2 カブモザイクウイルス (TuMV) ゲノム由来の遺伝子を導入した Nicotiana benthamiana における TuMV 抵抗性 CP Rp MP CP Rp MP protein-mediated resistance PMR RNA RNA mediated resistancerm
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(2) . カブモザイクウイルス（TuMV）ゲノム由来の遺伝子を導入した Nicotiana benthamiana における TuMV 抵抗性 ࠞࡉࡕࠩࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ㧔6W/8㧕ࠥࡁࡓ↱᧪ߩㆮવሶࠍዉߒߚ 0KEQVKCPCDGPVJCOKCPC ߦ߅ߌࠆ 6W/8 ᛶ᛫ᕈ. ✜ ⸒ ᬀ‛࠙ࠗ࡞ࠬߩㆮવሶߪ৻⥸ߦ㧘☸ሶࠍ᭴ᚑߔࠆᄖ. ࡄࡄࠗࡗߥߤ৻ㇱߩ‛ߢߪߔߢߦታ↪↪ߐࠇߡ ࠆ㧔Prins et al 2008, Fuchs and Gonsalves 2008㧕㧚. ⵍ࠲ࡦࡄࠢ⾰㧔CP㧕ㆮવሶ߿ㆮવሶߩⶄߦ㑐ਈߔࠆ. Potyvirus ߦዻߔࠆࠞࡉࡕࠩࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ㧔TuMV㧕. ⶄ㉂⚛㧔Rp㧕ㆮવሶߩઁ㧘࠙ࠗ࡞ࠬߩ⚦⢩㑆߹ߚߪ. ߪ㧘ࠞࡉ㧘࠳ࠗࠦࡦ߿⩿⒳ߥߤߩࠕࡉ࠽⑼‛ߦᗵ. 㐳〒㔌⒖ⴕߦ㑐ਈߔࠆ⒖ⴕ࠲ࡦࡄࠢ⾰㧔MP㧕ߥߤࠍࠦ. ᨴߒ߿⁁∝ࠢࠗࠩࡕߦ⪲ޔᩣోࠍ⪜❗ߐߖࠆߥߤߩ. ࠼ߒߡࠆ㧚ߎࠇࠄߩㆮવሶࠍᬀ‛ߦዉߔࠆߎߣ. ∛ᓽࠍᒁ߈ߎߔ㧔Tomlinson 1987㧕㧚ࠊࠇࠊࠇߪߎࠇ. ߢ࠙ࠗ࡞ࠬᛶ᛫ᕈࠍઃਈߢ߈ࠆߎߣ߇⍮ࠄࠇߡ߅ࠅ㧘. ߹ߢߦ TuMV ߩ CP ㆮવሶࠍዉߒߚࠪࡠࠗ࠽࠭࠽. ᛶ᛫ᕈᬀ‛ࠍᓧࠆߚߩㆮવሶߣߒߡߪ CP ߩઁ㧘Rp. 㧔Arabidopsis thaliana㧕ߦ߅ߌࠆ TuMV ᛶ᛫ᕈߦߟ. ߿ MP ࠍࠦ࠼ߔࠆㆮવሶ㧘߮ߎࠇࠄߩࠕࡦ࠴ࡦ. ߡ⸃ᨆߒߡ߈ߚ 㧔Nomura et al 2004㧕㧚ߒ߆ߒ㧘TuMV. ࠬㆮવሶߥߤ߇ࠆ㧚߹ߚ㧘ߎߩࠃ߁ߥᒻ⾰ォ឵ᬀ‛. ߇ࠦ࠼ߔࠆฦ⒳ࠥࡁࡓㆮવሶࠍᬀ‛ߦዉߒ㧘ዉ. ߦ߅ߌࠆᛶ᛫ᕈߩᯏ᭴ߪ㧘ዉㆮવሶ߆ࠄ⠡⸶ߐࠇߚ. ㆮવሶߩ⒳㘃ߦࠃࠆᛶ᛫ᕈࡌ࡞߿ᛶ᛫ᕈࠍ₪ᓧ. ࠲ ࡦ ࡄ ࠢ ⾰ ߇ 㑐 ਈ ߔ ࠆ protein-mediated resistance. ߔࠆߚߩല₸ࠍ⋧ኻ⊛ߦᲧセߒߚ⎇ⓥߪߥ㧚. 㧔PMR㧕ߣ㧘ォ౮ߐࠇߚ RNA ߇㑐ਈߔࠆ RNA mediated. ᬀ‛߆ࠄߩ↪ㆮવሶߩන㔌߿㧘ㆮવሶߩᯏ⢻ࠍ⺞. resistance㧔RMR㧕ߦᄢߐࠇߡ߈ߚ㧔Lomonossoff 1995㧕㧚. ߴߡታ↪‛ߦᔕ↪ߔࠆߚߦࠪࡠࠗ࠽࠭࠽߿࠲ࡃ. ࠲ࡃࠦࡕࠩࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ㧔TMV㧕ߩ႐ว㧘Rp ߢࠆ. ࠦߥߤߩࡕ࠺࡞ᬀ‛߇↪ߐࠇߡࠆ㧚ਛߢ߽࠲ࡃࠦ. 54K ࠲ࡦࡄࠢ⾰ㆮવሶࠍዉߒߚ࠲ࡃࠦߩᛶ᛫ᕈߦߪ. ߩㄭ✼⒳ߢࠆ Nicotiana benthamiana ߪ TMV ߿ CMV㧘. ⠡⸶↥‛߇ᔅⷐߢࠅ㧘54K ߩ⚂ 20 %ߒ߆⠡⸶ߐࠇߥ. PVY ߥߤᄙߊߩ࠙ࠗ࡞ࠬߦᗵฃᕈ߇㜞ߊ㧘TuMV ߦᗵ. ㆮવሶࠍዉߒߚ࠲ࡃࠦߢߪᛶ᛫ᕈࠍ␜ߐߥߎߣ. ᨴߒߚ㓙߽ᭂߡỗߒ∛ᓽࠍ␜ߔ㧚߹ߚ㧘ᬀ‛ߩ. ߆ࠄ㧘ߘߩࡔࠞ࠾࠭ࡓߪ PMR ߣ⠨߃ࠄࠇߚ㧔Carr et al. ਛ⒟ᐲߩᄢ߈ߐߢࠆߚࠨࡦࡊࡦࠣߒ߿ߔߛߌ. 1992 㧕㧚 ߹ ߚ 㧘 ࠕ ࡞ ࡈ ࠔ ࡞ ࡈ ࠔ ࡕ ࠩ ࠗ ࠢ ࠙ ࠗ ࡞ ࠬ. ߢߥߊធ߉ᧁ߽น⢻ߢ㧘ࡈ࠺ࠖࠬࠢᴺߦࠃࠆᒻ⾰. 㧔AIMV㧕ߩ Rp ዉᬀ‛ߢ߽ᛶ᛫ᕈߦߪ⠡⸶↥‛߇ᔅ. ォ឵ᴺ߽⏕┙ߐࠇߡࠆߎߣ߆ࠄ㧘࠙ࠗ࡞ࠬᛶ᛫ᕈߩ. ⷐߣߐࠇߡࠆ㧔Palukaitis et al 1997㧕㧚TMV ߩ MP ߢ. ⎇ⓥߦᐢߊ↪ࠄࠇߡࠆ㧚ߘߎߢᧄ⎇ⓥߢߪ㧘TuMV. ࠆ 30K ࠲ࡦࡄࠢ⾰ࠆߪࠪࡠࠢࡠࡃࡕࠩࠗࠢ࠙. ߩో㐳 CP ㆮવሶߩઁ㧘CP ㆮવሶߩ 3’ᧃ┵ㇱಽႮၮ. ࠗ࡞ࠬ㧔WCIMV㧕ߩ MP ߩ৻ߟߢࠆ 13K ࠲ࡦࡄࠢ. ㈩㧘NIb ㆮવሶߩ 3’ᧃ┵Ⴎၮ㈩߮ో㐳 VPg ㆮ. ⾰ߦᄌ⇣ࠍᣉߒߚ cDNA ࠍ࠲ࡃࠦߦዉߒߚߣߎࠈ㧘. વሶࠍዉߢ߈ࠆࠦࡦࠬ࠻ࠢ࠻ࠍ᭴▽ߒ㧘. ⶄᢙ⒳ߩ࠙ࠗ࡞ࠬߦኻߔࠆᛶ᛫ᕈ߇ઃਈߐࠇߡࠆ. N.benthamiana ߦዉߒߡᛶ᛫ᕈࡌ࡞߿ᛶ᛫ᕈ. 㧔Cooper et al 1995, Beck et al 1994㧕㧚৻ᣇ㧘CMV ߩ Rp. ߩ₪ᓧല₸╬ߦߟߡᲧセߒߚ㧚. ㆮવሶዉᬀ‛ߩᛶ᛫ᕈ߿㧘ࠨࠨࠥࡕࠩࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ. . 