:ミラクリンのアミ 2に示した｡合成遺ノ酸配列および設計したミラクリン合成遺伝子の塩基配列をFig. 伝子で使用したコドンはE. coliで使用頻度の高いものを選択した｡また合成遺伝子は全体を3個の断片-アミノ末端部分のブロックA,中央部分のブロックBおよびカルポキシル末端部分のブロックC一に分割できるようにし,それぞれのブロックの両末端にはEcoRI,. Kpn. I,. Xba. IおよびBamHIなどの制限酵素部位を導入した｡さらに. 開始コドンATGと終始コドンTAAを遺伝子の前後に配置した｡このようにして設計したミラクリン合成遺伝子を全部で28本の一本鎖オリゴヌクレオチド(M-1-M-28) に分割し,それぞれをDNA合成機(アプライドバイオシステムズ310A)を用いて合成した｡合成したオリゴヌクレオチドを脱保護し,ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した｡精製したオリゴヌクレオチドの5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後,各ブロック単位で二本鎖DNAを構成させた｡次にT4 ょり隣合ったオリゴヌクレオチドを結合させ,遺伝子ブロックA,. DNAリガ-ゼに. BおよびCを構築し. た｡これらの遺伝子ブロックをFig,3に示したように順次酵素的に結合し,ミラクリン合成遺伝子Mirを構築した｡このMirをE. coliのトリプトファンオペロンプロモ-.

(4) 14. 堀内正隆･栗原良枝. 夕-/オペレ一夕一領域(trpD/o)を含む発現プラスミドpTRPのtrDL'遺伝子の下流に結合させることにより,. TrpL'ペプチドーミラクリン融合タンパク質の発現プラスミドpTRPMIRを構築した｡このプラスミドpTRPMIRを制限酵素Cla Iを用いて切断. EcoR=. Het. Val. ATG TAG. GTC CAG. Cla=. aa亡tcatcga亡 gtagcta l. lO. A8p. 8er. Ala. Pro. ABZI. Pro. V&1. Len. A&p. =1e如p. GAC CTG. TCT AGA. GCT CGA. CCA. AAC TTG. CCA GGT. GTC CAG. TTG ARC. GAG CTG. ATT. TAR. GGT. 21. 61y. Qlu. LyB. Len. Arg. ℡hr. 61y. ℡hr. 20 Aさn. GAG. GGT. AAG TTC. TTG AAC. AGA TCT. Ace TGG. GGT CCA. AAC. CCA. GAA CTT. ACT. CTG. TGA. TTG. Len. ℡hz･. Val. Set. Al一℡hr. ℡hr. GでT. 30. ℡yr. Tyr. =1e. V&1. TAC AでG. T良C AでG. AでC でAG. GでC. CCA. 〔AG. GGT. Pro. Aan. Gly. ℡hr. The. CCA GGT. AÅc TTG. Kpn= GGT CCÅ. Ace TGG. Aさp. Arg. Pro. Len. GAC. AGA. CCAでTG. CTG. でCT. GGT. AÅc. A8p. Len. A月n. GAC CTG. TTG AAC. AAC TTG. Pro. V&1. Len. 40. Arg. Aさp. HiさQly. Qly. 61y. GでTでTG. AGA. CAA. AÅc. TCT. GAC CTG. CAC GTG. GGT CCA. GGT CCA. GGででTA且CC CCA AAで. TGG. CAA. TCT AGA. GCT CGA. ACC TGG. ACT TGA. Val. Cyz?. Pro. Pro. 50 Arg. Val. V&1. Gュn. ℡hr. Arg. Ly8. 61u. vll. Aさp. Elさ. TでC AAG. GTT CAA. TGT. CCA GGT. CCT GGA. AGA TCT. GTで CAA. GTT CAA. CA盈 GTT. ACC. AGA. AAG. GAA. GTで. GAT. ACA. TGG. でCT. TでC. CでT. CAA. CTA. CAC GTG. Al&. Phe. Phe. Pro. Glu. Aさn. Pro. Lyさ61Ⅶ. A叩Val. Val. Arg. V&1. 