PCNA とウラシル DNA グリコシラーゼの構造生物学的研究

熊本大学学位論文

好熱性古細菌由来ゲノム安定性に働く

PCNA とウラシル DNA グリコシラーゼの構造生物学的研究

2012 河合 聡人

Structural studies of genome stability-related protein, PCNA and uracil-DNA 熊本大学学位論文

好熱性古細菌由来ゲノム安定性に働く

ＰＣＮＡとウラシルＤＮＡグリコシラーゼの 構造生物学的研究

河合聡人

Structural studies of genome stability­related protein, PCNA and uracil­DNA glycosylase isolated from the thermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii.

Structural study of genome stability-related protein, PCNA and uracil-DNA glycosylase isolated from the thermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii.

Akito Kawai

The enzymatic machinery responsible for genome stabilization, such as in DNA replication, repair, and recombination (3R), consists of a large number of cooperating DNA-processing proteins. It is vital to maintain genome stabilization that individual DNA-processing proteins play precise roles corresponding to the 3R processes. To reveal the basic roles of DNA-processing proteins involved in 3R, we have carried out a structural study for DNA-processing proteins isolated from the thermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii, in which the mechanism resembles the eukaryotic 3R system. In this dissertation, structural studies of proliferating cell nuclear antigen (stoPCNA) and uracil-DNA glycosylase (stoUDG) that were mainly elucidated by X-ray crystallographic analysis are described.

The results of each study are summarized as follows.

Structural study of the stoPCNA2-stoPCNA3 complex.

PCNA, which is a DNA clamp in humans and archaea, directly interacts with DNA polymerase and acts as a processivity factor. Additionally, PCNA also interacts with the various DNA-processing proteins involved in 3R and acts as a platform for orchestrating their arrangement on the DNA molecule. The functional complex of stoPCNA is a heterotrimer (stoPCNA123) consisting of stoPCNA1, stoPCNA2, and stoPCNA3, while in eukaryotes and euryarchaea PCNA forms a homotrimer. Moreover, a functional complex composed of only stoPCNA2 and stoPCNA3 (stoPCNA2-stoPCNA3 complex) was recently found. The stoPCNA2-stoPCNA3 complex is roughly the size of stoPCNA123 and affects the enzymatic activity of DNA processing proteins like stoPCNA123. These findings presumably indicate that stoPCNAs enable diversity in the DNA clamps by changing the subunit interactions and complex formations. However, the structural and functional differences that exist between the stoPCNA2-stoPCNA3 complex and stoPCNA123 remain unclear.

To understand its structural features, we determined the crystal structure of the stoPCNA2-stoPCNA3 complex that was previously unknown.

The crystal structure of the complex showed an elliptic ring-like heterotetramer consisting of two molecules each of stoPCNA2 and stoPCNA3 that are joined in “head-to-tail” arrangements.

Additionally, the heterotetrameric formation of the stoPCNA2-stoPCNA3 complex in solution was confirmed by gel-filtration column chromatography and small-angle X-ray scattering analysis. Since the stoPCNA2-stoPCNA3 complex crystallized in space group I222 and P2₁212, the three states of the heterotetrameric structure for the stoPCNA2-stoPCNA3 complex were determined. These structures indicate that the interaction surfaces are classified into two types: stiff and flexible, although there are four interaction surfaces within the stoPCNA2-stoPCNA3 complex. While the stiff surface contributes

to form a rigid heterodimer of the stoPCNA2-stoPCNA3 complex, the flexible surfaces help form a heterotetramer by coupling two rigid heterodimers and permitting the complex to bend like a hinge.

Based on this new structural information and previous reports, we propose two possible biological roles of the stoPCNA2-stoPCNA3 complex as a Holliday junction clamp and as protection against the degradation of newly synthesized genomic DNA.

Structural study of uracil-DNA glycosylase

In DNA, uracil is generated by spontaneous or enzymatic deamination of cytosine. This uracil is repaired by the base excision repair pathway because it leads to a G:C to A:T transition mutation if the error is not repaired before the next round of replication. Uracil-DNA glycosylase (UDG) catalyzes the removal of uracil from DNA. UDG is widely found in eukaryotes, bacteria, archaea, and some DNA viruses. Structural determinations of UDG isolated from various species have been vigorously carried out. However, to date there have been no reports of the 3D structure of UDG isolated from archaea. In order to enhance understanding of the structural features of UDGs, we determined the crystal structure of stoUDG.

At first, we tried to find crystallization conditions for wild-type stoUDG, but were not able to reproducibly crystallize it. To obtain reproducible stoUDG crystallization, we designed and constructed a deletion mutant of stoUDG called stoUDGΔ. The deletion region was determined by reference to the results of disorder and secondary structure predictions. The stoUDGΔ crystals always appeared in the condition using PEG3350 as a precipitant, and crystal structures of stoUDGΔ in the free form and complexed with uracil were determined at 1.7 Å resolution. These structures revealed that UDGs generally form a three layered α/β/α sandwich fold, and that the recognition mode of uracil is highly conserved at the atomic level. To further study the hydrolysis reaction of stoUDG, we generated a model structure of stoUDG complexed with DNA. The model structure showed that Leu169, Tyr170, or Asn171 may insert into the space resulting from the flipped-out uracil from DNA.

Accordingly, we confirmed the enzymatic activity of each mutant (L169A, Y170A, N171A), and Y170 was identified as an intercalation residue of stoUDG. This finding indicates that a structural change of stoUDG, which is not observed in other UDGs, occurs when it forms a complex with DNA.

Furthermore, we believe that this feature is shared among UDGs isolated from thermophilic archaea, because secondary structural predictions indicate that they tend to form similar structures as stoUDG.