㧔CPMV㧕ߩ MP ㆮવሶዉᬀ‛ߦ߅ߌࠆᛶ᛫ᕈߪ㧘 RMR ߦࠃࠆߎߣ߇ႎ๔ߐࠇߡࠆ㧔Sijen et al 1996㧕㧚. ᧚ᢱ ᧚ᢱ߮ᣇᴺ ᣇᴺ 㧝㧚 TuMV ㆮવሶߩ ㆮવሶߩࠢࡠ࠾ࡦࠣ. Potyvirus ߩㆮવሶࠍዉߒߚᒻ⾰ォ឵ᬀ‛ߦߪ㧘ࠫ. TuMV ߩ CP ㆮવሶ㧘NIb ㆮવሶ߮ VPg ㆮવሶߩ. ࡖࠟࠗࡕ Y ࠙ࠗ࡞ࠬ㧔PVY㧕߿ࠛࡦ࠼࠙⒳ሶવᨴࡕࠩ. ฦ⒳㗔ၞࠍᬀ‛ߦዉߒ㧘ᛶ᛫ᕈࡌ࡞╬ࠍᲧセᬌ⸛. ࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ㧔PSbMV㧕ߩ NIb ㆮવሶࠍዉߒߚ࠲ࡃ. ߔ ࠆ ⋡ ⊛ ߢ 㧘 TuMV-JO ߩ CP ో 㐳 ㆮ વ ሶ 864 bp. ࠦ߿ࠛࡦ࠼࠙㧔Audy et al 1994, Jones et al 1998㧕㧘࠲ࡃ. 㧔Nomura et al 2004㧕 ߩઁ㧘CP ߩ 3’ᧃ┵ 430 bp㧔એ. ࠦࠛ࠶࠴࠙ࠗ࡞ࠬ㧔TEV㧕ߩ VPg ㆮવሶࠍዉߒߚ࠲. ਅ CP3’㧕㧘NIb ㆮવሶߩ 3’ᧃ┵ 820 bp㧔એਅ NIb3’㧕㧘. ࡃࠦ㧔Swaney et al 1995㧕╬߇ࠅ㧘ߎࠇࠄߩᒻ⾰ォ឵. VPg ㆮવሶో㐳 575 bp㧔એਅ VPg㧕 ࠍ RT-PCR ߦࠃࠅ. ᬀ‛ߦ߅ߌࠆ࠙ࠗ࡞ࠬᛶ᛫ᕈᯏ᭴ߪ RMR ߢࠆߣߐ. ࠢࡠ࠾ࡦࠣߒߚ㧚PCR ߦ↪ߚࡊࠗࡑߪ㧘CP3’. ࠇߡࠆ㧚ߎߩࠃ߁ߦᄙߊߩ࠙ࠗ࡞ࠬߣᬀ‛ߩ⚵ߺว. ߦߟߡߪ CPF-2 㧔GGATCCTGGAATTCCCGATCAA. ࠊߖߢ࠙ࠗ࡞ࠬߩࠥࡁࡓㆮવሶࠍዉߒߚᒻ⾰ォ឵ᬀ. ACCG㧕߮ CPR-1㧔GAGCTCTCATAACCCCTTAACG. ‛ߦ߅ߌࠆ࠙ࠗ࡞ࠬᛶ᛫ᕈߦߟߡ⎇ⓥ߇ㅴࠄࠇ㧘. CC㧕ࠍ㧘NIb3’ߦߟߡߪ NIbF1㧔GGATCCTATTGCGAT.
(3) 2012 神奈川県農業技術センター研究報告 第 155 号 2012 ᄹᎹ⋵ㄘᬺᛛⴚࡦ࠲⎇ⓥႎ๔ ╙ 155 ภ. . GCTGATGGCTC㧕߮ NIbR1 㧔GAGCTCTTACTGGT. N.benthamiana ߩ ᒻ ⾰ ォ ឵ ߪ ࡈ ࠺ ࠖ ࠬ ࠢ ᴺ. GATAAACACAAGCTT㧕ࠍ㧘߹ߚ㧘VPg ߦߟߡߪ. 㧔Horsch et al 1985㧕ߦࠃࠅⴕߞߚ㧚N.bentahmiana ߩ. VPgF1㧔GGATCCATGGCGAAAGGCAAGAGGCAAA. ⪲ࠍ 70 %ࠛ࠲ࡁ࡞ߢ㧝ಽ߮ᰴႮ⚛㉄࠽࠻࠙. G㧕߮ VPgR1㧔GAGCTCTTACTCGTGGTCCACTG. ࡓߢ㧡ಽ㑆ᠣᜈᓟ㧘Ṍ⩶᳓ߢᵞᵺߒߚ㧚ࠪࡖౝߩ. GGGACGA㧕ࠍ↪ߚ㧚ߥ߅㧘ࡃࠗ࠽ࡌࠢ࠲. ࠕࠣࡠࡃࠢ࠹࠙ࡓ⩶ᶧਛߢ 1cm ⒟ᐲߦࡔࠬߢಾᢿߒ㧘. pBI121 ߦࠢࡠ࠾ࡦࠣߔࠆߚ㧘ߕࠇߩࡊࠗࡑ. MS-NB ၭ㧔1 µg/ml 6-ࡌࡦࠫ࡞ࠕࡒࡁࡊࡦ㧘0.1. ߦ߽㒢㉂⚛ㇱߣߒߡࡈࠜࡢ࠼ࡊࠗࡑߦߪ. µg/ml ࠽ࡈ࠲ࡦ㈶㉄㧕ߦ⟎ᐥߒߡሽၭ㙃ߒߚ㧚. BamHI ㇱࠍ㧘߹ߚ㧘ࡃࠬࡊࠗࡑߦߪ SacI. 㧟ᣣᓟߦࠢࡈࠜࡦࠍ MS-NB ၭߦ⒖ᬀߒ㧘. ㇱࠍઃടߒߚ㧔㈩ਅ✢ㇱ㧕㧚RT-PCR ߦߪ♖ߒߚ. ࠕࠣࡠࡃࠢ࠹࠙ࡓࠍ㒰⩶ߔࠆߣߣ߽ߦࠞ࡞ࠬᒻᚑࠍ. TuMV-JO ߩ RNA ࠍ ㍌ ဳ ߦ RNA LA PCR ࠠ ࠶ ࠻. ଦㅴߒߚ㧚10 ᣣᓟߦࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦ㧔25 µg/ml㧕߮ࠢ. 㧔TaKaRa㧕ࠍ↪ߡⴕߞߚ㧚RT-PCR ߩᔕ᧦ઙߪᣢ. ࡈࠜࡦ㧔150 µg/ml㧕ࠍ MS-NB ၭߦ⒖ᬀߒ㧘. ႎ㧔Nomura et al 2004㧕ߦḰߓߡⴕߞߚ㧚. ࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦ⠴ᕈࠍㆬᛮࡑࠞߦߒߡᒻ⾰ォ឵ߩ. PCR Ⴧ ᢿ ߪ ߕ ࠇ ߽ 㧘 pT7Blue ࡌ ࠢ ࠲ . ㆬᛮࠍㅴߚ㧚ࠞ࡞ࠬ߆ࠄᒻᚑߐࠇߚਇቯ⧘ࠍߐࠄߦ. 㧔Novagen㧕ߦࠢࡠ࠾ࡦࠣᓟ㧘ABI3130DNA ࠪࠤ. ࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦ߮ࠢࡈࠜࡦࠍ MS ၭߦ⒖ᬀ. ࡦࠨߦࠃࠅႮၮ㈩ࠍቯߒ㧘⋡⊛ߣߔࠆㆮવሶ߇. ߒߡㆬᛮࠍㅴߚ㧚ౣಽൻߒߡ⊒ᩮߒ㧘ᬀ‛߇ᱜᏱ. න㔌ߢ߈ߡࠆߎߣࠍ⏕ߒߚ㧚ࠢࡠ࠾ࡦࠣߒߚฦ. ߦ↢⢒ߒߚ߽ߩࠍ T0 ઍߣߒߡ㗅ᰴ㋬ߍߒ㧘25 ͠㧘. ㆮવሶᢿ ࠍࡊࠬࡒ࠼ࠍ㒢㉂⚛ BamHI ߮. 