血 管 新 生 因 子 a n g i o g e n i n の 新 規 阻 害 剤 t e r r e i n の 口 腔 癌 制 御 に 関 す る 検 討
岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 薬 学 総 合 研 究 科 口 腔 顎 顔 面 外 科 学 分 野
柴 田 茜
T h e e f f e c t o f t e r r e i n , a n o v e l i n h i b i t o r o f a n g i o g e n i n , o n t h e t r e a t m e n t o f o r a l c a n c e r
D e p a r t m e n t o f O r a l a n d M a x i l l o f a c i a l S u r g e r y , O k a y a m a U n i v e r s i t y G r a d u a t e S c h o o l o f M e d i c i n e , D e n t i s t r y a n d
P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s
A k a n e S H I B A T A
（ 平 成 2 5 年 1 2 月 1 2 日 受 付 ）
緒 言
血 管 新 生 は 血 管 内 皮 細 胞 が 遊 走 し ， 増 殖 し ， 新 し い 血 管 を 形 成 す る 一 連 の 過 程 で あ る 。 血 管 新 生 因 子 は 血 管 内 皮 細 胞 に 作 用 し ， 血 管 新 生 を 促 進 し て い る 1 )。 血 管 新 生 は 癌 の 浸 潤 ・ 転 移 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と が 知 ら れ ， 現 在 ， 腫 瘍 血 管 新 生 を 標 的 と し た 分 子 標 的 薬 の 開 発 な ら び に 臨 床 応 用 が 進 め ら れ て い る 1 )。
a n g i o g e n i n（ A N G） は H T - 2 9 ヒ ト 大 腸 癌 細 胞 株 の 培 養 上 清 か ら 単 離 さ れ た 血 管 新 生 因 子 で あ る 2 )。 癌 細 胞 の 産 生 す
る A N G は ， 血 管 内 皮 細 胞 に 作 用 し 腫 瘍 血 管 新 生 に 重 要 な
役 割 を 果 た す 3 )。A N G は 血 管 内 皮 細 胞 表 面 の 受 容 体 に 結 合 す る と ， シ グ ナ ル 伝 達 因 子 を 活 性 化 さ せ る と 同 時 に ，A N G 自 体 も 直 接 核 に 移 行 す る 。 核 に 移 行 し た A N G は 核 小 体 に 集 積 し ， r R N A の 転 写 を 促 進 す る こ と に よ り 血 管 内 皮 細 胞 の 増 殖 を 促 進 す る 3 )。
近 年 ， 癌 細 胞 の 産 生 す る A N G は 血 管 新 生 の み な ら ず ， 癌 細 胞 の r R N A の 転 写 も 促 進 さ せ ， 直 接 的 に ， 癌 細 胞 の 増 殖 を 促 進 す る こ と が 明 ら か と な っ た 4 )。 し た が っ て ， A N G の 選 択 的 阻 害 に よ り 腫 瘍 血 管 新 生 と 癌 細 胞 増 殖 を 同 時 に 制 御 で き る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る 。
t e r r e i n は 真 菌 ア ス ペ ル ギ ル ス ・ テ レ ウ ス （ A s p e r g i l l u s
t e r r e u s） の 代 謝 産 物 と し て 単 離 さ れ た 分 子 量 1 5 4 . 1 6 の 有
機 物 で あ る 5 )。 今 ま で に ， 抗 菌 作 用 ， 植 物 の 成 長 抑 制 ， メ ラ ノ サ イ ト の メ ラ ニ ン 産 生 抑 制 6 - 8 )， 歯 髄 炎 に 対 す る 抗 炎 症 作 用 9 )， 骨 芽 細 胞 の チ タ ン 金 属 表 面 へ の 接 着 の 促 進 1 0 )， 表 皮 角 化 細 胞 の 増 殖 抑 制 1 1 )， 血 小 板 凝 集 抑 制 1 2 )な ど の 多 様 な 作 用 が 報 告 さ れ て い る 。 特 に メ ラ ニ ン 産 生 抑 制 作 用 の 報 告 が 多 く ， 肌 を 白 く す る 効 果 が 皮 膚 科 領 域 で 期 待 さ れ て
い る 6 - 8 )。
最 近 ，t e r r e i n が 前 立 腺 癌 細 胞 の A N G 産 生 を 抑 制 す る こ と が 明 ら か と な り 1 3 )，t e r r e i n が A N G の 新 規 阻 害 剤 と し て の 効 果 を 示 す 可 能 性 が あ る 。し か し t e r r e i n が A N G 産 生 を 抑 制 す る こ と に よ っ て ， 抗 腫 瘍 効 果 や 抗 血 管 新 生 作 用 を 示 す か 否 か に つ い て は 不 明 な 点 も 多 い 。 ま た 口 腔 癌 に 対 す る 作 用 に つ い て も 報 告 は な い 。 そ こ で 本 研 究 で は ， t e r r e i n に よ る A N G を 分 子 標 的 と し た 新 規 口 腔 癌 治 療 の 開 発 を 目
的 に t e r r e i n が 口 腔 癌 の 増 殖 お よ び 腫 瘍 血 管 新 生 に 与 え る
影 響 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。
材 料 な ら び に 方 法
1 . 培 養 細 胞 株 お よ び 細 胞 培 養
ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 H S C - 2，H S C - 3，H S C - 4，S A S
（ い ず れ も R I K E N よ り 供 与 ， 茨 城 ）， O S C - 1 9， O S C - 2 0
（ ヒ ュ ー マ ン サ イ エ ン ス 研 究 資 源 バ ン ク よ り 供 与 ， 大 阪 ），
正 常 ヒ ト 臍 帯 静 脈 内 皮 細 胞 ( n o r m a l h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s , 以 下 H U V E C； L o n z a , S w i s s )を 使 用 し た 。 癌 細 胞 の 培 養 に は D u l b e c c o 改 良 型 E a g l e 培 地 と H a m F - 1 2 培 地 の 等 量 混 合 培 地 （ 以 下 D M E M / F 1 2 ; I n v i t r o g e n C o r p . , G r a n d I s l a n d , N Y , U S A） を 用 い ， 非 動 化 1 0 %ウ シ 胎 児 血 清（ f e t a l b o v i n e s e r u m , 以 下 F B S ; J R H B i o s c i e n c e , L e n e x a , K S , U S A） お よ び 1 %ペ ニ シ リ ン ・ ス ト レ プ ト マ イ シ ン 液 （ G i b c o , N Y , U S A） を 混 合 し ， 5 % C O2， 3 7℃で 培 養 し た 。H U V E C の 培 養 に は e n d o t h e l i a l c e l l b a s a l m e d i u m - 2
（ 以 下 E B M - 2 ; L o n z a） を 使 用 し ， 5 % C O2， 3 7℃で 培 養 し た 。
2 . t e r r e i n の 合 成
t e r r e i n（ 図 1）は ，A l t e n b a c h ら の 報 告 1 4 )を 一 部 参 考 に ， 有 機 化 学 的 に 合 成 し た も の を 用 い た （ 岡 山 大 学 大 学 院 自 然
科 学 研 究 科 ・ 化 学 生 命 工 学 専 攻 ・ 合 成 プ ロ セ ス 化 学 研 究 室 ・ 萬 代 大 樹 博 士 か ら 供 与 ）。合 成 し た t e r r e i n の 立 体 構 造 の 確 認 は ，1H お よ び 1 3C の 核 磁 気 共 鳴 を 用 い て 炭 素 骨 格 を 確 認 し ， 高 分 解 能 質 量 分 析 に よ っ て 分 子 量 を 測 定 し て t e r r e i n で あ る と 判 断 し た 。 ま た ， 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る 光 学 純 度 （ > 9 8 % 鏡 像 体 過 剰 率 ） も 併 せ て 確 認 し た 。 天 然 抽 出 物 と の 比 較 は ，比 旋 光 度 を 比 較 す る こ と に よ っ て ， 天 然 物 と 同 一 の 鏡 像 異 性 体 で あ る こ と を 確 認 し た 。
3 . 細 胞 増 殖 能 の 検 討
t e r r e i n が 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 お よ び 血 管 内 皮 細 胞 の 細
胞 増 殖 に 与 え る 影 響 を 検 討 す る た め ， 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 な ら び に H U V E C に t e r r e i n ( 2 0 µ M も し く は 5 0 µ M )を 添 加 し ， 2 4，4 8， 7 2， 9 6， 1 2 0 時 間 後 の 細 胞 数 を 測 定 し ， 増 殖 曲 線 を 作 成 し た 。細 胞 数 の 測 定 に は ，T C 1 0 T M a u t o m a t e d c e l l c o u n t e r ( B i o - R a d L a b . , H e r c u l e s , C A , U S A )を 使 用 し た 。
4 . 細 胞 運 動 能 の 検 討
細 胞 運 動 能 は w o u n d h e a l i n g a s s a y で 評 価 し た 。O S C - 1 9
