ツ メ ガ エ ル 胚 並 び に ニ ワ ト リ胚 の 内 臓 逆 位 の 人 為 的 誘 発

ア ドレナ リン作 動 性 神 経 伝 達物 質処 理 並 び に カル シ ウム イ オ ノ フ ォ ア処 理 によ る

ツ メ ガ エ ル 胚 並 び に ニ ワ ト リ胚 の 内 臓 逆 位 の 人 為 的 誘 発

豊 泉 龍 児 、 福 田 裕 之 、 大 場 順 二 、 菊 川 明 広 、 小 林 琢 大 、 高 橋 雄1、 塩 尻 信 義2、

松 下 晋3、 竹 内 重 夫

神奈川大学理学部応用生物科学科 1帝 京大学薬学部病態生化学教室 2静 岡大学理学部生物学教室

3東 京女子医科大学生物学教室

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【要 旨 】

両生類胚 の左右性 は、既 に2細 胞期 か ら 「左半球 の優 位」 とい う形で潜在 的 に備わ って いる ことが 、Spemannと その弟子た ちの今世紀初 頭の実験か ら明 らか にされ て いる。一 方、 ラ ッ ト胚 においては胚 に内在 する左右性 は少な くとも神経胚 期 まで は変 更可能で ある

ことが 、Fujinagaら の最近の一連 の研究 によ って明 らか にされ た。彼 らは・交感神経刺 激剤 と して開発 され たphenylephrine等 を加 えて ラ ッ ト胚 を全 胚培養 中する と・最大50

%の 高率で 内臓逆位 が引 き起 こされ るこ とを発 見 した。 では、早 く も2細 胞期 に既 に左 右性 を 内在 して いるカエルで は、 内蔵器 官の左右性 の成 立の メカニズムは いつ まで可塑性

を持 つので あろ うか?脊 椎動 物内部で左右 軸の成 立機構 は どの程度 の共通性が あるので あ ろ うか?本 研 究は 、哺乳類 以外の脊椎動物 で も交感 神経 刺激 によ って後天 的 に内蔵逆位が 引 き起 こ され るか否か につ いて、 ア フ リカ ツメガエル胚やニ ワ トリ胚 を用 いて検討 した。

塩類溶液 中で培養可 能な アフ リカツメガエル胚 を、脊椎動物 のア ドレナ リン作動性神経 伝達物質norepinephrineやoctopamineで 曝露処 理 しなが ら飼育す る ことで、果た して 内蔵逆位 が生 じるか否か につ いて実験 を行 った。その結果 、神経胚期 のツメガエル胚 を norepinephrine溶 液 に曝露 する と、高率 で心臓や腸管 に逆位 が誘発 され る ことが 判 った。

神経伝 達物質octopamineで も逆位胚が有 意 に生 じた。神 経胚期 か ら神経 管期 のツメガエ ル胚 のCa2+‑ionophore処 理で も最大50%の 高率で 内臓 逆位が生 じた。カエル胚 の

norepinephrine処 理やCa2+‑ionophore処 理で は、普通胚で は1127例 中1例 も見 出され なか った 「心臓が正位 だが腸管 は逆位 」の胚が総 計981処 理個体 中、22個 体 得 られた。

Ca2+‑ionophore処 理 にお いて は、早 くか ら暴露処 理 を開始 する と逆位発 生率はむ しろ低 下 した。

また、鳥類胚 を卵殻外で3日 胚 まで簡便 に培 養す る方法 を開発 し、鳥類胚 を交感 神経刺 激 剤 に暴露 しなが ら全胚培養 する ことで心 臓逆位が誘発 出来るか否 か につ いて も検 討 した。

ニ ワ トリの種 卵を交感神経刺 激剤phenylephrineで 刺 激 しなが ら培 養す ると低頻 度なが ら心臓逆位が 生 じる ことが 判 った。

これ らの結 果か ら、ツメガエル胚 の 内蔵の左右 軸は、神経管 閉鎖前後 の時期 まで はア ド レナ リン作 動性交感神経 伝達物質 に均一 に曝露 する ことで変更 可能な可塑性 を持つ こ とが 分 か った。 ア ドレナ リン作動性伝 達物質受容体 への刺激 と それ に引 き続 いて生 じる細 胞 内Ca2+濃 度の上昇 を介 した、 ある神経性 のメカニズ ムの支配下 に脊椎 動物 胚の 内蔵器 官 の左右 性の決定機 構が存在 する ことが示 唆 された。

【序 論 】

脊椎 動 物 の 内臓 器 官 の形 態 や そ の 配 置 は、 外 部 形 態 の対 称 性 と は う らは らに、 器 官 に よ って は 際 だ った 左 右 性 を 示 す 。 発 生 の 途 中 まで は厳 密 な 対称 性 を 示 して いた 胚 性 器 官 も、

体 節 期 を過 ぎ る ころ か ら、 左 右 性 を示 す よ う にな る。 器 官 の 左右 性 は 、 自然 界 に お い て は そ れ が 反 転 す る こ と(逆 位[SltUSinVerSUS]と い う)は 希 で あ る の で 、 あ る遺 伝 的な 調 節

を 受 け て い る と考 え られ て い る。 内蔵 逆 位 と い う現 象 を手 が か りに 、 内臓 器 官 の 左右 性 の 決 定 の メ カ ニ ズ ム が 古 くか ら様 々 な ア プ ロ ーチ で 調 べ られ て きた 。 割 球 操 作 によ る 実 験 発 生 学 的 な 研 究(SpemannandFalkenberg,1919;Brownetal,,1991)や 、 内 臓 逆位 を 高 率 に引 き起 こす マ ウ ス 系統 の原 因 遺 伝 子iv,invの 追 求(HummelandChapman,

1959;Layton,1976;McGrathetal.,1992;Yokoyamaetal,,1993)に み られ る よ うな 分 子 生 物 学 的研 究 や 、 肺 の 分 葉 や 利 き腕 等 を指 標 と した 家 系 学 的 研 究(Fishmanet al.,1976;McManus,1991)が あ る。

カエ ル 胚 の 左 半球 の 優 位 性 の 研 究 か ら分 か る よ う に、 脊 椎 動物 胚 は2細 胞 期 か ら左 右 軸 に沿 った 潜在 的 な 極 性 を確 立 して い る こ とが 古 くか ら指 摘 され て きた 。 左 右 軸 に沿 った極 性 は 、 胚性 構 造 物 で あ る 中軸 組 織 が 出 来始 め る 原腸 胚 一神 経 胚 期 の 見 か け 上 完全 に対称 な 胚 の 形 態 か らは 目で 見 て分 か らな い。 しか しな が ら、 この 時期 に も形態 形 成 分 子 の 潜 在 的 な 左右 性 が(特 に外 胚 葉 や 中胚 葉 に)あ る こ とが 判 り始 め た。 形態 的 には未 だ 左 右 対 称 で あ る 原 条 期 ニ ワ トリ胚 にお い て 、 軸 形 成 に 関わ る遺 伝 子 で あ るSonichedgehogやactMn

typeIla受 容 体 並 び にcNR‑1のHensen氏 結 節 の周 囲 の 分 布 は既 に非 対 称 で あ る ことが 発 見 され た(Levinetal.,1995)。 また 、原 腸 胚 の動 物 極 の 胞 胚 天 井 の 基 底 膜 面 に発 現 す る 細 胞 移 動 に関 わ る細 胞 外 基 質 分 子fibronectinの 非 対 称 な 分 布 が0初 期 中胚 葉 細 胞 量 の 左 右 非 対称 な 分 布 を 介 して 内臓 配 置 の 左右 性 の 原 因 とな る こ とが 示 唆 され て い る(Yost,

1992)O

Fujinagaら は、 ラ ッ ト胚 に対 してN20曝 露 を行 う薬 理 学 的 な 研 究 の 途 中で 、そ の 処 理 が 高 率 に 内臓 逆 位 を 引 き起 こす こ と を発 見 した(1989,1990)。 彼 らは、N20が 交 感 神 経 を刺 激 す る作 用が あ る こ と に着 目 し、交 感 神 経 に対 す る 刺 激 を 介 してN20が 内臓 逆 位 を 引 き起 こ した の で は な いか と推 論 した。 そ こで 彼 らは 、 ラ ッ ト胚 を全 胚 培 養 しな が ら交 感 神 経 の刺 激 剤 で あ るphenylephrineに 曝露 した と こ ろ、 最 大50%の 高率 で ラ ッ ト胚 の 人為 的逆 位 化 に成 功 した(1991,1992)。 左右 軸 形 成 の メ カ ニズ ム は 、 脊椎 動 物 内 部 で す ら異 な る 部 分 が あ る と い う指 摘 が あ る(Levinetal.,1995のdiscussion参 照)が 、 カ エ ル 胚 や ニ ワ トリ胚 に お い て も、Fujinagaら が ラ ッ ト胚 に お い て 明 らか に した よ うに、 胚 の 左 右 軸 を 外 科 的手 術 に よ らず無 傷 の ま ま人 為 的 に擾 乱 させ る こ とが 出来 る の だ ろ うか?