8er. ℡hr. GCT. TTC AAG. TでC AAG. CCA GGT. GAA. CCÅ. CGA. GGT. AAG TTC. GA〔 CでG. GTでGででAGA CA久 CA久. TCでCAA. Zle. A8n. Phe. Set. AIL. phe. Met. Pro. CyさArg. ℡rp. ℡h王･. 5er. Bet. ATC. AAC TTG. TTC AAG. TCT AGA. GCT CGA. TTC AAG. ATG TAC. CCA GGT. TGT ACA. AGA TCT. TGG ACC. Ace TGG. TCT AGA. 41. 61. 60. 70. 80. AÅc CTでででG. 81. GÅA CTT. GででTCT AGA. ACC TGG. ℡hr. Va1. 5er. TCT AGA. Ace TGG. GTT CAA. TCT AGA. OIy. GIy. V&1. Lya. GTT CAA. AAG TTC. 90. TAG. IOl. 100 且ba=. llO. 120. Arg. Letl. ASP. LyJ?. ℡yr. AJ}p. ￠1u. 8er. ℡hr. Gly. Gュn. ℡y=･. The. Val. Thrエ1e. AGA TCT. TTG AAC. GAC CTG. AAG TTC. TAG ATG. GAC CTG. GAA CTT. TCT. ACT TGA. GGT CCA. CAA GTT. TAC ATG. TTC AAG. GTT. Ace TGG. Arc TAG. GGT. CAA. CCA. GGT CCA. 61y. A8Z). Pro. 61y. Pro. ￠1u也rエ1e. Bet. Bet. Trp. Phe. Ly8. =1e. Qlu. Qlu. the. Cyさ￠1y. Ser. GGT CCA. AAC TTG. CCA. GGT CCA. CCA GGT. GAA CTT. TCT. TCT. AAG. AAG TTC. ATT TAA. GAA CTT. GAA CTT. TTC AAG. TGT ACA. TCT. AGA. TGG Ace. TTC. AGA. V&1. CyB. 61y. set. CyJ3. Ly8. Val. LyさCy8. GTT CAA. でGT ACA. GGT CCA. TCT. でGでAAG. GTT. AAG. AGA. Ac九. TTC. CAA. ででC. Arg. Len. All. Len. Ber. A叩LyさPro. TTG AÅc. GCで CGA. TTG AÅc. TCT AGA. GAC CでG. AGA. 121. 130. GGT. Ace TGG. ATC TAG. 140. 141 Gly. Phe. Tyr. Ly8. Len. Val. Phe. cyJ?. Pro. 150 Thr. GGT CCA. でTC AAG. でAC ATG. AAG TTC. TTG AÅc. GTC C且G. で℡C AAG. TGT ACA. CCA GGで. ACC TGG. Aop. Val. Oly. Ilo. ℡yr. =1e. Aろp. Oln. Ly8. 61y. Arg. Arg. GAC. GTT CAA. GTC 〔AG. TAC ATG. AAG でTC. AででGAC TAÅ CTG. CAA GTT. AAG TでC. GGT. CでG. CCA. AGA TGT. AGA AGA TCTでCT. 181 Phe. All. The. Ghl. Phe. ABn. LyさThr. val. 190 ℡yr. phe. でTC AAG. GCT CGA. TTC AAG. GAA CTT. T■TT. AÅc TTG. AAG TTC. GTT. でAC. TでC. CAA. ATG. AAG. 161. GGT CCA. 160 01y TGで Ac九. 170. AAA. ACC でGG. AGA. GGT CCA 180. AAG. CCA. TTC. GGT. StopStop Bam8Z TAA ATT. Fig･. TAR ATT. 2･. g cctag. The. amino. gene. for. acid methionyl. sequence. of. miraculin.. miraculin. and. the. nucleotide. sequnce. of. synthetic.