を 6 w e l l プ レ ー ト 上 で 1 0 % F B S 含 有 D M E M / F 1 2 で 培 養 し
た 。 サ ブ コ ン フ ル エ ン ト に 達 し た 後 0 . 5 % F B S 含 有
D M E M / F 1 2 で 2 4 時 間 培 養 し プ レ ー ト 上 を 幅 約 1 m m の プ
ラ ス チ ッ ク チ ッ プ で 引 っ 掻 く こ と で ， 細 胞 を 剥 離 し ， 模 擬 的 な 創 傷 を 作 製 し た 。t e r r e i n ( 2 0 µ M )を 添 加 し ，6，1 2，1 8， 2 4 時 間 と 経 時 的 に 創 傷 面 積 を 測 定 し た 。測 定 し た 創 傷 面 積 と 作 製 直 後 の 創 傷 面 積 の 差 を 計 算 し 評 価 し た 。 面 積 の 測 定 に は 画 像 解 析 ソ フ ト I m a g e J （ v e r s i o n 1 . 4 3 r ， N I H ， B e t h e s d a， M D， U S A） を 用 い た 。
5 . 細 胞 遊 走 能 の 検 討
2 4 w e l l マ ト リ ゲ ル イ ン ベ ー ジ ョ ン チ ャ ン バ ー ○R( B D
F a l c o n , N J , U S A )の マ ト リ ゲ ル の コ ー テ ィ ン グ さ れ て い な
い ， ノ ン コ ー ト イ ン サ ー ト を 使 用 し た 。 こ れ は 2 層 式 の チ ャ ン バ ー で ，イ ン サ ー ト の ポ ア サ イ ズ 8 µ m の メ ン ブ レ ン 上 層 に O S C - 1 9 を 3×1 04 個 ず つ 播 種 し ，上 層 に t e r r e i n ( 2 0 µ M も し く は 5 0 µ M )を 添 加 し た 0 . 5 % F B S 含 有 D M E M / F 1 2 を ， 下 層 に 1 0 % F B S 含 有 D M E M / F 1 2 を 入 れ て 2 4 時 間 後 に ，メ ン ブ レ ン を 通 過 し 移 動 し た ， メ ン ブ レ ン 裏 面 の 細 胞 を デ ィ フ ・ ク イ ッ ク （ 国 際 試 薬 ， 兵 庫 ） を 用 い て 固 定 後 に ギ ム ザ 染 色 し ， 細 胞 数 を 計 測 し て ， 遊 走 能 を 評 価 し た 。
6 . 細 胞 浸 潤 能 の 検 討
2 4 w e l l マ ト リ ゲ ル イ ン ベ ー ジ ョ ン チ ャ ン バ ー ○R( B D
F a l c o n ) の マ ト リ ゲ ル の コ ー テ ィ ン グ さ れ た イ ン サ ー ト を
使 用 し た 。イ ン サ ー ト の ポ ア サ イ ズ 8 µ m の メ ン ブ レ ン 上 層 に O S C - 1 9 を 3×1 04 個 ず つ 播 種 し ， 上 層 に t e r r e i n ( 2 0 µ M も し く は 5 0 µＭ )を 添 加 し た 0 . 5 % F B S 含 有 D M E M / F 1 2 を ， 下 層 に 1 0 % F B S 含 有 D M E M / F 1 2 を 入 れ て 2 4 時 間 後 に ，マ ト リ ゲ ル と メ ン ブ レ ン を 通 過 し 移 動 し た ， メ ン ブ レ ン 裏 面 の 細 胞 を 遊 走 能 と 同 様 の 染 色 を 行 い 細 胞 数 を 計 測 し ， 浸 潤 能 を 評 価 し た 。
7 . 培 養 上 清 中 の 分 泌 さ れ た A N G 蛋 白 量 の 測 定
O S C - 1 9 を 6 0 m m デ ィ ッ シ ュ に 1×1 05 個 播 種 後 ，1 0 % F B S 添 加 D M E M / F 1 2 培 地 で 2 4 時 間 培 養 し た 。t e r r e i n を ( 2 0 µ M も し く は 5 0 µ M )添 加 し ，2 4，4 8，7 2，9 6，1 2 0 時 間 に 培 養 上 清 を 回 収 し ， 遠 心 分 離 （ 3 0 0 0 r p m , 1 0 分 間 ） を 行 い 細 胞 成 分 を 取 り 除 い た 。 培 養 上 清 中 に 分 泌 さ れ た A N G 蛋 白 量 を ， h u m a n A N G E L I S A k i t ( R & D S y s t e m I n c . , M i n n e a p o l i s , M N , U S A )を 使 用 し て 測 定 し た 。
8． リ ボ ソ ー ム 生 合 成 の 評 価
C u l t u r e s l i d e s ○R ( B D F a l c o n ) の ス ラ イ ド グ ラ ス 上 に O S C - 1 9 を 1×1 04 個 ず つ 播 種 し ，2 4 時 間 培 養 後 に ，t e r r e i n を 添 加 し 2 4 時 間 後 に A r g y r o p h i l i c n u c l e o l a r o r g a n i z e r
r e g i o n (以 下 A g N O R )染 色 1 5 , 1 6 )を 行 っ た 。 す な わ ち ス ラ イ ド グ ラ ス 上 の 細 胞 を ， メ タ ノ ー ル /酢 酸 ( 9 : 1 )溶 液 を 用 い て 室 温 で 1 0 分 間 固 定 し た 。2 %ゼ ラ チ ン と 1 %蟻 酸 水 溶 液 の 混 和 液 と 5 0 %硝 酸 銀 水 溶 液 を 1 : 2 の 割 合 で 混 和 し 染 色 液 を 作 製 し た 。 固 定 し た 細 胞 を 2 5〜 3 0 分 間 染 色 し た 。 蒸 留 水 で 洗 浄 後 ， 封 入 し 検 鏡 し た 。
9 . 免 疫 蛍 光 抗 体 法
カ バ ー グ ラ ス 上 に O S C - 1 9， H U V E C を 1 0 % F B S 添 加
D M E M / F 1 2， E B M - 2 培 地 で そ れ ぞ れ 2 4 時 間 培 養 し た 。 対
照 群 は r e c o m b i n a n t h u m a n A N G ( R & D )を 濃 度 1 µ g / m l で 培 地 に 添 加 し ， t e r r e i n 添 加 群 は t e r r e i n を 添 加 し 3 0 分 後 に r h A N G ( 1 µ g / m l )を 添 加 し た 。 2 4 時 間 培 養 を 行 っ た 後 P B S で 2 回 洗 浄 の 後 ，- 2 0℃メ タ ノ ー ル で 1 0 分 間 固 定 し た 。P B S で 洗 浄 し ，3 % F B S / P B S を 用 い て 室 温 で 1 0 分 間 ブ ロ ッ キ ン グ 後 ，1 次 抗 体 と し て 抗 ヒ ト A N G マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 ( 1 : 5 0 0 , A b c a m , C a m b r i d g e , U K )を 4℃で 1 2 時 間 反 応 さ せ た 。P B S で 洗 浄 後 ，2 次 抗 体 と し て 蛍 光 抗 体 で あ る A l e x a F l u o r○R4 8 8 ( 1 : 1 0 0 0 , I n v i t r o g e n )を 遮 光 下 お よ び 4℃で 1 時 間 反 応 さ せ た 後 ，P B S で 洗 浄 し ， 封 入 し て 倒 立 型 電 動 リ サ ー チ 顕 微 鏡 I X 8 1 ( O L Y M P U S , 東 京 )お よ び 手 動 ／ 電 動 落 射 蛍 光 シ ス テ ム ( O L Y M P U S , 東 京 )を 用 い て 検 鏡 し た 。
1 0 . 管 腔 形 成 能 の 測 定
t e r r e i n が 血 管 内 皮 細 胞 の 管 腔 形 成 能 に 与 え る 影 響 を 調
べ る た め に ， f i b r i n g e l i n v i t r o a n g i o g e n e s i s a s s a y k i t○R ( C h e m i c o n , U S A )を 使 用 し 検 討 を 行 っ た 。 す な わ ち 2 4 w e l l マ ル チ プ レ ー ト に ゲ ル を 2 0 0 µ l 流 し 入 れ ， 硬 化 後 に そ の 上 に H U V E C を 1×1 05 個 播 種 し t e r r e i n を 添 加 し E B M - 2 培 地 で 2 4 時 間 培 養 を 行 っ た 。 そ の 後 ， 液 体 培 地 を 吸 引 し ， 再 度 ゲ ル を 流 し 入 れ ， 細 胞 を ゲ ル 内 に 封 入 し 管 腔 形 成 の 観 察 を 行 っ た 。
1 1 . マ ウ ス 背 部 皮 下 移 植 腫 瘍 動 物 実 験 モ デ ル の 作 製
1 群 を 8 匹 と し 5 週 齢 雄 B A L B / C 系 n u / n u ヌ ー ド マ ウ ス
（ 日 本 ク レ ア ， 東 京 ） の 背 部 皮 下 に O S C - 1 9（ 8×1 05 個 ） を 移 植 し た 。 移 植 後 7 日 目 か ら 週 2 回 ， 対 照 群 に は P B S， t e r r e i n 投 与 群 に は t e r r e i n 3 0 m g / k g を 腹 腔 内 注 射 し た 。移 植 後 9 週 目 で マ ウ ス を 屠 殺 し ，腫 瘍 組 織 を 採 取 し た 。な お ， 腫 瘍 の 長 径 と 直 交 す る 短 径 を 計 測 し ， 腫 瘍 体 積 を 直 径 ×短 径 ×短 径 / 2 で 算 出 し た 。 動 物 実 験 は す べ て 岡 山 大 学 動 物 実 験 管 理 委 員 会 の 指 針 に 従 っ て 行 っ た 。
1 2 . 組 織 学 的 お よ び 免 疫 組 織 化 学 染 色 法
屠 殺 し た ヌ ー ド マ ウ ス よ り 腫 瘍 を 切 除 し ， 1 0 %中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン で 2 4 時 間 浸 漬 固 定 後 ， 上 昇 エ タ ノ ー ル 系 列 で 脱 水 後 ，パ ラ フ ィ ン に 包 埋 し た 。厚 さ 4 µ m で 切 片 を 作 製 し た 。 ヘ マ ト キ シ リ ン ・ エ オ ジ ン 染 色 （ 以 下 H . E .染 色 ）， 免 疫 組 織 化 学 染 色 を 施 行 し た 。