本 研 究 は 、分 子 生 物 学 的 な 実 験 材 料 と して も実 験発 生 学 的 な 実 験 材 料 と して も好 適 な ア フ リカ ツ メ ガエ ル を 用 いて 、 両 生 類 胚 を交 感 神 経 刺 激 剤phenylephrineに 曝露 処 理 す る こ とで 、果 た して 内 臓 逆 位 が 生 じる か否 か を検 討 した 。 そ の 結 果phenylephrine処 理

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で は ツ メ ガ エ ル 胚 に 内臓 逆 位 を 引 き 起 こせ な か った 。 しか しな が ら、 神 経 胚 期 の ツ メガ エ ル 胚 を 脊 椎 動 物 や 無 脊 椎 動 物 の 体 内 に存 在 す る 交 感 神 経 伝 達 物 質octopamineや

norepinephrineと い った よ りnativeな 物 質 によ って 、 高 率 で 内臓 逆 位 が 誘 発 され る こ と が 判 った 。 ま た 一 方 で 、神 経 胚 期 か ら(神 経 管 閉 鎖 前 後 の)神 経 管 期 の ツ エ ガ エ ル 胚 を Ca2+‑ionophoreA23187を 用 いて 刺 激 す る と 内蔵 逆 位 が 引 き起 こ され る こ とが 判 った 。

鳥 類 胚 につ いて は 、 そ れ を 卵 殻 外 で3日 胚 まで 簡 便 に培 養 す る 方法 を 新 た に 開発 し、 交 感 神 経 刺 激 剤phenylephrineに よ る 内臓 逆 位 が 誘 発 出来 る か 否 か につ いて 、 我 々 の 全 胚 培 養 法 で 検 討 した 。 種 卵 の ニ ワ トリ胚 をphenylephrineで 刺 激 しな が ら全 胚 培 養 す る と 、 低 率 な が ら心 臓 逆 位 胚 が 生 じる こ とが 判 った 。

これ らの 結 果 か ら、 内 臓 器 官 の左 右 軸 は 初 期 尾 芽胚 期 まで は 変 更 可 能 な 可 塑 性 を 持 つ こ とが 判 った 。 脊 椎 動 物 の 左 右 軸 は交 感 神 経 伝 達 物 質 の 関 与 す る機 構 に よ っ て成 立 す る こ と が 示 唆 され た 。Ca2+は 、 神 経 細 胞 間 の 化 学 的伝 達 機 構 の 鍵 分 子 で あ るの で 、 交 感 神 経 伝 達 物 質 並 び にCa2+‑ionophoreの 両 方 で 内蔵 逆 位 が 引 き起 こ され た こ とか ら、 あ る神 経 性

の メ カ ニ ズ ム の 直 接 の 支 配 下 に内蔵 器 官 の 左 右 性 が 決 ま る と予 想 され る。

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【材 料 と 方 法 】

ア フ リカ ツ メ ガ エ ル(Xenopus'aev'5)並 び にニ ワ トリ(Ga〃usdome5亡'c5)の 胚 を材 料 と して 用 い た 。 これ らの胚 を 、 特 定 の 時 期 に一 定 の 濃度 の 交 感 神 経 伝 達 物 質 も し くは 交 感 神 経 刺 激 剤 を 溶 か した 溶 液 に胚 全 体 を 曝 露 し、 内臓 器 官 の 心 臓 ル ー プ(カ エ ル 、 ニ ワ トリ) 並 び に腸 管 ル ー プ(カ エル の み)の 巻 き 方 の 左 右 性 が 判 定 で き る発 生 段 階 まで 培 養 した 。

〈 ツ メ ガ エ ル 胚 の場 合 〉

発 生 段 階 はNieukooP&Faber(1967)の 発 生 段 階 表 に従 って 同 定 した 。 卵 膜 を 剥 いた ツ メ ガ エ ル 胚 を 、stage9か ら26の 時 期 に、 交 感 神 経 伝 達 物 質norepinephrineや

octopamine、 並 び にCa2+‑ionophoreA23187溶 液 に浸 し始 め た 。 常 法 に従 って ・ メ ス の 背 側 皮 下 に生 殖 線 刺 激 ホル モ ンで あ るgonadotropinを500‑600unit注 射 して 、 十 数 時 間 後 に排 卵 させ 、 オ ス の精 巣 の 懸 濁 液 を 振 りか け て人 工 授 精 を行 った 。 同 時 に人 工 受 精 を 行 っ た2‑3匹 の 雌 ガ エ ル 由 来 の 受 精 卵 を1batchと 呼ぶ こ と にす る。 初 期 原 腸 期 か ら 体 節 期(後 期 尾 芽 胚 期)ま で の ツ メ ガ エ ル 胚 を 、 無 菌 的 に脱 ゼ リー した 後1匹 ず つ24穴 Multi‑wellplateに 入 れ て 、1.5‑2mlの 滅 菌 した10倍 希 釈Steinberg氏 液 に試 薬 を溶 か して23℃ 前後 で 定 温 培 養 した 。Multi‑wellplateで 神 経 伝 達 物 質 処 理 を 行 った 胚 は全 て 卵 膜 を予 め剥 いて お き 、 滅 菌 した 軟 寒 天 を ベ ッ ドに して10倍 希 釈Steinberg氏 液 中 で 、 往 復 振 邊 器 で 揺 す りな が ら処 理 開 始 ま で無 菌 的 に リザ ーブ して お い た。 予 備 実 験 と して 、

後 期 胞 胚 期 以 降 に卵 膜 を剥 いた 場 合 は 、 胚 の か た さが 十 分 で あ り重 力で っ ぶ れ る こ とな く 4日 胚 ま で 正 常 に発 生 す る こ と を確 か め た。 卵 膜 を剥 か な か った 場 合 は 、

norepinephrine処 理 やoctopamine処 理 の場 合 に は 、殆 ど効 果 は現 れ な か っ た。 しか し、

A23187に 関 して は 、 卵 膜 を剥 か な くて も効 果 が 見 られ た の で 、大 半 の例 数 は 卵 膜 を 剥 か な か った 胚 の もの で あ る。

試 薬 と して は 、 交 感 神 経 の 神 経 伝 達 物 質 で あ る 、(一)一(R)‑norepinephrine酒 石 酸 塩(和 光)並 び にD,L‑octopamine‑HCI(Aldrich)を 用 い た 。 いず れ も水 に易 溶 性 な の で 、 高 濃 度 のstocksolutionを 作 り、10倍 希 釈Steinberg氏 液 でstocksolutionを 薄 め 、 そ の 中 で 、 胚 を無 血 清 培 養 した 。 予 備 実験 と して 、0.5mM,5mMのnorepinephrine溶 液 に stage19‑20の 卵 膜 を剥 いた 胚 を暴 露 した と ころ 、5mMで は 全 例 が 死 亡 し、0.5mMで は

全例 が 生 き延 び た(n=各8)。 原 腸 胚 に対 して も、5mMのnorepinephrineは 致 死 的 な 影 響 を 与 え 、直 ち に発 生 が 停 止 して 死 に至 っ た(n=12)。 従 って処 理 濃 度 を0.5mMに 設 定 した 。 norepinephrineは 感 光性 が あ る の で 、24穴multi‑wellplateを ア ル ミホ イル で 包 ん で 暗 黒 下 で培 養 した 。octopamineの 処 理 濃 度 を 検 討 す る 予 備 実 験 と して 、 濃 度2.5mMの octopamine溶 液 に、stage9,18,19の 卵 膜 を 剥 い た 胚(n=11,12,10)を 暴 露 して stage41‑46ま で 飼 育 したが 、 生 存 個 体 は 合 計4個 体 で あ っ た。 原 腸 胚 に対 して は O.5mMのoctopamineは 致 死 的 な 影 響 を 与 え 、 直 ち に発 生 が 停 止 して 死 に 至 った(n=12)。

