小
コダニ谷 真
シンヤ也
略 歴 1997年 3月 東京大学農学部水産学科 卒業 2001年 4月 日本学術振興会 特別研究員 DC2採用 2002年 3月 東京大学大学院 農学生命科学研究科水圏生物化学 専攻博士課程 修了 2002年 4月 日本学術振興会 特別研究員 PD へ資格変更 2003年 4月 Hofstra 大学（アメリカ合衆国） Research associate（ポスドク研究員） 2004年 8月 日本学術振興会海外特別研究員 （Hofstra 大学、アメリカ合衆国） 2006年 4月 日本学術振興会特別研究員 PD （食品総合研究所 越智研究室） 2008年 4月 静岡大学創造科学技術大学院 助教 現在に至るサンゴの白化現象を食い止める ―サンゴ抗菌物質の探索―
To stop bleaching of corals
search for antibacterial compounds of corals
Most scleractinians that build coral reef colonies with other corals and other microorganisms such as bacteria including pathogenic ones. So far the existence of chemical defense system to prevent bacterial infection has been indicated by several researchers. To explore the possibility, the antibacterial screening of MeOH extracts of scleractinian coral tissues collected in Okinawa, Japan was accomplished using two strains of gram positive bacteria (Bacillus subtilis and Staphylococcus
aureus) and four strains of gram negative bacteria (Eshchelichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, and Vibrio hervei). High percentage of the scleractinian coral samples
showed antibacterial activity against S. aureus. Since the extract of Montipora digitata showed unique antibacterial activity against S. aureus and B. subtilus, isolation and identification of antibacterial principles was performed using NMR and MS spectra. The antibacterial compounds were identified as three known compounds, montiporic acids A and C, (Z)-13,15-hexadecadiene-2,4-diyn-1-ol, and a new compound named montiporic acid D.
1. 本研究の目的 “ サンゴ ”とは刺胞動物門花虫綱に属する動物である。ポリプと呼ばれる小さなサンゴ個体の集合体 であり、炭酸カルシウムの骨格の発達により硬質なものから軟質なものまで様々である。サンゴは水温が 18〜30 ℃くらいまでの温かい海が生息に適しており、熱帯または亜熱帯の地域の海に多く分布する。そ して、体内に褐虫藻と呼ばれる単細胞藻類が共生している。サンゴは褐虫藻の宿主となり、光合成に 必要な二酸化炭素や硝酸、アンモニアを提供し、褐虫藻が生産する光合成産物を利用して生存および 成長する1, 2。 近年、世界各地でサンゴの白化現象が観察されている（図1）。これはサンゴ内の褐虫藻の色素を失 うことでサンゴ骨格が白く透けて見える状態である3, 4, 5。褐虫藻が外部ストレスにより光合成能力が低下 し、サンゴは得られていた光合成生産物を十分に受け取ることが出来なくなるために群体の成長速度や 生殖能力が低下する6。多くのサンゴは褐虫藻からの光合成産物に依存しているため、長期間の白化 現象はサンゴを死滅に導き、大きな環境問題となっている。白化現象は、高水温や低水温、紫外線量 の増加、水質の人為的悪化（富栄養化、病原菌の流出）など、近年の様々な環境変化が外部ストレス として要因であると考えられている。サンゴの白化現象の報告は 1980 年代から急激に増加している。特 に、1997 年から1998 年にかけて起こった大規模な白化現象は、エルニーニョ現象による世界的な水温 の上昇が原因であると考えられている。Reef Manager’s Guide to Coral Bleaching（2006）によると、 1980年代以前には、わずかであった白化現象報告数が、2000年までには 500件以上になったことが明 らかとなっている7。 白化についての認識と研究の活発化に伴い、白化報告数が増えた可能性も示唆されるが、温暖化に 伴う水温の上昇がサンゴ礁生態系に対する世界的脅威として認識されていることが伺える。