略語表 塩基表記

A Adenine C Cytosine G Guanine T Thymine U Uracil

アミノ酸表記

1文字表記 3文字表記 アミノ酸名

A Ala Alanine

C Cys Cysteine

D Asp Aspartic Acid

E Glu Glutamic Acid

F Phe Phenylalanine

G Gly Glycine

H His Histidine

I Ile Isoleucine

K Lys Lysine

L Leu Leucine

M Met Methionine

N Asn Asparagine

P Pro Proline

Q Gln Glutamine

R Arg Arginine

S Ser Serine

T Thr Threonine

V Val Valine

W Trp Tryptophan

Y Tyr Tyrosine

%B Percentage of elution buffer

APOBEC Apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like APS Ammonium persulfate

AU Absorbance unit

BER Base excision repair

Bis-Tris Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane BSA Bovine serum albumin

CBB Coomassie brilliant blue

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

CV Column volume

DDW Double distilled water DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP 2'-Deoxynucleoside 5'-triphosphate dsDNA double-stranded deoxyribonucleic acid

DW Distilled water

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid FEN1 Flap endonuclease 1

GFP Green fluorescent protein

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HEX Hexachloro-fluorescein

HIV Human immunodeficiency virus LB Luria-Bertani’s broth

LLG Log Likelihood Gain

MES 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid MMR Mismatch repair

MW Molecular weight

NER Nucleotide excision repair NMR Nuclear Magnetic Resonance OD₆₀₀ Optical density at 600 nm ORF Open reading frame

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

RNA Ribonucleic acid rpm Rotation per minute

SAXS Small-angle X-ray scattering Sc Shape complemantarity SDS Sodium dodecyl sulfate

ssDNA single-stranded deoxyribonucleic acid sso Sulfolobus solfataricus

sto Sulfolobus tokodaii

SUMO Small ubiquitin-like modifier TCA Tricarboxylic acid

TEMED N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine

tma Thermotoga martima

Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethane tth Thermus thermophilus

UDG Uracil-deoxyribonucleic acid glycosylase Vif Viral infectivity factor

XPD Xeroderma pigmentosum factor D

XRCC1 X-ray repair cross-complementing protein 1

本論文は学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである。

1) Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the PCNA2-PCNA3 complex from Sulfolobus tokodaii strain 7

Akito Kawai, Shigesada Higuchi, Masaru Tsunoda, Kazuo T. Nakamura, and Shuichi Miyamoto

Acta Crystallogr. sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 65, 1282-1284 (2009)

2) A novel heterotetrameric structure of the crenarchaeal PCNA2-PCNA3 complex Akito Kawai, Hiroshi Hashimoto, Shigesada Higuchi, Masaru Tsunoda, Mamoru Sato, Kazuo T. Nakamura, and Shuichi Miyamoto

J. Struct. Biol., 174, 443-450 (2011)

3) Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of uracil-DNA glycosylase from Sulfolobus tokodaii strain 7

Akito Kawai, Shigesada Higuchi, Masaru Tsunoda, Kazuo T. Nakamura, and Shuichi Miyamoto

Acta Crystallogr. sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 68, 1102-1105 (2012)

目次

序論... 1

第1章stoPCNA2-stoPCNA3複合体の構造生物学的研究... 6

第1節 stoPCNA2-stoPCNA3複合体およびstoPCNA123の調製... 10

第1項 各種stoPCNA発現条件の検討... 10

第2項 stoPCNAsの精製... 12

第3項 stoPCNA2-stoPCNA3複合体およびstoPCNA123の精製... 19

第2節 結晶化およびX線結晶構造解析... 21

第1項 stoPCNA2-stoPCNA3複合体の結晶化... 21

第2項 X線結晶構造解析... 23

第3節 stoPCNA2-stoPCNA3複合体の立体構造... 27

第1項 結晶構造... 27

第2項 溶液中におけるstoPCNA2-stoPCNA3複合体の構造... 29

第3項 stoPCNA2-stoPCNA3複合体のヘテロ四量体構造... 32

第4節 機能予測... 38

第1項 複製直後のdsDNA保護に関与する可能性... 38

第2項 Holliday junctionクランプの可能性... 40

第2章stoUDGの構造生物学的研究... 42

第1節 stoUDGの調製... 46

第1項 発現条件検討... 46

第2項 精製方法の確立... 47

第3項 UDG活性の確認... 51

第2節 stoUDGの結晶化... 52

第3節 stoUDGΔの調製... 54

第4節 stoUDGΔの結晶化およびX線結晶構造解析... 56

第1項 結晶化... 56

第2項 X線結晶構造解析... 58

第5節 stoUDGΔの立体構造... 60

第1項 全体構造およびウラシル結合部位... 60

第2項 ウラシルの認識様式... 62

第6節 反応機構... 63

第1項 DNA複合体モデルの作成... 63

第2項 DNA複合体モデルに基づいた加水分解反応についての考察... 66

総括... 71

実験項... 74

謝辞... 91

参考文献... 93

序論

ここ数十年でめまぐるしく発展した生命科学技術は、現在では生命活動そのものを試 験管内に再現することや、成熟した細胞を初期化することが可能なところまで進歩して いる。これに並行して生命活動に関与するタンパク質が次々と発見され、それぞれの役 割を同定する研究が精力的に行われている。そしてタンパク質の立体構造情報はその機 能を解明するのに非常に有用であり、タンパク質の分子構造を詳細に観察することで他 の研究手法から推察された事柄の理解を容易にしたことや、それまで考えに至らなかっ た新たな発見につながった例は数多い。このことはMax PerutzとJohn Kendrewが1953 年にヘモグロビン、ミオグロビンの位相決定に成功し、最初のタンパク質の立体構造^{1, 2)} を報告してからわずか60年の間に、16名もの研究者が構造生物関連の研究業績でノー ベル賞を受賞したことからも窺えるだろう。そして現在、生命活動の全貌がうっすらと みえ始め、多くのタンパク質が協調的に働いていることが明らかになってきたのに伴い、

構造生物学研究も個々のタンパク質の分子構造から、実際の反応を触媒している状態や、

生命活動において協調的に活動するタンパク質群を複合体全体で捉えた構造解析とい った、より生命活動の場面を再現した立体構造の解明が目標とされるようになってきた。

DNA複製・修復・組換え (DNA Replication・Repair・Recombinationの頭文字をとっ て3Rと略す)では、多くのタンパク質が協調的に働くことが知られている。そもそもこ のDNAには、生命の設計図である遺伝情報が刻み込まれていて、これはグアニン、シ トシン、アデニン、チミン4種類の塩基の並びで決定される。そして、この遺伝情報を 次の細胞へ伝え、その生物の特徴を後世に受け継いでいくことは全ての生命において共 通した最も重要な生命活動の 1 つである。しかしながら、DNAは活性代謝物や環境化 学物質、紫外線、電離放射線などに常に曝されていて、塩基部分の構造変化や架橋、

DNA鎖の切断といった化学変化を受けやすい³⁾。そして、この様なDNAの化学変化は 細胞内では損傷として認識され、この影響はDNA複製や転写といった基本的な生命活

