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細胞の増殖に関する抑制効果

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学位論文

Doctor s Thesis

電位印加によるヒト免疫不全ウイルスの感染と   持続感染細胞の増殖に関する抑制効果

   （ln斜ibitory effect of electrlcal stimulation

on infect i on of hu㎜n i旧mMnodef i G i erlcy v i rus type 1 （H l V−1）

   and growth of chr◎nicalIy HlV−1−infected celis）

熊谷 エツ子 Etsuko Kumagai

指導教員

       原田 信志教授

熊本大学大学院医学教育部博士課程病態制御学専攻感染防御学

2007年度

学位論文

Doctofs Thesis

論文題名： 電位印加によるヒト免疫不全ウイルスの感染と

持続感染細胞の増殖に関する抑制効果

   （Ihhibiな）喧y ef繍ofelectdcal st㎞uk逝on

o臓h痴￠直Gn ofhuman immun（xk癒cie霊1cy vhus 1膿1（HIV4）

  and gmwth ofc㎞）nlcany H夏V−1一蜘ted ceUs）

著者名 熊谷エツ子

Et飢ko Kumagai

指導教員名＝ 熊本大学大学院医学教育部博士課程病態制御学専攻感染防御学

      原田 信志 教授

審査委員名＝ウイルス制御学担当教授 滝口 雅文

微生物学担当教授

赤池孝章

病態制御学担当教授 松下 修三

2007年度

目 次

要旨 一一一一一一一・一 Summary

学位論文の骨格となる関連論文および、その他の論文リスト 謝辞

略語一覧

第1章 研究の背景

第2章 本研究に関する基礎知識

 第1節HIV−1のライフサイクル

  2．後期過程

 第2節 電気化学反応   1．細胞の電極反応

  2。細胞に及ぼす電気効果   3．電極の役割

   1）作用極    2）対極    3）参照極

  4．ポテンションスタットと3電極方式による電位印加  第3節 活性酸素

  1．活性酸素の定義   2．活性酸素の生成   3，活性酸素の消去系    1）抗酸化酵素    2）抗酸化物質

  4。NOによる細胞傷害機構

一  1

  3   5   6   7

10

12 12 12

！2

15 15 15 16 i6 16 17 17 18 18 18 19 20 20 20

第3章 電位印加によるHIV−1持続感染細胞の増殖とHIV4の感染に     関する二三効果 ・・一一一一一・・一一一・一一一一一  第1節 本研究の目的 一一一一一一・・一・・一一一・一一一  第2節 材料ならびに方法 一一一一一一一一一一・一一一   1．細胞 ・．．．＿＿．＿＿一＿＿＿．．＿＿＿・．＿＿＿

  2．ウイルス 一一・一・一一

  3．蛍光プローブ 一一・・一一一一一一一・一一一一一   4．電位印加装置： 一一・一一一一一一・一一一一一   5．銀／塩化銀電極の作製法 一一一一一一一一一一・一一・

  6．細胞傷害の測定法 ・一・一一一一一一一一・一一一   7．細胞増殖の測定法 一一一一一一一一一一・一一・一一

  8．アポトーシス細胞の測定法

  9。HIV−1p24抗原量の測定法 ＿．＿＿＿＿＿＿＿

  10．Multinuclear activation of a galactosidase indicator（MAGI）

    アッセイ 一・一一一一一一・一一・一一一＿

  11．ルシフェラーゼ活性を用いたHIV−1量の測定法 一…・……

  12．フローサイトメータを用いた活性酸素種の測定法  第3節 実験結果

  1．HIV−1持続感染細胞に及ぼす低電：位印加の：影響 一一一一一・

   1）電位印加による細胞傷害 ・一一一一一一・一・一一一

   3）電位印加と細胞増殖との関係 … 一一一一一一・一一

   5）電位印加とHIV−1放出量との関係 ・・一・一一・一一一・・

  2．HIV−1吸着細胞に及ぼす低電位印加の影響 ・一・一・・… 一・

   1）電位印加による細胞傷害 一・一・一一一・一一・   一

   2）電位印加と細胞増殖との関係 ・一一一一一一一一・一

   5）電位印加とアポトーシスとの関係 一一一一一・一一一

22 22 22 22 23 23 24 25 26 26 27 27

28 28 28 30 30 30 31 32 32 33 34 34 35 36 38 40

第4節 考察

 1．HIV4持続感染細胞に及ぼす低電位印加の影響  2．HIV−1吸着細胞に及ぼす低電位印加の影響

第5節 結語

41 41 42 45

参考文献 ⁴⁷

要旨

［自訴］逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤を用いた多剤併用療法の導入に よって、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV4）感染者の発症率ならびに死亡率は劇 的に低下した。しかし多剤併用療法は、薬剤耐性ウ イルスの出現や重篤な副作用 などの多くの課題を抱えている。本研究では、従来の方法とは全く異なる細胞へ の電位印加というアプローチで、HIV−1持続感染細胞の増殖とHIV−1の感染性に 関する抑制効果を調べ、新たなウイルス抑制要因を探った。

［方法］酸化インジウム電極上で培養された細胞に、直流1．O V（vs． Ag／AgCl電極）

の電位を印加した。ウイルス量は田V4p24量およびルシフェラーゼ活性量：で求め た。またウイルス感染細胞はMAGIアッセイで測定した。

［結果］HIV−1持続感染細胞に及ぼす低電位印加の影響を検討した。1．O Vで30 分間印加した場合、HIV−1LAI持続感染P6 HeLa細胞（HIV」1持続感染細胞）と非感 染P6 HeLa細胞（非感染細胞）の傷害率の差が最も著明であり、傷害率はそれぞ れ87％、4％であった。またHIV4持続感染細胞は20分間の印加によって増殖が 著しく抑制されたが、非感染細胞には電位印加の影響はみられなかった。さらに 電位印加によるウイルス放出量の変化は認められなかった。

 次に、HIV−1初感染細胞に及ぼす低電位印加の影響を検討した。細胞とHIV−1 を37℃で2時間インキュベートした場合、ウイルス粒子は細胞表面に吸着してい るか細胞膜と融合しており、細胞内に侵入したウイルスは少ないと思われる。そ こで、HIV−1と2時間インキュベートした細胞をHIV−1吸着細胞と呼ぶ。 HIV−1LAI またはHlv−1 NL43−luc pseudovirus（Hlv−1NL43．1。、）吸着細胞に1．o vの印加を行う

と、HIV−1LAIの感染性は細胞傷害に比べて電位印加の影響を受けた。特に5分間 印加した場合、H：IV・ILAI吸着細胞の傷害率は約1％であるが、 HIV一1LAIと

