1 分析法 (1) 分析法概要水質水試料 2 ml を固相カートリッジに通水しとその分解物を濃縮しこれをメタノールで溶出し内部標準液を加えて LC/MS/MS-SRM 法で定量する底質底質試料 5 g( 乾泥換算 ) の湿泥を超音波洗浄機を用いてアセトンで超音波抽出するこのアセトン抽

(1)

徳島県保健環境センター

4-アミノ-6-(1,1-ジメチルエチル)-3-(メチルチオ)-

1,2,4-トリアジン-5(4H)-オン

4-amino-6-(1,1-dimethylethyl)-3-(methylthio)-1,2,4-triazin-5(4H)-one （別名：メトリブジン）【対象物質の構造】 C N C N N C NH2 O S CH₃ C C 3 H CH₃ C 3 H Metribuzin C8H14N4OS CAS番号：21087-64-9 【対象物質の分解化合物の構造】

Metribuzin-desamino Metribuzin-desamino-diketo Metribuzin-diketo (DA) (DADK) (DK) C8H13N3OS C7H11N3O2 C7H12N4O2 CAS番号:35045-02-4 52236-30-3 56507-37-0 分子量:199.3 分子量:169.2 分子量:184.2 【物理化学的性状】分子量融点（℃）蒸気圧（Pa) 水溶解度(mg/L) log Pow ＊ 214.3 126 5.8×10-5 1050 1.60 (21 ℃) ＊文献値出典：農薬ハンドブック2005年版日本植物防疫協会編【毒性、用途】毒性情報：ラット（急性経口毒性LD50）2220 mg/kg コイLC50>100ppm 用途：光合成阻害型除草剤 C N C NH N C NH2 O O C C 3 H CH₃ C 3 H C NH C N N C O S CH₃ C C 3 H CH3 C 3 H C NH C NH N C O O C C 3 H CH₃ C 3 H

(2)

§１

分析法

（１）分析法概要

〔水質〕水試料200 mL を固相カートリッジに通水し、メトリブジンとその分解物を濃縮し、これをメタノールで溶出し、内部標準液を加えて、LC/MS/MS-SRM 法で定量する。〔底質〕底質試料5 g（乾泥換算）の湿泥を超音波洗浄機を用いてアセトンで超音波抽出する。このアセトン抽出液をロータリーエバポレーターで濃縮し、精製水に溶解して固相カートリッジに通水し、メトリブジンとその分解物を濃縮し、これをメタノールで溶出する。この溶出液をカーボン/NH2 カートリッジでクリーンアップする。内部標準液を加えてLC/MS/MS-SRM 法で定量する。

（２）試薬・器具

メトリブジン：関東化学社製メトリブジン－デスアミノ(DA) ：関東化学社製メトリブジン－デスアミノジケト(DADK) ：関東化学社製メトリブジン－ジケト(DK) ：関東化学社製シマジン-d10 ：関東化学社製100 mg/L アセトン溶液メタノール：LC/MS 用ギ酸：試薬特級精製水：Milli-Q 水 MILLIPORE 製

固相カートリッジ：Waters 社製 Sep-pak Plus PS2

クリーンアップ用カートリッジ：Waters 社製 Sep-pak Vac 6cc Carbon/NH2

コンセントレーター：Waters 社製 Concentrator Plus

超音波抽出機遠心機ロータリーエバポレーターエキストラクションマニホールドなす型フラスコ200 mL、 50 mL リザーバーリザーバーアダプター遠沈管（50 mL）目盛付共栓遠沈管(10 mL) 【試薬の安定性・毒性】比較的皮膚刺激は少ない方であるが、暴露されないよう取り扱いに注意する。

（３）分析法

【試料の採取及び保存】環境省「化学物質環境調査における試料採取にあたっての留意事項」に従う。

(3)