(5) ミラクリン遺伝子の合成および大腸菌での発現. -. M･ 1 Nl-3 M･5 q■■■■ -■■ -■■ ■■一一1一■一○ M-2 M-4 N[-6. lT4DNA. M-7. NI-9. M･10. Ah･12. 1T4. l. Kp〟. M116. Xbq. 1. M118. M･23. M･20. M-22. M124L. I. kinase. I. T4. M-25. M･26. DNA. kinase. po･yr”c.eotjde HT. C. ligase tLl. Ban. DNA. Nl-28. Bdm. 別ock. I. T4. M127. ligase. I. XbD. a. BJock. Eco. M･21. lT4DNA. T4 Kpn. M･19. )igase. po.ynuc･eotide. Block. M-17. =g==出ニ. 1T4. ”nase. po･ynuc･eotide. M･15. M･14. 1T4DNA. n9aSe. EcoRIモ====己Kpd Block A. Nt-ll M113 q■■■■■■. q-. -. ---M･8. 15. BC. ligase Ban. RI. FI. Mir. Fig.. 3.. Synthesis. of the. gene.. miraculin. CZaI Eco RI. BLZm. EI. Mir. CLa I. Eco. RI. E7.. t'pL' BamFI. Amp'pTRP T4. DNA. 1aI. ljgase. Eco. RI Chz I. 叫⊥` 〝f′ Ban. ⅢI. pTRPM旧. ?; NA. Cta I ligase. 軒. Chz I. Fig･. 4･. Construction. of expression. plasmids. carrylng. Mir. '. Bam. EI. PMIR. the. synthetic. miraculin. gene..

(6) 堀内正隆･栗原良枝. 16. しtrpL'を除去後,残りの断片を再度結合することにより,ミラクリンの直接発現プラ 4)0. スミドpMIRを構築した(Fig.. colt HBIOl株 coliにおけるミラクリンの発現:プラスミドpTRPMIRによりE. 101 /pTRPMIRを得た｡この形質転換菌に3-インの形質転換を行い,形質転換菌HB E.. ドールアクリル酸を添加することによりtrpプロモーターを活性化し,さらに37oCで 16時間培養を行った｡培養後ただちに菌体を破砕し,これに含まれるタンパク質をSDS. -ポリアクリルアミドゲル電気泳動7)七より分析した｡この分析により,形質転換菌HB 101. HB. /pTRPMIRには,. IOl株だけのときには存在しない分子量約28,000の新規タン. パク質が発現していることがわかった(Fig.. 5A)｡また抗ミラクリン抗血清8)を用いて. イムノブロッティングを行ったところ,このタンパク質は強い交差反応性を示した (Fig. 5B)｡したがってこの新規タンパク質は,ミラクリン融合タンパク質であることが明らかになった｡. 次にプラスミドpMIRによりE.. colt. HBIOl株の形質転換を行い,これにより得ら. れた形質転換菌HBIOl/pMIRについて発現実験を行った｡しかしSDS-ポリアクリル. 1 5%. SDS-PAGE. Immunoblot analysIS uslng anti-miraculin antiserum. ￠. Fig.. 5.. Analysュs. Of the. PTRPMIR plasmids TrpL's-miraculin. induced. protein. and PMIR. fusion protein.. in the The. 小. transformants. protein. indicated. containlng. by. an. the arrow. expression represents.

(7) 17. ミラクリン遺伝子の合成および大腸菌での発現. 15%. SDS･PAGE. lmmunoblot. analysIS uslng anti-miracu‖n antjserum. や. 亀 Fig.. 6.. Purification represents. of. TrpL･-miraculin. TrpL'-miraculin. fusion fusion. protein･. The. protein. indicated. by. an. arrow. protein･. アミドゲル電気泳動では,形質転換菌中のタンパク質は菌体のみのタンパク質と比較して変化が見られなかった(Fig. 5A)｡一方,イムノブロッティングによる分析では,読導化後の培養時間が18時間の時にミラクリン抗血清と交差反応性を示す新規タンパク質が微量ではあるが検出された(Fig.. 5B)｡この新規タンパク質は分子量22,000付近. に存在することから,直接発現したミラクリンであることが明らかとなった○. ⊥出過瞳:ミラクリン融合タンパク質の活性を測定するための前段階として,形質転換菌HB. 101/pTRPMIRからミラ. クリン融合タンパク質の精製を行った｡まず形質転換菌をM9CA培地中で37oCで培養し,波長600nmにおける菌液の吸光度が0.5に達した時点で3-インドールアクリル酸を添加した｡その後さらに16時間培養を行いミラクリン融合タンパク質を生産さ NaClを含むリン酸緩衝液に懸濁し,菌体を超音波により破砕せた｡この菌体を0.5M した｡ミラクリン融合タンパク質は菌体内では不溶性のタンパク質として存在していた (ファルマシため, 7M尿素により溶解した｡このタンパク質溶液をSephadexG-100.