動を妨げ、これらの蓄積が細胞死や老化だけでなく、ガンなどの重篤な疾患を招いてし まう。そこで全ての生物はこれらの損傷に対して様々な方法で対処している。DNA 修 復機構はその代表的なもので、塩基除去修復 (BER)、ヌクレオチド除去修復 (NER)、

ミスマッチ修復 (MMR)、相同組換え、非相同末端連結や複製後修復など損傷の具合や 程度に応じた複数の修復機構が存在している⁴⁾。

DNA修復機構の中でここではBER⁵⁾に注目する。BERはDNA鎖中の単一塩基に起き た損傷に対応する修復機構で、この修復ではそれぞれの損傷塩基を認識・除去するDNA グリコシラーゼによって損傷塩基部分が切り取られ、これにより生じた脱塩基部位は AP エンドヌクレアーゼによって糖が除去される。そして、BERはここから short-patch BERとlong-patch BERの2つに分岐する。short-patch BERでは、DNAポリメラーゼが 欠失している1塩基部分を伸長し、DNAリガーゼが伸長された部分と現存のDNA鎖を つなぐ。この際、ヒトではXRCC1がDNA polymerase βやDNA ligase IIIと相互作用す ることで BER を円滑に進める足場の役目を担っていることが知られている ⁶⁾。一方

long-patch BERでは、DNAポリメラーゼにより2~10塩基ほどの伸長反応が起き、この

伸長によりDNAから解けてしまった1本鎖DNAの部分はFEN1によって除去される。

この際、DNA polymerase βもしくはDNA polymerase δがPCNA依存的に伸長反応を行う ことが知られている⁷⁾。さらにPCNAはFEN1とも複合体を形成することでその活性が 増強されることが報告されている⁷⁾。このように、DNAグリコシラーゼやDNAポリメ ラーゼといった BER で直接的に作用する酵素の他に、それを手助けする PCNA や

XRCC1 といったタンパク質が存在することで BER は円滑に進められている。さらに、

PCNAやXRCC1はこのBERだけで活躍するのではなく、3Rの至る所で補助的な役目

向け試行錯誤されている。

この複合体構造解析研究において、1つの課題は安定した複合体を形成するタンパク 質を大量に得ることにある。そこで、我々はタンパク3000プロジェクトの一環で始ま った好熱性古細菌Sulfolobus tokodaii由来タンパク質の網羅的構造解析研究に注目した。

高温や高塩濃度、低pHなど過酷な環境に生息する古細菌由来のタンパク質は熱だけで なくpHや塩濃度などにも耐性を示すタンパク質が多く、広い意味で非常に安定したタ ンパク質であることから結晶化を必須とする X 線結晶構造解析では重宝にされている タンパク質である。

ここで注目したSulfolobus tokodaiiは1983年に大分県の別府温泉で発見され、2001年 にはゲノムの全塩基配列が決定されたことから、コードされているORF が既に同定さ れている ⁸⁾。そしてこの ORF 中には、その過酷な環境で生息するために必要な特別な 酵素が存在しているが (例えば、糖新生においてフルクトース-6-リン酸の合成には、一 般的な生物では2種類の酵素の関与が必要だが、Sulfolobus tokodaiiでは1つの酵素 (フ ルクトース-1,6-ビスリン酸 アルドラーゼ/ホスファターゼ)で 2 つの反応を触媒してい

る)^{9, 10)}、しかしその一方で、糖新生にも関わるTCA サイクルの酵素群には、オキソグ

ルタル酸デヒドロゲナーゼに相当する酵素が同定されていて、真核生物によく似た機構 であることも知られている ⁸⁾。加えて、古細菌の3R 機構は真核生物とよく類似してい ると考えられている生命活動で¹¹⁾、近年、Sulfolobus tokodaii由来XPDヘリカーゼの構 造が解明されたことでその分子機構が議論されると同時に、XPD ヘリカーゼの変異が 原因となって発症する色素性乾皮症、コケイン症候群、硫黄欠乏性毛髪異常症などの発 症との関係が議論され、酵素としての機能解明だけではなく真核生物に置き換え疾患と の関連した研究も進められている¹²⁾。

以上のように、Sulfolobus tokodaiiはヒトなどの真核生物などと共通する生命活動の解 明に向けたモデル生物になることが期待されている生物の1種である。さらに、タンパ ク3000プロジェクトが実施されたことで、Sulfolobus tokodaii由来の多くのタンパク質

について大腸菌を使った発現系が既に構築されているところも注目した利点の 1 つで ある。そこで、本研究ではSulfolobus tokodaiiの3Rの場面を再現した構造解析を実施す ることを目的にして研究に着手した。そして、本研究で3Rの正常な場面を解明するこ とによって、遺伝的な要因とされる疾患やDNAの損傷に起因される疾患では何が異常 なのかということを明確にすることが容易になり、薬学の領域にも貢献できるのではな いかと考えた。

これらの背景のもと、この論文では、第 1 章に Sulfolobus tokodaii 由来の PCNA

(stoPCNA)、第2章にウラシルDNAグリコシラーゼ (stoUDG)の研究から得られた研究

成果を記す。

stoPCNA では機能性複合体としてヘテロ三量体 (stoPCNA123)を形成し DNA クラン

プとして働くことが知られていた。これに加えて、このヘテロ三量体からstoPCNA1が 存在しない状態、つまり、stoPCNA2-stoPCNA3複合体の状態でもstoPCNA123と同程度 の大きさの複合体を形成することが発見された ¹³⁾。このことから、stoPCNA では機能 性複合体を構成する分子の種類と数を変化させることでDNAクランプの多様性を生み 出しているのではないかと考えられた。そこで、このDNAクランプの違いを立体構造 から議論するため、stoPCNA2-stoPCNA3 複合体のX線結晶構造解析を実施した。その 結果、stoPCNA2-stoPCNA3複合体はヘテロ四量体であることを明らかにした。また、X 線溶液散乱およびゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いた実験を実施し、溶液中で も楕円状のヘテロ四量体構造を形成していることを確認した。

stoUDG に関しては、ヒトやカエル、大腸菌など様々な生物由来の UDG の立体構造

が報告されているが古細菌由来 UDG の立体構造は未だ解明されていない。そこで、

た。また、立体構造の観察と変異体実験から、ウラシルをflipped-outさせることで生じ る DNA鎖中の空間を埋めるアミノ酸が stoUDG では Tyr170 であると同定した。この 結果は他のUDG では観察されなかったDNA結合時の構造変化が stoUDGには存在す ることを示唆した。