そ こで 、O.005mM,0.05mM,0.5mMの 濃 度 のoctopamine溶 液 を 使 い分 け て 暴 露 処 理 す る こ と に した。 早 い発 生 段 階 で は 、octopamine処 理 に よ る 死 亡 率 が 高 か った の で 、 0.005mM,0.05mMで 処 理 を 行 った 。 比 較 的後 期 の 胚 で は0.5mMの 濃 度 で 処 理 を行 った 。 処 理 胚 は 、 同 一 バ ッチ の 無 処 理 胚 が 心 臓 ル ープ 並 び に腸 管 ル ー プの 巻 き 方 の 左 右 性 が 判 定 で き る 、stage41‑46の 発 生 段 階 に達 す る ま で 培 養 した 。 処 理 胚 、特 に逆 位 化 の 生 じた 胚 は発 生 が 無 処 理 胚 に比 べ て遅 れ る 傾 向 が あ った が 、数 時 間 置 き に左右 性 の 判 定 を 繰 り返

し、Multi‑wellplate内 の 全 て の 個 体 にっ いて 内臓 の 正 位/逆 位 を 判 定 した。 心 ル ー プ 並 び に腸 管 ル ー プ によ り正 位/逆 位 の 判 定 の 出来 るstage41‑46で 、 判 定 した 。

無 処 理 群 と して 、10倍 希 釈Steinberg氏 液 中 で飼 育 した 人 口授 精 胚 をバ ッチ ご と に stage41‑46で 心 臓 と腸 管 の 左 右 性 につ いて 判 定 した 。 また 、 卵 膜 を 剥 い て試 薬 処 理 群

と同 じ24穴 プ レー ト内で10倍 希 釈Steinberg氏 液 の み で 培 養 した 対 照 群 を設 け、 これ につ いて も両器 官 の 左 右 性 を 検 定 した 。 天 然 の逆 位 胚 もや は り、 発 生 が 遅 れ る 傾 向が あ っ た 。 そ こで 、後 期 尾 芽 胚 期 に正 常 な胚 を セ レク シ ョン し、大 半 の 胚 がstage41‑46に 達

した 段 階 で まず1回 目の 判 定 を行 い 、 残 りは 棄 却 す る の で は な く、 バ ッチ 内の 全 て の胚 に つ いて 判定 可 能 なstageま で は培 養 して は 判定 す る こ と を繰 り返 した 。

交 感 神経 伝 達 物 質norepinephrineやoctopamineが それ らの 受容 体 に結 合 す る と、

シナ プ ス後 膜 上 のCa2+一 チ ャ ン ネ ル を 解 放 す る な ど して 、 受 容 体 発 現 細 胞 の 細 胞 質 へ の Ca2+イ オ ンの 流 入 が 生 じて 、 細 胞 内Ca2+濃 度 が 上 昇 す る こ とが 知 られ て い る。 そ こで 、

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Ca2+‑ionophoreA23187を 胚 に作 用 さ せ る こ と で逆 位 が 引 き起 こ され る か否 か につ い て 実 験 を 行 い 、norepinephrine処 理 やoctopamine処 理 の 結 果 と比 較 検 討 した

(Fujinagaetal.,1994)。 予 備 実 験 と して 、stage26の 卵 膜 の な い(鰐 化 した)胚 を 、 0.1,1,10,50,100nMのA23187に 暴 露 処 理 した結 果 、 半 数 致 死 量 は、50,100nMの 間 にあ った(n=各8)。 そ こで処 理 濃 度 を50nMに 設 定 した 。DMSO(dimethylsulfoxide)

に溶 か したstocksolutionか らCa2+‑ionophoreA23187(Sigma)を50nMの 最 終 濃 度 で 滅 菌 した10倍 希 釈Steinberg氏 液 に溶 か し、 原 腸 期 か ら後 期 尾 芽胚 期 まで の 胚 を そ の 中 で 無 菌 的 に培 養 した。 処 理 胚 がstage41‑46の 発 生 段 階 に達 した 段 階 で 、全 て の 処 理 個 体 につ いて 逐 次 心 ル ー プ と腸 管 ル ー プ の 巻 き方 の 左 右 性 を 判 定 した 。 判 定 後 、逆 位 化 した 胚 に お いて 何 らか の 生 理機 能 不 全 が 生 じて い るか 否 か を 検 討 す る た め に 、池 の 水 で1ヶ 月 以 上 長 期 に飼 育 す る こ とを試 み た 。

〈 ニ ワ トリ胚 の 場 合 〉

内蔵 の 左 右 性 の 最 初 に現 れ る マ ー カ ー で あ る、 形成 期 の 心 臓 の ル ー プの 胚 軸 に対 す る位 置(正 位 の 胚 で は 、 背 側 か ら見 て 右 側)に よ って 、 内蔵 の 左 右 軸 が 反 転 した か 否 か を 検 定 し た 。 試 薬 に暴 露 した ま ま 、 心 臓 ル ー プ の 左 右 性 の 判 定 の 出来 る3日 胚 まで 長 期 に全 胚 培 養 す る こ と を試 み た か った の で 、 そ の 目的 に適 した 全 胚 培 養 法 か ら検 討 した 。 鳥類 胚 の 全 胚 培 養 法 と して 、New(1955)の 胚 盤 葉 の み の 培 養 法 とPerry(1988)の 自然 の卵 殻 を 容 器 と

して 用 いた 方法 が 知 られ る が 、 いず れ の 方 法 も習 熟 に経 験 を要 す る た め 、新 た に簡 便 な 方 法 を確 立 した 。 上 面 の 一部 に菌 を通 過 させ な いサ イ ズ の ボ ア フ ィル タ ー(直 径1cm)を 装 着 した 、 直 径8cm、 高 さ7cmの 植 物 培 養 用 の 容 器(luchi製culturejar,250mI)を 紫 外 線 滅 菌 した 後 に、Hanks氏 液40m1と 種 卵 ま た は 艀 卵2日 胚 か ら採 取 した 鶏 卵2.5個 分 の 卵

白(80mり を 混 ぜ 合 わ せ て そ の 中 に注 い だ 。 こ こ に、 卵 黄 膜 を傷 つ けな い よ う に、 卵 黄 全 部 を 浮 か べ た(図1A)。Hanks氏 液 を混 ぜ た の は 、Par6nandTh6rneby(1976)の 方 法 に 習 って 、 卵 白の 比 重 を 下 げ る こ とで 卵 黄 の 上 面 に位 置 す る胚 盤 葉 を 、 水 面 下 ギ リギ リに 丁 度 沈 ませ た状 態 で 培 養 す る た め で あ る 。 こ こ まで の 操 作 は 、全 て 無 菌 的 に ク リー ン ベ ンチ 内 で 行 った 。 容 器 は 、旋 回 半 径2.5cm,35r.p.m.で 緩 や か に撹 拝 しな が ら、 全体 を 湿 度 を80%以 上 に高 く した38度 の イ ン キ ュベ ー タ ー に収 納 し(図1B)、 最 大70時 間旋 回 培 養 し た 。 予 備 実 験 の 結 果 、 卵 白の み でHanks氏 液 を混 ぜ な か った 場 合 、 胚 盤 葉 は卵 白液 か ら浮 き上 が った 状 態 で 乾 燥 して 死 滅 して しま った(n=3)。Hanks氏 液 と卵 白 と を等 ■ 混 合 した 場 合 は 、卵 黄 は容 器 の 底 に沈 ん で しま い、 恐 ら くガ ス 交 換 が うま く いか な か った為 に死 滅

した(n=42)。 上 記 の 方 法 で 、 ル ーチ ン に8096の 成 績 で 、 見 た 目 には 完 全 な3日 鰐 卵 胚 を 得 る こ と に成 功 した(n=14;図1C)。 用 いた 容 器 が 、Perryの 方 法 の 核 心 で あ る 、 内部 の 湿 度 が 失 わ れ ず にガ ス 交換 を 行 うと い う 目的 に合 致 した の で あ ろ う。 更 に全 体 を 緩 や か に 撹 搾 す る こ とは 、 転 卵 と等 価 な 効 果 を もた ら した と考 え られ る。

簡 便 な 全 胚 培 養 に成 功 した の で 、Hanks氏 液 に最 終 濃度0.05mM‑0.25mMに な る よ う にphenylephrineを 溶 か して 、 胚 全 体 を培 養 期 間 中暴 露 した 。phenylephrineは 感 光 性 の 薬 剤 で あ るが 、扉 を 閉 め た イ ンキ ュ ベ ータ ー の 内部 は 暗 黒 に保 たれ た 。2.5‑3日 後 に 、 容 器 の 蓋 を 開 け て 内 部 の 胚 とそ の 心 臓 ル ー プ と の位 置 関 係 並 び に、 血 流 の 方 向 性 を観 察 し、