HIV」1NL43．1。。の感染率はいずれも約40％低下した。 HIV−1NL43．1。。吸着細胞と非吸着

細胞を5分間印加後、強い酸化力を有する活性酸素種（hROS）と一酸化窒素（NO）

の平均蛍光強度（MFI）を生細胞で調べた。その結果、電位印加H：IV4吸着細胞 のhROSとNOのMFIは、未印加HIV−1吸着細胞に比べて有意に増加した。 mV−1

非吸着細胞のhROSおよびNOのMFIも、5分間の印加によってHIV−1吸着細胞

と同レベル増加した。

［考察］ HIV−1持続感染細胞の電位感受性が非感染細胞に比べて著しく高く、電 位印加によって細胞傷害が誘導されることが示された。HIV−1を吸着させた細胞

を用いた急性感染系では、HIV−1吸着細胞が電位印加の直接または間接作用によ って障害され、ウイルスの感染性が低下した。電位印加による細胞膜とウイルス エンベロープの変化がHIV4の感染抑制に作用したと考えられるが、印加によっ て活性酸素種が増加することから、活性酸素種もHIV−1の感染を低下させる要因 の一つであることも否定できない。

［結論］ HIV−1持続感染細胞の電位印加に対する高感受性とHIV−1吸着細胞の電 位印加によるHIV4感染性の低下機構には、細胞膜とウイルスエンベロープの要

因が大きく関与していると考えられる。本研究で得られた知見は、HIV4感染症 の予防法及び治療法の可能性を広げることに寄与すると思われる。

2

       Summary

Objective: Combination anti‑retroviral drug regimens including reverse‑transcriptase inhibitors and pretease inhibitors have dramatically decreased morbidity and mortality rates in human immunodeficiency type 1 virus (HIV‑1) infected individuals. However, it is reported that these combination therapies induce many side effects and have aided the emergence of strains ofresistant HIV‑1. In this study, we examined the inhibitory effect of electrical stimulation on infection of HIV‑･1 and the growth of chronically

HIV‑ 1‑infected cells. I then investigated new inhibition factors of HIV‑1.

Methods: Cells were seeded directly onto indium‑tin oxide electrodes and were then stimulated by a constant d.c. potential of l.O V (vs. Ag/AgCl). The amounts of HIV‑1 in the cell‑free supernatants of chronically HIV‑ILAi‑infected P6 HeLa cells and in acute HIV‑INL43‑iucny‑infected MAGIC‑5 cells were measured using HIV‑1 p24 antigen ELISA and luciferase assays, respectively. Acute HIV‑ILAi and HIV‑‑INL43.iue‑infected MAGIC‑5 celis were measured using multinuclear activation of a gaiactosidase indicator (MAGI) assay.

Results: I examined the efliects of electrical stimulation on ehronically HIV‑1‑infected P6 HeLa cells. The difference in the damage rate was most obvious at a constant d.c.

potential of l.O V for 30 min stimulation; damaged cells were about 87% and 4% of chronically HIV‑ILAi‑infected and uninfected cells, respectively. After the application of the potential for 20 min, the proliferation of the HIV‑ILAi‑infected cells remarkably decreased, while that of uninfected cells did not. No significant difference in the amounts of virus released from the HIV‑ILAi‑infected cells was observed irrespective of the electrical stimulation for 20 min.

  I also examined the efliects of electrical stimulation on acute HIV‑1‑infected MAGIC‑5 cells. When MAGI cells and HIV‑1 were incubated at 37eC for 2 hours, HIV‑1 appeared to be adsorbed at the cell surface or fused in the cell membrane. These cells were designated as HIV‑1‑adsorbed cells. When HIV‑1‑adsorbed cells were stimulated with a constant d.c. potential of 1.0 SvL infectivity was more affected by the electrical stimulation than by cell damage. In particular, after application of a potential at 1.0 V fbr 5 min, about 1% of the HIV‑1LAi‑adsorbed cells were damaged, but the rates of both HIV‑ILAi and HIV‑INL43.iuc infection decreased by about 40%, respectively. After

application of a potential at l.O V for 5 min, the mean fiuorescence intensities (MFIs) of highly reactive oxygen species (hROS) and nitric oxide (NO) in the HIV‑INL43.iuc‑

adsorbed cells were significantly increased compared with those of unstimulated cells.

Discussion: Sensitivity to electrical stimulation was found to be much higher in chronically HIV‑1‑infected than uninfected cells. In acute HIV‑1‑infected cells, it is suggested that HIV‑1‑adsorbed cells are damaged by the direct or indirect effects of electrical stimulation, resulting in decreased HIV‑1‑infectivity. It is considered that the change of the cell membrane and envelope caused by electrical stimulation is connected with the low infectivity of HIV‑‑1‑adsorbed cells. ROS may be an important factor fbr inhibiting HIV‑1 infection, because both hROS and NO were increased by electrical stimulation.

Conclusion: The high susceptibility of chronically HIV‑1‑infected cells to electrical stimulation and the low infectivity of HIV‑l‑adsorbed cells caused by electrical stimulatien appeared connected with factors related to the cell membrane and viral envelope. Data from the present study could provide a basis for deveioping preventive strategies and treatments fbr HIV‑1 infection.

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学位論文の骨格となる関連論文及び、その他の論文リスト

1．関連論文

LTo1ninaga M， Kumagai E， Harada S（2003）E働ct of electrical stimulatlon o鷺田V−1一

  447−450．

2。Kumagai E， Tominaga M， Harada S（2004）Sensitivity of chronically HIV−l infbcted HeLa

3．Tolninaga M， Nagaishi S， Kirihara M， Kumagai E， Harada S， Tanigbchi I（2007）Frequency

  change。induced alternative pGtentia豆wavefbrm dependenGe of membrane damage to cells   cultured on an e藍ectrode surface． J Biotechno1129：498−501

4。Kumaga田， Tominaga M， Nagaishi S， Harada S（2007）Ef〔セct of electric翫l sti鵬ulation on   human immun．odeficie難cy virus type・1 infbctivity． Appl Microbiol Biotechno177：947−953

2．その他の論文

1．Kumagai E， Kumagai T， Tanoue S， Asou N， Yanlaguchi K， Okabe H， Yoshida M，

  Takatsuki K（1988）Clinical study o獄the serum levels of immunosuppressive acidic   protein in patients with adult T−ce11亜eukemia． Acta．Haemat 79＝157−160

2。Kumaga｛E， Tanaka R， Kumagal T， Higaskida Y， Onomichi M， Nakamura I， Tanoue S   Katsuki T， Sawada S（1988）Effbcts of long term low dose radiation−Epste蓋n−Bafr

3。Kumagai E， Tanaka R， Kumagai T， Onomichl M， Sawada S（1990）Ef飴ct of Iong−term   radiation exposure on chromosomal aberrations in radio豆ogical techgologists． J Radiat   Res 31：270−279