12 ᤨ㑆ᣣ㐳ߩࠣࡠࠬ࠴ࡖࡦࡃߢ⢒ᚑߒߚ㧚ฦᒻ⾰. SacI ߢಣℂߒߡฦㆮવሶᢿ ࠍࠥ࡞♖ߒߚ㧚ฦㆮવ. ォ឵߆ࠄᰴઍࠍណ⒳ߒ㧘ࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦ㧔25 µg/l㧕. ሶࠍࡃࠗ࠽ࡌࠢ࠲pBI121 ߩ GUS ㆮવሶߣ⟎឵. ࠍ MS ၭߦή⩶⒳ߒ㧘ࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦ⠴ᕈࠍࡑ. ߒ㧘ㆮવሶዉ↪ߩࠦࡦࠬ࠻ࠢ࠻ߣߒߡ pBI-CP3’㧘. ࠞߦߒߡᒻ⾰ォ឵ T1 ઍࠍㆬᛮߒߚ㧚. pBI-NIb3’߮ pBI-VPg ࠍ᭴▽ߒߚ㧔࿑ 1㧕㧚ߎࠇࠄߩ. 㧟㧚᳝ᶧធ⒳⹜㛎. ࠦࡦࠬ࠻ࠢ࠻ߪߘࠇߙࠇ࠻ࡍࠕࡦ࠲࡞ࡔࠗ࠹ࠖ. TuMV-JO ߦᗵᨴߒߚࠦࠞࡉ߹ߚߪ N.benthamiana ߩ. ࡦࠣᴺ㧔Ditta et al 1980㧕ߦࠃࠅࠕࠣࡠࡃࠢ࠹࠙ࡓ. ࡕࠩࠗࠢ⪲ࠍធ⒳Ḯߣߒ㧘T1 ߮ߘߩ⥄ᱺᓟઍߢࠆ. 㧔LBA4404㧕ߦ⒖ⴕߐߖߚ㧚. T2 ઍߩ♽⛔ฦ 8㨪20 ߦቯᴺߦࠃࠅ᳝ᶧធ⒳ߒߚ㧚. 㪩㪙. 䇭㪣㪙 㪥㪦㪪㪄㫇㫉㫆 㪥㪧㪫㸈 㪥㪦㪪㪄㫋㪼㫉. 㪚㪸㪤㪭㩷㪊㪌㪪㩷㫇㫉㫆. 㪥㪦㪪㪄㫋㪼㫉 㪫㫌㪤㪭㪄㪚㪧 㪏㪍㪋㪹㫇 㪙㪸㫄㪟㪠㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㪪㪸㪺㪠. 㪩㪙. ⥄ኅฃ♖ߦࠃࠅᰴઍࠍណ⒳⢒ᚑߒ㧘T3 ߮ T4 ઍ ߳ߩធ⒳ࠍⴕߥߞߡ TuMV ߦኻߔࠆᔕࠍ⺞ߴߚ㧚. 䇭㪣㪙 㪥㪦㪪㪄㫇㫉㫆 㪥㪧㪫㸈 㪥㪦㪪㪄㫋㪼㫉. 㪚㪸㪤㪭㩷㪊㪌㪪㩷㫇㫉㫆. 㪫㫌㪤㪭㪄㪚㪧㪊㩾 㪥㪦㪪㪄㫋㪼㫉 㪋㪊㪇㪹㫇 㪙㪸㫄㪟㪠㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㪪㪸㪺㪠. 㧠㧚 ዉㆮવሶߩ ዉㆮવሶߩ⏕ ᒻ⾰ォ឵ᬀ‛ߦ߅ߌࠆዉㆮવሶߩ⏕ߪ㧘T0 ઍ. 㪩㪙. 䇭㪣㪙 㪥㪦㪪㪄㫇㫉㫆 㪥㪧㪫㸈 㪥㪦㪪㪄㫋㪼㫉. 㪚㪸㪤㪭㩷㪊㪌㪪㩷㫇㫉㫆. 㪥㪦㪪㪄㫋㪼㫉 㪫㫌㪤㪭㪄㪥㪠㪹㪊㩾 㪏㪉㪇㪹㫇 㪙㪸㫄㪟㪠㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㪪㪸㪺㪠. 㪩㪙. 䇭㪣㪙 㪥㪦㪪㪄㫇㫉㫆 㪥㪧㪫㸈 㪥㪦㪪㪄㫋㪼㫉. 㪚㪸㪤㪭㩷㪊㪌㪪㩷㫇㫉㫆. ߹ߚ㧘ᛶ᛫ᕈ߇ᓧࠄࠇߚ♽⛔ߩ৻ㇱߦߟߡߪ㧘. 㪫㫌㪤㪭㪄㪭㪧㪾 㪥㪦㪪㪄㫋㪼㫉 㪌㪎㪌㪹㫇 㪙㪸㫄㪟㪠㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㪪㪸㪺㪠. ߦߟߡߪࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦ⠴ᕈࠍㆬᛮ⢒ᚑᓟ㧘CP ㆮવሶߦߟߡߪ TuMV-CP ㆮવሶߩౝㇱߦ⸳⸘ߒߚ ᬌࡊࠗࡑߦࠃࠆ PCR ߦࠃࠅⴕߞߚ㧚ᬌࡊࠗ ࡑ ߦ ߪ CP ㆮ વ ሶ ౝ ㇱ ߦ ⸳ ⸘ ߒ ߚ CPU1 㧔 5’-TTAACAGACGAGCAAAAGCA-3’ 㧕 ߮ CPL1 㧔5’-TCCATCCAAGCCGAACAAAT-3’㧕ࠍ↪㧘ᒻ⾰ ォ឵߆ࠄߒߚో DNA ࠍ㍌ဳߦ PCR ࠍⴕߞߚ㧚. ࿑㧝࠲ࠢࡌ࠽ࠗࡃޓR$+ࠍၮߦ᭴▽ߒߚࠦࡦࠬ࠻ࠢ࠻ߩ᭴ㅧ㧚 0152TQ㧦ࡁࡄࡦࠪࡦ࠲ࡊࡠࡕ࠲026Τ㧦ࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦᛶ᛫ᕈㆮવሶ015 6GT㧦ࡁࡄࡦࠪࡦ࠲࠲ࡒࡀ࠲%C/8㧿RTQ㧦ࠞࡈࡢࡕࠩࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ 㧿ࡊࡠࡕ࠲6W/8㧦ࠞࡉࡕࠩࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ%2㧦ᄖⵍ࠲ࡦࡄࠢ⾰ㆮવሶ0+D㧦ⶄ㉂ ⚛ㆮવሶ82I㧦ࠥࡁࡓ⚿ว࠲ࡦࡄࠢ⾰ㆮવሶ. ߹ߚ㧘CP3’㧘NIb3’߮ VPg ㆮવሶߩᬌߦߟߡߪ. 㧞㧚 Nicotiana benthamiana ߩᒻ⾰ォ឵. ࡦࠍ MS ၭߦή⩶ߪ⒳ߒ㧘⮎⠴ᕈߦࠃࠆㆬᛮ. ዉㆮવሶߩჇߦ↪ߚࡊࠗࡑߦࠃࠆ PCR ߦ ࠃࠅⴕߞߚ㧚T1 ઍߦߟߡߪ⥄ᱺ⒳ሶࠍࠞ࠽ࡑࠗࠪ.