写 真 撮 影 また は ビデ オ 撮 影 によ り記 録 した 。 我 々 の 方 法 の 長 所 の 一 つ と して 、 ネ ジ 回 し式 の 容 器 の 蓋 を 開 け て 胚 の 成 長 の 状 況 を観 察 し、胚 の 生 育 が 遅 れ た場 合 に は 再 び 蓋 を 閉 め 直

して 全 胚 培 養 を継 続 す る こ とが 容 易 にで きた 。 こ う してstage11‑19の2.5‑3日 胚 の 心 臓 ル ー プの 左 右 性 を 検 討 した 。

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【結 果 】

<自 然 逆 位>

stage41‑46に 達 した 人 工 受 精 胚 を 用 いて 、 無 処 理 の ツ メ ガ エ ル 胚 の 内臓 逆 位 の 出 現 頻 度 を 、 心 ル ー プ並 び に腸 管 の らせ ん の 巻 き 方 の 非 対 称 性 を 手 が か り に調 べ た 。

9batchの 人 工 授 精 群 の1127個 体 につ い て 、 心 臓 一腸 管逆 位 を 双 眼 実 体 鏡 を用 い た 視 認 に よ りチ ェ ック した 。 そ の 結 果 、25個 体 、2.2%の 自然 逆 位 胚 が 存在 した(表1)。 心 臓 も 腸 管 も逆 位 を 示 した個 体(n=8)や 、 腸 管 が 正位 で 心 臓 の み が 逆 位 を示 した 個 体(n=17)は 出 現 した が 、 心 臓 が 正位 で 腸 管 の み が 逆 位 で あ る例 は観 察 され な か った(n=0;表5)。 逆 位 個 体 は発 生 が や や 遅 れ る 傾 向 が み られ 、 正位 胚 よ り も判 定 可 能 な 発 生 段 階 に達 す る の が 半 日 か ら一 日遅 れ る場 合 が 多 か った 。

次 に、 対 照 群 と して コ リオ ン を剥 い た だ け場 合 の 、 逆 位 胚 の 発 生 率 を調 べ た 。stage 12ま た はstage19の 発 生 段 階 で 卵 膜 を 剥 い た胚 を 、10倍 希 釈Steinberg氏 液 を満 た し た24穴 プ レ ー トの 中で 実 験 群 同様stage41‑46ま で 飼 育 して 、 心 臓 並 び に腸 管 の 左 右 性 を 検 定 した 。 逆 位 胚 は 生 じな か った(表1)。

〈 交 感 神 経 伝 達 物 質norepinephrineに よ る人 為 逆 位 〉

主 と して交 感 神 経 伝 達 路 の α受 容 体 を 刺 激 す る と され 、 ツ メ ガ エ ル 胚 内 に お いて は 神経 胚 以 降 か ら出 現 す る(Roweetal.,1993)、 脊 椎 動 物 の 神 経 伝 達 物 質norepinephrineに 胚 を 暴 露 した 。norepinephrineを 溶 か した10倍 希 釈Steinberg氏 液 中 で 、stage9‑24

の 胚 を暴 露 処 理 しな が ら、 正 位/逆 位 の 判 定 可 能 なstage41‑46ま で培 養 した 。 原 腸 胚 期 か ら神 経 胚 期 に濃 度0.5mMのnorepinephrineで 暴 露 処 理 を 行 った場 合 、 高 頻 度 の 逆 位 個 体 が 出現 した(図2;表2)。 特 に 、stage11か ら処 理 を 開 始 した 場 合 に は、 心 臓 の 逆 位 や 腸 管 の 逆 位 が2896の 確 率 で 生 じた 。 前 項 の無 処 理 群 で は 、1127例 中0例 で あ った 、r心

臓 は正 位 で あ るが 腸 管 は 逆 位 」 と い う胚 がstage9‑19の 暴 露 処 理 生 存 胚343個 体 中8個

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体 出 現 した こ とが 、 注 目 され る(図2C;表5)。 また 、 胚 全 体 に対 してsymmetricalな 刺 激 を 与 え た が,逆 位 が 誘 発 され た こ と にな る 。 表2の 実験 例 は全 て 卵 膜 を 剥 いた 。 卵 膜 を剥 か な か った 場 合 は 、stage12の 神 経 胚 に逆 位 を生 じ させ た 濃 度0.5mM,0.05mMの

norepinephrineで 処 理 して も、 普 通 胚 程 度 に しか 逆 位 は 出現 しな か った(n=各8計16、

うち逆 位 個 体1)。 従 ってnorepinephrineは 卵 膜 を 透 過 しな か った よ うだ 。

norepinephrine処 理 中 には 、4日 胚 で 外 鯉 と して 存 在 す る 鯉 が 、胚 体 の 側 面 か ら垂 直 に そ そ り立 つ 傾 向 が あ った 。 しか しな が らそ の こ とが 原 因 で 以 後 の 胚 発 生 が 異 常 に な った わ

け で は な く、norepinephrine処 理 後 に 正 常 な10倍 希 釈Steinberg氏 液 に戻 して飼 育 を 続 け た が 、 そ の ま ま数 日間一1ヶ 月間 生 き続 け、 外 形 や遊 泳 行 動 も正 常 だ った(図3)。 従 っ

て 、norepinephrine処 理 で左 右 が 反 転 した こ と以 外 は 、 正 常 な 胚 が 得 られ た こ と にな る。

norepinephrineに 浸 した ま ま更 に飼 育 を続 け た場 合 に は 、 徐 々 に腹 部 が 水 泡 化 して膨 ら み 、 そ うな っ た個 体 か ら死 ん で い った 。

〈 交 感 神 経 伝 達 物 質octopamineに よ る人 為 逆 位 〉

交 感 神経 伝 達 路 のα1受 容 体 を主 に刺 激 す る と され る脊 椎 動 物 の 脳 や 交 感 神 経 の 神 経 伝 達 物 質octopamine(MolinoffandAxelrod,1969;AxelrodandSaavedra,1977;

Maxwelletal.,1982;David,1984;lbrahimetal.,1985)を 用 い て 暴 露 処 理 を行 っ た 。octopamineを0.005‑0.5mMの 濃 度 で 溶 か した10倍 希 釈Steinberg氏 液 中で 、 stage12(初 期 神 経 胚 期),stage21(神 経 管 期)の 胚 を 、正 位/逆 位 の 判 定 可 能 なstage 41‑46ま で 培 養 し、逆 位 個 体 の 出 現 率 を 検 定 した 。stage12か らの 処 理 胚 に お い て

16%の 頻度 で 、stage18か らの 処 理 胚 に お い て35%の 頻 度 で逆 位 個 体 が 出 現 した(図2D;

表3)。 この 頻 度 は 、2x2分 割 表 にお け るカ イ検 定 の 結 果 、卵 膜 を 剥 いた だ け の 対 照 群 や 普 通 の 人 工 受 精 胚 に お ける 逆 位 出現 率 よ り も有 意 に高 か っ た(P.<0.001)。 胚 全 体 に対 し てsymmetricalな 刺 激 を 与 え た に もか か わ らず 、 逆 位 が 誘 発 され た 。 表3の 実 験 例 は全 て 卵 膜 を剥 いた 。 卵 膜 を 剥 か な か った場 合 に は 、stage19の 胚 に逆 位 を 生 じさせ た 2.5mMで 処 理 して も、control程 度 に しか 逆 位 胚 は 出 現 しな か った(n=20の うち 奇 形1以 外 は全 て 正位 で 生 存 して いた)。 従 って 、octopamineは 卵 膜 を通 過 しな か った よ うだ 。 左 右 性 の 判 定 後 、 通 常 の10倍 希 釈Steinberg氏 液 に切 り替 え て培 養 した と ころ 、 大 半 の 胚 が 正 常 な 外 部 形 態 を持 ち つ つ 、普 通 胚 と 同程 度 の 生 存 率 を示 した 。stage19か ら 0.5mMのoctopamineに 浸 した ま ま 内蔵 器 官 の 左 右 性 を 判 定 す る ま で 暴 露 し、 そ の 後 普 通 の 池 の 水 に戻 して 飼 育 を 続 けた 場 合 、3日 後 ま で は8096の 処 理個 体(15個 体 中12個 体) が 正 常 な 外 見 と遊 泳 行 動 の ま ま生 き て い た(stage47‑48)。octopamineに 浸 した ま ま 更 に飼 育 を続 けた 場 合 に は 、徐 々 に腹 部 が 水 泡 化 して 膨 らみ 、 そ うな った 個 体 か ら死 ん で い った 。