【試料の前処理及び試料液の調製】〔水質〕コンディショニングした PS2 固相カートリッジ（注１）をコンセントレーターにセットし、試料200 mL を 10 mL/min で通水し、濃縮する。通水終了後の固相カートリッジに精製水10 mL を通して洗浄した後、窒素ガスを通気して間隙水を除去する。次いで2 mL のメタノールでバックフラッシュ溶出し、10 mL の目盛付共栓遠沈管に受ける。窒素ガスを通気して1 mL の定容にし、内部標準液 5 µＬを添加し、試料液とする。〔底質〕底質5 g（乾泥換算）の湿泥を 50 mL の遠沈管に精秤し、アセトン 20 mL を加えてよく攪拌し、超音波洗浄機を用いて 10 分間超音波抽出する。（注２）その後3000 rpm で 10 分間遠心分離したのち、アセトン層を 200 mL のなす型フラスコに分取する。この操作を２回繰り返してアセトン層を合わせる。ロータリーエバポレーターを用いて2 mL 程度まで濃縮し、精製水を 200 mL 程度加えて、水質試料と同様にコンディショニングした PS2 固相カートリッジに全量を通水する。通水終了後の固相カートリッジに精製水10 mL を通して塩分を除去し、窒素ガスを通気して間隙水を除去する。次いでメタノール2 mL でバックフラッシュ溶出する。この溶出液の着色が著しく、夾雑物が測定の妨害となる恐れがある場合は、Carbon/NH2 カートリッジによるクリーンアップを行う。砂質で着色が少ない場合は窒素ガスを通気して1 mL に定容し、水質試料と同様に内部標準液を5 µL 添加し、試料液とする。クリーンアップは、コンディショニングしたCarbon/NH2 カートリッジ（注３）をエキストラクションマニホールドにセットし、受器として50 mL のなす型フラスコをセットする。2 mL のメタノールで PS2 カートリッジからバックフラッシュ溶出した溶出液を Carbon/NH2 カートリッジに負荷し、ヘッドまで下げる。この溶出液も受器に受ける。メタノール30 mL で溶出し、ロータリーエバポレーターで2 mL 程度まで濃縮し、目盛付共栓遠沈管に移し、窒素ガスを通気して 1 mL に定容し、内部標準液 5 µL を添加して試料液とする。【空試験液の調製】試料と同じ量の精製水を用い【試料の前処理及び試料液の調製】の項に従って操作し、得られた試料液を空試験液とする。【標準液の調製】メトリブジン、メトリブジンDA、メトリブジン DADK、メトリブジン DK をそれぞれ10 mg ずつ精秤し、100 mg/L の濃度になるようメタノールに溶解し、混合標準原液とする。混合標準原液をメタノールで順次希釈し、0.05n g/ml から 100 ng/mLの希釈標準液を作製する。希釈標準液を 1 mLずつバイアル瓶に採り、内部標準液5 µL を添加して標準液とする。 100 mg/L のシマジン-d10をメタノールで希釈して2 mg/L とし、これを内部標準液とする。

(4)

【測定】〔LC/MS 条件〕（注４） (LC) 機種：Waters 2695 カラム：Mightysil RP-18 MS ,150-2.0(5 µm) 移動相：A:水 B:メタノール

0-5分 A=85, B=15 →A=20, B=80 linear gradient

5-13分 A=20, B=80 13-17分 A=85, B=15 流量：0.2 mL/min. カラム温度：40 ℃ 注入量：10 µL (MS)

機種：Waters Quattro micro

イオン源温度：120 ℃ 脱離ガス温度：300 ℃ 物質イオン化法 Q1>Q3 キャピラリー電圧 (kV) コーン電圧 (V) コリジョン電圧 (V) メトリブジン ESI+ 215.1>84.0 3.5 35 20 メトリブジンDA ESI+ 200.1>172.1 3.5 35 18 メトリブジンDADK ESI- 168.0>97.0 4.0 30 15 メトリブジンDK ESI- 183.0>41.7 4.0 35 20 内標：シマジン-d10 ESI+ 212.2>134.1 3.5 35 20 （注５）〔検量線〕標準液10 µL を LC/MS/MS に注入して分析する。得られた標準物質のピーク面積と内標準物質のピーク面積の比から検量線を作成する。〔定量〕試料液10 µL を LC/MS/MS に注入して分析する。得られた標準物質のピーク面積と内標準物質のピーク面積の比を検量線と照らして定量する。〔濃度の算出〕（水質）水質試料中の濃度(ng/L)=最終試料液中の濃度(ng/mL)× 最終液量(mL) 試料量(L)

(5)

（底質）

底質試料中の濃度(µg/kg-dry)=最終試料液中の濃度(ng/mL)×最終液量(mL)