(4) . カブモザイクウイルス（TuMV）ゲノム由来の遺伝子を導入した Nicotiana benthamiana における TuMV 抵抗性 ࠞࡉࡕࠩࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ㧔6W/8㧕ࠥࡁࡓ↱᧪ߩㆮવሶࠍዉߒߚ 0KEQVKCPCDGPVJCOKCPC ߦ߅ߌࠆ 6W/8 ᛶ᛫ᕈ. ᓟ㧘PCR ߦࠃࠅዉㆮવሶࠍᬌߒߡ⋡⊛ߣߔࠆᒻ⾰. ߒߚ PCR ࡊࡠࡉࠍ↪㧘ࡂࠗࡉ࠳࡚ࠗࠪࡦ. ォ឵ߢࠆߎߣࠍ⏕ߒߚ㧚ߐࠄߦ㧘ᛶ᛫ᕈ߮ᗵ. ߮ࠪࠣ࠽࡞ߩᬌࠍⴕߞߚ㧚. ฃᕈࠍ␜ߔౖဳ⊛ߥ♽⛔ࠍⶄᢙㆬ߮㧘ࠨࠩࡦࡉࡠ࠶࠻. 㧣㧚 TuMV ᛶ᛫ᕈᒻ⾰ォ឵߆ࠄߩ ᛶ᛫ᕈᒻ⾰ォ឵߆ࠄߩ siRNA ߩᬌ. ⸃ᨆࠍⴕߞߚ㧚. ో RNA ߪࡁࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆߣห᭽ߦ 0.5 g ߩ. 㧡㧚ࠨࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ ࠨࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ. ⪲߆ࠄߒߚ㧚siRNA ߩಽ↹ߦߪႮൻ࠴࠙ࡓࠍ. 0.5 g ߩ⪲߆ࠄో DNA ࠍ CTAB ᴺߦࠃࠅߒߚ㧚. ↪ߡಽ↹ߒߚ㧚ࠛ࠲ࡁ࡞ᴉᲚᓟߩૐಽሶ RNA ࠨ. ߹ߕ㧘0.1㨪1 g ߩ⪲ࠍ-80 ͠ߩࡈࠩౝߢ㋬ߣ. ࡦࡊ࡞ࠍ 50 µl ߩ DEPC ಣℂ᳓ߦṁ⸃ߒ㧘ߎߩౝ 10 µl. ߣ߽ߦಓ⚿ᓟ㧘⏴⎈ߒߡࡄ࠙࠳⁁ߦߒߚ㧚㋬ߦࠨ. ࠍ㔚᳇ᵒേߦଏ⹜ߒߚ㧚pT7Blue ࡌࠢ࠲ߦᝌߒߚ. ࡦࡊ࡞ߩ 3 ㊂ߩ CTAB ᶧࠍട߃ߡᷙวߒ㧘ṁ⸃. CP ㆮવሶࠍ↪㧘DIG ࡌ࡞ߒߚࡦࠬ㎮ߩ RNA. ᓟ㧘ࡑࠗࠢࡠ࠴ࡘࡉ߹ߚߪ 15 ml ㆙ᔃ࠴ࡘࡉߦ࿁. ࡊࡠࡉࠍߘࠇߙࠇวᚑߒ㧘ࡂࠗࡉ࠳࡚ࠗࠪࡦ. ߒߚ㧚1/2 ኈ㊂ߩ TE 㘻ࡈࠚࡁ࡞߮ࠢࡠࡠࡈࠜ. ߦ↪ߚ㧚㔚᳇ᵒേ߮࠽ࠗࡠࡦࡔࡦࡉࡦ߳ߩォ౮㧘. ࡞ࡓࠍട߃ߡォୟᷙߒ㧘15,000 × g ߢ 10 ಽ㑆㆙ᔃߒ. ࠪࠣ࠽࡞ߩᬌߪߕࠇ߽ࡁࠩࡦࡉࡠ࠶࠻ߣห᭽. ߚ㧚ጀࠍ࿁ߒ㧘╬㊂ߩࠢࡠࡠࡈࠜ࡞ࡓࠗ࠰ࠕࡒ. ߩᚻᴺߢⴕߞߚ㧚. ࡞ࠕ࡞ࠦ࡞ࠍട߃ߡォୟᷙߒ㧘15,000 × g ߢ 10 ಽ. ⚿ ᨐ. 㑆㆙ᔃߒߚ㧚ጀࠍ࿁ߒ㧘╬㊂ߩࠗ࠰ࡊࡠࡄࡁ࡞ ߹ߚߪ 2.5 ㊂ߩ 99 %ࠛ࠲ࡁ࡞ࠍട߃ߡᷙวߒ㧘. 㧝㧚TuMV-CP ㆮવሶࠍ ㆮવሶࠍዉߒߚ ዉߒߚ Nicotiana benthamiana. 15,000 × g ߢ 15 ಽ㑆㆙ᔃߒߡ DNA ࠍᴉᲚߐߖߚ㧚. ߩ TuMV ߦኻ ߔࠆᔕ ߔࠆᔕ. 70 %ࠛ࠲ࡁ࡞ᵞᵺࠍⴕ㧘10 ಽ㑆㘑ੇᓟ㧘RNase ࠍ. N.benthamiana ߦࡈ࠺ࠖࠬࠢᴺߢ TuMV-CP ߮. TE ߦṁ⸃ߒߡ DNA ࠨࡦࡊ࡞ߣߒߚ㧚ಽశశᐲ⸘. CP3’ࠍዉߒ㧘ฦㆮવሶߦߟߡ 20 ߩࠞ࠽ࡑࠗ. 㧔Beckman㧕ߦࠃࠅ DNA ߩỚᐲࠍ᷹ቯߒ㧘10 µg ߩࠥ. ࠪࡦ⠴ᕈࠍ␜ߔౣಽൻࠍᓧߚ㧚ߎࠇࠄߩᐜᬀ‛߆. ࡁࡓ DNA ࠍ㒢㉂⚛ BamHI ߢᶖൻߒߚ㧚㒢㉂⚛ಣ. ࠄ DNA ࠍߒ㧘PCR ᴺߦࠃࠅዉㆮવሶߩሽࠍ. ℂᓟߩ DNA ࠍࡈࠚࡁ࡞ࠢࡠࡠࡈࠜ࡞ࡓߦࠃ. ⺞ߴߚ⚿ᨐ㧘ోߡߩ߆ࠄ⋡⊛ߣߔࠆㆮવሶ߇ᬌ. ࠅ♖ߒ㧘ࠛ࠲ࡁ࡞ᴉᲚᓟ㧘10 µl ߩ TE ߦౣᐲṁ⸃. ߐࠇߚ㧚ߎࠇࠄߩᒻ⾰ォ឵ T0 ઍ߆ࠄ T1 ઍࠍណ. ߒ㧘1 %ࠕࠟࡠࠬࠥ࡞㔚᳇ᵒേᓟ㧘ࡃࠠࡘࡓࡉࡠ. ⒳ߒ㧘ࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦߦࠃࠆㆬᛮࠍߒߡ⢒ᚑᓟ㧘TuMV. ࠶࠹ࠖࡦࠣⵝ⟎. ᛶ᛫ᕈᬌቯߦଏ⹜ߒߚ㧚ߘߩ⚿ᨐ㧘TuMV-CP ࠍዉߒ. 㧔Bio-Rad㧕ࠍ↪ߡ࠽ࠗࡠࡦࡔࡦࡉࡦ㧔Roshe㧕ߦ. ߚᒻ⾰ォ឵㧔Nb-Tu-CP㧕ߢߪ T1 ઍߩᄙߊߪ㕖ᒻ⾰. DNA ࠍォ౮ߒߚ㧚ࡊࡠࡉߩวᚑߪ DIG PCR ࡊࡠ. ォ឵ߣห᭽ߦ TuMV ᗵฃᕈߢߞߚ߇㧘ᛶ᛫ᕈ. ࡉวᚑࠠ࠶࠻ 㧔Roshe㧕 ࠍ↪㧘ฦㆮવሶࠍࠢࡠ࠾. ߇ᄙߊࠍභࠆᒻ⾰ォ឵♽⛔߇ࠄࠇ㧘CP1㧘CP2㧘. ࡦࠣߒߚࡊࠬࡒ࠼ࠍ㍌ဳߦߒߡዉㆮવሶߦ⋧ᒰߔ ࠆࡊࡠࡉࠍวᚑߒߚ㧚ࡊࡠ࠻ࠦ࡞ߦᓥ㧘 0.1 %SDS ࠍ 2SSC ߮ 0.2SSC ߦࠃࠆᵞᵺ㧘 ࡉࡠ࠶ࠠࡦࠣ߮ AP ᮡ⼂ DIG ᛫ಣℂࠍⴕ㧘ࡔࡦ ࡉࡦߩᵞᵺᓟ㧘ൻቇ⊒శᬌࡈࠖ࡞ࡓ㧔Roche㧕ߦ 5 㨪15 ಽ㑆㔺శߒߡࠪࠣ࠽࡞ࠍᬌߒߚ㧚 㧢㧚ࡁࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ ࡁࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ ో RNA ߪ Easyprep RNA ࠠ࠶࠻㧔TaKaRa㧕ࠍ. A. B. C. D. ↪㧘0.5 g ߩ⪲߆ࠄߒߚ㧚ߕࠇߩࠨࡦࡊ࡞߽ 5 µl ߩో RNA ࠍ MOPS ᄌᕈࠥ࡞ߦࠃࠅᵒേߒ㧘ࡃࠠࡘ ࡓࡉࡠ࠶࠹ࠖࡦࠣߦࠃࠅ࠽ࠗࡠࡦࡔࡦࡉࡦߦォ౮ ߒߚ㧚ࡊࡠࡉߦߪࠨࠩࡦࡉࡠ࠶࠻ߣห᭽ߦ DIG ᮡ⼂. ࿑ 2 N.benthamiana 㕖ᒻ⾰ォ឵(A)߮ TuMV-CP ㆮવሶࠍዉ ߒߚᒻ⾰ォ឵(B~D)ߩ TuMV ߦኻߔࠆᔕ. A, B㧦ᗵฃᕈޔC㧦࿁ᓳဳᛶ᛫ᕈޔD㧦ᛶ᛫ᕈ.