4．熊谷エツ子，田中龍＝二，尾道三一，澤田昭三（1991）低線量放射線の人体に及ぼす影   響一診療放射線技師にみられる転座染色体と癌遺伝子存在部位との関連一．臨床病理

  39：639−644

5．熊谷エツ子，宋 薇（2001）唾液によるエイズウイルスの感染抑制．臨床免疫24：

  152−159

謝 辞

 本研究を行うに際して、ご指導ご論罪を賜り、本稿の作製に多大なるご教示を 賜りました熊本大学大学院医学教育部感染防御学原田要理教授に深甚なる感 謝の意を表します。

 本研究を進めるに際して、ご鞭燵を賜りました熊本大学院自然科学研究科 谷口功教授に深く感謝いたします。

 ご指導、ご協力を賜りましたました熊本大学院自然科学研究科冨永昌人助教 に心より感謝いたします。

 ご助言ならびにpCXN−FLenvの恵与を賜りました熊本大学大学院医学教育部 感染防御学 前田洋介准教授に深く感謝いたします。

 P6 He：La細胞ならびにHIV−ILAI持続感染P6 HeLa細胞を恵与していただきまし た元熊本大学大学院医学教育部感染防御学博士課程森園光樹氏に深謝いたしま

す。

 MAGIC−5細胞を恵与していただきました国立感染症研究所エイズ研究セン ター 巽正志博士に深謝いたします。

 励ましとご助言をいただきました遊佐啓介講師をはじめとする熊本大学大学 院医学教育部感染防御学研究室の皆様、ならびに保健学科森信子助教に深く感

謝いたします。

研究者として育てていただきました元熊本大学医療技術短期大学部 澤田昭三 教授ならびに田中龍二助教授に心より感謝いたします。

最後に、常に励まし支えて頂きました家族に心より感謝いたします。

6

AIDS Ag

APF

Arg

ATP MPase

Br Cat Cl

DAF‑FM DA

DMEM

eNOS ESR

Env

FBS

GPX GSH GSSG

GST

HEPES

HIV‑1

HNE

gp120

hROS

IL‑1

iNOS

wasu‑‑ee

acquired immunodeficiency syndrome

argentum (silver) silver chloride

aminophenyl fluorescein arginine

adenosine triphosphate adenosine triphosphatase bromine

catalase chloride

diaminofluorescein‑FM diacetate Dulbecco modified Eagle medium

endothelial nitric oxide synthase electron resonance

envelope

fetal bovine serum group specific antigen glutathione peroxitdase reduced glutathione exidized glutatione glutation S‑transferase

highly active anti‑retroviral therapy

N‑2‑hydroxyethlpiperazine‑N'‑2'‑ethanesulfbnic acid human irnmunodeficiency virus type 1

4‑hydroxy‑2‑nonenal glycoprotein 120

highly reactive oxygen species

interleukin‑ 1

inducible nitric oxide synthase indium‑tin oxide

LPS

LTR

MAGI

MDA

MetHb MFI

MPO NADH NADPH

Nef Neuro D2

NF‑ rc B

nNOS

NO

I02 02‑

"OC1

'OH

ONOO

8‑oxodG PIC Pol Pt

Rev

RRE RLU

ROS

'I:AR

lipopolysaccharide long terminal repeat

multinuciear activation of a galactosidase indicator malenyl‑dia!dehyde

methemoglobin

mean fluorescence intensity myeloperoxidase

reduced nicotinamide adenine dinucleotide

reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate negative factor

neuronal D2

nuclear factor kappa B

neuronal nitric oxide synthase nitric oxide

nitric oxide synthase singlet oxygen superoxide hypochloride hydroxyl radical peroxymtrlte

8‑hydroxydeoxyguanosine

pre･dintegration complex

polymerase platinum

regulator of expression of virion protein Rev responsive element

relative light unit

8

TNF

Vpr

Vpu

vs

tumer necrosis factor

TdT‑mediated dUTP nick end labeling viral protein R

viral protein U versus

第1章 研究の背景

 後天性免疫不全症候群（acquired immu鍛odeHciency syndrome：AIDS）症例が1981 年に初めて報告され1）2）、その原因ウイルスとしてヒト免疫不全ウイルス（human i搬mu貧odeficiency virus＝HIV）が1983年に同定された3）。以後、 HIVの感染者が 増加し続け、2005年には世界のHIV感染者は約3，800万人、 HIV新規感染者は 410万人、AIDSによる死亡者は280万人に達すると推定されている4）。また日本

における2005年のHIV新規感染者は832人（日本国籍741人）であり、AIDS発

を除く）5）。HIVは細胞性免疫能を低下させ、その結果、種々の日和見感染や悪 性リンパ腫を引き起こす1）2）6）7）。1990年代後半に開発された逆転写酵素阻害剤や プロテアーゼ阻害剤を用いた多剤併用療法（highly active anti−retroviral therapy；

HAART）の導入によって、 AIDSの発症率および死亡率が急速に低下した8） lo）。

しかし多剤併用療法は、耐性ウイルスの出現や重篤な副作用、服用の複雑さなど、

さまざまの問題を抱えているi1）曲13）。 AIDSの根治療法やワクチンが確立されてい ない現状においては、全く新しい原理に基づいた治療法の開発も有用であると思

われる。

 多くの生体反応は基本的には酵素が触媒として働く反応と考えられている14）。

酵素反応は電極上で生じる電気化学反応と多くの類似点がある15）。例えば、細胞 膜に存在する酵素の反応は電極反応と同じように不均一界面での反応であること、

細胞膜・電極いずれも電荷を持っていることなどが類似している。

 実際に、生きた細胞に及ぼす電位印加の影響が1970年代から広範囲に研究され 始めた。例えば、直流高電圧パルス印加による膜構造および透過性の変化16）、細 胞膜の傷害16）17）、細胞の融合18）19）、およびミトコンドリアでのATP合成20）が観 察されている。また低電位印加による細胞膜の傷害21）、細胞膜流動性の低下22）、

細胞の形態変化23）、細胞増殖速度の制御22）24）、蛋白産生25）、神経成長因子の活性 化26）、遺伝子発現27）28）、神経や骨の分化28）29）が観察されている。さらに低電位印 加とcisplatinとの併用により、細胞死が誘導されている30）。このように、電極上

に培養した細胞を電位印加することにより、細胞の機能を人為的に制御できるこ とが明らかにされつつある。

 これまでに、直流印加によって細胞膜の流動性が低下するという報告22）と、低 温下で細胞膜の流動性が低下しHIV−1感染が抑制されるという報告31）はあるが、

10

電位印加によるHIV感染細胞ならびにウイルスへの影響を調べた報告はない。た だ特許の中には、電気的エネルギーを用いたHIV感染症の治療方法がいくつか提 案されている32）33）。しかし、これらの方法はいずれも遊離ウイルスのみを不活化 する方法およびそれに用いる装置に関する発明であり、HIV感染細胞の傷害なら びに細胞内ウイルスの不活化に関する知見は何も記載されていない。本研究では、