試料量(g-dry) 〔装置検出下限(IDL)〕

本分析に用いたLC/MS/MS（Waters Quattro Micro）の IDL を下表に示す。

（注６）（水質試料）物質 IDL(ng/mL) 試料量(L) 最終液量(mL) IDL 試料換算値(ng/L) メトリブジン 0.017 0.2 1 0.087 メトリブジンDA 0.0088 0.2 1 0.044 メトリブジンDADK 0.67 0.2 1 3.4 メトリブジンDK 0.48 0.2 1 2.4 （底質試料）物質 IDL(ng/mL) 試料量(g) 最終液量(mL) IDL試料換算値(µg/kg-dry) メトリブジン 0.017 5 1 0.0035 メトリブジンDA 0.0088 5 1 0.0018 メトリブジンDADK 0.67 5 1 0.13 メトリブジンDK 0.48 5 1 0.096 〔測定方法の検出下限(MDL)、定量下限(MQL)〕本測定方法における検出下限及び定量下限を次に示す。（注７）（水質試料）物質試料量(L) 最終液量(mL) 検出下限値(ng/L) 定量下限値(ng/L) メトリブジン 0.2 1 0.14 0.36 メトリブジンDA 0.2 1 0.14 0.36 メトリブジンDADK 0.2 1 5.3 14 メトリブジンDK 0.2 1 6.5 17 （底質試料）物質試料量(g) 最終液量(mL) 検出下限値 (µg/kg-dry) 定量下限値 (µg/kg-dry) メトリブジン 5 1 0.0054 0.014 メトリブジンDA 5 1 0.033 0.085 メトリブジンDADK 5 1 0.11 0.29 メトリブジンDK 5 1 0.22 0.56

(6)

注

解

（注１）固相カートリッジは5 mL のメタノールと 10 mL の精製水でコンディショニングしたものを使用する。（注２）高速溶媒抽出では、マトリックスが増えて、夾雑物による妨害を受けやすいので、超音波抽出が良い。（注３）クリーンアップ用カートリッジは、0.2%ギ酸メタノール溶液 10 mL で洗浄後、メタノール10 mL で洗浄してコンディショニングしたものを使用する。（注４）

LC/MS/MS の条件は、本測定に使用した機種(Waters Quattro micro)特有のものである。（注５）メトリブジンDADK と DK は ESI-positive でも検出されるが、感度が悪いので、 ESI-negative で測定した。メトリブジンは 215.1>187.1 の方が感度は高いが、マトリックスの影響を受けやすいので215.1>84.0 を使用した。（注６）装置検出下限(IDL)は、「化学物質環境実態調査実施の手引き」（平成 17 年 3 月）に従って、表１のとおり算出した。

表１装置検出下限（IDL）の算出(Waters Quattro micro)

物質名メトリブジンメトリブジン DA メトリブジン DADK メトリブジン DK 試料量(L) 0.2 0.2 0.2 0.2 最終液量(mL) 1 1 1 1 注入液濃度(ng/mL) 0.05 0.05 2.5 2.5 装置注入量(µL) 10 10 10 10 結果１(ng/mL) 0.0481 0.0418 2.34 2.19 結果２ 0.0395 0.0413 2.58 2.40 結果３ 0.0410 0.0449 2.30 2.16 結果４ 0.0420 0.0476 2.43 2.39 結果５ 0.0386 0.0457 2.74 2.11 結果６ 0.0470 0.0455 2.67 2.32 結果７ 0.0496 0.0433 2.65 2.13 平均値(ng/mL) 0.0437 0.0443 2.53 2.24 標準偏差(ng/mL) 0.00445 0.00227 0.173 0.124 IDL(ng/mL) 0.0173 0.00882 0.672 0.482 IDL 試料換算値(ng/L) 0.0865 0.0441 3.36 2.41 IDL 試料換算値（µg/kg-dry） 0.00346 0.00176 0.134 0.0964 S/N 10 26 14 14 CV(%) 10.2 5.1 6.8 5.5 ※IDL=t(n-1,0.05)×σn-1×2

(7)