(5) 2012 神奈川県農業技術センター研究報告 第 155 号 2012 ᄹᎹ⋵ㄘᬺᛛⴚࡦ࠲⎇ⓥႎ๔ ╙ 155 ภ. 1ޓTuMV-CPㆮવሶࠍዉߒߚN.benthamiana ᒻ⾰ォ឵ T1߮T2ઍߩTuMVߦኻߔࠆᔕ. ⷫ♽⛔ ޓ6Qᬀ‛ %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 ޓ6ᬀ‛ %24 4 4 %24 4 4 %25 5 %24 4 4. 6W/8ߦኻߔࠆᔕ ᛶ᛫ᕈ㧔߁ߜ࿁ᓳဳ㧕ᗵฃᕈ. ᛶ᛫ᕈ 㧔㧑㧕. . TuMV-CP3’ࠍዉߒߚᒻ⾰ォ឵㧔Nb-Tu-CP3’㧕ߩ TuMV ߦኻߔࠆᔕߪ Nb-Tu-CP ߣ߶߷ห᭽ߢࠅ㧘 ߘߩᔕߪቢోߥᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ㧘࿁ᓳဳᛶ᛫ᕈࠍ ␜ߔ߮ᗵฃᕈߦಽ㘃ߐࠇߚ߇㧘ᛶ᛫ᕈ. . . . . . ߇ᓧࠄࠇߚߩߪ CP3’1㧘CP3’3㧘CP3’4㧘CP3’5㧘CP3’6㧘 CP3’9㧘CP3’10㧘CP3’12 ߮ CP3’13 ߩ 9 ♽⛔ߢߞߚ 㧔 2㧕㧚ߎߩ߁ߜ T1 ߩㆊඨᢙ߇ᛶ᛫ᕈߣߥࠆ♽ ⛔ߪ CP3’3 ߮ CP3’9 ߩ 2 ♽⛔ߢࠅ㧘CP3’3 ߮ CP3’10 ߩ৻ㇱ ߦߟ ߡ ߪ࿁ᓳဳ ᛶ᛫ᕈ ࠍ␜ߒ ߚ 㧚 CP3’3 ߩ T1 ߆ࠄᛶ᛫ᕈߩ 5 ࠍㆬᛮߒ㧘T2 ઍ 㧔CP3’3-R1㨪R5㧕ߩᬌቯࠍⴕߞߚߣߎࠈ㧘Nb-Tu-CP ߣห᭽ߦోߡߩ߇ TuMV ᛶ᛫ᕈߩ♽⛔㧔CP3’3-R1 㨪R3㧕ߣ㧘ᛶ᛫ᕈ/ᗵฃᕈ߇ಽ㔌ߔࠆ♽⛔㧔CP3’3-R4, R5㧕߇ᓧࠄࠇߚ㧚 㧞ޓ6W/8%2̉ㆮવሶࠍዉߒߚ0DGPVJCOKCPC ᒻ⾰ォ឵ T1߮T2ઍߩTuMVߦኻߔࠆᔕ. ⷫ♽⛔. 6W/8ߦኻߔࠆᔕ ᛶ᛫ᕈ㧔߁ߜ࿁ᓳဳ㧕ᗵฃᕈ. ޓ6Qᬀ‛ %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 %2 CP9㧘CP12㧘CP13㧘CP19 ߮ CP20 ߩ㧣♽⛔ߦߟߡ %2 %2 ߪଏ⹜ߩ 50%એ߇ TuMV ធ⒳ᓟ߽ోߊ∛ᓽ߇ %2 %2 ࠄࠇߥߎߣ߆ࠄ TuMV ᛶ᛫ᕈ♽⛔ߣ್ᢿߒߚ㧔 %2 1, ࿑ 2D㧕㧚߹ߚ㧘ធ⒳ߒߚ♽⛔ਛߩ৻ㇱᬀ‛ߦ㧘TuMV %2 %2 ࠍធ⒳ߒߚᓟߦዷ㐿ߒߡߊࠆ⪲ߦߪ∛ᓽ߇ࠄࠇࠆ߇㧘 %2 %2 ߘߩᓟߦዷ㐿ߔࠆ⪲ߦߪ∛ᓽ߇ࠄࠇߥߊߥࠆ࿁ᓳ %2 ဳᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ߇⏕ߐࠇߚ㧔࿑ 2 C㧕㧚 %2 %2 ᛶ᛫ᕈ♽⛔ CP1㧘CP2 ߮ CP12 ߆ࠄߘࠇߙࠇ㧟 ޓ6ᬀ‛ %2 4 ࠍㆬ߮㧘ᓟઍࠍណ⒳ߒ㧘ࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦߦࠃࠆㆬᛮ⢒ 4 ᚑᓟ㧘TuMV ᛶ᛫ᕈᬌቯࠍⴕߞߚ㧚ߘߩ⚿ᨐ㧘ଏ⹜ 4 4 ߩ ో ߡ ߇ ᛶ ᛫ ᕈ ࠍ ␜ ߔ ♽ ⛔ 㧔 CP2-R2 㧘 CP2-R3 㧘 4 CP12-R1㧘CP12-R2㧕߮ᛶ᛫ᕈߣᗵฃᕈ߇ಽ㔌ߔࠆ♽. ᛶ᛫ᕈ 㧔㧑㧕. . . . . ⛔㧔CP1-R1㧘CP1-R2㧘CP1-R3㧘CP2-R1㧘CP12-R3㧕 ߇ᓧࠄࠇߚ㧚߹ߚ㧘ో߇ᛶ᛫ᕈߣߥࠆ♽⛔ߩᓟઍ. 㧞 㧚 NIb ߮ VPg ㆮ વ ሶ ࠍ ዉ ߒ ߚ Nicotiana. ߦߟߡᛶ᛫ᕈᬌቯࠍⴕߞߚߣߎࠈ㧘ోߡߩ߇ᛶ. benthamiana ߩ TuMV ߦኻ ߔࠆᔕ ߔࠆᔕ. ᛫ᕈߢߞߚ㧔࠺࠲⋭⇛㧕㧚. N.benthamiana ߦ TuMV ߩ NIb3’ࠍዉߒߚ 20 .
(6) . カブモザイクウイルス（TuMV）ゲノム由来の遺伝子を導入した Nicotiana benthamiana における TuMV 抵抗性 ࠞࡉࡕࠩࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ㧔6W/8㧕ࠥࡁࡓ↱᧪ߩㆮવሶࠍዉߒߚ 0KEQVKCPCDGPVJCOKCPC ߦ߅ߌࠆ 6W/8 ᛶ᛫ᕈ. ߩౣಽൻࠍᓧߚ㧚ߎࠇࠄߩᒻ⾰ォ឵. ᕈࠍ␜ߒߚߩߪ VPg6㧘VPg7 ߮ VPg9 ߩ 3 ♽⛔ߢ. 㧔Nb-Tu-NIb3’㧕 T0 ઍ߆ࠄᰴઍ㧔T1 ઍ㧕ࠍ⥄ኅ. ߞߚ㧚. ណ⒳⢒ᚑߒߡ TuMV ᛶ᛫ᕈᬌቯߦଏ⹜ߒߚ㧔 3㧕㧚 ߘߩ⚿ᨐ㧘T1 ઍߩᄙߊߪ CP ㆮવሶࠍዉߒߚ႐ว ߣหߓߊ TuMV ᗵฃᕈߢߞߚ߇㧘NIb3’3㧘NIb3’7㧘 NIb3’8㧘NIb3’10㧘NIb3’12㧘NIb3’14 ߮ NIb3’15 ߩ㧣 ♽⛔ߢߪ 50~90 %ߩ߇ቢోߥᛶ᛫ᕈࠍ␜ߒߚ㧚߹ ߚ㧘NIb3’3 ߮ NIb3’10 ߩਛߦ࿁ᓳဳᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ ߇⏕ߐࠇߚ㧚ᛶ᛫ᕈ♽⛔ NIb3’3 ߮ NIb3’7 ߩ T1 ᬀ‛߆ࠄᓟઍࠍណ⒳ߒ㧘ࠞ࠽ࡑࠗࠪࡦߦࠃࠆㆬᛮ⢒ ᚑᓟ㧘TuMV ᛶ᛫ᕈᬌቯࠍⴕߞߚ㧚ߘߩ⚿ᨐ㧘ଏ⹜ ߩ ో ߡ ߇ ᛶ ᛫ ᕈ ࠍ ␜ ߔ ♽ ⛔ 㧔 NIb3’3-R1 㨪 R3 㧘 NIb3’7-R1㨪R3㧕߇ᓧࠄࠇߚ㧚 㧟ޓ6W/80+D̉ㆮવሶࠍዉߒߚ0DGPVJCOKCPC ᒻ⾰ォ឵ T1߮T2ઍߩTuMVߦኻߔࠆᔕ. ⷫ♽⛔. 6W/8ߦኻߔࠆᔕ ᛶ᛫ᕈ㧔߁ߜ࿁ᓳဳ㧕 ᗵฃᕈ. ޓ6Qᬀ‛ 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D 0+D ޓ6ᬀ‛ 0+D 4 4 4 0+D 4 4 4 . ᛶ᛫ᕈ 㧔㧑㧕. . . . . 㧠ޓ6W/882Iޓㆮવሶࠍዉߒߚ0DGPVJCOKCPC ᒻ⾰ォ឵ T1ઍߩTuMVߦኻߔࠆᔕ. 6W/8ߦኻߔࠆᔕ ⷫ♽⛔ ᛶ᛫ᕈ㧔߁ߜ࿁ᓳဳ㧕 ᗵฃᕈ 82I㧝 82I㧞 82I㧟 82I㧠 82I㧡 82I㧢 82I㧣 82I㧤 82I㧥 82I㧝㧜 82I㧝㧝 82I㧝㧞 82I㧝㧟 82I㧝㧠 82I㧝㧡 82I㧝㧢 82I㧝㧣 82I㧝㧤 82I㧝㧥 82I㧞㧜 㕖ᒻ⾰ォ឵ . ᛶ᛫ᕈ 㧔㧑㧕 . 㧟㧚TuMV-CP ㆮવሶࠍ ㆮવሶࠍዉߒߚ ዉߒߚ Nicotiana benthamiana ߩࠨࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ ࠨࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ Nb-Tu-CP ߩ߁ߜᛶ᛫ᕈ߮ᗵฃᕈࠍ␜ߔฦ♽⛔ߩ ࠦࡇᢙࠍ⸃ᨆߒߚߣߎࠈ㧘T1 ઍߢᛶ᛫ᕈ♽⛔ߣ್ ᢿߒߚ㧣♽⛔㧔CP1㧘CP2㧘CP9㧘CP12㧘CP13㧘CP19㧘 CP20㧕ߩ߁ߜ CP19 ࠍ㒰ߊ 6 ♽⛔ߢ 2 ᧄએߩࡃࡦ࠼ ߇ࠄࠇ㧘ⶄᢙࠦࡇߢࠆߎߣ߇⏕ߐࠇߚ㧔࿑ 3㧕㧚ߎࠇߦኻߒ㧘ᗵฃᕈ♽⛔ߢߪ㧣♽⛔ਛ 6 ♽⛔㧔CP10㧘 CP11㧘CP14㧘CP15㧘CP16㧘CP17㧕ߢන৻ࡃࡦ࠼߇㧘 ߹ߚ㧘15 %ߩ߇࿁ᓳဳᛶ᛫ᕈࠍ␜ߒߚ CP18 ߢߪ 2 ᧄߩࡃࡦ࠼߇ᬌߐࠇߚ㧚 1 . 