以下に本研究で得られた知見をそれぞれのタンパク質の特徴と共に各章節に分けて 詳述する。

第1章 stoPCNA2-stoPCNA3複合体の構造生物学的研究

大腸菌において主にDNA 修復の際に働くと考えられている DNA polymerase Iは、

1秒間に約 10塩基の伸長ができる ¹⁴⁾。一方で、複製を主に担当していると考えられて いるDNA polymerase III holoenzymeは、1秒間に約1,000塩基の伸長を行うことができ、

その効率は100倍異なる¹⁵⁾。これにはDNAクランプと呼ばれるプロセッシビティー因 子の有無が関係していて、DNA polymerase III holoenzyme ではそのβサブユニットが DNA クランプの役割を担っている ¹⁵⁾。この DNA クランプは、一般的にドーナツ状の 構造をしていて (Fig. 1-1)、中心の空洞にdsDNAを通すような形でDNAを包み込み、

さらに分子の側面でDNAポリメラーゼと直接相互作用し、DNAポリメラーゼを DNA 上に繋ぎ止める働きを担うことによって、その伸長反応を手助けしていると考えられて いる¹⁵⁾。

真核生物、古細菌では、PCNAが DNAクランプとして働いている。PCNAは三量体 を 形 成 す る こ と で DNA ク ラ ン プ の 特 徴 で あ る ド ー ナ ツ 状 の 構 造 を 形 成 す る ¹⁶⁾ (Fig. 1-1b)。そして、DNA polymerase δ (真核生物)やDNA polymerase B1 (古細菌)などと 相互作用することでそのプロセッシビティー向上の働きを担う^{17, 18)}。さらに、PCNAは 3R に関わる様々な因子とも相互作用し、その働きを助長することが報告されている (Tabel 1-1)。また、複製後修復機構においては、PCNAがRad6経路でmono-ubiquitin化 されると損傷乗り越え型修復経路に必要なDNAポリメラーゼを損傷部位に誘導する¹⁷⁾。 加えて、このmono-ubiquitin化されたPCNAが続けてRad5によってpoly-ubiquitin化さ れた場合にはテンプレートスイッチ型の組換え機構に移行し ¹⁷⁾、さらに、PCNA が SUMO化されると、poly-ubiquitin化で惹起されたテンプレートスイッチ型の組換え機構

には、自身を修飾するものが変わることで修復の経路を変化させるような、まるで 3R のコンダクターのような存在であることが明らかになってきた。

PCNAは、真核生物および古細菌の多くがホモ三量体でドーナツ状の構造を形成する。

しかし、古細菌の中でも crenarchaea に属する古細菌の一部では、PCNA が PCNA1、

PCNA2、PCNA3 といった異なる 3 種類の分子で構成されるヘテロ三量体 (PCNA123)

を形成するものが存在する。この PCNA123 を形成する生物種の中でも、Sulfolobu solfataricus (ssoPCNA)¹⁹⁾、Aeropyrum pernix (apePCNA)²⁰⁾、Sulfolobus tokodaii (stoPCNA)¹³⁾、

Sulfolobus islandicus (sisPCNA)²¹⁾については生化学的な研究が実施され、その機能や構造

が他のホモ三量体型 PCNA と特に変わらないと報告されている。しかし近年、このヘ テ ロ 三 量 体 を 形 成 す る PCNA1、PCNA2、PCNA3 の う ち 、PCNA1 が 存 在 し な い

PCNA2-PCNA3複合体の状態でもPCNA123ヘテロ三量体と同じ大きさの複合体を形成

することが、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いた研究によりapePCNAおよび

stoPCNAで確認された^{20, 13)}。また、このPCNA2-PCNA3複合体はPCNA123と同様に他

の 3R に関わる酵素の活性に影響与えた。加えて、GFP 融合 stoPCNA、His タグ融合

stoPCNA を用いたプルダウンアッセイにより、この stoPCNA2-stoPCNA3 複合体は、

stoPCNA2が 1 分子、stoPCNA3 が 2分子で構成されるヘテロ三量体であることが示唆

された ¹³⁾。さらに、apePCNA ではウェスタンブロット法を用いて細胞内のそれぞれの apePCNA 量 を 比 較 す る と 、apePCNA2 (2,200 molecules/cell)が も っ と 多 く 、 次 い で apePCNA3 (660 molecules/cell)、apePCNA1 (230 molecules/cell)の順であったことが報告さ れ²⁰⁾、同様な結果がsisPCNAでも得られていると報告されている²¹⁾。

ヒトなどの真核生物では、PCNAとよく似た立体構造を有し、チェックポイントクラ ンプと呼ばれるRad9-Rad1-Hus1複合体 (9-1-1)の存在が確認されている^22–24) (Fig. 1-1c)。 そして、細胞周期のS期チェックポイント機構が活性化されるには、この9-1-1がDNA 上へ ローディングされることが重要であると示唆されていて、この時9-1-1はDNA損 傷部位を検出し、さらに、修復に関わる様々な酵素と相互作用することで、それらのタ

ンパク質の反応の足場として働くことが考えられている。このように、真核生物では

PCNAと 9-1-1のように、複数の DNAクランプが存在し、場面に応じた使い分けの様

子が明らかになりつつある。

以上のことから、古細菌ではPCNA123の他にPCNA2-PCNA3複合体のような組成の 異なるDNAクランプが複数存在していて、PCNAと9-1-1のように3Rの場面に応じて 使い分けられていると仮説を立てた。また、stoPCNA123を構成するそれぞれの分子は、

ssoPCNA123 の分子と一次構造の相同性が~50%と高いことから立体構造は類似してい

ると予想された。しかし、stoPCNA2-stoPCNA3 複合体については立体構造が不明であ った。そこで、本研究では、stoPCNA2-stoPCNA3 複合体の立体構造を明らかにするこ とで、stoPCNA123 との立体構造比較から DNA クランプとしての違いを見い出せるの ではないかと考え、stoPCNA2-stoPCNA3 複合体のX線結晶構造解析に着手した。以下 にその結果を記す。

Fig. 1-1 DNA clamp structure.