〈Ca2+‑ionophoreに よ る 人 為 逆 位 〉

初 期 神 経 胚(stage11)か ら初 期 神 経 管 期 胚(stage19‑20)ま で の 間 に、50nMのCa2+‑

ionophoreA23187に 暴 露 し始 め 、 そ の ま ま 、stage41‑46の 左 右 性 が 判 定 出来 る stageま で培 養 した場 合 、 高 頻 度 に内臓 逆 位 胚 が 出 現 した(図4;表4)。 逆 位 個 体 の 出現 率

は 、神 経 摺 期(stage17)か ら初 期 神 経 管 期(stage20)に 処 理 を 開 始 した 場 合 に最 も高 く、

50%前 後 で あ った 。後 期 原 腸 胚 を低 濃 度 のA23187で 処 理 した場 合 には 、 尾 部 が 縮 れ た 胚 が 高 頻度 で 出 現 した 。 尾 部 の 形 成 不 全 が 見 られ た 胚 の 場 合 で も、 心 臓 や 腸 管 な ど の 内 臓 器 官 は 意外 に見 か け上 正 常 で あ る こ とが ほ とん どで 、 逆 位 の 出現 も無 処 理 の 対 照 群 以 上 に

見 られ た 。 尾 部 の 形 成 不 全 は 、Ca2+イ オ ンが 前 後 軸 に も影 響 した 結 果 だ ろ う(Gotouet al.,1994)。 一 方 、 体 節 期 の 尾 芽 胚(stage23‑26)にA23187処 理 を して も 、逆 位 個 体 は 殆 ど出 現 しな か った 。 早 い発 生 段 階 か ら処 理 を開 始 した 場 合 に は 、逆 位 の 出 現 率 は 顕 著 に低 下 した の で 、 胚 が 長 期 の 暴 露 刺 激 に対 して 順応 して しま い、 刺 激 の 効 果 が 薄 れ た よ う だ 。Ca2+‑ionophore処 理 の 場 合 、逆 位 胚 の 大 半(67%)は 心 臓 と腸 管 が 同 時 に逆 位 を示 し た 。普 通 胚 に は決 して 見 られ な か った 「心臓 は 正位 だ が 、 腸 管 は逆 位 」 とい う胚 が検 定 数 142個 体 中5個 体 出現 した こ とが 注 目 され る(表5)。

逆位 個 体 は、 見 か け上 正 常 な外 見 を 示 した 。stage17‑22か ら50nMで 処 理 して得 られ た33個 体 の 逆 位 胚 を、 判 定 後10倍 希釈Steinberg氏 液 に戻 して 飼 育 した 場 合 、8匹 の 個 体(24%)が4週 間 以 上 、 正 常 な外 見 の ま ま生 存 した の で 、左 右 は逆 移 転 したが 、胚 の基 本

的 な 生 理 機 能 は 損 な わ れ て い な い と考 え られ る 。 卵 膜 を剥 か な か っ た場 合 も、剥 い た場 合 同 様 に高 頻 度 に逆 位 胚 が 出現 す る こ とが 判 明 した の で 、卵 膜 が 存 在 して もA23187の 左右 軸 を 撹 乱 す る効 果 は あ る と言 え た 。 表4の 個 体 は全 て 卵 膜 を剥 いて い な い処 理胚 の もの で あ る 。

〈 植 物 培 養 用 容 器 を用 い た鳥 類 胚 全 胚 培 養法 に よ るphenylephrine処 理 〉

鰐 卵0時 間の 種 卵 の状 態 か ら、 濃 度O.05mM‑0.25mMの 交 感 神 経 刺 激 剤 で あ る phenylephrineを 卵 白 に溶 か した 中 で 全 胚培 養 した 。 高 率 と は言 え な いが 、O.OSmM‑

0.25mMのphenylephrineを 加 え た 場 合 、 心 臓 ル ー プの 位 置 が 背 側 か ら見 て左 側 に位 置 す る もの が 、 全 処 理 個 体37例 中4例 の 割 合(8%)で 出現 した(図5)。 ニ ワ トリ3日 正 常 胚 に見

られ る胚 体 全 体 の 体 のtorsion(ね じれ)に 関 して は、 処 理 群 中 に は反 転 す る個 体 は 得 られ な か った 。 心 臓 の 反 転 した もの は体 軸 が 培 養3日 目にな って もtorsionを 示 さず 垂 直 な ま ま で あ った(n=4/4)。 心 臓 の 反 転 した個 体 は 、3日 胚 に達 す る まで の培 養 時 間 がOmMの controlよ りも約1日 余 計 に か か った 。 対 照 群 と して 、OmMのphenylephrineで 処 理 し た 場 合 、 心 臓 のDル ー プが 逆 位 を 示 した例 は 、 有 精 卵 の 調 子 が 悪 いlotで1例 の み 出 現 し た(n=59)。

29

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【考 察 】

controlで は2%に す ぎ なか った 内蔵 逆 位 個体 が 、norepinephrine,octopamine, A23187処 理 によ って著 しく増 加 した の で 、内蔵 逆 位 関連 遺伝 子iv,rrev(Layton,1976;

Brueckneretal.,1989;McGrathetal.,1992;Yokoyamaetal,,1993)な どの 遺 伝 によ る もの で はな く、 薬 理 的 な処 理 によ って 引 き起 こ され た 後 天 的 な 現 象 で あ る こ とは間 違 い な いで あ ろ う。 我 々の 処 理 方法 は 、50%を 越 え る逆 位 胚 を 作 出す る の には 至 らな か っ

た の で 、左 右 軸 を 「変 更 」 した の で は な く、 そ の成 立 を 「混 乱 させ た 」 の で あ ろ う と想 像 され る 。 内 蔵逆 位 関連 遺 伝 子 の 研 究 や 割 球 操作 によ る逆 位 化 の研 究 と考 え 併 せ る と、 内蔵 の左 右 性 の 決 定 機 構 は 、途 中 ま で変 更 可 能 な 可 塑 性 を 有 す る 多 段 階 の反 応 で あ る こ とが 予 想 され る。 我 々の 刺 激処 理 によ って 、2細 胞 期 か ら既 に左右 性 の確 立 して い る両 生 類 胚 に お い て 、そ の 決 定 は 、 神 経 管 形成 直 後(stage19‑20)ま で は 可 塑性 を持 っ て い る こ とが 判 った。 処 理 時 期 の 遅 さか ら、 我 々 の処 理 方 法 は 、 内蔵 の 非 対 称 性 を 直接 に指 示 す る 「実 行 者 」 に影 響 を 与 えた と考 え られ る 。 逆位 化 処 理 に対 す る感 受 性 の 強 い発 生 段 階(stage19 前 後)は 、 心臓 と腸 管 とで 一 致 した 。 この こ とか ら、心 臓 の 左 右 性 を 決 定 す る機 構 と、腸 管 の 左右 性 を 決 定 す る機 構 と は、 交 感 神 経 伝 達 物質 の刺 激 を特 定 の 時期 に受 け取 る とい う 点 に お いて 同 質 の もの で あ る こ とが 伺 わ れ る。

今 回の 神 経 伝 達 物 質処 理 によ って得 られ た 逆 位 個 体 の 器 官 も、 形 が裏 返 しで あ る こ と以 外 は正 常 な 外 形 を示 して いた 。器 官 の巻 き方 の 左 右 性 は 、0度 「どち ら向 き に転 ぶ か 」 が 決定 され れ ば 、そ れ が 左 巻 き で あ ろ う と右 巻 き で あ ろ うと決 め られ た 同 じ形 に巻 くこ と に な る よ うだ。

〈 どの シグ ナ ル伝 達 系が 内臓 逆 位 にか か わ る の か 〉

ア ドレナ リン作 動 性 交 感神 経 を刺 激 す る こ とが 知 られ る 神経 伝 達 物 質 を両 生 類 胚 に与 え た場 合 、 内臓 逆 位 が 高 頻 度 で誘 発 され る こ とが 分 か った 。 交 感 神経 の場 合 、α1,α2と β1, β2の4つ の タ イ プのreceptorが 知 られ て お り(Ahlquist,1948;Langer,1977a,b;