従来の方法とは全く異なる細胞への電位印加というアプローチで、HIV・1持続感 染細胞の増殖抑制とHIV・1の感染抑制に関する基礎研究を行い、新たなウイルス 抑制要因を探った。

第2章 本研究に関する基礎知識

 HIV−1持続感染細胞に及ぼす電位印加の影響についての研究は、 HIV・1ライフ サイクルの後期過程への電位印加の作用を調べたものである。一方、HIV」1吸着 細胞に及ぼす電位印加の影響についての研究は、前期過程への電位印加の作用を 調べたものである。そこでHI早1のライフサイクルについて概説するとともに

34）66）、その模；式図（Fig．1）を示す。

1．前期過程

 ウイルス感染は宿主細胞表面へのウイルスの吸着によって開始する。HIV・1の 場合、HIV−1 gp120が細胞表面のCD4とケモカインレセプター（CXCR4、 CCR5）

に吸着後、細胞内に侵入する。脱殻したHIV−1はウイルス自身の逆転写酵素を用

いてHIV−RNAゲノムをDNAに変換する。二重鎖DNAになったプロウイルスは

（PIC）として核内に移動する。二本鎖線状のプロウイルスDNAは両端にlong terminal repeat（LTR）を持っているが、二本鎖DNAの3 端より2〜3塩基がイン テグラ佃町によって切り取られる。PICとともに核内に入ったインチダラーゼは 染色体のDNAを5 端が突出する形で切り込む。プロウイルスの3 端と染色体の DNAを5 端が細胞のDNAリガーゼによって結合し、プロウイルスの染色体DNA への組み込みが完成する。ここまでが前期過程といわれている。

2．後期過程

 後期過程とは、一般に宿主染色体に組み込まれたウイルスゲノム（プロウイル ス）から遺伝子発現が起こり、ウイルス粒子が宿主細胞から放出されるまでの過

程を言う。

 染色体DNAに組み込まれたプロウイルスはU3−R−U5配列のLTRを両端に持つ。

このうちのU3−R領域が転写のためのプロモーター活性に必須である。ウイルス

メッセンジャーRNA（mRNA）は5 側のLTRのU3とRの境界から転写され、 R の最初の塩基にmRNAキャップがつき、3 側のLTRのRの最後の塩基にポリA

董2

協同的に作用してウイルスmR：NAの転写量と感染細胞から産生されるウイルス 量を決定する。R領域の5 側にはウイルス固有の転写活性因子であるTatが結合 するtransactivation responsive（TAR）エレメントが存在する。これらの結合配列 の多くは、各HIWクローンで異なるが、TATAボックス周辺の中央領域（LEFITCF、

：N F・κBとSp1の結合部位、 TAR）は非常によく保存される。

 宿主転写活性化因子のうちNF一κBは、細胞外からの種々のシグナルによって 活性化し、細胞内に潜伏感染しているプロウイルスの転写の引き金を引く働きを する。：NF一κB活性化因子として、腫瘍壊死因子（TNF）、リンフォトキシン、イ

ンターロイキンー1（IL−1）などの炎症・免疫応答に関わるサイトカイン、活性化 酸素およびある種：の細菌に由来するリボ他県体（1ipopolysaccharide；LPS）などが 知られている。

 レトロウイルスは元来約9，000塩基からなる一本鎖プラス鎖RNAであるが、転 写されたRNAには多数のスプライスドナー・アクセプターが存在しており、発 現初期には核内でスプライスを受ける。HIV−1の場合、完全にスプライスされた 2，000塩基強のサブゲノムmRNAのみが輸送され、このInRNAから調節遺伝子で

あるTat、 Rev、 Nefが翻訳される。Tat、 Revは核移行・核外移行シグナルを持ち、

核内外を行き来する能力を持っている。Tatは核内でTARと特異的に相互作用し、

転写進行中のRNAの安定化と転写活性の上昇を喚起してウイルスR．NA生産を増 幅させる。RevはウイルスEnv遺伝子内に位置するRev responsive element（R：RE）

と特異的に結合する。RREは通常のスプライシングではイントロンとして削除さ れてしまう領域内に位置するが、RREを介してRevと結合した非スプライシング

（完全長〉または不完全にスプライシングされたウイルスRNAはスプライシン グを逃れて、Revの核外移行シグナルと相互するCRM 1／Exportin 1の核外輸送系に 乗って細胞質へ運ばれ、翻訳を受ける。

 不完全にスプライスされた約5，000塩基長のサブゲノムmRNAから、構造蛋白 であるエンベロープ（Env）や、調節蛋白であるVpu、 Vif、 Vprが翻訳される。

Envは約160kDaの前駆体として発現し、：ゴルジーERの輸送経路を通じて各種の修 飾を受け細胞膜まで輸送され、糖蛋白質として細胞表面に発現する。このときEnv は宿主細胞のプロテアーゼにより切断されて、膜貫通蛋白質（9P41）とそれに非 共有的に結合している細胞外蛋白質の複合体が三量体となっている。

 約9，000塩基の完全長ウイルスRNAは、ウイルスのGag蛋白と、三種類の酵素 をコードするPo1蛋白のmR：NAであると同時に、ウイルス粒子にパッケージング

されるゲノムR：NA本体でもある。55kDaのGag前駆体蛋白と、Gag翻訳中のリ ボソーマルフレームシフトにより発現される160kDaのGag−Po豆前駆体融合蛋白 は、細胞内で集合し、ゲノムRNAを取り込みながら細胞膜直下で球状に粒子を 形成しつつ出芽し、細胞外に放出される。このとき出芽部分の細胞の形質膜がウ イルス膜となり、Env蛋白もウイルスに取り込まれウイルス表面に存在すること になる。ウイルス粒子放出と同時か直後にGag−Po1蛋自中のプロテアーゼが活性 化し、GagとGag−Po1前駆体蛋白を切断して、初めて感染性をもったウイルス粒 子となる。これをウイルスの成熟という。このような一連の過程を経て、感染能

を持つ成熟粒子が産生される。

癒、

 吸着

〆

〈前期過程〉     〈後期過程〉

       ：        …        ：

   プロウィルス1

φ  》

み込

〜

〜 mRN

〜

    転菟

階窒＼阜

訳

      ●Gag／Po畢

E。．，1。二・ 。●．へ●

  ∴●

↓

燃成熟

／出芽

×

 ●  ●

●  ● ●

 ●  ●

Fig．1． HIV4のライフサイクル（岡本の図35）を改変）

14

第2節 電気化学反応

 本稿では、細胞に及ぼす電気効果およびHI塾1の増殖抑制に用いた電極などに ついて概説する。

1．細胞の電極反応

 細胞に電位印加した場合、細胞と電極の相互作用は電場の影響と、細胞の直接 または間接の電極反応に大別される37）。電場の影響には、細胞の泳動、電極への 吸脱着、膜透過性の変化、ATPaseの活性化、 InRNAおよび蛋白質の合成誘導など がある。一方、細胞の電極反応には、細胞の直接電極反応、放出された細胞内物 質の電極反応、電極反応生成物と細胞の相互作用などがある。