白化現象 の原因として、高水温ストレスは褐虫藻のチラコイド膜のスタッキング構造を損なわせ、これによって光化 学系エネルギー伝達の脱共役が引き起こされる。それに伴うプロトンの漏出とATP の損失は光合成の 炭素同化を制限するが、PSⅡによって生成された酸素は、PSⅠで光化学的に生成された電子と反応し 活性酸素を形成する。形成された活性酸素は脂質を酸化し、最終的に共生藻類を死滅させ宿主細胞 にダメージを与える5。その一方、低水温（温水温 18 ℃）でも、サンゴは1〜2 週間しか生きることが出来 ないという報告もある8。また、紫外線量の増加はサンゴに限らず、地球上の生物全体に影響を与える。 紫外線は化学結合を破壊する十分なエネルギーを有する。DNA 上の隣り合ったピリミジン残基の5位お よび 6 位間に共有結合が形成される反応が進行し、シクロブタン型ピリミジン二量体を形成する。ピリミジ ン二量体はDNA 複製を阻害するため、細胞致死に繋がる9, 10。さらに近年では、水質の人為的悪化も 問題となっている。人口増加や産業振興に起因する沿岸地域の栄養塩負荷の増大などの局所的な環 境変化の影響を受ける11。
病原菌の感染による影響として、Serratia marcescensはWhite Pox（白痘）の原因菌であり12、カリブ
海のサンゴ礁を代表するサンゴ（Acropora palmata）を絶滅危惧種にまで追いやった。S. marcescens
は自然界に広く分布しているが、サンゴに感染し死をもたらすものは人由来であることがわかっている13。
人の糞便や口腔からしばしば分離される常在菌の一種であり、日和見感染による院内感染が国内でも 問題となった。また、VibrioはYellow Band DiseaseやRapid Tissue Necrosisの原因菌であり、カリ ブ海の造礁サンゴに影響を与えた14。これらの他に、病原菌によるサンゴの病気として、シアノバクテリア
によるBlack Band DiseaseやParacoccusによる感染が報告されている。 図1. サンゴ白化の概要 このような背景の元、本研究では病原菌に対するサンゴの抵抗性に注目した。最近の研究で、サンゴ の白化は高水温条件下での病原菌による褐虫藻の死滅が主な原因であることが分かった。これらに対 するサンゴの抵抗性として、粘液分泌や抗菌物質が現在までに研究されている。粘液はポリプ表皮の 粘液細胞から粘性と流動性を持つ透明な液体として放出され、褐虫藻が光合成により作り出した有機物 （糖タンパク質、多糖、脂質）で構成されている*15。サンゴは高水温ストレスに曝されるとこの粘液とアン モニアを放出する。しかし、同時にこの粘液は周囲に生息する病原菌の餌となり、病原菌が増殖する。 増殖した病原菌はプロテアーゼによってサンゴや褐虫藻の組織を構成するタンパク質を分解し、褐虫藻 の色素の喪失による白化の促進、またはサンゴ組織の破壊により病気の原因となる。 このような背景のもと、本研究では沖縄石サンゴの抗菌活性試験及びMontipora digitata組織から の抗菌活性物質の単離・構造決定および抗菌活性の評価を行った。 2. 実験結果 2.1. 沖縄石サンゴ活性試験 冷凍保存したサンゴ組織を粉砕して、約等量のメタノールで粗抽出を行った。得られた粗抽出物 を遠心分離し、その上清を新しい 1.5mL マイクロチューブに移し入れた。それを乾燥しメタノールを加 え10mg/mL に調製し、代表的ないくつかの病原菌（Bacillus subtilis、Staphylococcus aureus、
Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Serratia marcescens、Vibrio harveyi）に対してペー パーディスク法 *31による抗菌活性試験を行った。ペーパーディスクには調製したサンプルを50μL 添加
した。
成される。この阻止円の直径を抗菌活性の力価とした。その結果、ほとんどすべての資料において
Staphylococcus aureusに対する抗菌活性を検出した（表1）16。 表1.抗菌活性試験結果
Coral E. coli P. aer S. mar V. har B. sub S. aur
Acropora muricata － － － － － ＋＋ Acropora muricata － － － － － ＋＋＋ Acropora muricata － － － － － ＋＋＋ Acropora latistella － － － － － ＋＋ Acropora latistella － － － － － ＋＋＋ Acropora hyacinthus － － － － － ＋＋ Acropora hyacinthus － － － － － ＋＋＋ Acropora cerealis － － － － － ＋＋ Acropora cerealis － － － － － ＋＋＋ Acropora florida － － － － － ＋＋＋ Acropora intermedia － － － － － ＋＋＋ Acropora gemmifera － － － － － ＋＋ Acropora humilis － － － － － ＋＋ Acropora nasuta － － － － － ＋＋＋ Acropora digitifera － － － － － ＋＋＋ Acropora pulchra － － － － － ＋＋ Montipora