The polypeptide chains are color-coded. (a) E. coli β-clamp (PDB code 3bep²⁵⁾) exists as a homodimer. (b) human PCNA (PDB code 1vym²⁶⁾) exists as a homotrimer. (c) Rad9, Rad1 and Hus1 were colored red, green and yellow, respectively. (PDB code 3g65²⁷⁾)

Table. 1-1 PCNA-binding proteins¹⁷⁾

Activities Proteins

DNA polymerase Polδ, Polε, Polη, Polι, Polκ, Polζ, Polλ, Polβ, Rev1

Clamp loader Rfc1, Rfc3, Rfc4

Flap-endonuclease FEN1

DNA ligase DNA ligase 1

Topoisomerase Topo IIα

Replication licensing factor Cdt1 E3 ubiquitin ligase Rad18, Rad5 E2 SUMO-conjugating enzyme Ubc9

Helicase, ATPase Srs2, Rrm3, Mgs1, WRN, RECQ5 Mismatch repair enzyme Msh3, Msh6, Mlh1, EXO1

Base excision repair enzyme UNG2, MPG, NTH1, hMYH, APE1, APE2, XRCC1 Nucleotide excision repair enzyme XPG

Poly (ADP-ribose) polymerase PARP1

Histone chaperon CAF1

Chromatin remodeling factor WSTF Histone acetyltransferase p300 Histone deacetyltransferase HDAC1

DNA methyltransferase DNMT1

Sister-chromtid cohesion factors Eco1, Chl1, Ctf18

Protein kinases CDK2, EGF receptor

Cell-cycle regulators p21, p57, Cyclin D1 Apoptotic factors Gadd45, ING1b, p53

第1節 stoPCNA2-stoPCNA3複合体および stoPCNA123の調製

第1項 各 種 stoPCNA発 現 条 件 の 検 討

本研究に先行して、昭和大学の直枝らは、各種 stoPCNA 発現用プラスミドベクター を用いて大腸菌Rosetta-gami(DE3)を形質転換し、その大腸菌を一晩培養することで発現 がリークしている各種stoPCNAを得る方法を確立していた ²⁸⁾。この方法は簡便だが、

本研究で必要な量の各種stoPCNAを獲得するには10 L以上の大腸菌培養が必要になっ てしまう。そこで本研究では、タンパク質発現誘導剤としてラクトースを用いることで より少ない培養量で多量の各種stoPCNAを得る方法の確立を試みた。

各種 stoPCNA 発現用のプラスミドベクターは、直枝らが用いていたものと同じプラ スミドベクターを いわき明星大学 角田 大 先生より譲っていただいた。このプラスミ ドベクターには、それぞれの stoPCNA をコードする遺伝子領域 (Tabel 1-2 参照)が

pET-11aプラスミドベクター内のマルチクローニングサイト (制限酵素部位Nde I及び

BamHI)に挿入されていて、発現するタンパク質は各種stoPCNAのORF領域のみを有す

る組み換えタンパク質が得られる設計となっている。これらの発現用プラスミドベクタ ーを用いて個別に大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。この大腸菌を用いて、発現誘導 剤 (ラクトース)1 mM、誘導時間4時間、振盪数145 rpm、培養温度37℃の条件でタン パク質発現を行い、ここで得られた大腸菌は超音波で破砕した後、熱処理による粗精製 を行った。Fig. 1-2に各ステップで回収したサンプルをSDS-PAGEで分離した結果を示 す。この結果により、いずれの stoPCNA もラクトース添加後タンパク質の発現が確認 され、可溶性で耐熱性を示す各種stoPCNAが得られた。

Table. 1-2 List of stoPCNAs Gene/protein ID

Protein names No. of amino acids Molecular weight Gene names UniProt ID

stoPCNA1 245 27,284 STK_03870 Q975N2

stoPCNA2 248 27,542 STK_03970 Q975M2

stoPCNA3 246 27,437 STK_09440 Q973F5

Fig. 1-2 Confirmation of expression of stoPCNAs.

SDS-PAGE analysis was performed using a 15% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS. The arrowhead indicates the position of each stoPCNA. Mw means the molecular weight marker and the values near the molecular weight of each stoPCNA are labeled (20,000, 25,000 and 37,000).

The “+“ and “−“ charcters indicate the addition of lactose and no addition, respectively. The abbreviations indicate: HS; supernantant after heat treatment, HP; precipitant after heat treatment, LS; supernantant before heat treatment, LP; precipitant before heat treatment. (a) stoPCNA1 (b) stoPCNA2 (c) stoPCNA3.

第2項 stoPCNAsの 精 製

各種 stoPCNA の発現と同様に直枝らは精製方法も確立していた。そこで、本研究で は直枝らの方法を基に、陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出方法の変更、精製の最 終段階にゲルろ過カラムクロマトグラフィーを追加することで、高純度な各種stoPCNA を得ることに成功した。

本研究で用いた精製方法の手順をFig. 1-3に示す。各種stoPCNAを発現する大腸菌の 大量培養、熱処理による粗精製、硫安沈殿による核酸の除去までは、各種 stoPCNA い ずれも共通した手順で行った。陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製以降 の手順は個々の stoPCNA により精製条件が異なる。以下に陰イオン交換クロマトグラ フィー以降の精製手順における詳細な結果を各種stoPCNAについて個別に記す。

Fig. 1-3 Purification scheme of stoPCNAs.

stoPCNAs were individually overexpressed in E.coli. The cells were disrupted by sonication followed by incubation at 70℃. Partial purifications of stoPCNAs were performed by ammonium sulfate precipitation, and then purified by anion-exchange column chromatography.

stoPCNAs were finally purified by gel filtration column chromatography. The purity of stoPCNAs was evaluated using a SDS-PAGE analysis.

Overexpression in E.coli

↓

Sonication (200W, 5 min)

↓

Heat treatment (70℃, 30 min)

↓

Ammonium sulfate precipitation

↓

Dialysis against 20 mM Tris-HCl pH 8.0

↓

Anion-exchange column chromatography

↓

Gel filtration column chromatography

＜stoPCNA1の 精 製 ＞

陰 イ オ ン 交 換 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

透析により塩類を除いたstoPCNA1の溶液は、陰イオン交換カラム (HiTrap Q 担体量

5 mL)を用いて精製した。まず、stoPCNA1をカラムに結合させた後、結合溶液2CVで

洗浄した。stoPCNA1は0%B→50%B (0 mM → 500 mM NaCl) 30CVの間で溶出させ、

この間5 mLずつ溶出液を分取した。Fig. 1-4に精製結果を示す。SDS-PAGEの結果から

stoPCNA1は溶出画分16以降で溶出が確認された。しかし、夾雑タンパク質の存在も確

認されることから、溶出画分16〜18までを回収し、濃縮した溶液をゲルろ過カラムク ロマトグラフィーにより精製することにした。

Fig. 1-4 Purification of stoPCNA1 by anion-exchange column chromatography.