2．細胞に及ぼす電気効果

 細胞に及ぼす電気効果は、次の3つに大別される37）。各電位効果の模式図を

Fig．2に示す。

 ①細胞への誘電効果＝導電性の低い溶液中の細胞に高周波電界を印加すると、

細胞が荷電分極し、連珠現象を起こす。さらにもっと大きな高周波電界を印加す ると、細胞融合が起きる。この現象を利用した細胞融合装置や細胞内に物質を導 入するエレクトロポレーション装置が実用化されている。

 ②細胞表面または溶液中の物質が電極表面で電気化学反応をすることによっ て、細胞機能に影響が及ぶ電気効果：この効果は、細胞の殺傷に利用されている。

 ③電極表面に接触した細胞に認められる電気効果であり、電極表面での電気 化学反応をほとんど伴わない電気効果：電極表面で培養した細胞に電位をかける

ことによって、電位効果が誘導される。この効果は細胞の増殖、遺伝子発現、分 化などに顕著に現れるので、細胞機能の制御に利用されている。

 本研究では、③の効果を用いてHIV4持続感染細胞の増殖とHIV−1の感染に関 する抑制効果を調べた。

電極

一§

十十十十十  電極

   酸化還元物質

ぴ

①誘電効果

電極 e繍

②細胞表面物質の  電気化学反応

   電極

③細胞表面の  電気効果

Fig．2．細胞に及ぼす種々の電気効果（松永の図37）を改変）

3．電極の役割

 細胞への電位印加には、下記の作用極、対極および参照極を用いる38）。

1）作用極

 作用極は、電極を構成する材料自体が反応するもの（電池の電解質や電解溶液 など）と、電極自体は変化することなく被検材料の電気特性を調べるための電気 化学反応の場として機能するもの（金、白金などの貴金属電極および炭素電極な ど）に大別される。電気化学反応の場として機能する作用極には、①高い伝導性 を持つ②使用電位範囲での耐食性がある③化学的に安定で他のイオンと錯 形成しない④電極自身の溶解や酸化皮膜の生成がおこりにくい⑤用いる溶 液の分解をなるべく起こしにくいなどが求められる。

 本研究には、厚さ1mmの透明なガラスの片面に錫ドープ酸化インジウム

（indium−tin ox韮de：ITO， Kinoene Optics， Japan）を蒸着した電極（ITO電：極）を用

いた39）40）

2）対極

 対極とは、ある電位に設定した作用極に電位が支障なく流れるようにする電極 である。対極には、①抵抗が小さい②分極しにくい③自身が反応しないな

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どが求められ、通常、金や白金が用いられている。本研究には、白金線または白 金板を用いた。

3）参照極

 参照極とは、作用極における電位測定の基準となる電位を定める電極である。

参照極の条件として、測定中に外的な因子による電位変動があまり起こらないこ とが求められる。一般に、飽湘カロメル電極、銀／塩化銀（Ag／AgCl）電極が用い られている。本研究には、Ag／AgCl電極を用いた。

4．ポテンションスタットと3電極方式による電位印加

 電極反応は電極と電解液の界面で起きるので、参照極で電解液層の電位を検出 できれば、参照極と作用極間の電位を測定したことになる。作用極と対極間には 電流が流れるが、作用極と参照極間には電流がほとんど流れない。参照極に対す

る作用極の電位と、作用極に流れる電流を測定することにより、作用極の反応に 関わる情報を知ることができる4D。

 作用極の電位を参照極に対してある電位に設定しても、電極反応の進行に伴っ て作用極表面における反応種の濃度が減少し、生成物の濃度が増加するので、作 用極の電位は変動する。作用極の参照極に対する電位を初めに設定した電位に保 つために、本研究では定電位電解装置（ポテンショスタット）を用いた。ポテン ショスタットと3電極の模式図をFig．3に示す。

←・

d流 ^e →

V

A

参照極

対極

作用極 e

Fig．3．ポテンショスタットと3電極の模式図

第3節 活性酸素

 HIV−1吸着細胞に及ぼす電位印加の影響についての研究は、 HIV」1感染性と活 性酸素との関係について言及している。そこで活性酸素について概説するととも に活性酸素の生成から消去過程の模；式図（Fig．4）を示す。

 われわれが呼吸により取り入れている酸素の85％以上はミト灘ンドリアの電 子伝達系で酸化され、水まで還元される。ミクロソームの電子伝達系では水酸化 反応によって水酸化される。しかし呼吸により取り入れている酸素の1〜5％は、

これらの系から漏れ出て、水や水酸化物まで還元されない中間体（活性酸素種）

となる42）。また活性酸素種は、日常生活の様々な場面（喫煙43）、老化44）45）、紫外 線46）、大気汚染47）等）で体内に発生している。一方、生体は生成された活性酸素 種を消去する酵素ならびに低分子化合物を持っているので、活性酸素種の生成と 消去のバランスが保たれている。これらの経路が何らかの原因で活性化されるか、

あるいは消去系が不活化されると、活性酸素種が過剰に生成され、生体は酸化的 障害を受ける42）46）鋤。また活性酸素種は、老化45）、アポトーシス50）51）、シグナ ル伝達機構にレドックス制御（酸化還元制御）を介して関わっている42）52）53）。

1．活性酸素種の定義

 活性酸素種とは、通常の酸素分子よりも活性化された状態の酸素分子とその関 連物質のことである54）。広義の活性酸素種には、酸素を含む反応性の高い化合物 すべてが含まれる。一方、狭義の活性酸素種は、スーパーオキシド （02）、過酸 化水素（H202）、ヒドロキシラジカル（●OH）、一重項酸素（102）、次亜塩素酸イ オンCOCI）に限定されている55）56）。本研究では、狭義の活性酸素種にパーオキ シナイトライト（0：NOO）および一酸化窒素（：NO）などの窒素化合物を含めた ものを活性酸素種とした。