digitata － － － － ＋＋ ＋＋ Montipora digitata － － － － ＋＋ ＋＋ Montipora informis － － － － ＋＋ ＋＋ Favites chinensis － － － － － ＋＋ Favites chinensis － － － － － ＋＋ Goniastrea edwardsi － － － － － ＋＋ Leptastrea pruinosa － － － － － ＋＋ Porites lutea － － － － － ＋＋ ＋＋…阻止円が直径10mm以上20mm未満 ＋＋＋…阻止円が直径20mm以上 2.2. の生産する抗菌活性物質の単離と構造決定 抗菌活性試験の中で黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusに対して高確率で抗菌活性が見ら れた。その中で石サンゴMontipora digitataの抽出物に顕著な抗菌活性が見られたため、逆相クロ マトグラフィーおよび HPLC による抗菌物質の単離を行った。ODSを用いた HPLC 分取によって得 られた抗菌物質に関して NMR および MS スペクトルを用いた構造決定を行ったところ、既知化合物 の montiporic acid A および C（Z）-13,15-hexadecadiene-2,4-diyn-1-olと共に新規ポリアセチレンカ ルボン酸の montiporic acid Dを見出した。この成分はポジティブイオンモードの HR-ESI-MS 測定で m/z 311.1623にイオンピークを与えたことから、組成式はC18H24O3Naと推定され、montiporic acid Dは
分子式 C18H24O3であると示唆された。さらに化学構造を決定するために、重アセトン中での各種 NMR スペクトラムの測定を行い、構造決定を試みた。COSY 、TOCSY 、HMBC 、HMQC の二次元 NMR スペクトラムを測定し構造を以下のように決定した（図2）17。 図2. Montiporicacid 類の構造 2.3. montiporic acid 類の抗菌活性試験 それぞれ精製した4種のmontiporic acid類を抗菌活性試験に供した（表2）。その結果montiporic acid A および Cと比べ、montiporic acid D および（Z）-13,15-hexadecadiene-2,4-diyn-1-ol は活性が 非常に弱かった。montiporic acid Aおよび Cはペーパーディスク上に10μgを添加し抗菌活性を示す のに対し、montiporic acid Dおよび（Z）-13,15-hexadecadiene-2,4-diyn-1-olは250μgを添加しないと 抗菌活性を示さなかった。
表2.Montiporicacid類の抗菌活性比較
E. coli P. aer S. mar V. har B. sub S. aur
Montiporic acid A 10μg/disk － － － － ＋＋ ＋＋ Montiporic acid C 10μg/disk － － － － ＋＋ ＋ Montiporic acid D 250μg/disk － － － － ＋ ＋＋ (Z)-13,15-hexadecadiene-2,4-diyn-1-ol 250μg/disk － － － － ＋ ＋＋ ＋…阻止円が直径10mm未満 ＋＋…阻止円が直径10mm以上20mm未満
3. 結 論
今回の研究の結果、沖縄石サンゴには広く抗菌物質が分布している可能性が示唆された。
Montipora digitataの抗菌活性物質の同定を試み、montiporic acid 類が抗菌活性を有していること を突き止めた。今後はさらに他のサンゴにおいてどのような抗菌物質を有しているのかを調べる必要が ある。 謝 辞 本研究を遂行するにあたり、公益財団法人アサヒビール学術振興財団により研究助成金を賜りました。 ここに深く感謝申し上げます。 文 献 1) Muscatine L
Glycerol excretion by symbiotic algae from corals and Tn'daena and its control by the host. Science 156, 516-519 (1967)
2) Muscatine L, Porter JW, Kaplan IR
Resource partitioning by reef corals as from stable isotope composition I. 513C of zooxanthellae and animal tissue vs depth
Mar. Biol., 100, 2,185-193 (1989) 3) Brown BE
Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reefs 16: S129-S138 (1997)
4) Lesser MP, Stochaj WR, Tapley DW, Shick JM
Bleaching in coral reef anthozoans: effects of irradiance, ultraviolet radiation, and temperature on the activities of protective enzymes against active oxygen.