（ 1） H . E .染 色 切 片 を キ シ レ ン で 脱 パ ラ フ ィ ン し ， 下 降
ア ル コ ー ル 系 列 で 水 和 後 ， H . E .染 色 を 行 っ た 。 上 昇 ア ル コ ー ル 系 列 及 び キ シ レ ン で 脱 水 を 行 っ た 後 封 入 し ， 組 織 学 的 検 索 を 行 っ た 。
（ 2）免 疫 組 織 化 学 染 色 組 織 切 片 を 脱 パ ラ フ ィ ン 後 ，0 . 3 % 過 酸 化 水 素 を 含 む メ タ ノ ー ル に よ る 内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 阻 止 を 行 っ た 。抗 原 性 の 再 賦 活 化 法 と し て 0 . 0 1 M ク エ ン 酸 緩 衝 液 （ p H 6 . 0） 中 で 加 圧 熱 処 理 を 行 っ た 。 1 次 抗 体 に は 抗 マ ウ ス C D 3 1 ラ ビ ッ ト ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 （ A b c a m）
を 1 : 5 0 に 希 釈 し ， 抗 ヒ ト K i 6 7 ラ ビ ッ ト ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗
体 （ D a k o , G l o s t r u p , D e n m a r k） を 1 : 5 0 に 希 釈 し ， 抗 ヒ ト
A N G マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 （ A b c a m） を 1 : 1 0 0 に 希 釈
し て 使 用 し た 。 2 次 抗 体 反 応 は ， 抗 C D 3 1 抗 体 は A B C k i t ( V e c t o r L a b , B u r l i n g a m e , U S A )，抗 K i 6 7 抗 体 ，抗 A N G 抗 体 は E n v i s i o n○Rキ ッ ト （ D a k o） に よ っ て 行 っ た 。 発 色 は
0 . 0 1 % 3 , 3 ’ -ジ ア ミ ノ ベ ン チ ジ ン ( D A B )含 有 0 . 0 5 M T r i s - H C l 緩 衝 液 （ p H 7 . 6） で 行 っ た 。 発 色 後 の 切 片 を 光 学 顕 微 鏡 で 検 鏡 し た 。 C D 3 1 染 色 は 血 管 密 度 の 高 い 部 位 を 1 0 0 倍 視 野 下 で 3 視 野 選 び ，血 管 面 積 を 計 測 し 平 均 値 を 算 出 し た 。K i 6 7 染 色 は 腫 瘍 組 織 の 中 心 を 1 0 0 倍 視 野 下 で 3 視 野 選 び ，K i 6 7 陽 性 細 胞 数 を 計 測 し 平 均 値 を 算 出 し た 。
1 3 . 統 計 分 析
統 計 分 析 に は S t u d e n t ’ s t 検 定 を 用 い た 。 危 険 率 5 %未 満 を 有 意 差 あ り と 判 定 し た 。
結 果
1 . t e r r e i n が ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 の 増 殖 能 ， 運 動 能 ，
遊 走 能 ， 浸 潤 能 に 与 え る 影 響
H S C - 2， H S C - 3， H S C - 4， S A S， O S C - 1 9， O S C - 2 0 を 用 い て 細 胞 増 殖 能 を 検 討 し た 。 い ず れ の 細 胞 株 に お い て も
t e r r e i n 添 加 群 が 対 照 群 と 比 較 し て 増 殖 能 を 濃 度 依 存 的 に
抑 制 し て い た 。（ 図 ２ ）
O S C - 1 9 を 用 い て w o u n d h e a l i n g a s s a y で 運 動 能 を 検 討 し た 。t e r r e i n 添 加 群 が 対 照 群 と 比 較 し て 6 時 間 で は 5 2 . 3 %， 1 2 時 間 で は 5 1 . 8 %，1 8 時 間 で は 5 3 . 6 %，2 4 時 間 で は 4 9 . 3 % し か 創 傷 面 積 は 縮 小 せ ず ，運 動 能 が 有 意 に 抑 制 さ れ て い た 。
（ 図 3）
O S C - 1 9 を 用 い て m i g r a t i o n a s s a y で 遊 走 能 を 検 討 し た 。 メ ン ブ レ ン 裏 面 へ 遊 走 し た 細 胞 数 は ，1 視 野 0 . 0 5 m m2 当 た り ， 対 照 群 9 9 7 ± 1 3 4 個 ，t e r r e i n 2 0 µ M 添 加 群 7 0 4 ± 1 2 9 個 , t e r r e i n 5 0 µ M 添 加 群 5 7 5 ± 1 1 8 個 で あ り ， 運 動 能 と 同 様 に
t e r r e i n 添 加 群 が 対 照 群 と 比 較 し て 遊 走 能 が 有 意 に 抑 制 さ
れ て い た 。（ 図 4 - A）
O S C - 1 9 に お い て マ ト リ ゲ ル イ ン ベ ー ジ ョ ン チ ャ ン バ ー
を 用 い た i n v a s i o n a s s a y で 浸 潤 能 を 検 討 し た 。マ ト リ ゲ ル
を 破 壊 し て メ ン ブ レ ン 裏 面 へ 浸 潤 し た 細 胞 数 は ， 1 視 野 0 . 0 5 m m2 当 た り ， 対 照 群 4 0 2 ± 1 1 3 個 ， t e r r e i n 2 0 µ M 添 加 群 3 2 0 ± 8 0 個 ， t e r r e i n 5 0 µ M 添 加 群 2 5 6 ± 8 0 個 で あ り 増 殖 能 ， 運 動 能 ， 遊 走 能 と 同 様 に t e r r e i n 添 加 群 が 対 照 群 と 比 較 し て 浸 潤 能 が 抑 制 さ れ て い た が 有 意 差 を 認 め た の は t e r r e i n 5 0 µ M の み で あ っ た 。（ 図 4 - B）
2 . t e r r e i n が ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 の A N G 産 生 に 与 え る
影 響
O S C - 1 9 の A N G 産 生 に 影 響 を 及 ぼ す か 否 か 検 討 を 行 っ た 。
O S C - 1 9 に お い て ， t e r r e i n 添 加 後 2 4， 4 8， 7 2， 9 6， 1 2 0 時 間 後 の 培 養 上 清 を 回 収 し 行 っ た E L I S A で は ， 7 2 時 間 以 降 で 対 照 群 と t e r r e i n 5 0 µ M 添 加 群 で ， そ れ 以 降 は 3 群 間 で 有 意 差 を 認 め ，t e r r e i n は 濃 度 依 存 的 に A N G の 産 生 を 抑 制 し て い た 。（ 表 1）
3 . t e r r e i n が ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 の リ ボ ソ ー ム 生 合 成
に 与 え る 影 響
t e r r e i n が O S C - 1 9 の リ ボ ソ ー ム 生 合 成 に 与 え る 影 響 に
つ い て 検 討 を 行 う た め A g N O R 染 色 を 行 っ た 1 5 , 1 6 )。核 小 体 形 成 域 ( n u c l e o l a r o r g a n i z e r r e g i o n :以 下 N O R )は ， 染 色 体
中 の r D N A が ル ー プ 構 造 を 形 成 し て い る 領 域 で あ り ，r R N A
の 転 写 や リ ボ ソ ー ム 生 合 成 が 行 わ れ て い る 部 位 で あ る 1 5 )。
A g N O R 染 色 は 好 銀 性 を 示 す N O R 関 連 蛋 白 を 染 色 す る 方 法
で ， そ の 数 が リ ボ ソ ー ム 生 合 成 を 反 映 し て お り 1 6 )， ま た 細 胞 増 殖 能 と 関 連 が あ る 1 7 )。 染 色 さ れ た N O R の 個 数 は 対 照 群 2 2 . 6 ± 4 . 0 個 ，t e r r e i n 2 0 µＭ 添 加 群 1 5 ± 2 . 9 個 ，t e r r e i n 5 0 µ Ｍ 添 加 群 1 1 . 1 ± 3 . 0 個 で 有 意 に t e r r e i n 添 加 群 で 減 少 を 認 め
た 。 t e r r e i n は 濃 度 依 存 的 に ， A g N O R 陽 性 数 が 減 少 し ， こ
の こ と か ら リ ボ ソ ー ム の 生 合 成 が 低 下 し て い る と 考 え ら れ た 。（ 図 5）
4 . t e r r e i n が ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 の A N G の 細 胞 内 局 在
に 与 え る 影 響
t e r r e i n が O S C - 1 9 に お け る A N G の 細 胞 内 局 在 に 与 え る
影 響 に つ い て 免 疫 蛍 光 抗 体 染 色 で 検 討 を 行 っ た 。A N G で 刺 激 し た 細 胞 と ， t e r r e i n で 前 処 理 を 3 0 分 間 行 っ た 後 A N G で 刺 激 し た 細 胞 を 比 較 検 討 し た 。 A N G で 刺 激 す る と A N G は 核 内 に 移 行 す る が ，t e r r e i n で 前 処 理 し た 後 に A N G で 刺 激 し た 細 胞 で は A N G の 核 内 移 行 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ の こ と か ら 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 に お い て t e r r e i n は A N G の 核 内 移 行 を 阻 害 し て い る と 考 え ら れ た 。（ 図 6）
5 . t e r r e i n が 血 管 内 皮 細 胞 の 細 胞 増 殖 能 に 与 え る 影 響