2．活性酸素種の生成42）54）56）

 活性酸素種は、ミクロソーム、ペルオキシソーム、細胞質、ミトロンドリアで 生成されるが、その約15％がミトコンドリアで生成される。

 02はキサンチン酸化酵素により酵素的にも生成されるが、ミトコンドリアや 小胞体などの電子伝達系でも生成される。特にミトコンドリアの電子伝達系では、

末端に位置するシトクロム6酸化酵素が酸素に非常に強い親和性をもち、細胞内

18

の90％以上の酸素分子をここで有効に利用し、活性酸素種の生成を抑えている。

しかし、生理的条件で1〜5％の酸素分子は活性酸素としてミトコンドリアから漏 出する。ミトコンドリア遺伝子の異常や老化によって02の漏出が増加し、ミト コンドリアDNAが傷害される。 DNAの酸化的障害マーカーには、8一ヒドロキシ デオキシグアノシン（8−oxodG）がある。また02は、シトクロムP450、シクロオ キシゲナーゼ、リポキシゲナ一助などからも生成される。さらに02は、白血球、

マクロファージに存在するNADPH：酸化酵素（reduced nicotinamide ade益ine dinudeotide phosphate；NADPH）から生成される。02は過酸化物分子変換酵素

（superoxide di揃utase；SOD）または非酵素の作用でH202に変わり、ミエロベ ルオキシダーゼ（MPO）によりハロゲンイオン（Cl、Br、1など）と反応して次 亜塩素酸（HOCDとなる。

 限月素的には、メナジオン、パラロートなどの薬物により02が生成される。

また、抗がん剤のアドリアマイシンやブレオマイシンなども02一を生成する。ま た老化、糖尿病などでみられる非酵素的な糖付加反応（メイラード反応）により、

還元糖とタンパク質からシッフ塩基、アマドリ化合物が生成された後、遷移金属 存在下または非存在下で02が生成される。02は細菌の殺菌に寄与する。

  OHは、 Y線、 X線、紫外線などによる水の放射分解で生じるが、銅、鉄など の遷移金属の存在下でも生成する。

 ℃2は、ビリルビン、ヘム（ポルフィリン）、リボフラビンなどから光照射によ

って生じる。

 NOは、L一アルギニン（Arg）と分子状酸素からNO合成酵素（NO synthase；NOS）

によって生成される。NOは分子量が小さく脂溶性なため、細胞膜を自由に通過 し、標的分子に直接作用する。NOSは、神経型NOS（neuronal NOS；nNOS）、誘 導型NOS（inducible NOS；iNOS）および内皮型NOS（endotheHal：NOS；eNOS）に 大別される。iNosによって、マクロファージ、好中球、肝細胞、血管平滑筋細 胞などから生成されたNOは、抗菌作用、抗ウイルス作用および抗腫瘍作用など

を示す。NOと02からONOOが、さらにペルオキシ亜硝酸（ONOOH）が生成さ

れる。

3．活性酸素種の消去系

活性酸素種は、下記の抗酸化酵素と抗酸化物質によって消去される42）54＞。

1）抗酸化酵素

 抗酸化酵素には、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPX）、カタラーゼ（Cat）

などがある。

 哺乳動物のSODには3種類のアイソザイムがある。Mn−SODはミトコンドリア マトリックスに存在する誘導性の酵素であり、Cu−SODとZn・SODは細胞質に存 在する酵素である。また細胞外SODは分泌性の酵素で、ヘパリン結合ドメインを

もつ糖タンパク質である。

 GPXには、細胞質型、リン脂質型、消化管型、血漿型の4種類のアイソザイム

がある。GPXのリン脂質型は19kDaの単量体であるが、他はすべて22kDaの

 Catはベルオキ・シソームに存在する。その他に、グルタチオンS一トランスフェ ラーゼ（GST）、チオレドキシン、ペルオキシレドキシンなどの消去系がある。

2）抗酸化物質

 低分子化合物の抗酸化物質として、グルタチオン、アスコルビン酸、トコフェ ロール（ビタミンE）、ハ乙アセチルシステインなどがある。

4．NOによる細胞障害機構

 NOによる細胞死のメカニズムについては十分に解明されておらず、標的物質 は明らかでない。現在、NO毒性は、ミトコンドリアでの代謝障害57）やDNA障害

／p53経路58）を介して起こると考えられている。：NOは、鉄一硫黄クラスターを含む 酵素と容易に反応するが、このような酵素にはミトコンドリアNADH一ユビキノン 酸化還元酵素やNADH一コハク酸酸化還元酵素がある。：NOは、両酵素を阻害し、

酸化的リン酸化を抑制する59）。また：NOは、他の鉄一硫黄クラスターを含む酵素で あるcis一アコニターゼを阻害し、解糖系を抑制する。 NOは、チトクローム酸化酵 素において酸素と競合することでミトコンドリアの呼吸を可逆的に抑制する60）。

NOによる細胞死惹起にはこのようなミトコンドリア酵素の障害が関与するとい

われている。

20

虚血＼

薬物→ 炎症ノ「

Arg→

囎

 』

麟

NQガ＋go＋

Fig．4．活性酸素の生体傷害（谷口の図54）を改変）

第3章 電位印加によるH互V4持続感染細胞の増殖と

     HIV−1の感染に関する抑制効果

第1節 本研究の目的

 HIV−1持続感染細胞に及ぼす低電位印加の影響を明らかにするために、HIV−ILAI 持続感染P6 HeLa細胞と非感染P6 HeLa細胞61）を直流1．O V（vs． Ag／AgC1電：極）

で一定時間印加後、細胞形態、細胞傷害、細胞増殖、アポトーシス細胞およびHIV−1 放出量を測定した。次に、HIV−1初感染細胞に及ぼす低電位印加の影響を明らか にするために、HIV−1吸着MAGIC−5細胞を直流1．O Vで印加後、 HIV−1の感染が 成立した細胞を解析した。またしO V印加H：IV−1吸着MAGIC−5細胞について、強 い酸化力を有する活性酸素種（highly Ros：hRos）および一酸化窒素（No）の増 加の有無を調べ、HIV−1感染性との関連を考察した。なお、細胞とHIV−1を37℃

で2時問インキュベートした場合、ウイルス粒子は細胞表面に吸着しているか細 胞膜と融合しており、細胞内に侵入したウイルスは少ないと思われる。そこで、

HIV−1と2時間インキュベートした細胞をHIV吸着細胞と呼ぶ。

第2節 材料ならびに方法

1。細胞

 HeLa細胞からクローニングされたP6 H：eLa細胞とHIVILAI持続感染P6 HeLa細 胞は、1001U／m1ペニシリン、0．1mg／mlストレプトマイシン、10％熱不活化牛胎 児血清（FBs）（Gibco）を添加したRPMI−1640培養液で継代培養した。 MAGIc・5

（CCR5 expressing HeLa−CD4／long重erminal repeat一β一galactosidase cell line）細胞62）

は、10％熱不活化FBS、2mM L一グルタミン、1001U／mlハイグロマイシンB、0．05 mg／mlゼオマイシン、1001U／mlペニシリンおよび0．I mg／m1ストレプトマイシン