LangerandHicks,1984)、 どの 受 容体 と結 合 す るか に よ って シナ プス後 膜 下の 情 報 伝 達 系 は異 な って お り、 引 き起 こ され る 自律 神 経 性 の効 果 も異 な って くる(Shepherd,

1988参 照)。 今 回逆 位 を 引 き起 こ した 物 質 は いずれ もα受容 体 の 刺 激 剤 で あ る こ とが知 ら れ て い る(Ruffolo,1985;MorrowandCreese,1986;Ruffoloetal.,1991)。 特 に octopamineは 主 にα1受 容 体 を刺 激 す る こ とが 知 られ て いる。 α 受容 体 が 、 神経 伝 達物 資の 結 合 で 刺 激 され た場 合 、 シ ナ プ ス後 膜 側 の 細 胞 表 面 のCa2+channelの ゲ ー トが 開 く な ど して、 シナ プス 後 膜側 の細 胞 質 のCa2+濃 度 が 上 昇 す る こ とが 知 られ て お り(van

BreemenetaL,1980;NelsonetaL,1988)、 今 回のA23187Ca2+‑ionophore処 理 で 内 臓逆 位 が 引 き起 こ され た の は 、 この こ と に関連 す る と考 え られ る 。 逆位 化 処 理 に対 す

る感 受 性 の 高 い発 生 段 階 が 、 神経 伝 達 物 質 処 理 とCa2+‑ionophore処 理 と で 一 致 した の は 、 この 推 論 を支 持 す る 。Ca2+‑ionophoreA23187に よ って 逆 位 化 した 胚 が そ の 後1ヶ 月 の 長 期 に渡 って 生 存 した こ とか ら、 左 右 軸 の 成 立機 構 は 、 他 の 生 理機 能 に大 き な 影 響 が 出 な い レベ ル の 細 胞 内Ca2+濃 度 の 上 昇 に 対 して も鋭 敏 に反 応 す る 、 最 もCa2+感 受 性 の 高 い メ カ ニ ズ ム で あ る こ とが 推 察 され る。

〈逆 位 を 引 き起 こ した 交 感 神 経 伝 達 物 質 の 標 的 器 官 は どれ か?〉

交 感 神 経 伝 達 物 質 で 逆 位 が 引 き起 こ され る発 生 段 階 は 、神 経 胚 期 か ら初 期 神 経 管 期(初 期 尾 芽 胚 期)に 限 定 され 、後 期 体 節 期 には 左 右 軸 の 変 更 は不 可 能 で あ る こ とが 判 った 。 こ の こ と は 、 表題 の 問 題 に対 して我 々 に推 論 の 手 が か りを与 え て くれ る。 ツ メ ガ エ ル 胚 の 神 経 伝 達 物 質norepinephrine並 び にそ の 受 容 体 は後 期 原 腸 胚 期 か ら発 現 し始 め る(Rowe etal.,1993)。 神 経 細 胞 と して の機 能 的 分 化 の タ イ ミ ング と我 々 の 処 理 によ って 逆 位 が 誘 発 出来 る初 期 段 階 とが 符 合 す る こ と は 、神 経 組 織 が 内臓 器 官 の 左 右 性 を 指 示 す る シグ ナ ル を 出す こ とを 伺 わ せ る 。 我 々 の用 いた 神 経 伝 達 物 質 は交 感 神 経 の そ れ で あ る の で 、 交 感 神 経 が 何 らか の 形 で 直 接 内臓 の左 右 性 に 関わ る こ とが 、強 く示 唆 され る。 処 理 が 有 効 で あ った 発 生 段 階 を 考 え る と、 交 感 神 経 の 起 源 細 胞 で あ る神 経 冠 細 胞 に対 して 外 部 か ら与 え た 伝 達 物 質 が働 きか け た と も考 え られ る。 我 々 が 処 理 を行 った 発 生 段 階 は 、 神 経 冠 細 胞 が ア ドレナ リン作 動 性 神 経 細 胞 に分化 し、 そ のautocrineな 影 響 に よ る正 の 調 節 を 受 けな が ら 交 感 神 経 節 を 形 成 す る 時 期 で あ る(LeDouarinetal.,1975;Cochardetal.,1978;

Kahnetal.,1980;LeDouarinetal.,1986;Sieber‑Blum,1989;Artingerand

Bronner‑Fraser,1992;Dupinetal.,1993)。 体 節 期 以 降 に は左 右 軸 の 可 塑 性 は 一 切 失 わ れ る こ と を考 慮 に いれ る な らば 、 我 々 の 処 理 方 法 の標 的 器 官が 神 経 冠 細 胞 由来 の 交 感 神 経 前 駆 細 胞 そ の もの で あ り、norepinephrine等 のautocrineな 刺 激 の も と に形 成 され

る 内蔵 支 配 の 交 感 神 経 節 の機 能 的 な 分 化 の タ イ ミ ング を 、 外 部 か ら与 え た 伝 達 物 質 が 乱 し た こ とが 、 内蔵 逆 位 に繋 が った の で は な いだ ろ うか?

左右 に分 か れ て移 動 す る 神 経 冠 細 胞 の 、 左 側 の0群 と右 側 の 一 群 とのmotilityの 差 が 、 外 部 か ら与 え られ た 神 経 伝 達 物 質 の 影 響 で 解 消 され て 、 左 右 軸 の 正 常 な 成 立 を 妨 げ た.̲と

い う こ と を第 二 の 可 能 性 と して 我 々 は 考 え て い る。 頭 部 神 経 冠 細 胞 の 移 動 に関 して は 、 serotoninが そ の 調 節 因 子 で あ る と い う報 告 が 最近 な され た(Moiseiwitschand

Lauder,1995)。norepinephrineに つ いて は 、 そ の よ うな 研 究 は な い 。 しか しなが ら、

norepinephrineは 、 白血 球 細 胞 や 精 細 胞 の 細 胞 運 動 のmotilityの 調 節 因 子 で あ る と い う 報 告 は 数 多 くな され て い る こ と(DeitchandBridges;1987;Doukasetal.,1989;

McCorkleetal.,1990;SIiwa,1994)、 原 生 動 物 に対 して す ら走 化 因 子 と して 機 能 す る こ と(Hauseretal.,1975)を 考 慮 す る な らば 、norepinephrineが 神 経 冠 細 胞 の移 動 の調 節 因 子 とな る 可 能 性 は 十 分 に考 え られ る。 ア ドレナ リン作 動 性 神 経 伝 達 物 質 の 神経 冠

一31一

細 胞の細胞移 動 に対す る効 果を検討す る必要が ある と思われ る。

〈腸 管 の み の逆 位 胚 の 出現 につ いて 〉

自然 逆 位 の 場 合 、 心 臓 逆 位 が 生 じた 場 合 に限 って 腸 管逆 位 が 生 じた 。 従 っ て 、 自然 状 態 の胚 内 に お い て は 心 臓 ル ープ が 左 右 非 対 称 に巻 き始 め る こ とが 、腸 管 の 左 右 性 を 指 示 す る可 能 性 が 強 い こ とが 判 った 。 しか しな が ら、 我 々 の 神経 伝 達 物 質 処 理 やA23187処 理 に お いて は 、 心 臓 が 正 位 で あ っ て も腸 管 の 逆 位 が 生 じて い た 個 体 が 合 計22個 体 出現 した 。 そ の 理 由 と して は 、(最 初 に非 対 称 性 を示 す 器 官 で あ る)心 臓 か ら腸 管 に向 けて 左 右 性 に 関 す る情 報 が 伝 わ る プ ロセ ス に、 外 部 か ら与 え た 神 経 伝 達 物 質 が 干 渉 した と考 え られ る 。 ラ

ッ ト11.5日 胚 にお いて は 、腸 管 を 形 成 す る細 胞 自身 にnorepinephrineの 合 成 酵 素 で あ る dopamine一 β一hydroxylaseとtyrosinehydroxylaseが 存 在 し、 そ の後 減 弱 して い く こ

との 報 告 が あ る(Cochardetal.,1978;Blacketal.,1981)。 力 エ ル の 腸 管 細 胞 にお い て も 同様 の こ とが いえ るな ら、 腸 管 の 左 右 性 の 決 定 に際 して 、 外 か ら与 え た

norepinephrineは 交 感 神 経 経 路 以 外 に 、 直 接 腸 管 細 胞 に働 きか け た 可 能 性 も あ る 。 そ し て 、 この こ とが 腸 管 の み の 逆 位 を 高 頻 度 で 引 き 起 こ した 原 因 か も しれ な い。