2 . 3. 4. R. R. R. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. R. R. S. S. S. S. S. 13. 14. TuMV ߩ VPg ㆮવሶߦߟߡ߽ 20 ߩᒻ⾰ォ឵ T0 ઍ㧔Nb-Tu-VPg㧕ࠍ₪ᓧߒߚ㧚T1 ઍߩ TuMV ᛶ ᛫ᕈᬌቯߢߪ㧘VPg1㧘VPg2㧘VPg6㧘VPg7㧘VPg8㧘. R. R. S. S. ࿑ 3 TuMV-CP ㆮવሶࠍዉߒߚ Nicotiana benthamiana ᒻ⾰ォ឵ T1 ઍߩࠨࠩࡦ ࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ.. VPg9㧘VPg10 ߮ VPg19 ߩ 8 ♽⛔ਛߦᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ. 1, CP1;. ߇ࠄࠇߚ㧔 4㧕㧚߹ߚ㧘VPg3㧘VPg㧠㧘VPg5. ဳ R㧦 ᛶ᛫ᕈ S㧦ᗵฃᕈ. 9, CP11;. 2, CP2;. 3, CP9;. 10, CP14;. 4, CP12;. 11, CP15;. 5, CP13;. 12, CP16;. 6, CP19;. 13, CP17;. 7, CP20;. 8, CP10;. 14, CP18.. ߮ VPg10 ߩ 4 ♽⛔ਛߦ࿁ᓳဳᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ߇⏕. 㧠㧚ዉㆮવሶߩ ዉㆮવሶ ߩ⊒⸃ᨆ. ߐࠇߚ㧚ߎࠇࠄߩ߁ߜ 50 %એߩ߇ቢోߥᛶ᛫. Nb-Tu-CP ߩ TuMV ᛶ᛫ᕈ♽⛔߮ᗵฃᕈ♽⛔߆ࠄ.
(7) 2012 神奈川県農業技術センター研究報告 第 155 号 2012 ᄹᎹ⋵ㄘᬺᛛⴚࡦ࠲⎇ⓥႎ๔ ╙ 155 ภ. . ో RNA ࠍᓟ㧘ࡁࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆࠍⴕߞߚ㧚. વሶ߇ᬌߐࠇߥߩߦኻߒ㧘ᗵฃᕈ♽⛔ߢࠆ. ߥ߅㧘T1 ઍߩဳߪ RNA ↪ߩࠨࡦࡊ࡞⪲ࠍ. NIb3’2㧘NIb3’4㧘NIb3’6㧘߮ NIb3’11 ߢዉㆮવሶ. ណขᓟߦ࠙ࠗ࡞ࠬࠍធ⒳ߒߡ․ቯߒߚ㧚ߘߩ⚿ᨐ㧘ᛶ. ߩ⏕ߥࠪࠣ࠽࡞߇ᬌߐࠇߚ㧔࿑ 6㧕㧚. ᛫ᕈ♽⛔ߢࠆ CP1㧘CP2㧘CP9㧘CP12㧘CP13㧘CP19 ߮ CP20 ߢߪోߡߩଏ⹜ߢ mRNA ߇ᬌߐࠇߥ. 1 . 2 . 3. 4. 5. 6. 7. 8. ߆㧘߹ߚߪࠊߕ߆ߦᔕ߇ࠄࠇࠆ⒟ᐲߢߞߚ TuMV-NIb. ߩߦኻߒ㧘ᗵฃᕈ♽⛔㧔CP10㧘CP11㧘CP14㧘CP15㧘 CP16㧘CP17㧘CP18㧕ߢߪోߡߩ߆ࠄ CP ߩ mRNA ߇ᬌߐࠇߚ㧔࿑ 4㧕㧚 1 2 3. 4. . 5. 6. 7. R 8. 9. 10. 11 12. 13. R. R. R. S. S. S. S. 14 rRNA TuMV-CP. R. R. R. R. R. R. R. S. S. S. S. S. S. S. ࿑ 6 TuMV-NIb3’ㆮવሶࠍዉߒߚ Nicotiana benthamiana ᒻ⾰ォ឵ T1 ઍߩࡁࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ. rRNA. 1, NIb3’3; 2, NIb3’7; 3, NIb3’8; 4, NIb3’10; 5, NIb3’2; 6, NIb3’4; 7, NIb3’6; 8, NIb3’11.. ࿑ 4 TuMV-CP ㆮવሶࠍዉߒߚ Nicotiana benthamiana ᒻ⾰ォ឵ T1 ઍߩࡁࠩ ࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ. 1, CP1; 2, CP2; 3, CP9; 4, CP12; 5, CP13; 6, CP19; 7, CP20; 8, CP10; 9, CP11;. R. S. Nb-Tu-VPg ߦߟߡߪ VPg1㨪VPg10 ߩ T0 ઍ߮ߩ ࡁࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆࠍⴕߞߚߣߎࠈޔVPg1㧘VPg3㧘 VPg4㧘VPg5 ߩ mRNA ᬌࡌ࡞߇㜞߆ߞߚ㧚VPg6㧘. 10, CP14; 11, CP15; 12, CP16; 13, CP17; 14, CP18.. ဳ R㧦 ᛶ᛫ᕈ S㧦ᗵฃᕈ. VPg7㧘VPg8 ߮ VPg10 ߦߟߡߪࠊߕ߆ߦࠪࠣ࠽࡞. Nb-Tu-CP3’ߢߪ CP3’3-R1㧘CP3’3-R2㧘߮ CP3’3-R3. ߇ᬌߐࠇࠆ⒟ᐲߢࠅ㧘VPg2㧘VPg9 ߦߟߡߪᬌ. ࠍᛶ᛫ᕈ♽⛔ߣߒߡㆬᛮߒ㧘ᗵฃᕈ♽⛔ߢࠆ CP3’2㧘. ߐࠇߥ߆ߞߚ㧔࿑ 7㧕㧚. CP3’7 ߮ CP3’8 ߩ T1 ઍߣᲧセߒߚ㧚ߘߩ⚿ᨐ㧘ో. 1 . 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 㐳ߩ CP ㆮવሶࠍዉߒߚ႐วߣห᭽ߦᗵฃᕈ♽⛔ߩ. TuMV-VP㨓. ଏ⹜߆ࠄߪߕࠇ߽ዉㆮવሶ߇⏕ߥࠪࠣ࠽࡞. mRNA. ߣߒߡᬌߐࠇࠆ߇㧘ᛶ᛫ᕈ♽⛔ߩଏ⹜߆ࠄߪࠊ ߕ߆ߦᔕ߇ࠄࠇࠆ⒟ᐲߢߞߚ㧔࿑ 5㧕㧚 1. 2. 3. 4. 5. rRNA. 6 TuMV-CP3’. ࿑ 7 TuMV-VPg ㆮવሶࠍዉߒߚ N.benthamiana T0 ઍߩ ࡁࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ. 1, VPg1; 2, VPg2; 3, VPg3; 4, VPg4; 5, VPg5;. R. R. R. S. S. 6, VPg6;. 7, VPg7; 8, VPg8; 9, VPg9; 10, VPg10.. S. rRNA. 㧡 㧚 TuMV-CP ㆮ વ ሶ ࠍ ዉ ߒ ߚ. Nicotiana. benthamiana ᒻ⾰ォ឵߆ࠄߩ ᒻ⾰ォ឵߆ࠄߩ siRNA ߩᬌ ࿑ 5 TuMV-CP3’ㆮવሶࠍዉߒߚ N.benthamiana T1 ઍ ߮ T2 ઍߩࡁࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆ. 1, CP3’3-R1; 2, CP3’3-R2; 3, CP3’-R3; 4, CP3’2;. 5, CP3’7;. 6, CP3’8. R㧦 ᛶ᛫ᕈ S㧦ᗵฃᕈ. Nb-Tu-NIb ߩ T1 ઍߢߪ㧘ᛶ᛫ᕈ♽⛔ߢࠆ NIb3’3㧘 NIb3’7㧘NIb3’8 ߮ NIb3’10 ߩᛶ᛫ᕈߢߪዉㆮ. Nb-Tu-CP ߆ࠄ siRNA ߩᬌࠍ⹜ߺߚ㧚ߘߩ⚿ᨐ㧘 ᛶ᛫ᕈ♽⛔ CP12-R1 ߩ T1 ᬀ‛ߢߪ TuMV ធ⒳೨ߦ 㓸ߒߚ⪲߆ࠄ siRNA ߇ᬌߐࠇߚߩߦኻߒ㧘࿁ᓳဳᛶ ᛫ᕈࠍ␜ߔ♽⛔ CP4 ߩ T1 ᬀ‛ߢߪ TuMV ធ⒳೨ߦߪ siRNA ߪᬌߐࠇߕ㧘ធ⒳ᓟߦ∛ᓽࠍ␜ߒߚᓟߦዷ㐿 ߒߡ߈ߚή∛ᓽߩ⪲߆ࠄߪ siRNA ߇ᬌߐࠇߚ㧚ᗵฃ.