を添加したDulbecco lnodiHed Eagle培地（DMEM）（ICN， Costa Mesa， CA）で継代培 養した。

 ウイルスを得るためのHIV−1LA互持続感染MOLT−4細胞63）と293T細胞は、それ ぞれRPMI−1640培地（Gibco）およびDMEM培地で継代培養した。これらの培地に は、10％熱不活化FBS、1001U／m1ペニシリンおよび0．1 mg／mlストレプトマイ

22

シンを添加した。

2．ウイルス

 LAIウイルスにはHIV−1LA互持続感染MOLT・4細胞の培養上清を用いた。NL43・1uc pseudovirus（HIV4にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ：NL43−luc pseudovirus）

は、リン酸カルシウム法で作成した64）。つまり293T細胞にルシフェラーゼ遺伝 子を持つエンベロープ欠損：NL4−3プラスミド（pNL43−1uc）とJR−FL由来のエン ベロープ糖蛋白発現ベクターであるpCXN−FLenvをトランスフェクトし、その培 養上清をNL434uc pseudovirusとして用いた。

 各細胞の培養上清を0，45μmブイルターで濾過後、小試験管に分注し、使用ま

で一80。Cに保存した。

3．蛍光プローブ

 H202以外の活性酸素種（ROS）は寿命が短いために、直i接的な測定が不可能で

ある。そこで02一やOHなどのROSは、分光法、化学発光法、電子スピン共鳴

（electron resonance；ESR）法などにより間接的に測定されている68）。これらの方 法を用いた場合、ITO電極上で培養した細胞数では少なすぎて、 ROSを測定する ことができない。今回、生きた細胞の活性酸素種を測定する蛍光プローブに着目 し、その中から強い酸化力を有する活性酸素種（hROS：．OH， ONOO，OC董など）

と一酸化窒素（NO）に対する蛍光プローブを用いた。

 hROSと：NOの測定には、それぞれアミノフェニルーフルオレセイン（APF：

C26H17NO5）試薬69）とジアミノフルオレセインーFMジアセテート（DAF−FM DA：

C25H18F2N207）試薬70）（第一化学）を用いた。 APFはフルオレセインとベンゼン 環の一NHが一〇一で結合しているが、hROSと反応すると速やかに一〇一部分が切れてフ ルオレセインになり、490nmで励起すると波長5董5 nmの緑色の蛍光を発する。

DAF−FM DAは細胞膜を透過し、細胞内のエステラーゼにより加水分解され、細 胞膜を透過しにくいDAF−FMになる。 DAF−FM基のアミノ基がNOと速やかに反 応し、500nmで励起すると波長515nmの緑色の蛍光を発する。

4．電位印加装置

 細胞への電位印加にはポテンショスタット（PS−06， Toho Technical Research，

Japan）ならびに作用極、対極、参照極の3電極を用いた。作用極として、酸化イ

ンジウム（indium−tin oxide；ITO）電極を用いた64）65）。 ITO電極は表面をコンタミ

ノンN溶液中で超音波処理した後、純水で十分にすすぎ、オートクレーブで121℃

2気圧20分間滅菌した。細胞培養シャーレ（60×60mm）の底に置いた約3×3c1n のITO電極上に、 HIWLAI持続感染P6 HeLa細胞と非感染P6 HeLa細胞を播き

（Fig．5）、電位印加を行った。 Fig5のITo電極を用いてMAGIc−5細胞にHIv−1 を感染させるためには、多量のウイルス液が必要である。また活性酸素種の測定 に必要な細胞数が得られない。そこで、ITO板を約5×5cm四方の大きさに切り、

超音波洗浄して表面の有機物を除去後、ガラスリング（内径36mm、高さ15min）

を接着し、乾燥させたものをITO電極（ITOディシュ）として用いた（Fig．6）。

対極として白金線または白金板電極を、参照極として銀／塩化銀（Ag／AgCl）電極 を用いた。白金線および白金板は、電位印加を行う前にガスバーナーで赤熱処理

を行った。

参照極 Ag／AgCl

作用極    対極

置TO板

 Pt線

      細胞

筐≡≡即興鱒繋ジウム

Fig．5。 Schematic diagram of the electrical stimulation system． HIV−1LAI inf矯cted and uninfbcted P6 HeLa cells were cultured on the surface of an ITO working electrode．

Potential was applied using a three−electrode system， consistiロg of the ITO electrode， a counter electrode（platinum wire electrode）， and a refbrence electrode（Ag／AgCl electrode）． The potential of the working electrode was maintained at a constant voltage．

All pote皿tials were reported with respect to the Ag／AgCl reference electrode．

24

参照極 Ag／AgCl

作用極 ITO板

対極

         細胞

豊（馨鍮ジウム

Fig．6． Schematic diagraln of the electrical stimulation system． HIV4 LAI absorbed and unabsorbed MAGIC−5 cells were cultured on the surface of an ITO working electrode．

Potential was applied using a tree−electrode system， consistiRg ofthe ITO electrode as a

working electrode， a counter electrode（platinum electrode）， and a reference electrode

（Ag／Agαelectrode）．

5．銀／塩化銀電極の作製法

下記に示す方法で、銀／塩化銀電極を作製した。

①ガラス管を約6cmに切り、片側に白金（Pt）線を差し込み、ガスバーナー   で焼き、ガラス管に白金線を封印した。

②①のガラス管に飽和KCI溶液を充填した。

③約2cmの銀（Ag）線の片側1cmを紙やすりで表面研磨後、研磨部分を塩酸   （3分の1希釈）につけ、＋1．2Vの電位を印加することで、その表面を塩化   銀にした。

④②の片方に③の塩化銀部分を差し込み、パラフィルムで固定した。

 ④の電位を標準カロメル電極（飽和KC1）と比較し一40〜一45 mVの差であ ることを確認後、実験に用いた。なお、銀部分を電源につなぎ、白金部分を培 養液中につけて使用した。

銀／塩化銀（Ag／Agc1）電極の模式図をFig．7に示す。

Z 飽タKCI Aニ

AgCl

Fig．7． Schelnatic illustration of Ag／AgCl electrode

6．細胞傷害の測定法

 HIW LAI持続感染P6 HeLa細胞およびP6 HeLa細胞（12×105個）をITO電極 上に播き、37℃の5％CO2インキュベータで3日間培養後、直流1．OVを一定時間 印加した。電位印加した細胞を、ITO電極上で0．4％トリパンブルー液にて5分間 染色した。ダルベッコPBS（PH7．2）で洗浄後、倒立顕微鏡にて写真撮影した。

細胞を写真上で1，000個以上算定し、染色した細胞を総細胞数で割って、傷害率

を求めた。

 一方、急性感染系では、MAGIC−5細胞をITOディシュ上に60×104個播き、

37℃の5％CO2インキ・ユベータで1日間培養した。培養上清を除き、細胞にHIV−1LAI を2ml加えて、37。Cで2時間インキュベートした。ウイルス液を除去後、培養 液91nlを加え、細胞に直流1．O V（vs． Ag／AgCl）を一定時間印加した。 ITOディ