〈 内蔵 逆位誘発 モデル と しての ツメガエル胚 〉

カエル胚の場合 は、卵膜 を剥 いて も、ラ ッ ト胚 に逆位 を引 き起 こ したphenylephrine 処理 では逆位が 生 じなか った(n=72)。 その原 因は 、phenylephrineが 哺乳類 に対する薬 効か ら薬 理設計 されたので 、カエルの場合 はphenylephrine一 α受容体 間のaffinityが 低 か ったか らか もしれな い。 ある いは、単 にphenylephrineが 表皮 を透過 出来なか ったか

らか も しれな い。

ラツ トの 内臓逆位 を誘発 したnorepinephrine(Fujinagaetal.,1992)に よ ってカエ ル の内臓逆位 も誘 発 された のは、下等脊椎動 物 と高等 脊椎 動物 との間で、 内蔵 の左右性の 決定 のメカニ ズムが保存 され て いるこ とを示 唆す る。

ラッ ト の場合 、80‑100%血 清 中で全胚培 養 した条件 下で試薬処 理が行われ て いたので 、 交感 神経刺激剤 と血清成分 中の未だ 同定 され て いな い刺 激剤が協 同 して 内臓逆位 を誘発 し て いた可能性 があ ったが 、カエル胚の場合 は塩類溶液 中で胚が生 育するのでそ の懸 念 は生

じな い。大量 の同調胚 に対 して、無血清 中で最大SO%の 逆 位個体 を生 じさせ るこ との出来 るツメガエル胚 を用 いた我 々の処理法 は、脊椎動物胚 の内臓器官 の左右 性の問題 の分子生 物 学的な解析 に最適の方法論 を提供す る と思われ る。 今後 は、交感神経 伝達物質処 理 に対 する初 期応答遺 伝子の解析が 、我 々に手が か りを与 えて くれ るだ ろ う。

ニ ワ トリ胚 の場 合 には、カエル胚 ほど完全 な逆位個体 は得 られな か った。ニ ワ トリ胚が 端黄 卵 と して発 生す ることが 、 内臓器 官の左右性の変 更を難 しくして いるのか もしれな い。

しか しなが ら、心臓逆位 に関 しては、背側 か らみて胚 の左側 に存在 する とい う逆位 胚が、

controlよ りも高頻度 で見 られ た。ニ ワ トリ胚の心臓 の左右性 に関 しては 、交感 神経の刺 激伝導路 が、 カエル 胚や ラ ッ ト胚 同様 に、左右軸 に関す る情報 の 「実行者 」 と して の役 割 を果 た して いる と言えそ うだ。ニ ワ トリ胚特有のrtorsion」 は、胚域 と胚体 外域 との複 雑 な連 携 によ り成 立 して いる と思われ る。形成 され る交感神経節 か らは遠 い領域で お こる 現 象であ りことか らも、交 感神経刺 激 とは別 の機 構で左右性が 生 じる現 象か も しれ な い。

それ故、今 回の交感神経刺 激剤処 理で はtorsionの 逆位 は生 じなか ったのか も しれ な い。

今 回の 一連 の実験 は、ニ ワ トリ胚のphenylephrine処 理か ら始め た。 しか しなが ら、

カエル胚 に系 を移 してか ら、左右 軸のみ が変 更 され た完全な個体 が大量 に高頻度 で得 られ たの で、カエル胚 の方が現 時点では解析 系 と して好適 であ ると言 えそ うだ。今後 は、解析 系 を生殖サ イクル が数 カ月 と短 く単為発 生 も容易 な小型魚類胚 に移 して 、左右 軸の成 立の 遺伝 学的な解析 を進め たい。//

[以 下 の ペ ー ジ に附 表 ・附 図 を示 す]

一33一

表1 普 通胚(上 段)な らび に卵膜 除 去胚(下 段)集 計

stage 検定数 生存数 正位 逆位 逆位率 不明

一 日 1127 ^一 1,102 25296 ^一

2 911

0 0

24 48

24100%

42100%

24 42

00%

11'.

0 0

表2norepinephrine処 理 集 計

stage mM 例 数 生存数 生 存率 正位 逆位 逆位率 不明

9 0.5 24 1146% 6 327% 2

10 o.s 72 3650% 27 514% 4

11 0.5 72 2535% 14 728% 4

12 o.s 56 3257% 26 516% 1

13 o.s 72 5475% 45 47% 5

14 o.s 48 4594% 42 24% 1

19 0.5 96 8488% 62 1720% 5

24 0.5 48 48100% 48 ^11'. 0

合計 544391 43 22

表30ctopamine処 理 集 計

stage mM 例数 生存 生存率 正位 逆位 逆位率 不明

12 0,005 24 1979% 11 316% 5

12 0.05 36 226196 15 314% 4

15 0,005 46 4087% 26 615% 8

18 0.05 27 2696% 15 9359% 2

19 o.os 48 4594% 41 24% 2

19 0.5 67 S887% 49 6109'0 3

21 0.5 16 1488% 14 1!'. 0

合 計 zs4zz4 29 24

表4calciumi。n。ph。re処 理 集 計

stage 幽 例数 生存数 生存率 正 位 逆位 逆位率 不明

11‑12 0.05 16 1381% 9 323% 1

13‑15 0.05 16 106396 8 11090 1

16‑17 0.05 29 2897% 17 932% 2

18‑19 0.05 36 2878% 9 1554% 4

20‑21 0.05 24 1667% 8 8SO% 0

22‑23 0.OS 36 3186% 23 82696 0

24‑25 0.05 16 1610096 15 16% 0

合計 173 142 45 8

【附 表 の 説 明 】

艀化 した尾 芽胚の段階で見た 目が 完全 な胚 を選別 し、それ ら全て につ いてバ ッチ ごとに、

心臓ル ープ並び に腸管ル ープの巻 き方の左右 性を もとに、両器 官の正位/逆 位 を判定 した。

結果は、正位/全 逆位(両 器 官 とも逆位)/心 臓のみが逆位/腸 管のみ が逆位 の4つ につ いて 判定 した。左右性の判 定できない天然の奇形胚 につ いて は表 か ら外 してある。

1127個 体の普通胚 を検定 した ところ、25個 体(2.2%)の 天然逆位胚 が存在 した。

心臓が正位で あ った場 合、腸 管のみの逆位胚 は出現 しな か った。

表2norepinephrine処 理 に よ る 逆 位 胚 の 出 現 率

後 期 胞 胚 期 一初 期 神経 管 期(stage9‑19)か ら0.5mMのnorepinephrineで 暴 露 処 理 を行 う と、表1のcontrolよ りも高 頻 度 に逆 位 胚 が 生 じた 。 心 臓/腸 管 が と も に逆 位 の 胚 、心 臓 の みが 逆 位 の 胚 、 腸 管 の み が 逆 位 の胚 の い ずれ の場 合 も得 られ た 。 生 き残 った逆 位 胚 の 形 態 は 、 内 蔵 の 左 右 軸 が 反 転 して い る以 外 は 、 ほ ぼ 完 全 に正 常 で あ った(図3)。 心 臓 が 正位

で 、腸 管 の み が 逆 位 を示 した例 が 合 計8個 体 得 られ た が 、そ れ らは天 然 の逆 位 胚 で は1例 も生 じて いな い こと に注 意 。

表30ctopamine処 理 によ る逆 位 胚 の 出現 率

初 期 神 経 胚 期 一初 期 神 経 管 期(stage12‑19)か ら0.005‑0.5mMのoctopamine溶 液 に暴 露 した と ころ 、 表1のcontrolよ りも高 頻 度 に逆 位 胚 が 生 じた 。 生 き残 った 逆 位 胚 の形 態 は 、 内蔵 の 左右 軸 が 反 転 して い る以 外 は 、 ほ ぼ 完 全 に正 常 で あ った 。 心 臓 が 正 位 で 、腸 管 のみ が 逆 位 を 示 した 胚 が 合 計9個 体 得 られ た が 、 天 然 の 逆位 胚 で は1例 も生 じて いな い。

表4Ca2+ionophore,A23187処 理 に よ る 逆 位 胚 の 出 現 率

原腸 胚 期 一初 期 尾 芽 胚 期(stage11‑23)か らSOnMのcalciumionophoreA23187溶 液 に暴 露 した と ころ 、表1のcontrolよ りも高 頻 度 に逆 位 胚 が 生 じた 。stage19前 後 か ら の 処 理 で は 、心 臓/腸 管 と も に50%の 高 頻 度 で 逆 位 胚 が 得 られ た 。stage16以 前 に処 理