(a) Chromatogram of anion-exchange column chromatography. Plotted on the x-axis is the elution volume and plotted on the y-axes are the absorbance at 280 nm (left side, solid line) and the %B (right side, dashed line). The circled number indicates the fraction number. The region between the arrows was analyzed by SDS-PAGE analysis. (b) SDS-PAGE analysis was performed using a 15% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS. The arrowhead indicates the position of stoPCNA1. Mw means the molecular weight marker and the values near the molecular weight of stoPCNA1 are labeled (20,000, 25,000 and 37,000). The numbers of the elution fraction are indicated under each line.

ゲ ル ろ 過 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより得られたサンプルを、ゲルろ過カラム (HiLoad 16/60 Superdex 75pg)を用いて精製した。精製結果をFig. 1-5に示す。クロマト グラムには、stoPCNA1 を含むメインピーク、stoPCNA1 より高分子量を示すピークが 確認された。また、stoPCNA1を含むメインピーク部分の溶出画分をSDS-PAGEで分離 すると非常に純度の高いstoPCNA1が単離できていることが確認された。また、700 mL の培養で得られた大腸菌から最終的に得られたstoPCNA1は約53 mgであった。

Fig. 1-5 Purification of stoPCNA1 by gel filtration column chromatography.

(a) Chromatogram of gel filtration column chromatography. Plotted on the x-axis is the elution volume and plotted on the y-axis is the absorbance at 280 nm. The circled number indicates the fraction number. The region between the arrows was analyzed by SDS-PAGE analysis. (b) SDS-PAGE analysis was performed using a 15% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS. The arrowhead indicates the position of stoPCNA1. Mw means the molecular weight marker and the values near the molecular weight of stoPCNA1 are labeled (20,000, 25,000 and 37,000). The numbers of the elution fraction are indicated under each line.

＜stoPCNA2の 精 製 ＞

陰 イ オ ン 交 換 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

透析により塩類を除いたstoPCNA2の溶液は、陰イオン交換カラム (HiTrap Q 担体量

5 mL)を用いて精製した。まず、stoPCNA2をカラムに結合させた後、結合溶液2CV、

続いて5%B溶液 (50 mM NaCl) 1CVを用いてカラムを洗浄した。stoPCNA2は5%B→

50%B (50 mM → 500 mM NaCl) 30CVの間で溶出させ、この間5 mLずつ溶出液を分取

した。Fig. 1-6に精製結果を示す。SDS-PAGEの結果からstoPCNA2は溶出画分6以降

での溶出が確認された。また、純度はstoPCNA1と比べ高かったが、わずかに低分子量 のタンパク質が混在していることが認められた。そこで、溶出画分6〜9を回収し、濃 縮した溶液を、stoPCNA1同様にゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製するこ とにした。

Fig. 1-6 Purification of stoPCNA2 by anion-exchange column chromatography.

(a) Chromatogram of anion-exchange column chromatography. Plotted on the x-axis is the elution volume and plotted on the y-axes are the absorbance at 280 nm (left side, solid line) and the %B (right side, dashed line). The circled number indicates the fraction number. The region between the arrows was analyzed by SDS-PAGE analysis. (b) SDS-PAGE analysis was performed using a 15% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS. The arrowhead indicates the position of stoPCNA2. Mw means the molecular weight marker and the values near the molecular weight of stoPCNA2 are labeled (20,000, 25,000 and 37,000). The numbers of the elution fraction are indicated under each line.

ゲ ル ろ 過 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより得られたサンプルを、ゲルろ過カラム (HiLoad 16/60 Superdex 75pg)を用いて精製した。精製結果をFig. 1-7に示す。クロマト グラムには、stoPCNA2 を含むメインピーク、stoPCNA2 より高分子量、低分子量を示 す、非常に小さな2つのピークが確認された。また、stoPCNA2を含むメインピークの 溶出画分をSDS-PAGEで分離すると、非常に純度の高いstoPCNA2が単離できているこ と が 確 認 さ れ た 。 ま た 、700 mL の 培 養 で 得 ら れ た 大 腸 菌 か ら 最 終 的 に 得 ら れ た stoPCNA2は約21 mgであった。

Fig. 1-7 Purification of stoPCNA2 by gel filtration column chromatography.

(a) Chromatogram of gel filtration column chromatography. Plotted on the x-axis is the elution volume and plotted on the y-axis is the absorbance at 280 nm. The circled number indicates the fraction number. The region between the arrows was analyzed by SDS-PAGE analysis. (b) SDS-PAGE analysis was performed using a 15% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS. The arrowhead indicates the position of stoPCNA2. Mw means the molecular weight marker and the values near the molecular weight of stoPCNA2 are labeled (20,000, 25,000 and 37,000). The numbers of the elution fraction are indicated under each line.

＜stoPCNA3の 精 製 ＞

陰 イ オ ン 交 換 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

透析により塩類を除いたstoPCNA3の溶液は、陰イオン交換カラム (HiTrap Q 担体量

5 mL)を用いて精製した。まず、stoPCNA3をカラムに結合させた後、結合溶液2CV、

続いて20%B溶液 (200 mM NaCl) 1CVで洗浄した。stoPCNA3は20%→50%B (200 mM

→ 500 mM NaCl) 20CVの間で溶出させ、この間、溶出液を5mLずつ分取した。Fig. 1-8 に精製結果を示す。SDS-PAGEの結果からstoPCNA3は溶出画分16以降で溶出が確認 された。しかし、ほかのstoPCNA同様に夾雑タンパク質の混在が認められたため、溶 出画分17〜20を回収し、濃縮した溶液をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精 製することにした。

Fig. 1-8 Purification of stoPCNA3 by anion-exchange column chromatography.

(a) Chromatogram of anion-exchange column chromatography. Plotted on the x-axis is the elution volume and plotted on the y-axes are the absorbance at 280 nm (left side, solid line) and the %B (right side, dashed line). The circled number indicates the fraction number. The region between the arrows was analyzed by SDS-PAGE analysis. (b) SDS-PAGE analysis was performed using a 15% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS. The arrowhead indicates the position of stoPCNA3. Mw means the molecular weight marker and the values near the molecular weight of stoPCNA3 are labeled (20,000, 25,000 and 37,000). The numbers of the elution fraction are indicated under each line.