H U V E C の 培 地 内 に t e r r e i n を 添 加 し た と こ ろ ， t e r r e i n 添 加 群 は 対 照 群 と 比 較 し て 増 殖 能 が 濃 度 依 存 的 に 抑 制 さ れ て い た 。（ 図 7）
6 . t e r r e i n が 血 管 内 皮 細 胞 の 管 腔 形 成 能 に 与 え る 影 響
H U V E C の 培 地 内 に t e r r e i n を 添 加 し ，管 腔 形 成 能 を 評 価
し た 。 t e r r e i n 2 0 µ M 添 加 群 で は 対 照 群 よ り 管 腔 形 成 数 は 減 少 し ， t e r r e i n 5 0 µ M 添 加 群 で は 管 腔 形 成 を ほ と ん ど 認 め な か っ た 。 従 っ て t e r r e i n は 血 管 内 皮 細 胞 の 管 腔 形 成 能 を 抑 制 し た と 考 え ら れ た 。（ 図 8）
7 . t e r r e i n が 血 管 内 皮 細 胞 に お け る A N G の 細 胞 内 局 在 に 与
え る 影 響
t e r r e i n が H U V E C に お け る A N G の 細 胞 内 局 在 に 与 え る
影 響 に つ い て 免 疫 蛍 光 抗 体 染 色 で 検 討 を 行 っ た 。A N G で 刺 激 し た 細 胞 と ， t e r r e i n で 前 処 理 を 3 0 分 間 行 っ た 後 A N G で 刺 激 し た 細 胞 を 比 較 検 討 し た 。 A N G で 刺 激 す る と A N G は 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 と 同 様 に 核 内 移 行 し た 。 t e r r e i n で 前 処 理 し た 後 に A N G で 刺 激 し た 細 胞 で は A N G の 核 内 移 行 は 減 少 し な か っ た 。 こ の こ と か ら 血 管 内 皮 細 胞 に お い て
t e r r e i n は A N G の 核 内 移 行 を 阻 害 し な い と 考 え ら れ た 。（ 図
9）
8 . t e r r e i n が マ ウ ス 背 部 皮 下 移 植 腫 瘍 モ デ ル に 与 え る 影 響 に つ い て
O S C - 1 9 を 5 週 齢 雄 の ヌ ー ド マ ウ ス の 背 部 皮 下 に 移 植 し ，
t e r r e i n 投 与 群 と 対 照 群 の 腫 瘍 体 積 を 経 時 的 に 計 測 し た 。
対 照 群 は 経 時 的 に 増 殖 を 認 め た が 3 匹 で 腫 瘍 内 部 が 壊 死 変 性 す る も の も 認 め た が そ れ 以 外 は 内 部 壊 死 は 認 め な か っ た 。
一 方 t e r r e i n 投 与 群 で は ， す べ て 腫 瘍 中 心 部 が 壊 死 し 陥 没
し た 形 態 と な っ た 。 計 測 期 間 中 を 通 じ て t e r r e i n 投 与 群 の 腫 瘍 体 積 は 対 照 群 と 比 較 し て 抑 制 さ れ て お り ， 移 植 8 週 間 後 に 腫 瘍 体 積 は t e r r e i n 投 与 群 7 1 7 ± 2 9 1 m m3 ， 対 照 群
3 0 5 4 ± 1 7 8 5 m m3 に な っ た 。屠 殺 後 に 切 除 し た 腫 瘍 の 重 量 は ，
t e r r e i n 投 与 群 0 . 9 7 5 ± 0 . 3 4 5 g， 対 照 群 2 ± 0 . 9 3 g で あ っ た 。
t e r r e i n 投 与 群 が 対 照 群 と 比 べ て 有 意 に 腫 瘍 体 積 お よ び 重
量 が 小 さ か っ た 。 ま た ， 計 測 中 体 重 変 化 に 有 意 差 は 認 め な か っ た 。（ 図 1 0）
腫 瘍 組 織 内 の 血 管 新 生 に つ い て は 免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し た 。 微 小 血 管 密 度 に は t e r r e i n 投 与 群 9 1 ± 3 8 個 ,対 照 群
1 0 7 ± 4 0 個 で 減 少 傾 向 を 認 め た が ， 有 意 差 を 認 め な か っ た 。
血 管 面 積 は そ れ ぞ れ t e r r e i n 投 与 群 2 1 7 0 9 ± 8 1 6 3 µ m２ ,対 照 群 3 5 8 1 7 ± 1 2 0 1 7 µ m２ で 有 意 差 を 認 め ， t e r r e i n 投 与 に よ る 抑 制 を 認 め た 。（ 図 1 1， 1 2）
K i 6 7 は 細 胞 周 期 関 連 核 タ ン パ ク 質 で ，細 胞 増 殖 と 細 胞 周
期 の マ ー カ ー と し て 用 い ら れ る 1 8 )。 K i 6 7 陽 性 細 胞 数 は そ れ ぞ れ t e r r e i n 投 与 群 1 1 1 ± 8 個 ,対 照 群 1 5 7 ± 1 8 個 で 有 意 差 を 認 め ，t e r r e i n 投 与 に よ る 腫 瘍 増 殖 能 の 抑 制 を 認 め た 。（ 図 1 1， 1 3）
腫 瘍 組 織 内 に お け る A N G の 局 在 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 対 照 群 で は 腫 瘍 細 胞 の 核 内 に A N G の 染 色 性 を 認 め た が ，
t e r r e i n 投 与 群 で は 細 胞 質 に 染 色 性 を 認 め た が ， 核 内 の 染
色 性 は 対 照 群 と 比 較 し 低 下 し て お り ， t e r r e i n 投 与 に よ り
A N G の 核 移 行 が 抑 制 さ れ て い る と 示 唆 さ れ た 。（ 図 1 1）
考 察
A N G の 発 現 は ， 乳 癌 ， 子 宮 頸 癌 ， 結 腸 直 腸 癌 ， 子 宮 内 膜
癌 ， 胃 癌 ， 肝 癌 ， 腎 癌 ， 卵 巣 癌 ， 膵 癌 ， 前 立 腺 癌 ， 尿 路 上 皮 癌 に お い て 亢 進 し て い る 4 )。 癌 細 胞 の 産 生 す る A N G は 血 管 内 皮 細 胞 表 面 の 分 子 量 1 7 0 k D a の A N G 受 容 体 に 結 合 す る が ， そ の 構 造 は 現 在 の と こ ろ 不 明 で あ る 1 9 )。 受 容 体 に 結 合 し た A N G は ，シ グ ナ ル 伝 達 因 子 で あ る E R K と A k t が 活 性 化 す る と 同 時 に ， 核 内 に 移 行 す る 2 0 , 2 1 )。 A N G の 核 内 移 行 は ， 細 胞 密 度 に 逆 相 関 し て お り ， 細 胞 密 度 が 疎 な 状 態 で 促 進 さ れ ， 密 に な る と 抑 制 さ れ る 2 2 )。 核 内 に 移 行 し た
A N G は リ ボ ソ ー ム 生 合 成 が 行 わ れ る 部 位 で あ る 核 小 体 に
集 積 す る 。 そ の 後 ， 核 内 の A N G は r D N A の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に 結 合 し ， r R N A の 転 写 を 促 進 す る 。 血 管 内 皮 細 胞 の 細 胞 増 殖 を 促 進 す る と 同 時 に 血 管 新 生 を 介 し て 癌 の 増 殖 が 促 進 さ れ る 3 )。
さ ら に 近 年 ，A N G は 癌 細 胞 の r R N A 転 写 も 促 進 さ せ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 癌 細 胞 の 産 生 す る A N G は ， 血 管 新 生 を 促 進 す る と 同 時 に ， 癌 細 胞 に オ ー ト ク ラ イ ン 的 に 作 用 し 癌 細 胞 増 殖 を 促 進 す る 。 癌 細 胞 に お い て は 細 胞 密 度 に 関 係 な く ，A N G は 恒 常 的 に 核 内 に 存 在 し ，r R N A 転 写 と 細 胞 増 殖 を 亢 進 し て い る 4 )。 つ ま り A N G を 阻 害 す れ ば 腫 瘍 血 管 新 生 と 癌 細 胞 増 殖 を 同 時 に 抑 制 で き る 可 能 性 が あ る 。 ま
た A N G に よ る r R N A の 転 写 は ， A N G 以 外 の 血 管 新 生 因 子
で あ る b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( b F G F )や v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F )に よ る 血 管 新 生 に お い て も 必 須 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 2 3 )。
つ ま り A N G 発 現 を 阻 害 す る と ， A N G 以 外 の 血 管 新 生 因 子 に よ る 血 管 新 生 も 阻 害 さ れ る こ と が 推 察 さ れ ，A N G は 分 子 標 的 と し て 有 用 で あ る と 考 え ら れ て い る 。
こ れ ま で A N Gを 分 子 標 的 と し た 新 た な 癌 治 療 法 を 臨 床 応 用 す る た め の 基 礎 研 究 が 行 わ れ て き た 。 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 生 物 質 n e o m y c i nは A N Gの 核 移 行 を 阻 害 し ，血 管 新 生 と 腫 瘍 増 殖 を 抑 制 す る 。し か し n e o m y c i nは 腎 毒 性 と 聴 器 毒 性 を 有 す る た め ， 抗 腫 瘍 薬 と し て 臨 床 応 用 さ れ る に は 至 っ て い な い 2 4 )。n e o m y c i nの 誘 導 体 n e a m i n eは 腎 毒 性 と 聴 器 毒
性 が n e o m y c i nの 1 / 2 0で A N Gを 分 子 標 的 と し た 抗 腫 瘍 薬 の