(8) . カブモザイクウイルス（TuMV）ゲノム由来の遺伝子を導入した Nicotiana benthamiana における TuMV 抵抗性 ࠞࡉࡕࠩࠗࠢ࠙ࠗ࡞ࠬ㧔6W/8㧕ࠥࡁࡓ↱᧪ߩㆮવሶࠍዉߒߚ 0KEQVKCPCDGPVJCOKCPC ߦ߅ߌࠆ 6W/8 ᛶ᛫ᕈ. ᕈ♽⛔㧔CP10-S1㧕ߩᬀ‛߆ࠄߪ siRNA ߪᬌߐࠇߥ. Germundsson et al 2006㧕㧚ᧄ⎇ⓥߢߪ CP3’㧘NIb3’߮. ߆ߞߚ㧔࿑ 9㧕㧚. VPg ㆮવሶࠍዉߒߚ႐วߦ߽㧘CP ㆮવሶࠍዉߒߚ ႐วߣห᭽ߦᒝᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ♽⛔߇ᓧࠄࠇߚ㧚ߘߩ. . 1 . 2. 3. 4. ₪ᓧ♽⛔ᢙߪ㧘Nb-Tu-CP3’ߢߪߒߚ 20 ♽⛔ਛ 2. . ♽⛔㧔10 %㧕㧘Nb-Tu-NIb ߢߪห᭽ߦ 7 ♽⛔㧔35 %㧕㧘. . Nb-Tu-VPg ߢߪ㧟♽⛔㧔15 %㧕ߢߞߚ㧚ߎࠇࠄߩ⚿. . ᨐߪㆮવሶ⚵឵߃ߦࠃࠅ TuMV ᛶ᛫ᕈᬀ‛ࠍ⢒ᚑߔࠆ. . ႐ว㧘ၮᧄ⊛ߦߪዉㆮવሶߩ⒳㘃ߦߪଐሽߒߥߎ. . ߣࠍ␜ߒߡࠆ㧚ᧄ⎇ⓥߢዉߒߚㆮવሶߪ㧘ో㐳ߩ. . CP ㆮવሶએᄖߪߕࠇ߽࠲ࡦࡄࠢ⾰߳ߩ⠡⸶߇᧪. . ߥㆮવሶߢࠆ㧚ዉㆮવሶ↱᧪ߩ mRNA ⊒ࡌ. . ࡞ࠍࠆߣ㧘ᛶ᛫ᕈ♽⛔ߢߪߕࠇ߽ᬌࡌ࡞߇ૐ siRNA. . ߆㧘߹ߚߪᬌߐࠇߥ߆ߞߚ㧚Nb-Tu-VPg ߢߪᗵฃ. . ᕈ♽⛔ߣห⒟ᐲߩ mRNA ߇ᬌߐࠇࠆ߇ሽߒ. . ߚ߇㧘ߎࠇࠄߪߕࠇ߽࿁ᓳဳᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔߢ. . ࿑ 9 TuMV-CP ㆮવሶࠍዉߒ. ߞߚ㧚ኻߦ㧘mRNA ߇ᬌߐࠇߥ߇ TuMV ᗵฃᕈ. . ߚ Nicotiana benthamiana ߩ TuMV. ࠍ␜ߔ♽⛔߇ࠄࠇߚ㧚ߎࠇࠄߩ♽⛔ߦߟߡߪ. . ᛶ᛫ᕈᒻ⾰ォ឵ߦ․⇣⊛ߦᬌߐ. mRNA ߩォ౮ᛥ㧔transcriptional gene silencing㧕߇. . ࠇࠆ siRNA.. 1, ᗵฃᕈᒻ⾰ォ឵(CP10-S1); 2, ࿁ᓳ. ߎߞߡࠆߎߣ߇ផኤߐࠇࠆ㧔Vaucheret and Fagard. ဳᛶ᛫ᕈᒻ⾰ォ឵㧔CP4:TuMV ធ⒳೨㧕;. 2001㧕㧚CP ㆮવሶࠍዉߒߚ TuMV ᛶ᛫ᕈᬀ‛߆ࠄߪ. . 3, ࿁ᓳဳᛶ᛫ᕈᒻ⾰ォ឵(CP4:TuMV ធ. RNA ࠨࠗࡦࠪࡦࠣߩᜰᮡߣߥࠆዉㆮવሶ↱᧪ߩ. . ⒳ᓟ); 4, ᛶ᛫ᕈᒻ⾰ォ឵(CP12-R1:. siRNA ߇ᬌߐࠇߚ㧔Hamilton and Baulcombe 1999㧕㧚. . . TuMV ធ⒳೨).. ߎࠇࠄߩ⚿ᨐߪ㧘ᧄታ㛎ߢ↪ߚ CP ߿ NIb㧘VPg ߥ ߤߩ࠙ࠗ࡞ࠬㆮવሶࠍዉߒߡᛶ᛫ᕈᬀ‛ࠍߔࠆ. . ⠨ ኤ. 㓙ߦዉㆮવሶ↱᧪ߩ࠲ࡦࡄࠢ⾰ߪᔅⷐߥߊ㧘TuMV. TuMV ߩ CP ㆮવሶߩઁ㧘CP ㆮવሶߩ 3’ᧃ┵ㇱಽ. ㆮવሶࠍዉߒ㧘RNA ࠨࠗࡦࠪࡦࠣࠍߎߒߡࠆ. Ⴎၮ㈩㧔CP3’㧕㧘NIb ㆮવሶߩ 3’ᧃ┵ㇱಽႮၮ㈩. ♽⛔ࠍㆬᛮߔࠆߎߣߦࠃࠅ TuMV ᛶ᛫ᕈᬀ‛ࠍ. 㧔NIb3’㧕㧘߮ VPg ㆮવሶࠍ N.benthamiana ߦዉߒ . ߔࠆߎߣ߇น⢻ߢࠆߎߣࠍ␜ߒߡࠆ㧚. ߚᒻ⾰ォ឵ࠍߒ㧘ߘߩ․ᕈࠍ⺞ߴߚ㧚CP ዉᬀ. TEV ߩ CP ㆮવሶࠍዉߒߚ࠲ࡃࠦߢߪ㧘࠙ࠗ࡞ࠬ. ‛ߦ߅ߌࠆ TuMV ߦኻߔࠆᔕࠍ⺞ߴߚ⚿ᨐ㧘7 ♽⛔. ߩᗵᨴߦࠃߞߡ RNA ࠨࠗࡦࠪࡦࠣ߇⺃ዉߐࠇࠆ. ߩ T1 ઍᬀ‛ߢㆊඨᢙߩଏ⹜߇㜞ᐲᛶ᛫ᕈࠍ␜. ߇ႎ๔ߐࠇߡࠆ㧚ߎߩ႐ว㧘TEV ߩធ⒳ߦࠃࠅᗵ. ߒߚ㧚N.benthamiana ߪ TuMV ߦኻߔࠆᗵฃᕈ߇㜞ߊ㧘. ᨴೋᦼߦዷ㐿ߒߚ⪲ߢߪỗߒ∛ᓽ߇ࠇࠆ߇㧘ߘ. ᗵᨴߔࠆߣᩣో߇⪜ߔࠆߥߤỗߒ∛ᓽࠍ␜ߔ߇㧘. ߩᓟዷ㐿ߔࠆ⪲ߢߪ∛ᓽ߇シᷫߒ㧘ߐࠄߦ߆ߌ. CP ㆮવሶࠍዉߒߚᒻ⾰ォ឵߆ࠄߪ㜞ᐲߥᛶ᛫ᕈ. ஜోߥ⪲߇ዷ㐿ߒߡߊࠆ㧚ή∛ᓽߩ⪲ߦߪ TEV ߇߶. ࠍ␜ߒ㧘TuMV ߇ᗵᨴߒߥ߇ㆬᛮߐࠇߚ㧚CP ㆮ. ߣࠎߤᬌߐࠇߕ㧘ߐࠄߥࠆ TEV ᗵᨴߦኻߒߡᒝᛶ. વሶએᄖߩㆮવሶࠍዉߒߚᒻ⾰ォ឵ᬀ‛ߦ߅ߌࠆ࠙. ᛫ᕈࠍ␜ߔ㧚ߎߩࠃ߁ߥ࿁ᓳဳᛶ᛫ᕈߪࠞࡃߣ. ࠗ࡞ࠬᛶ᛫ᕈߦߟߡߪ㧘Potyvirus ߢߪ NIb ㆮવሶ߿. ฬઃߌࠄࠇߡࠆ㧚㧔Lindbo et al 1993㧘Dougherty et al. VPg ㆮવሶ㧘P1 ㆮવሶ㧘HC-Pro ㆮવሶߥߤߦߟߡ. 1994㧕㧚ᧄ⎇ⓥߢߒߚᒻ⾰ォ឵ߩਛߦߪ㧘ធ⒳ᓟ. ⎇ⓥ߇ⴕࠊࠇߚ߇ࠆ㧔Audy et al 1994, Jones et al. ߦዷ㐿ߒߚ⪲ߦߪ∛ᓽ߇ࠄࠇࠆ߇㧘ߘߩᓟߩ↢⢒ߦ. 1998, Moreno et al 1998, Maki-Valkama et al 2000,. ∛ᓽ߇ᶖᄬߔࠆ࿁ᓳဳᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ߇ࠄ.