シュ上でトリパンブルー染色を行った後、細胞を光学顕微鏡野で1，000個以上算 定し、傷害率を求めた。

7．細胞増殖の測定法

 HIV・ILAI持続感染P6 HeLa細胞およびP6 HeL＆細胞をITO電極上に12×105個 播き、直流1．O Vを印加した。電位印加した細胞を0．25％トリプシンでITO電極 から剥離した。細胞の一部を0．4％トリパンブルー液で染色後、光学顕微鏡下で 細胞数を算定した。残りの細胞（1×104個）を24ウェルプレートの3ウェルに それぞれ播き、37℃のCO2インキュベータで3日または6日間培養した。培養3

日目、6日目に細胞を0．25％トリプシンで剥がし、0．4％トリパンブルー液で染色 後、光学顕微鏡下で細胞数を算定した。なお、細胞を6日間培養する場合には、4

日目に培養液を交換した。

26

 一方、急性感染系では、MAGIC−5細胞（15×104個／3 ml）を9個のITOディシ ュ上に播き37℃で1日間培養した。mV−1LAI感染前のMAGIC−5細胞にCCK試薬

（CeU Counting Kit：CCK， DOJrNDO， Japan）300μ1を加えて37℃で30分間反応さ

せた後、上清100μ1を96穴ウェルプレートの3穴に移し、直ちにマイクロプレ ートリーダーで測定した。測定には測定波長450回目、参照波長620 nmを使用し た。残りのITOディシュの4個にH：IV−1LAIを感染させた。細胞へのHIV−1LAI感 染ならびに電位印加は、後述のMAGIアッセイで述べる方法に従って行った。1．O V印加または未印加細胞を2日間培養後、前述した方法で各細胞にCCK試薬を加

えてインキュベートし、吸光度を測定した。

8．アポトーシス細胞の測定法

 HIV−1LAI持続感染P6 HeLa細胞およびP6 HeLa細胞を各ITO電極上に12×105 個播き、37℃の5％CO2インキュベータで3日間培養した。直流1．OVを印加した 後、0．25％トリプシンで両細胞をITO電極表面から剥がし、4％中性ホルマリン緩 衝液で10分間固定した。アポトーシス細胞をアポトーシス η5 吻検出キット（和 光純薬工業株）を用いて調べた。

 MAGIC−5細胞を各ITOディシュ上に60×104個播き37℃で1日間培養後、37。C で2時間mV−ILAIを感染させた。HIV−ILAI吸着MAGIC−5細胞とMAGIC−5細胞を 1．OVで印加後、4％中性ホルマリン緩衝液で10分間固定し、上記のキットを用 いてアポトーシス細胞を測定した。なお本実験では、細胞をITOディシュ表面か

ら剥がさないで、すべての操作をITOディシュ上で行った。

 光学顕微鏡下で1，000個以上の細胞を算定して、アポトーシス細胞の比率を求 めた。本測定法はTdT・med三ated dUTP nick end labeling method（TUNEL法）を測 定原理としている。

9．HW−1p24抗原量の測定法

 HIV−1LAI持続感染P6 HeLa細胞をITO電極1個あたり12×105個播き、370Cで3 目間培養した。1．O Vで20分間印加したHIV−ILAI持続感染細胞および未印加 HIV4 LAI持続感染細胞を0．25％トリプシンでITO電極表面から剥がし、6ウェルー プレートの3ウェルに各15×104個播いた。4日間培養した両HIVILA互持続感染細 胞の培養上清中のウイルス量を、HIV4 p24抗原ELISAキット（ZeptoMetric， N．Y USA）を用いて測定した。

10．Multinuclear activation of謎ga量3ctosidase ind孟cator（MAGI）アッセイ

 MAGIC−5細胞をITOディシュ1個あたり1．5×106個播き、37℃の5％CO2インキ ュベータで1日間培養した。培養上清を除き、細胞にHIV−ILAIまたはHIV−1NL43−1。、

を2m1加え、370Cで2時間インキュベートした。ウイルス液を除去後、培養液 を9ml加え、細胞に直流1．O V（vs． Ag／AgC1）を5分間印加した。細胞を37。C で2日間培養後、培養上清を除去し、1％ホルムアルデヒド、0．2％グルタルアル

デヒド含有リン酸緩衝液（PBS）2mlで5分間固定した。細胞をPBSで2回洗浄

した後、2mM：塩化マグネシウム、4mMフェロシアン化カリウム、0。4 mg X−Gal 含有PBSを2ml加えて37。Cで50分間インキュベートした。染色液を除去し、

細胞をPBSで2回洗浄した65）66）。1，000個以上の細胞を光学顕微鏡下で数え、HIV−1 感染細胞の比率を求めた。

 また1．O V 5分間印加したMAGIC−5細胞にHIV−1LAIを感染させ、上記の方法で HIV−1感染細胞を測定した。

11．ルシフェラーゼ活性を用いたHIV−1量の測定法

 MAGIアッセイと同じ方法で1日間培養したMAGIC−5細胞に、H：IV−1NL43．1。、を 2ml加えて37。Cで2時間インキュベートした。ウイルス液を除去後、細胞にLO Vを5分間印加し、37。Cで2日間培養した。ルシフェラーゼ分析用緩衝液（Promega，

USA）500μ1でHIWNL43，1。、急性感染細胞を溶解した。その溶解液10μ1にルシフ ェラーゼ分析用基質を50μ1加え、直ちにルミノメータ検出器（Lumat LB 9501／16；

EG＆GBerthold， Bad Wildbad， Germany）にてルシフェラーゼ活性を測定した67）。

同サンプル中の蛋白濃度をBCA Protein assayキット（PIERCE， Rock董）rd， IL）で 測定した。MAGIC・5細胞中のHIV−1NL43．監。、量は、蛋白1μgあたりのルシフェラー ゼ活性値で示した。

12．フローサイトメータを用いた活性酸素種の測定法

 MAGIC−5細胞を各ITOディシュ上に60×104個播き、37℃の5％CO2インキュベ ータで1日間培養した。培養上清を除去後、HIV−1NL43．盤。、を2ml加えて37。Cで2 時間インキュベートした。HIV4NL43．1。。吸着細胞と非吸着細胞を37℃の希釈緩衝 液（20mM HEPES，120 mM NaCl，2mM KCI，2mM CaC12，1mM MgC12，51nM

glucose， pH 7．4， at 25℃）で2回洗浄し、10μM APFまたは2．5鉢M DAF−FM DA試 薬含有希釈緩衝液（37℃）を9ml加えた。両細胞に直流1．O V（vs． Ag／AgCl）を

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