候 補 の 1つ と し て 考 え ら れ る 2 5 , 2 6 )。 ま た N 6 5 8 2 8は ， 自 動 化 ロ ボ ッ ト を 用 い 創 薬 タ ー ゲ ッ ト に 対 し て 活 性 を 持 つ 化 合 物 を 選 別 す る ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ 技 術 を 用 い て ， 米 国 国 立 が ん 研 究 所 と 米 国 C h e m B r i d g e社 に 登 録 さ れ た
1 8 3 1 0個 の 化 合 物 の 中 か ら ， A N Gの リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ 活 性
を 最 も 阻 害 す る 化 合 物 と し て 発 見 さ れ た 。 し か し N 6 5 8 2 8 は 血 管 新 生 を 抑 制 す る が ， 腫 瘍 細 胞 の 増 殖 は 抑 制 し な い 2 7 )。
t e r r e i n は ア ス ペ ル ギ ル ス 属 真 菌 か ら 抽 出 さ れ た 新 規
A N G 阻 害 薬 9 )で あ る 。t e r r e i n は 従 来 の A N G 阻 害 薬 と は 異
な り ， 前 立 腺 癌 に お い て 癌 細 胞 の A N G 産 生 そ の も の を 抑 制 す る 薬 剤 で あ る 1 3 )。 し か し t e r r e i n の 抗 腫 瘍 効 果 や 抗 血 管 新 生 作 用 に つ い て は 不 明 で あ る 。 本 研 究 で は ， 各 種 口 腔 癌 細 胞 を 用 い て t e r r e i n が 細 胞 増 殖 に 与 え る 影 響 に つ い て 検 討 し た 。t e r r e i n は ヒ ト 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 で あ る H S C - 2， H S C - 3， H S C - 4， S A S， O S C - 1 9， O S C - 2 0 の い ず れ の 細 胞 株 に お い て も 濃 度 依 存 的 に 細 胞 増 殖 を 抑 制 し た 。 特 に H S C - 3， H S C - 4， O S C - 1 9， O S C - 2 0 で は 2 0 µ M の t e r r e i n 投 与 に よ っ て 細 胞 増 殖 の 割 合 は 約 4 0％ に 減 少 し た 。こ れ は
t e r r e i n に よ る 表 皮 角 化 細 胞 増 殖 の 抑 制 効 果 の 報 告 1 1 )と 同
様 の 結 果 で あ る が ， 表 皮 角 化 細 胞 で は t e r r e i n 2 5 µ M で 約
7 0 %， t e r r e i n 5 0 µ M で 約 3 0 %に 細 胞 増 殖 を 減 少 さ せ る こ と か ら ， 口 腔 扁 平 上 皮 癌 細 胞 で の 抑 制 効 果 の 方 が 著 明 で あ っ た 。 こ れ は 正 常 細 胞 と 癌 細 胞 の A N G 産 生 量 や 細 胞 周 期 の 差 異 が 原 因 で あ る と 考 え ら れ た 。 血 管 新 生 は 腫 瘍 の 進 展 の み な ら ず 浸 潤 ・ 転 移 に 大 き く 関 与 し て お り ， 臨 床 的 に も 浸 潤 ・ 転 移 の 制 御 は 極 め て 重 要 な 課 題 で あ る 。 本 研 究 で は 臨 床 的 に 予 後 不 良 を 示 す こ と が 知 ら れ て い る 索 状 の 浸 潤 様 式 を 保 持 し 2 8 )高 悪 性 度 で あ る O S C - 1 9 を 以 下 の 検 討 に 用 い た 。
t e r r e i n が 運 動 能 ， 遊 走 能 ， 浸 潤 能 に 与 え る 影 響 に つ い て
は ， t e r r e i n ( 2 0 µ M )添 加 に よ っ て 運 動 能 は 約 5 0％ ， 遊 走 能 は 約 3 0％ ， 浸 潤 能 は 約 2 0％ に 低 下 し た 。t e r r e i n が 癌 細 胞 に 与 え る 影 響 に つ い て は ， 前 立 腺 癌 細 胞 に お け る A N G 産 生 抑 制 作 用 1 3 )以 外 に ，乳 癌 細 胞 と 子 宮 頸 癌 細 胞 に お け る ア ポ ト ー シ ス 誘 導 作 用 2 6 )が 報 告 さ れ て い る が ， t e r r e i n の 癌 の 運 動 能 や 浸 潤 能 な ど に 与 え る 影 響 は 全 く 報 告 が な い 。
A N G は 血 管 内 皮 細 胞 の 運 動 能 ，遊 走 能 ，浸 潤 能 に 関 与 す る 。
A N G は 血 管 内 皮 細 胞 表 面 の ア ク チ ン と 複 合 体 を 形 成 し ，組
織 プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン 活 性 化 因 子 （ t i s s u e p l a s m i n o g e n
a c t i v a t o r： t P A） の 活 性 化 と ， プ ラ ス ミ ン 合 成 を 惹 起 す る
こ と で ， 細 胞 外 基 質 を 分 解 し 血 管 内 皮 の 細 胞 浸 潤 を 促 進 す
る 2 9 - 3 1 )。 ま た A N G は 血 管 内 皮 細 胞 の ス ト レ ス フ ァ イ バ ー
と 接 着 斑 （ f o c a l a d h e s i o n） の 形 成 を 制 御 し ， 細 胞 遊 走 に 関 与 す る こ と が 知 ら れ て い る 3 2 )。 A N G が 癌 細 胞 の 浸 潤 能 に 与 え る 直 接 的 な 影 響 に つ い て は ， 神 経 芽 細 胞 腫 と 肝 細 胞 癌 に お い て 促 進 的 に 働 く と 報 告 さ れ て い る 3 3 , 3 4 )。 t e r r e i n が 口 腔 癌 細 胞 に 対 し て も A N G の こ の 様 な 作 用 を 阻 害 し た の か も し れ な い 。
口 腔 癌 細 胞 は A N G を 高 産 生 す る 。t e r r e i n は 口 腔 癌 細 胞
の A N G 産 生 を 抑 制 し た 。 こ れ は 前 立 腺 癌 細 胞 に お け る 報
告 と 同 様 で あ る 1 3 )。 ま た t e r r e i n は 口 腔 癌 細 胞 の A g N O R
陽 性 数 を 減 少 さ せ た こ と か ら ， リ ボ ソ ー ム 生 合 成 を 抑 制 し た と 考 え ら れ た 。A N G は 癌 細 胞 の リ ボ ソ ー ム 生 合 成 に 関 与
す る 3 )。t e r r e i n が 口 腔 癌 細 胞 の A N G 産 生 を 減 少 さ せ る こ
と で ， リ ボ ソ ー ム 生 合 成 を 抑 制 し た と 考 え ら れ た 。 さ ら に 本 研 究 で は ，t e r r e i n は O S C - 1 9 の 外 因 性 A N G の 核 移 行 を 抑 制 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。t e r r e i n が A N G の 核 移 行 に 与 え る 影 響 に つ い て は 報 告 が な い 。 A N G 阻 害 剤 で あ る
n e o m y c i n は 前 立 腺 癌 細 胞 お よ び 血 管 内 皮 細 胞 に お い て
A N G の 核 移 行 を 阻 害 す る 2 4 )。 血 管 内 皮 細 胞 内 蛋 白 質 を 抽
出 し て 分 析 し た 研 究 で は ，n e o m y c i n は 核 分 画 の A N G の み 減 少 さ せ ， 細 胞 可 溶 化 物 （ w h o l e c e l l l y s a t e） 中 の A N G は 変 化 さ せ な い 。 さ ら に n e o m y c i n を 作 用 さ せ る と 細 胞 膜 周
辺 に A N G が 集 積 し ，同 部 で A N G が 捕 捉 さ れ て い る 可 能 性
が 指 摘 さ れ て い る 2 4 )。 n e o m y c i n と t e r r e i n は 全 く 化 学 構 造 式 が 異 な る こ と か ら ， 阻 害 機 序 も 異 な る 可 能 性 が あ り ， 本 検 討 の t e r r e i n で 処 理 し た 口 腔 癌 細 胞 に お い て は ， 細 胞 膜 で は な く 細 胞 質 内 に A N G の 集 積 を 認 め る こ と が ， 初 め て 明 ら か に な っ た 。
さ ら に t e r r e i n が 腫 瘍 血 管 新 生 に 与 え る 影 響 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 t e r r e i n は 血 管 内 皮 細 胞 の 細 胞 増 殖 能 と 管 腔 形 成 を 抑 制 し た 。 細 胞 増 殖 能 の 抑 制 に つ い て は ， 口 腔 癌 細 胞 に お け る 検 討 と 同 様 の 結 果 で あ っ た 。 t e r r e i n は 血 管 内 皮 細 胞 に お け る A N G 産 生 の 抑 制 作 用 が 報 告 さ れ て お り 1 3 )， そ れ に 起 因 す る も の と 考 え ら れ た 。 し か し t e r r e i n の A N G 核 移 行 に 与 え る 影 響 の 検 討 で は ， 口 腔 癌 細 胞 と は 異 な り ， 血 管 内 皮 細 胞 に お い て は 外 因 性 A N G の 核 移 行 を 抑 制 し な か っ た 。 こ れ に つ い て は ， t e r r e i n が 口 腔 癌 細 胞 に お い て
A N G 核 移 行 を 抑 制 す る 機 構 が 明 ら か で な い た め 不 明 で あ
る が ， 細 胞 種 の 違 い に よ る も の で あ り ， n e o m y c i n と の 相 違 点 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
次 に 口 腔 癌 細 胞 を ヌ ー ド マ ウ ス の 背 部 皮 下 に 移 植 し ，