Coral Reefs, 8: 225-232 (1990)
5) Fitt Wk, Spero HJ, Halas J, White MW, Porter JW
Recovery of the coral Montastrea annularis in the Florida Keys after the 1987 Caribbean ‘bleaching event’.
Coral Reefs 12, 57-64 (1993) 6) Baird AH, Marshall PA
Mortality, growth and reproduction in scleractinian corals following bleaching on the Great Barrier Reef.
Mar. Ecol. Prog. Ser. 237, 133-141(2002) 7) Marshall PA, Schuttenberg HZ
A Reef Manager’s Guide to Coral Bleaching.
8) Jokiel PL, Coles SL
Effects of temperature on the mortality and growth of Hawaiian reef corals. Mar. Biol. 43, 3, 201-208 (1977)
9) Vink AA, Roza L
Biological consequences of cyclobutane pyrimidine dimers. J. Photochem. Photobiol. B, 65: 101-104 (2001)
10) Reef R, Dunn S, Levy O, Dove S, Shemesh E, Brickner I, Leggat W, Hoegh-Guldberg O Photoreactivation is the main repair pathway for UV-induced DNA damage in coral planulae. Journal of Experimental Biology 212: 2760-2766 (2009)
11) Carpenter KE et al.
One-Third of Reef-Building Corals Face Elevated Extinction Risk from Climate Change and Local Impacts.
Science 321, 5888, 560-563 (2008)
12) Patterson KL, Porter JW, Ritchie KB, Polson SW, Mueller E, Peters EC, Santavy DL, Smith GW. The etiology of white pox, a lethal disease of the Caribbean elkhorn coral, Acroposa palmate. Proc. Nat. Acad. Sci. 99:8725-8730 (2002)
13) Sutherland KP, Shaban S, Joyner, James JL W. Porter, Erin K. Lipp
Human Pathogen Shown to Cause Disease in the Threatened Eklhorn Coral Acropora palmate. PLoS ONE 6(8): e23468 (2011)
14) Richards A, Cervino JM, Goreau TJ, Bartels E, Hughen K, Smith GW, A
Coral Yellow Band Disease; current status in the Caribbean, and links to new Indo-Pacific outbreaks
Proceedings of the 11th International Coral Reef Symposium, Ft. Lauderdale, Florida, 7-11 July 2008, Session 7 (2008)
15) Meikle P, Richards NG, Yellowlees D
Structural investigations on the mucus from six species of coral. Mar. Biol. 99, 187-193 (1988)
16) Sato K, Casareto BE, Suzuki Y, Kodani S
Antibacterial activity of scleractinian corals in Okinawa, Japan Galaxea, Journal of Coral Reef Studies, in print (2013) 17) Kodani S, Sato K, Higuchi T, Casareto BE, Suzuki Y
Montiporic acid D, new polyacetylene carboxylic acid from scleractinian coral Montipora