(9) 2012 神奈川県農業技術センター研究報告 第 155 号 2012 ᄹᎹ⋵ㄘᬺᛛⴚࡦ࠲⎇ⓥႎ๔ ╙ 155 ภ. ࠇ㧘TuMV ߩㆮવሶࠍዉߒߚᒻ⾰ォ឵ߦ߅ߡ߽. . ቇ㒮 㔍ᵄᚑછᢎߦᷓ⻢ߩᗧࠍߔࠆ㧚. ࠙ࠗ࡞ࠬߩᗵᨴߦࠃࠅ RNA ࠨࠗࡦࠪࡦࠣ߇⺃ዉߐ ࠇࠆ႐ว߇ࠆߎߣ߇⏕ߐࠇߚ㧚. . ዉㆮવሶߩ㐳ߐߣᛶ᛫ᕈߩ₪ᓧല₸ߦߟ. ᒁ↪ᢥ₂. ߡ㧘Pang ࠄ㧔1997㧕ߪ Tomato spotted wilt virus㧔TSWV㧕. Audy, P., Palukaitis, P., Slack, S. A., and Zaitlin, M. 1994.. ߩ㐳ߐߩ⇣ߥࠆ N ㆮવሶᢿ ࠍ N.benthamiana ߦዉ. Replicase-mediated resistance to potato virus Y in. ߒߚᒻ⾰ォ឵ࠍߒ㧘ዉㆮવሶ㐳߇ 387㨪453 bp. transgenic. ߢߪ TSWV ᛶ᛫ᕈ♽⛔߇ᓧࠄࠇࠆ߇㧘92㨪235 bp ߢߪ. Interact. 7:15-22.. tobacco. plants.. Mol.. Plant-Microbe. ᛶ᛫ᕈ♽⛔߇ᓧࠄࠇߥߎߣ㧘߹ߚ㧘236~387 bp ߩㆮ. Beck, D. L., van Dolleweerd, C. J., Lough, T. J., Balmori,. વሶᢿ ࠍ GFP ㆮવሶߣⲢวߐߖߡዉߔࠇ߫ᛶ᛫. E., Voot, D. M., Andersen, M. T., O’Brien, I. E. W.,. ᕈ♽⛔߇ᓧࠄࠇࠆߎߣ߆ࠄ㧘࠙ࠗ࡞ࠬᛶ᛫ᕈᬀ‛ࠍᓧ. and Forster, R. L. S. 1994. Disruption of virus. ࠆߦߪዉㆮવሶߦߟߡ৻ቯߩ㐳ߐ߇ᔅⷐߢࠆߎ. movement confers broad-spectrum resistance against. ߣࠍ␜ߒߚ㧚ᧄ⎇ⓥߢ↪ߚ TuMV-CP ㆮવሶߩ႐ว㧘. systemic infection by plant viruses with a triple gene. T2 ઍߩㆊඨᢙ߇ᛶ᛫ᕈߣߥࠆ♽⛔ߩ₪ᓧല₸ߪో. block. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10310-10314.. 㐳 CP ㆮવሶ㧔864 bp㧕ࠍዉߒߚ႐วߪ 35 %ߢࠅ㧘. Carr, J. P., Marsh, L. E., Lomonossoff, G. P., Sekiya, M. E.,. ߘߩඨಽߩ㐳ߐߦ⋧ᒰߔࠆ CP3 ㆮવሶ’㧔430 bp㧕ߪല. and Zaitlin, M. 1992. Resistance to tobacco mosaic. ₸߇ૐ߆ߞߚ㧚ߎߩߎߣ߆ࠄන৻ߩㆮવሶࠍዉߒߡ. virus induced by the 54-kDa gene sequence requires. ࠙ࠗ࡞ࠬᛶ᛫ᕈᬀ‛ࠍ₪ᓧߔࠆߚߦߪዋߥߊߣ߽ో. expression. 㐳 CP ㆮવሶ㧔864 bp㧕⒟ᐲߩ㐳ߐࠍᜬߟㆮવሶࠍዉ. Plant-Microbe Interact. 5:397-404.. ᓟ㧘ㆬᛮߔࠆᣇ߇ല₸⊛ߢࠆ㧚. of. the. 54-kDa. protein.. Mol.. Cooper, B., Lapidot, M., Heick, J. A., Dodds, J. A., and. Nb-Tu-CP ߩࠨࠩࡦࡉࡠ࠶࠻⸃ᨆߩ⚿ᨐ㧘ᛶ᛫ᕈ♽⛔. Beachy, R. N. 1995. A defective movement protein. ߪ 2㨪4 ࠦࡇ㧘ᗵฃᕈ♽⛔ߪ 1㨪2 ࠦࡇߢࠅ㧘ᛶ. of TMV in transgenic plants confers resistance to. ᛫ᕈ♽⛔ߦߟߡߪߕࠇ߽ⶄᢙࠦࡇߢߞߚ㧚ᛶ. multiple viruses whereas the functional analog. ᛫ᕈ♽⛔ߩ T1 ઍߢߪᒻ⾰߇ಽ㔌ߔࠆ߇㧘ߘߩᰴઍ. increases susceptibility. Virology 206:307-313. ߢߪᒻ⾰߇ಽ㔌ߔࠆ߽ߩߣ㧘ోߡߩ߇ᛶ᛫ᕈࠍ␜. Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., and Helinski, D. R.. ߔ߽ߩ߇ᓧࠄࠇ㧘ߐࠄߦᓟઍߦߟߡㆬᛮࠍ➅ࠅߔ. 1980. Broad host range DNA cloning system for. ߎߣߦࠃࠅቯߒߡ TuMV ᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ♽⛔߇ᓧࠄࠇ. gram-negative bacteria: Construction of a gene bank. ߚ㧚TuMV-CP ߩઁ㧘CP3’㧘NIb3’߮ VPg ㆮવሶࠍዉ. of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ߒߚ N.benthamiana ߢ߽ 2 ࿁એߩ⥄ᱺߣㆬᛮߦࠃ. 77:7347-7351.. ࠅోߡߩ߇ᛶ᛫ᕈߣߥࠆ♽⛔߇ᓧࠄࠇ㧘ߘߩᓟઍ. Dougherty, W. G., Lindbo, J.A., Smith, H. A., Parks, T. D.,. ߢߪ TuMV ᛶ᛫ᕈ߇⛽ᜬߐࠇߡߚ㧚ߒߚ߇ߞߡ㧘ฦ. Swaney,. ⒳‛ߦ࠙ࠗ࡞ࠬㆮવሶࠍዉᓟ㧘RNA ࠨࠗࡦࠪࡦ. RNA-mediated virus resistance in transgenic plants:. ࠣߦࠃࠅᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ♽⛔ࠍല₸⊛ߦ₪ᓧߔࠆߚߦ. exploitation of a cellular pathway possibly involved. ߪ⥄ᱺߢ߈ࠆ‛ߢߪ㧘ߘߩᓟઍ߆ࠄᛶ᛫ᕈࠍㆬ. in RNA degradation. Mol. Plant-Microbe Interact.. ᛮߔࠆߎߣߢቯߒߚ࠙ࠗ࡞ࠬᛶ᛫ᕈࠍ␜ߔ♽⛔߇ࠃ. 7:544-552.. ࠅല₸⊛ߦᓧࠄࠇࠆ߽ߩߣ⠨߃ࠄࠇࠆ㧚. Fuchs,. M.,. S.,. and. and. Proebsting,. Gonsalves,. D.. W.. 2008.. M.. 1994.. Safety. of. . virus-resistant transgenic plants two decades after. . their introduction: lessons from realistic field risk. ⻢ ㄉ ᧄ⎇ⓥࠍⴕ߁ߦߚࠅ㧘ߏᜰዉߚߛߚ᧲੩ᄢቇᄢ. assessment studies. Annu. Rev. Phytopathol 45: 173-202..
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