t e r r e i n の 抗 腫 瘍 効 果 に つ い て 評 価 し た 。 対 照 群 の 腫 瘍 体
積 が 9 週 間 の 実 験 期 間 を 通 し て ほ ぼ 一 定 の 割 合 で 増 加 し て い る の に 対 し て ， t e r r e i n 投 与 群 に お い て は ， t e r r e i n 投 与 後 5 週 目 か ら 腫 瘍 体 積 は ほ ぼ 一 定 と な っ た 。 実 験 終 了 時 に は 対 照 群 の 腫 瘍 体 積 と 比 較 し て ， t e r r e i n 投 与 群 の 腫 瘍 体 積 は 約 1 / 4 と 抑 制 さ れ て お り ，t e r r e i n の 抗 腫 瘍 効 果 が 初 め て 確 認 さ れ た 。 t e r r e i n の 抗 腫 瘍 効 果 に つ い て ， さ ら に 詳 細 な 検 討 を 行 う た め 組 織 切 片 を 作 製 し 免 疫 組 織 化 学 的 に 分 析 を 行 っ た 。t e r r e i n 投 与 群 で は C D 3 1 陽 性 の 血 管 面 積 が 減 少 し て い た 。 t e r r e i n 投 与 群 で は 大 血 管 が 認 め ら れ ず ， 血 管 新 生 が 抑 制 さ れ て い る と 考 え ら れ た 。 ま た t e r r e i n 投 与 群 で は K i 6 7 陽 性 の 口 腔 癌 細 胞 数 が 減 少 し A N G の 核 移 行 が 抑 制 さ れ て い た 。A N G の 核 移 行 が 抑 制 さ れ ， 口 腔 癌 細 胞 の 細 胞 増 殖 が 阻 害 さ れ た と 考 え ら れ た 。
ま と め
t e r r e i n は ， 口 腔 癌 細 胞 に お い て A N G の 産 生 お よ び 核 移
行 を 阻 害 す る こ と で リ ボ ソ ー ム 生 合 成 を 抑 制 し ， 増 殖 能 ， 運 動 能 ， 遊 走 能 ， 浸 潤 能 を 低 下 さ せ た 。 血 管 内 皮 細 胞 に お い て は 細 胞 増 殖 お よ び 管 腔 形 成 を 阻 害 し た 。 ま た i n v i v o に お い て t e r r e i n は 抗 腫 瘍 細 胞 作 用 お よ び 抗 血 管 新 生 作 用 に よ り 抗 腫 瘍 活 性 を 示 し て お り ， 口 腔 癌 の 分 子 標 的 薬 の 候 補 に な り う る と 考 え ら れ た 。
謝 辞
稿 を 終 え る に あ た り ， 本 研 究 を 行 う 貴 重 な 機 会 を 与 え て 頂 き ， 御 懇 切 な る 御 指 導 と 御 高 閲 を 賜 り ま し た 岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 薬 学 総 合 研 究 科 口 腔 顎 顔 面 外 科 学 分 野 ， 佐 々 木 朗 教 授 に 深 甚 な る 感 謝 の 意 を 表 し ま す 。 ま た ， 本 研 究 の 遂 行 に 際 し ， 御 指 導 ， 御 協 力 頂 き ま し た 岡 山 大 学 病 院 口 腔 外 科
（ 病 態 系 ），伊 原 木 聰 一 郎 博 士 に 深 く 感 謝 い た し ま す 。さ ら に ， 本 研 究 に t e r r e i n を 供 与 頂 き ま し た 岡 山 大 学 大 学 院 自 然 科 学 研 究 科 化 学 生 命 工 学 専 攻 合 成 プ ロ セ ス 化 学 講 座 ， 萬 代 大 樹 博 士 な ら び に 同 研 究 室 の 皆 様 ， ま た 研 究 を 進 め る に あ た り 様 々 な 面 で 多 く の 貴 重 な 御 援 助 と 御 助 言 を 頂 き ま し た 岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 薬 学 総 合 研 究 科 口 腔 顎 顔 面 外 科 学 分 野 お よ び 岡 山 大 学 病 院 口 腔 外 科 （ 病 態 系 ） の 諸 先 生 方 に 深 く 御 礼 申 し 上 げ ま す 。
脚 注
岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 薬 学 総 合 研 究 科 病 態 制 御 科 学 専 攻 腫 瘍 制 御 学 講 座 口 腔 顎 顔 面 外 科 学 分 野
（ 主 任 ： 佐 々 木 朗 教 授 ）
参 考 文 献
1 ) H a n a h a n , D . a n d F o l k m a n , J . : P a t t e r n s a n d e m e r g i n g m e c h a n i s m s o f t h e a n g i o g e n i c s w i t c h d u r i n g t u m o r g e n e s i s . C e l l , 8 6 , 3 5 3 - 3 6 4 , 1 9 9 6 .
2 ) F e t t , J . W . , S t r y d o m , D . J . , L o b b , R . R . , A l d e r m a n , E . M . , B e t h u n e , J . L . , R i o r d a n , J . F . a n d V a l l e e , B . L . : I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n g i o h e n i n , a n a n g i o g n i c p r o t e i n f r o m h u m a n c a r c i n o m a c e l l s . B i o c h e m . J . , 2 4 , 5 4 8 0 - 5 4 8 6 , 1 9 8 5 .
3 ) G a o , X . a n d X u , Z . : M e c h a n i s m s o f a c t i o n o f a n g i o g e n i n . A c t a . B i o p y s . S i n . , 4 0 , 6 1 9 - 6 2 4 , 2 0 0 8 . 4 ) Y o s h i o k a , N . , W a n g , L . , K i s h i m o t o , K . , T s u j i , T . a n d
H u , G . F . : A t h e r a p e u t i c t a r g e t f o r p r o s t a t e c a n c e r b a s e d o n a n g i o g e n i n - s t i m u l a t e d a n g i o g e n e s i s a n d c a n c e r c e l l p r o l i f e r a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . , 1 0 3 , 1 4 5 1 9 - 1 4 5 2 4 , 2 0 0 6 .
5 ) R a i s t r i c k , H . a n d S m i t h , G . : S t u d i e s i n b i o c h e m i s t r y o f m i c r o - o r g a n i s m s : T h e m e t a b o l i c p r o d u c t s o f A s p e r g i l l u s t e r r e u s T h o m . A n e w m o u l d m e t a b o l i c p r o d u c t - T e r r e i n . B i o c h e m . J . , 2 9 , 6 0 6 - 6 1 1 , 1 9 3 5 . 6 ) P a r k , S . H . , K i m , D . S . , K i m , W . G . , R y o o , I . J . , L e e ,
D . H . , H u h , C . H . , Y o u n , S . W . , Y o o , I . D . a n d P a r k , K . C . : T e r r e i n : a n e w m e l a n o g e n e s i s i n h i b i t o r a n d i t s m e c h a n i s m . C e l l . M o l . L i f e S c i . , 6 1 , 2 8 7 8 - 2 8 8 5 , 2 0 0 4 . 7 ) P a r k , S . H . , K i m , D . S . , L e e , H . K . , K w o n , S . B . , L e e , S . ,
R y o o , I . , K i m , W . G . , Y o o , I . D . a n d P a r k , K . C . : L o n g - t e r m s u p p r e s s i o n o f t y r o s i n a s e b y T e r r e i n v i a t y r o s i n a s e d e g r a d a t i o n a n d i t s d e c r e a s e d e x p r e s s i o n .
E x p . D e r m a t o l . , 1 8 , 5 6 2 - 5 6 6 , 2 0 0 9 .
8 ) L e e , S . , K i m , W . G . , K i m , E . , R y o o , I . J . , L e e , H . K . , K i m , J . N . , J u n g , S . H . a n d Y o o , I . D . : S y n t h e s i s a n d m e l a n i n b i o s y n t h e s i s i n h i b i t o r y a c t i v i t y o f ( + / - ) - t e r r e i n p r o d u c e d b y P e n i c i l l i u m s p . 2 0 1 3 5 . B i o r g . M e d . C h e m . L e t t . , 1 5 , 4 7 1 - 4 7 3 , 2 0 0 5 .