(8) 18. 堀内正隆･栗原良枝. ア)によりゲルろ過し,目的のミラクリン融合タンパク質を精製した(Fig. 6)｡このようにして得られたラクリン融合タンパク質を0.5M NaClを含むリン酸緩衝液に透析し味覚修飾活性を測定したところ,この試料には味覚修飾活性は認められなかった｡以上述べたように,. 2種類の発現プラスミドpTRPMIRおよびpMIRによる形質転換菌は,ともにミラクリン抗血清と交差反応性を示すタンパク質を発現した｡しかしその発現量は両者の間で大きく異なっていた｡プラスミドpTRPMIRを用いた場合にはミラクリン融合タンパク質の発現量は多く,. SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後. にクーマシープリリアントブルーで染色するだけで確認することができた｡一方,プラスミドpMIRを用いた場合にはミラクリンの発現は微量であったため,イムノブロッテイングでのみ検出することができた｡ pMIRではSD配列と開始コドンATGとの距離がpTRPMIRより長くなったため,この距離が最適化されているpTRPと同じであるpTRPMIRに比べて著しく発現量が低下したものと考えている｡しかし収量の多かったミラクリン融合タンパク質は菌体内で封入体を形成していた｡封入体になったタンパク質は変性していることが多く,ほとんどの場合は活性を失っている｡ミラクリン融合タンパク質の場合も活性は認められなかった｡一般にシステインを多く含むタンパク質が封入体を形成した場合,これを活性化することは難しい｡今後は活性化条件の検討や分泌発現系についても検討することを考えている｡天然ミラクリンには糖鎖がっいているが,糖鎖がミラクリンの活性に必要であるならば,融合タンパク質,直接発現タンパク質とも大腸菌由来のミラクリンは活性化しない可能性もある｡このような意味からも今後は糖鎖付加能力を有する宿主の検討も必要であると考えている｡. 謝. 辞. 本研究実施にあたり,東燃㈱基礎研究所の長谷川明博士,浦上研一氏および阪本-央氏のご協力を得ました｡心から感謝いたします｡. 参考文献 1) 2). Theerasilp,. (1989). 3). J. Biol. Chem.,. Takahashi, Chem.,. 4). H･,. Igeta,. Yip,. Tamura,. K. T,. Y･,. 1079,. and. Senses,13,. (1988) J.. Nakaya,. Biol.. Chem.,. S･, Nakaya,. 263,. 11536.. K” Nakamura,. Y., and. Y.. Kurihara,. 6655. H･,. Hanazawa,. H.,. Y.,. Arata,. and. Y.. Kurihara. (1990) J.. Biol.. ･Fujita,. K., Nakamura,. Nakaya,. Beidler,. L. M.. (1969) Nature, C., Saito,. Taniguchi,. j.,and U. K. (1970) Nature,. S, Theerasilp, 663｡. Y., and. Kurihara,. Y.. (1991). Biochim.. 303.. T･, Takaoka,. Y･ K” Vilcek,. 7) Laemmli, 8) Nakajo,. Y.. 7793.. Acta,. Kurihara, Nishi,. 264,. N･, Hitotsuya,. 265,. Biophys.. 5) 6). S･ and Kurihara, H･, S” Hitotsuya,. Theerasilp･. S., Nakaya,. T. (1985). 227, K.,. 222,. l176.. A., Matsumoto,. T.,. J. Biochem”. Sato, 97,. M.,. Oka,. T.,. Itoh,. 153.. 680. Nakamura,. Y,. and. Kurihara,. Y.. (1988) Chemical. S,.

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