ゲ ル ろ 過 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより得られたサンプルを、ゲルろ過カラム (HiLoad 16/60 Superdex 75pg)を用いて精製した。精製結果をFig. 1-9に示す。クロマト グラムには、stoPCNA3 を含むメインピーク、stoPCNA3 より高分子量を示す小さなピ ークが確認された。また、stoPCNA3を含むメインピークの溶出画分をSDS-PAGEで分 離すると、非常に純度の高い stoPCNA3 が単離できていることが確認された。また、

700 mLの培養で得られた大腸菌から最終的に得られたstoPCNA3は約26 mgであった。

Fig. 1-9 Purification of stoPCNA3 by gel filtration column chromatography.

(a) Chromatogram of gel filtration column chromatography. Plotted on the x-axis is the elution volume and plotted on the y-axis is the absorbance at 280 nm. The circled number indicates the fraction number. The region between the arrows was analyzed by SDS-PAGE analysis. (b) SDS-PAGE analysis was performed using a 15% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS. The arrowhead indicates the position of stoPCNA3. Mw means the molecular weight marker and the values near the molecular weight of stoPCNA3 are labeled (20,000, 25,000 and 37,000). The numbers of the elution fraction are indicated under each line.

第3項 stoPCNA2-stoPCNA3複 合 体 お よ び stoPCNA123の 精 製

stoPCNA2-stoPCNA3複合体の調製は、まず、濃縮したstoPCNA2およびstoPCNA3を

それぞれstoPCNA2：stoPCNA3＝1：1のモル比となるように混合した。stoPCNA123の

調製は濃縮した各種 stoPCNAを用いて stoPCNA1：stoPCNA2：stoPCNA3＝1：1：1 の モル比となるように混合した。これらの混合液は4℃で一晩静置した後、ゲルろ過カラ ム (HiLoad 16/60 Superdex 75pg)を用いて精製し、複合体と考えられるピークの溶出画分 を回収した。Fig. 1-10に精製した結果を示す。stoPCNA2-stoPCNA3複合体とstoPCNA123 をゲルろ過カラムで分離した際の溶出位置は ほぼ同じで、波長 280 nm の吸光度は

stoPCNA123 のピークの方が高い。また、SDS-PAGE の結果より、stoPCNA3 由来のバ

ンドは、stoPCNA123とstoPCNA2-stoPCNA3複合体を泳動したどちらのレーンを比較し

ても同じ濃さ、太さである。一方で、その下に確認されるstoPCNA1とstoPCNA2由来 のバンドは、 stoPCNA123 のサンプルを泳動したレーンにあるバンドの方が太いため

stoPCNA1 と stoPCNA2 の両方が含まれていると考えられる。これらの結果から、

stoPCNA2-stoPCNA3 複合体と stoPCNA123 はそれぞれ混合した構成分子全てを含む複

合体を形成し、精製されたと判断した。

Fig. 1-10 Preparation of the stoPCNA2-stoPCNA3 complex and stoPCNA123.

(a, b) Chromatogram of gel filtration column chromatography of stoPCNA123 (a) and the stoPCNA2- stoPCNA3 complex (b). Plotted on the x-axis is the elution volume and plotted on the y-axis is the absorbance at 280 nm. (c) SDS-PAGE analysis was performed using a 15%

polyacrylamide gel containing 0.1% SDS. Mw means the molecular weight marker and the values near the molecular weight of stoPCNA2 are labeled (20,000, 25,000 and 37,000). The numbers of the elution fraction are indicated under each line. The positions of stoPCNA1, stoPCNA2 and stoPCNA3 are indicated by labeled arrowheads.

第2節 結晶化および X線結晶構造解析

第1項 stoPCNA2-stoPCNA3複 合 体 の 結 晶 化

調製したstoPCNA2-stoPCNA3複合体は、30 mg/mLに濃縮し、結晶化条件の検討を行 った。結晶化は、結晶化スクリーニングキット (Index、Crystal Screen、Crystal Screen 2) を用いてシッティングドロップ蒸気拡散法に従って行った。その結果、形、大きさは様々 だが結晶に見えるものが複数の条件で得られた。そして、単結晶に近いと思われるもの が得られている条件は、沈殿剤として硫酸アンモニウムもしくはクエン酸ナトリウムを 使用している条件であった。そこで、この2種類の沈殿剤を基準にして、その濃度、緩 衝液の種類、添加剤の種類、タンパク質濃度など結晶化条件の精密化を行った。また、

結晶化条件の精密化にはハンギングドロップ蒸気拡散法を用いた。その結果、X線回折 実験が可能な大きさの結晶を得ることに成功した (Fig. 1-11)。

硫酸アンモニウムを用いた条件では添加剤を加えても結晶化条件は改善されず、沈殿 剤としては硫酸アンモニウムのみを用いるのが最適であると考えられた。また、緩衝液 は酢酸緩衝液 pH 5.0を用いることが重要で、緩衝液のpHが0.5異なると単結晶は得ら れなくなった。さらに、タンパク質濃度は20〜30 mg/mLぐらいが至適濃度であり、40

mg/mL以上の濃度では単結晶が得られなかった。

一方、クエン酸ナトリウムを用いた条件では結晶同士が重なった状態で得られ、単結 晶として得ることは出来なかった。そこで、大きめの結晶が重なっている部分から単結 晶と思われる部分のみを切り取り、MicroMAX007 / R-AXIS IV++を用いてX線回折実験 を行ったが回折点は観測出来なかった。また、X線回折実験のため結晶をクライオルー プで触ると薄い膜のようなものが結晶の表面から次々と剥がれることがあった。これら を踏まえ推測すると、クエン酸ナトリウムを沈殿剤として結晶化した条件で得られる結 晶は単結晶が重なったように見えていたが、実際は薄い膜状の結晶が幾重にも重なって いたのかもしれないと考えられた。

以上、stoPCNA2-stoPCNA3複合体は硫酸アンモニウムと酢酸緩衝液 pH 5.0を用いた 結晶化条件で得られる結晶が X 線結晶構造解析には最適であると判断し、これらの結 晶を用いてX線回折データの収集を試みた。

Table 1-3 Crystallization conditions of the stoPCNA2-stoPCNA3 complex.

Droplet: Total 3 µL

20 mg/mL stoPCNA2-stoPCNA3 complex Reservoir solution

1.5 µL 1.5 µL

Resirvoir: Total 1 mL

(a) 1.6 M Ammonium sulfate 0.1 M Sodium acetate pH 5.0 (b) 0.2 M Sodium citrate

18%(w/v) PEG3350 0.1 M HEPES pH 7.0

Temperature 20℃

Fig. 1-11 Preparation of the stoPCNA2-stoPCNA3 complex and stoPCNA123.