9 ) L e e , J . C . , Y u , M . K . , L e e , R . , L e e , Y . H . , J e o n , J . G . , L e e , M . H . , J h e e , E . C . , Y o o , I . D . a n d Y i , H . K . : T e r r e i n r e d u c e s p u l p a l i n f l a m m a t i o n i n h u m a n d e n t a l p u l p c e l l s . J . E n d o d . , 3 4 , 4 3 3 - 4 3 7 , 2 0 0 8 .
1 0 )L e e , Y . H . , L e e , N . H . , B h a t t a r a i , G . , O h , Y . T . , Y u , M . K . , Y o o , I . D . , J h e e , E . C . a n d Y i , H . K . : E n h a n c e m e n t o f o s t e o b l a s t b i o c o m p a t i b i l i t y o n t i t a n i u m s u r f a c e w i t h T e r r e i n t r e a t m e n t . C e l l . B i o c h e m . F u n c t . , 2 8 , 6 7 8 - 6 8 5 , 2 0 1 0 .
1 1 )K i m , D . S . , C h o , H . J . , L e e , H . K . , L e e , W . H . , P a r k , E . S . , Y o u n , S . W . a n d P a r k , K . C . : T e r r e i n , a f u n g a l m e t a b o l i t e , i n h i b i t s t h e e p i d e r m a l p r o l i f e r a t i o n o f s k i n e q u i v a l e n t s . J . D e r m a t o l . S c i . , 4 6 , 6 5 - 6 8 , 2 0 0 7 . 1 2 )K i m , D . S . , L e e , H . K . , P a r k , S . H . , L e e , S . , R y o o , I . J . ,
K i m , W . G . , Y o o , I . D . , N a , J . I . , K w o n , S . B . a n d P a r k , K . C . : T e r r e i n i n h i b i t s k e r a t i n o c y t e p r o l i f e r a t i o n v i a E R K i n a c t i v a t i o n a n d G 2 / M c e l l c y c l e a r r e s t . E x p . D e r m a t o l . , 1 7 , 3 1 2 - 3 1 7 , 2 0 0 7 .
1 3 )A r a k a w a , M . , S o m e n o , T . , K a w a d a , M . a n d I k e d a , D . : A n e w T e r r e i n g l u c o s i d e , a n o v e l i n h i b i t o r o f a n g i o g e n i n s e c r e t i o n i n t u m o r a n g i o g e n e s i s . J . A n t i b i o t . , 6 1 , 4 4 2 - 4 4 8 , 2 0 0 8 .
1 4 )A l t e n b a c h , H . J . a n d H o l z a p f e l , W . : S y n t h e s i s o f ( + ) - T e r r e i n f r o m L - t a r t a r i c a c i d .
A n g e w . C h e m . I n t . E d . E n g l . , 2 9 , 6 7 - 6 8 , 1 9 9 0 .
1 5 )R u s c h o f f , J . , P l a t e , K . , B i t t i n g e r , A . a n d T h o m a s , C . : N u c l e o l a r o r g a n i z e r r e g i o n s ( N O R s ) . B a s i c c o n c e p t s a n d p r a c t i c a l a p p l i c a t i o n i n t u m o r p a t h o l o g y . P a t h o l . R e s . P r a c t . , 1 8 5 , 8 7 8 - 8 8 5 , 1 9 8 9 .
1 6 )T r e r e , D . , P e s s i o n , A . a n d D e r e n z i n , I . M . : T h e s i l v e r - s t a i n e d p r o t e i n s o f i n t e r p h a s i c n u c l e o l a r o r g a n i z e r r e g i o n s a s a p a r a m e t e r o f c e l l d u p l i c a t i o n r a t e . E x p . C e l l . R e s . , 1 8 4 , 1 3 1 - 1 3 7 , 1 9 8 9 .
1 7 )K i s h i m o t o , K . , Y o s h i d a , S . , I b a r a g i , S . , Y o s h i o k a , N . , O k u i , T . , H u , G . F . a n d S a s a k i , A . : H y p o x i a - i n d u c e d u p - r e g u l a t i o n o f a n g i o g e n i n , b e s i d e s V E G F , i s r e l a t e d t o p r o g r e s s i o n o f o r a l c a n c e r . O r a l O n c o l . , 4 8 , 1 1 2 0 - 1 1 2 7 , 2 0 1 2 .
1 8 )G e r d e s , J . , S c h w a b , U . , L e m k e , H . a n d S t e i n , H . : P r o d u c t i o n o f a m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y r e a c t i v e w i t h a h u m a n n u c l e a r a n t i g e n a s s o c i a t e d w i t h c e l l p r o l i f e r a t i o n . I n t . J . C a n c e r . , 3 1 , 1 3 - 2 0 , 1 9 8 3 .
1 9 )H u , G . F . , R i o r d a n , J . F . a n d V a l l e e , B . L . : A p u t a t i v e a n g i o g e n i n r e c e p t o r i n a n g i o g e n i n - r e s p o n s i v e h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . , 9 4 , 2 2 0 4 - 2 2 0 9 , 1 9 9 7 .
2 0 )L i u , S . , Y u , D . , X u , Z . P . , R i o r d a n , J . F . a n d H u , G . F . : A n g i o g e n i n a c t i v a t e s E R K 1 / 2 i n h u m a n u m b i l i c a l
v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s .
B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 2 8 7 , 3 0 5 - 3 1 0 , 2 0 0 1 . 2 1 )K i m , H . M . , K a n g , D . K . , K i m , H . Y . , K a n g , S . S . a n d
C h a n g , S . I . : A n g i o g e n i n - i n d u c e d p r o t e i n k i n a s e B / A k t a c t i v a t i o n i s n e c e s s a r y f o r a n g i o g e n e s i s b u t i s i n d e p e n d e n t o f n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f a n g i o g e n i n
i n H U V E c e l l s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 3 5 2 , 5 0 9 - 5 1 3 , 2 0 0 7 .
2 2 )H u , G . F . , X u , C . J . a n d R i o r d a n , J . F . : H u m a n a n g i o g e n i n i s r a p i d l y t r a n s l o c a t e d t o t h e n u c l e u s o f h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s a n d b i n d s t o D N A . J . C e l l . B i o c h e m . , 7 6 , 4 5 2 - 4 6 2 , 2 0 0 0 .
2 3 )K i s h i m o t o , K . , L i u , S . , T s u j i , T . , O l s o n , K . A . a n d H u , G . F . : E n d o g e n o u s a n g i o g e n i n i n e n d o t h e l i a l c e l l s i s a g e n e r a l r e q u i r e m e n t f o r c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d a n g i o g e n e s i s . O n c o g e n e , 2 4 , 4 4 5 - 4 5 6 , 2 0 0 5 .
2 4 )H u , G . F . : N e o m y c i n i n h i b i t s a n g i o g e n i n - i n d u c e d a n g i o g e n e s i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . , 9 5 , 9 7 9 1 - 9 7 9 5 , 1 9 9 8 .
2 5 )H i r u k a w a , S . , O l s o n , K . A . , T s u j i , T . a n d H u , G . F . : N e a m i n e I n h i b i t s X e n o g r a f i c H u m a n T u m o r G r o w t h a n d A n g i o g e n e s i s i n A t h y m i c M i c e . C l i n . C a n c e r R e s . , 1 1 , 8 7 4 5 - 8 7 5 2 , 2 0 0 5 .
2 6 )I b a r a g i , S . , Y o s h i o k a , N . , L i , S . , H u , M . G . , H i r u k a w a , S . , S a d o w , P . M . a n d H u , G . F . : N e a m i n e i n h i b i t s p r o s t a t e c a n c e r g r o w t h b y s u p p r e s s i n g a n g i o g e n i n - m e d i a t e d r R N A t r a n s c r i p t i o n . C a n c e r R e s . , 1 5 , 1 9 8 1 - 1 9 8 8 , 2 0 0 9 .
2 7 )K a o , R . Y . , J e n k i n s , J . L . , O l s o n , K . A . , K e y , M . E . , F e t t , J . W . a n d S h a p i r o , R . : A s m a l l - m o l e c u l e i n h i b i t o r o f t h e r i b o n u c l e o l y t i c a c t i v i t y o f h u m a n a n g i o g e n i n t h a t p o s s e s s e s a n t i t u m o r a c t i v i t y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . , 9 9 , 1 0 0 6 6 - 1 0 0 7 1 , 2 0 0 2 . 2 8 )K a w a s h i r i , S . , K u m a g a i , S . , K o j i m a , K . , H a r a d a , H .
a n d Y a m a m o t o , E . : D e v e l o p m e n t o f a n e w i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s m o d e l o f h u m a n o r a l s q u a m o u s c e l l
c a r c i n o m a s . O r a l O n c l . E u r . J . C a n c e r , 3 1 B , 2 1 6 - 2 2 1 , 1 9 9 5 .
2 9 )H u , G . F . , C h a n g , S . I . , R i o r d a n , J . F . a n d V a l l e e , B . L . : A n a n g i o g e n i n - b i n d i n g p r o t e i n f r o m e n d o t h e l i a l c e l l s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . , 8 8 , 2 2 2 7 - 2 2 3 1 , 1 9 9 1 .
3 0 )H u , G . F . , S t r y d o m , D . J . , F e t t , J . W . , R i o r d a n , J . F . a n d V a l l e e , B . L . : A c t i n i s a b i n d i n g p r o t e i n f o r a n g i o g e n i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . , 9 0 , 1 2 1 7 - 1 2 2 1 , 1 9 9 3 .