を 開始 す る と 、逆 位 胚 の発 生 率 が 低 下 した こ と は、 刺 激 に対 す る順 応 の結 果 と思 わ れ る。

逆 位 の 発 生 率 は 、stage19‑20の 初 期 神 経 管 期 以 降 は減 少 して い る 。 生 き残 った 逆 位 胚 の 形 態 は 、 内蔵 の 左右 軸 が 反 転 して い る以 外 は 、 ほ ぼ 完全 に正 常 で あ り、1ヶ 月の 長 期 に 渡 り 生 育 し た 。 心 臓 が 正 位 で 、 腸 管 の み が 逆 位 を 示 し た 例 が 合 計5例 得 られ た が 、 そ れ ら

は 天 然 の逆 位 胚 で は1例 も生 じて いな い こ と に注 意。 原腸 胚 期 にA23187処 理 す る と、 尾 部 の 形成 不 全 の 傾 向 が あ った が 、 それ らの胚 も、 頭 部 一胴 部 の 外 部 形 態 は ほ ぼ正 常 に見 え 、 腸 管 の 左 右 性 の 判 定 に支 障 はな か った。

一35一

表5 得 られ た逆位 個 体の 分類

逆 位

心腸 と も逆 心 のみ逆 腸 のみ逆

逆 位発生 率

普通胚 ²⁵

8170

2%一 (25/1127)

無 処 理 胚 (コ リオ ンな し/st.12,19)

0 000

o%

(各0/48)

norepinephrine (st.9‑24集 計)

43 13228

2096(st.19に て)

(P.<0.1%)★

octopamine (st.12‑21集 計)

29 9119

3596(st.18に て)

(P.<0.1%)★

Ca‑ionophoreA23187 (st.11‑25集 計)

45 5496(st.18‑19に て)

(P.く0.196)★

30105

★H1=P普 通胚 ≠P処 理群

,Ho:P普 通 胚=P処 理 群

表5得 られた逆位個 体 における心臓逆位 と腸 管逆位 の連鎖

我 々は、各検定個体 において、心臓 と腸管 の二つの 内臓 器官の左右性 につ いて記録 した。

結果 は、 「心臓 と腸 管の 両者 にお いて逆位 」、 「心臓 のみが逆位 」な らび に 「腸 管のみが 逆位 」の3カ テ ゴ リーに類別 した。普通胚 にお いては、心臓が逆位 を示 した場 合 に限 って 腸管 の逆位が認 め られ 、腸管 が単独 で逆位 を示す ことはなか った。 ところが 、神経伝達物 質処 理や カル シ ウムイオ ノフォア処理 によ って誘発 された逆位 の場 合 は、腸 管のみの逆位

が少なか らず 出現 した。

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植 物 培 養 用 容 器(内部は無菌状態)

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図1

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【附 図 の 説 明 】

図1

今 回 新 た に我 々 の 開発 した 簡 便 な ニ ワ トリ胚 の 卵 殻 外 全 胚 培 養 法 。

図1A;全 胚 培 養 に用 いた 植 物 培 養 用 の 容 器 。 底 面 の 直 径8cmX高 さ7cm。 上 面 の 一 カ 所 に は 、 直 径1cmの 白 い ミ リポ ア フ ィル タ ーが と りつ け られ て お り、容 器 内の 湿 度 を 乾 燥 さ せ 過 ぎず 、 か つ 無 菌 的 な ガ ス 交 換 を 容 易 に さ せ て いる 。 胚 盤 葉 が 容 器 内 を 満 た した 卵 白 液 の 水 面 直 下 に沈 む よ う に、Hank's液 を40rn1+水 溶 性 卵 白80m1の 割 合 で 混 合 して 、 そ の 中 に卵 黄 を 浮 か べ た 。

図1B;容 器 全 体 を ラ ック に並 べ 、 イ ン キ ュベ ータ ー 内 に設 置 した ロ ータ リー シ ェ ーカ ー (旋 回 半 径2.5cm)を 用 い て35r.P.mで 緩 や か に撹 絆 しな が ら、 湿 度8096以 上 、38℃ の 条 件 で 全 胚 培 養 した 。

図1C;我 々 の 方 法 で 得 られ た3日 胚 。 種 卵(H.H.stage1)か ら91時 間 全 胚 培 養 す る こ と で 得 られ たstage19の 胚 。 容 器 の 蓋 を 開 けた 状 態 で 観 察 す る と、 心 臓 の 左 右 性 並 び に 心 臓 回 りの 血 流 の 方 向性 が 容 易 に観 察 出来 た 。Barは1cm。

図2

ア ドレナ リ ン作 動 性 神 経 伝 達 物 質 に暴 露 す る こ とで得 られ た 逆 位 胚 の 腹 面 図 。倍 率40倍 。 図2A;比 較 対 照 の た め の 正 位 の 普 通 胚(stage42)。 心 臓 に お い て は 丸 く膨 らん だ 動 脈 球 (小 矢 印)が 、 心 室 に 対 して 向か って 左 側(胚 の右 側)に 位 置 す る 。

腸 管 に お いて は 、 くび れ 目が3時 方 向 に存 在 す る(矢 印)。

図2B;norepinephrine処 理(0.5mM)に よ って 得 られ た 心 臓 の み が 逆 位 の 胚(stage42)。

腸 管 に お い て は くび れ 目が3時 方 向 に存 在 す る(矢 印;正 位)が 、動 脈 球(小 矢 印)が 、 心 室 に対 して 、 向 か って 右 側(胚 の 左 側)に 位 置 す る逆 位 とな って い る 。

図2C;norepinephrine処 理(0.5mM,st.11)に よ って 得 られ た 腸 管 の み が 逆 位 の 胚 (stage41)。 動 脈 球(小 矢 印)が 、 心 室 に対 して 向か って 左 側(胚 の 右 側)に 位 置 す る が 、 腸 管 にお いて は 、 くび れ 目が9時 方 向 に存 在 す る(矢 印)。

図2D;octopamine処 理(5ｵM,st.15)に よ っ て得 られ た 、 心 臓/腸 管 と も に逆 位 の 胚 (stage42)0

図3

norepinephrine処 理 に よ って 心 臓 逆 位 を 示 した 胚 を1ヶ 月 間 飼 育 した もの 。 倍 率40倍 。 逆 位 化 した 個 体 を 池 の 水 に戻 して 飼 育 した と こ ろ 、 完 全 に近 い外 形 で 生 育 した 。

一39一

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← 図3

↓ 図4

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図4

50nMのcalciumionophoreA23187に 暴 露 す る こ とで 得 られ た 、逆 位 の 胚(stage45) の 腹 面 図 。 倍 率40倍 。

図4A;比 較 対 照 の た め の 正 位 の 普 通 胚(stage46)。 心 臓 にお いて は 、 丸 く膨 らん だ 動 脈 球(矢 印)が 、 心 室(○)に 対 して 、 向 か って 左 側(胚 の 右 側)に 位 置 し、 血 流 がS字 形 を示 す 。 腸 管 は 反 時 計 回 りに巻 き始 め て い る 。

図4B;A23187処 理 に よ って 得 られ た 心 臓/腸 管 と も に逆 位 を 示 した 胚(stage45)。

動 脈 球(矢 印)が 、心 室(○)に 対 して 向 か って 右 側(胚 の 左 側)に 位 置 す る 逆 位 とな って い る。

腸 管 の 巻 き 方 は 、 時 計 回 りの 逆 位 を 示 して い る 。

図5

種 卵(H.H,stage1)か ら全 胚 培 養 しな が ら0.1mMのphenylephrmeに 暴 露 して 得 られ た 、 心 臓 逆 位 胚 。 背 側 か ら撮 影 。 ビデ オ録 画 に よ って 解 析 した と こ ろ 、 心 室 と動 脈 洞 との 前 後 軸 に沿 った 位 置 関 係 は保 存 され て い て 、 血 流 は 後 方 か ら前 方 へ 向 か った 。 胚 は ね じれ (torsion)を 示 さな か っ た 。 心 臓 の 左 右 性 が 判 定 で き る 発 生 段 階 に達 す る ま で 、 無 処 理 の 対 照 群 に比 べ 、20時 間 程 度 発 生 が 遅 れ た 。 倍 率5倍 。

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図5

一41一

【参 考 文 献 】

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