Crystal of the stoPCNA2-stoPCNA3 complex. (a) Crystals with dimensions of 0.03 × 0.1 × 0.3 mm were obtained in the codition shown in Table 1-3a. (b) Crystals with dimensions of 0.05 × 0.8 × 1.0 mm were obtained in the codition shown in Table 1-3b.

第2項 X線 結 晶 構 造 解 析

<X線 回 折 デ ー タ の 収 集>

得られた結晶はMicroMAX007 / R-AXIS IV++を用いてX線回折実験を行った。その 結果、多くの結晶で低角に回折点が数個観察されたが、その分解能は良い結晶で最大7 Å ほどであった。しかし、約 50 個の結晶について回折実験を行ったところ、グリセロー ルを不凍剤として用いた結晶に1つだけ分解能が3 Å以上の回折点を観測できる結晶が あった。3 Å以上の分解能で回折データが収集出来れば構造解析は可能であると判断し、

この結晶については続けて回折データの収集を行った。回折データの収集は、露光時間 10分、振動角0.5°、結晶と検出器の距離230 mmの条件で行い、合計540フレームの 回折データの収集に成功した。また、同じ結晶化条件から得られる結晶を用いて

SPring-8 BL44XUでも回折実験を行い、構造解析可能な複数の回折データの収集に成功

した。BL44XUでは、波長0.9000 Å、露光時間4秒、振動角1.0°、結晶と検出器の距

離500 mmの条件で回折実験を実施し、1データあたり合計180フレームの回折データ

を収集した。得られた回折データはそれぞれプログラムパッケージ CCP4²⁹⁾内のプログ

ラム MOSFLM³⁰⁾およびプログラム SCALA³¹⁾を用いて処理を行った。X 線回折データの

統計値をTabel 1-4に示す。

MicroMAX007 / R-AXIS IV++を用いて回折データを収集した結晶は、斜方晶系で空間

群I222に属していた。一方、SPring-8 BL44XUで回折データを収集した結晶は、どれも 斜方晶系で空間群 P2₁2₁2 に属しており、同じ結晶化条件で得られた結晶だったが異な る空間群に属した結晶であったことが明らかになった。しかしながら、顕微鏡下で観察 した結晶の外形から2つ空間群に属する結晶を区別することは出来なかった。また、収 集したデータの最大分解能は、I222の結晶が2.90 Å、P21212の結晶が2.80 Åで両者ほ ぼ同じであった。一般的に高輝度X線の使用が可能なSPring-8 BL44XUで収集する回 折 デ ー タ は よ り 高 分 解 能 な デ ー タ を 期 待 出 来 る 。 こ れ を 踏 ま え て 推 測 す る と 、 MicroMAX007 / R-AXIS IV++を用いて回折実験を行い、格子定数を決めることが出来な

かった多くの結晶はおそらく SPring-8 BL44XU で回折実験を行った結晶と同じ空間群 P21212に属する結晶だと予想される。つまり、本研究で確立した結晶化条件で得られる

stoPCNA2-stoPCNA3複合体の結晶はそのほとんどが空間群 P21212に属する結晶だと考

えられた。

Table. 1-4 Data-collection statistics

Values in parentheses are for the highest resolution shell.

Space group I222 P21212

Source MicroMax 007/R-AXIS IV++ SPring-8 BL44XU

Wavelength (Å) 1.5418 0.9000

Unit-cell parameters (Å) a = 91.1, b = 111.8, c = 170.9 a = 91.1, b = 160.6, c = 116.6 Resolution range (Å) 50.0-2.90 (3.06-2.90) 50.0-2.80 (2.95-2.80)

No. of unique reflections 19,736 (2,830) 42,314 (6,051)

Multiplicity 10.7 (10.8) 7.0 (7.2)

Completeness (%) 100 (100) 98.9 (97.6)

R_merge^# 0.101 (0.495) 0.135 (0.449)

<I/σ(I)> 19.7 (5.4) 10.3 (4.5)

#Rmerge = Σhkl Σi |Ii(hkl) - <I(hkl) >| / Σhkl Σi Ii(hkl), where Ii(hkl) is the intensity of the ith measurement of reflection hkl and <I(hkl)> is the average value of Ii(hkl) for all i measurements.

＜ 構 造 解 析 ・ 構 造 精 密 化 ＞

stoPCNA2-stoPCNA3複合体の構造解析は、空間群がI222に属す結晶から得られた回

折データを用いた分子置換法による構造解析を試みた。構造解析はサーチモデルに Sulfolobus solfataricus由来PCNA (ssoPCNA)の結晶構造 (PDB code 2izo³²⁾)を用いて、回 転 探 索 お よ び 並 進 探 索 の 計 算 に は プ ロ グ ラ ム パ ッ ケ ー ジ CCP4²⁹⁾内 の プ ロ グ ラ ム

Phaser³³⁾を使用した。まず、ssoPCNA2 (stoPCNA3との一次構造一致度：53%)の立体構

造をサーチモデルに stoPCNA3 の解の探索を行い明確な解が得られた (LLG = 404、 Z-score = 19.2)。次にstoPCNA3の座標を固定した後、ssoPCNA1 (stoPCNA2との一次構 造一致度：51%)の立体構造をサーチモデルにstoPCNA2の解の探索を行ったところ、こ ちらも明確な解 (LLG = 964、Z-score = 26.4)を得ることに成功して非対称単位中に

stoPCNA2が１分子、stoPCNA3が１分子含まれるstoPCNA2-stoPCNA3複合体の初期構

造を得ることができた。一方、空間群 P21212 に属する結晶から得られた回折データに ついても、I222同様に分子置換法による構造解析を試みた。この際、サーチモデルには I222 で構造精密化していた構造を用いて、I222 の場合と同様な方法で解析した結果、

非対称単位中にstoPCNA2が2分子、stoPCNA3が2分子含まれるstoPCNA2-stoPCNA3 複合体の初期構造を得ることに成功した (LLG = 8543、Z-score = 77.8)。構造解析により 得られた初期構造はプログラムパッケージ PHENIX ³⁴⁾のプログラム phenix.refine³⁵⁾を用 いて構造精密化を行い、プログラムCOOT ³⁶⁾を用いて分子モデルの構築・修正を行った。

また、プログラムMolProbity³⁷⁾を用いて最終構造の妥当性を確認した。構造精密化後の 統計値はTabel 1-5に示す。