3 1 )H u , G . F . , R i o r d a n , J . F . a n d V a l l e e , B . L . : A n g i o g e n i n p r o m o t e s i n v a s i v e n e s s o f c u l t u r e d e n d o t h e l i a l c e l l s b y s t i m u l a t i o n o f c e l l - a s s o c i a t e d p r o t e o l y t i c a c t i v i t i e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . , 9 1 , 1 2 0 9 6 - 1 2 1 0 0 , 1 9 9 4 .
3 2 )W e i , S . , G a o , X . , D u , J . , S u , J . a n d X u , Z . : A n g i o g e n i n e n h a n c e s c e l l m i g r a t i o n b y R e g u l a t i n g s t r e s s f i b e r a s s e m b l y a n d f o c a l a d h e s i o n d y n a m i c s . P L o S O n e , 6 , e 2 8 7 9 7 , 2 0 1 1 .
3 3 )C h o , G . W . , K a n g , B . Y . a n d K i m , S . H . : H u m a n a n g i o g e n i n p r e s e n t s n e u r o p r o t e c t i v e a n d m i g r a t i o n e f f e c t s i n n e u r o b l a s t o m a c e l l s . M o l . C e l l . B i o c h e m . , 3 4 0 , 1 3 3 - 1 4 1 , 2 0 1 0 .
3 4 )Z h a o , J . , W a n g , Y . C . , Y a n g , L . Y . , Y u , D . H . , P a n , P . T . a n d W a n g , L . : N e a m i n e i n h i b i t s c e l l p r o l i f e r a t i o n , m i g r a t i o n , a n d i n v a s i o n i n H 7 4 0 2 h u m a n h e p a t o m a c e l l s . S a u d i . M e d . J . , 3 1 , 1 3 0 9 - 1 3 1 4 , 2 0 1 0 .
図１：terreinの構造式 分子量154.16の有機物。
図２：terreinがヒト口腔扁平上皮癌細胞の増殖能に与える影響
6cmディッシュにHSC-2，HSC-3，HSC-4，SAS，OSC-19，OSC-20を1×105個 ずつ播種しterrein(20µMもしくは50µM)を添加し，経時的に細胞数を測定し増殖能 を検討した。terrein添加群では細胞形態に変化はなかったが，増殖能は低下してい
0"
1"
2"
3"
4"
5"
6"
7"
8"
9"
10"
1" 2" 3" 4" 5"
0"
2"
4"
6"
8"
10"
12"
14"
1" 2" 3" 4" 5"
*
*
*
A B
図３：terreinがヒト口腔扁平上皮癌細胞の運動能に与える影響
運動能の検討はwound healing assayで評価を行った。プレート上に付着した細胞を 1mmの幅で剥離し，模擬的な創傷を作製した。左図に示すように，対照群では18時間 で創傷面積は縮小し，一方，terrein投与群は18時間後で対照群の50%程度しか創傷面 積が縮小しなかった。平均値±標準偏差(n=6)を示す。
＊：対照群に対するterrein添加群の統計的有意差を示す(p<0.01)。
遊走能の評価には，24wellのマトリゲルインベージョンチャンバーのノンコートイン サートを使用した。上段は，インサートの裏面をギムザ染色したものを示す。下段のグラ フに示すように濃度依存的に遊走能が低下していた。（A）
浸潤能の評価には，24wellのマトリゲルインベージョンチャンバーを使用した。上段は，
インサートの裏面をギムザ染色したものを示す。下段のグラフに示すように濃度依存的に 浸潤能が低下する傾向を示したが，terrein20µMでは有意差は認めなかった。（B）
平均値±標準偏差（n=3）を示す。
＊：対照群に対するterrein添加群の統計的有意差を示す（p<0.05）。
図4：terreinがヒト口腔扁平上皮癌細胞の遊走能と浸潤能に与える影響
* *
表1：terreinがヒト口腔扁平上皮癌細胞のANG産生に与える影響
OSC-19を1×105個播種後，対照群にはPBSを，terrein添加群には terrein(20µMもしくは50µM) を添加し，24，48，72，96，120時間で培 養上清を回収し，培養上清中に分泌されたANGの蛋白量を，ELISA 法に て定量した。図に示すように，72時間以降では有意に低下した。
平均値±標準偏差（n=3）を示す。
＊：対照群に対するterrein添加群の統計的有意差を示す（p<0.05）。
図5：terreinが口腔扁平上皮癌細胞のリボソーム生合成に与える影響 CultureslidesにOSC-19を播種し，terreinを添加し，24時間後にAgNOR染 色を行った。上段は，それぞれの群の典型像を示す。核内の染色された
AgNOR陽性数が，濃度依存的に低下した。平均値±標準偏差（n=10）を示す。
time（h） control terrein
20μM 50μM
24 0.623 0.6 0.536
48 0.497 0.593 0.534
72 1.075 0.686 0.514
96 2.603 0.951 0.414
120 2.656 0.973 0.527
＊
＊
＊
＊
＊
control 20μM 50μM
(pg/103cells/day)
図7：terreinが血管内皮細胞の細胞増殖に与える影響
６cmディッシュにHUVECを3×105個ずつ播種しterrein(20µMもしくは 50µM)を添加し，経時的に細胞数を測定し増殖能を検討した。平均値±標準 偏差(n=3)を示す。
＊：対照群に対するterrein添加群の統計的有意差を示す(p<0.05)。
0"
0.2"
0.4"
0.6"
0.8"
1"
1.2"
1" 2" 3" 4"
control"
terrein20μM"
terrein50μM"
図6：terreinがヒト口腔扁平上皮癌細胞におけるANGの細胞内局在に与える影響 OSC-19にANGで刺激した群（A,B）と，terreinを添加後ANGで刺激した群
（C,D）を免疫蛍光抗体染色を用いて比較検討した。ANG染色において，対照 群（A）は核内に染色性を認め，terrein添加群（C）では細胞質に染色性を認 めたが，核内においては認めなかった。
A B
C D
図9：terreinが血管内皮細胞におけるANGの細胞内局在に与える影響 図8：terreinが血管内皮細胞における管腔形成能に与える影響
対照群では，網状の管腔様構造が観察された。terrein20µMでは，
細胞同士が突起を形成していたが網状の管腔様構造は減少していた。 。 terrein50µMでは，管腔形成を認めなかった。
A B
C D
HUVECにANGで刺激した群（A,B）と，terreinを添加後ANGで刺激 した群（C,D）を免疫蛍光抗体染色を用いて比較検討した。ANG染色に おいて，対照群（A）と，terrein添加群（C）ともに核内に染色を認めた。
図10：terreinがマウス背部皮下移植腫瘍の体積に与える影響 5週齢雄ヌードマウスの背部皮下にOSC-19（8×105個）を移植し，7日 後より週2回，対照群にはPBS，投与群にはterrein 30mg/kgを腹腔内注射 した。上図に，腫瘍体積の変化を示す。マウスは投与開始後8週間後に屠 殺し，腫瘍組織を切除した。平均値±標準偏差(n=8)を示す。
＊：対照群に対するterrein投与群の統計的有意差を示す(p<0.05)。
0"
1"
2"
3"
4"
5"
6"
6" 15" 24" 33" 42" 51" 60"
control"
terrein"
day
G
B#
C# D#
E F
H
図11 terreinがマウス背部皮下移植腫瘍組織のCD31，Ki67，ANGの発現に与える影響 A: 対照群のH.E.染色像を示す。
B: terrein投与群のH.E.染色像を示す。
C: 対照群の抗CD31抗体を用いた免疫組織化学染色を示す。CD31陽性の血管内皮細胞が多く 認められた。
D: terrein投与群の抗CD31抗体を用いた免疫組織化学染色を示す。対照群と比較し，CD31陽 性細胞は減少していた。
E: 対照群の抗Ki67抗体を用いた免疫組織化学染色を示す。腫瘍実質全体に陽性細胞を認め，
染色率は高値であった。
F: terrein投与群の抗Ki67抗体を用いた免疫組織化学染色を示す。腫瘍実質全体に陽性細胞を 認めるものの，染色率は対照群と比較して低値であった。
G: 対照群の抗ANG抗体を用いた免疫組織化学染色を示す。腫瘍細胞の核内に陽性像を認めた。
H: terrein投与群の抗ANG抗体を用いた免疫組織化学染色を示す。腫瘍細胞の細胞質に陽性 像を認めたが，核内に陽性像は認めなかった。
図13：terreinがin vivoにおける腫瘍増殖に与える影響 抗Ki67抗体を用いて免疫組織学的染色を行い，腫瘍の中心を 100倍視野下で3視野選択し，Ki67陽性細胞数を計測し，平均値 を算出し評価した。（図12 E,F）平均値±標準偏差(n=24)を示す。
＊：対照群に対するterrein投与群の統計的有意差を示す(p<0.05)。
図12：terreinがin vivoにおける血管新生に与える影響
抗CD31抗体を用いて免疫組織化学的に検討した。血管密度の高い部位 を100倍視野下で3視野選び，血管面積を計測し平均値を算出し評価した。
（図12 C,D）平均値±標準偏差(n=24)を示す。
＊：対照群に対するterrein投与群の統計的有意差を示す(p<0.05)。