（注７）測定方法の検出下限(MDL)及び定量下限(MQL)は、「化学物質環境実態調査実施の手引き」（平成17 年 3 月）により、次のとおり算出した。表２測定方法の検出下限(MDL)及び定量下限(MQL)の算出（水質試料）物質名メトリブジンメトリブジン DA メトリブジン DADK メトリブジン DK 試料量(L) 0.2 0.2 0.2 0.2 標準添加量(ng) 0.1 0.1 2.5 2.5 試料換算濃度(ng/L) 0.5 0.5 12.5 12.5 最終液量(mL) 1 1 1 1 注入液濃度(ng/mL) 0.1 0.1 2.5 2.5 装置注入量(µL) 10 10 10 10 操作ブランク平均(ng/L) 0 0 0 0 無添加平均(ng/L) 0 0 0 0 結果１(ng/L) 0.464 0.385 11.0 11.0 結果２ 0.550 0.402 12.9 11.6 結果３ 0.540 0.395 10.5 13.0 結果４ 0.500 0.411 12.8 15.2 結果５ 0.468 0.390 11.8 11.4 結果６ 0.479 0.302 10.2 12.5 結果７ 0.535 0.386 9.15 14.9 平均値(ng/L) 0.505 0.381 11.2 12.8 標準偏差(ng/L) 0.0364 0.0363 1.37 1.67 MDL(ng/L) 0.141 0.141 5.33 6.51 MQL(ng/L) 0.364 0.363 13.7 16.8 S/N 9 13 8 11 CV(%) 7.2 9.5 12.3 13.1 表3 測定方法の検出下限(MDL)及び定量下限(MQL)の算出（底質試料）物質名メトリブジンメトリブジン DA メトリブジン DADK メトリブジン DK 試料量乾泥換算(g) 5 5 5 5 標準添加量(ng) 0.1 0.1 2.5 2.5 試料換算濃度(µg/kg) 0.02 0.02 0.5 0.5 最終液量(mL) 1 1 1 1 注入液濃度(ng/mL) 0.1 0.1 2.5 2.5 装置注入量(µL) 10 10 10 10 操作ブランク平均(µg/kg ) 0 0 0 0 無添加平均(µg/kg ) 0 0 0 0 結果１(µg/kg) 0.0212 0.0396 0.638 0.588 結果２ 0.0194 0.0350 0.612 0.594 結果３ 0.0173 0.0208 0.678 0.562 結果４ 0.0179 0.0264 0.640 0.608 結果５ 0.0190 0.0198 0.602 0.496 結果６ 0.0206 0.0408 0.678 0.528 結果７ 0.0186 0.0294 0.648 0.666 平均値(µg/kg) 0.0192 0.0303 0.642 0.577 標準偏差(µg/kg) 0.00138 0.00853 0.0293 0.0555 MDL(µg/kg-dry) 0.00537 0.0332 0.114 0.216 MQL(µg/kg-dry) 0.0138 0.0853 0.293 0.555 S/N 11 24 10 12 CV(%) 7.2 28 4.6 9.6

(8)

§２

解

説

【分析法】〔フローチャート〕分析のフローチャートを図１に示す。（水質試料）試料水固相抽出脱水溶出濃縮 200mL PS-2 窒素ガスメタノール 1 mL 2 mL 内標添加 LC/MS/MS-SRM ESI-pos.,neg. シマジン-d10 （底質試料）湿泥試料超音波抽出遠心分離濃縮水添加 5g（乾泥換算）２回アセトン 3000 rpm 10 分約2 mL 200 mL 20 mL,10 分固相抽出水洗脱水溶出クリーンアップ PS-2 精製水窒素ガスメタノール Carbon/NH2 10 mL 2 mL メタノール 30 mL 濃縮内標添加 LC/MS/MS-SRM ESI-pos.,neg. ロータリーエバポレーターシマジン-d₁₀ 窒素ガス 1 mL 定容図１分析フロー

(9)

〔検量線及びマススペクトル〕

検量線及びマススペクトル図を次に示す。

メトリブジンとメトリブジンDA は 0.05～20 ng/mL、メトリブジン DADK と

メトリブジンDK は 2.5～100 ng/mL

メトリブジンメトリブジンDA

Compound name: metribuzinDADK

Correlation coefficient: r = 0.999822, r^2 = 0.999644 Calibration curve: 0.000622114 * x + 0.00010044 Response type: Internal Std ( Ref 5 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0.000 0.062

Response

Compound name: metribuzinDK

Correlation coefficient: r = 0.999932, r^2 = 0.999863 Calibration curve: 0.000756938 * x + -1.37011e-005 Response type: Internal Std ( Ref 5 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 -0.000 0.076 Response メトリブジンDADK メトリブジン DK 図2.検量線

Compound name: metribuzin

Correlation coefficient: r = 0.999968, r^2 = 0.999936 Calibration curve: 0.0245119 * x + 0.00261536

Response type: Internal Std ( Ref 5 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0

0.000 0.493

Response

Compound name: metribuzinDA

Correlation coefficient: r = 0.999776, r^2 = 0.999552 Calibration curve: 0.138237 * x + 0.0169987

Response type: Internal Std ( Ref 5 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0

0.00 2.78

(10)

図３ IDL 算出時のメトリブジン、メトリブジン DA クロマトグラム図４ IDL 算出時のメトリブジン DADK、メトリブジン DK クロマトグラム std0.00005mg/l 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00Time 3 100 % 12 100 % 0 100 %

metribuzin-IDL1-11 2: MRM of 4 Channels ES+

212.2 > 134.1 6.46e5 10.89

215.1 > 84 1.23e3 10.94 1.56 0.91 0.48 8.31 2.152.632.90 3.704.13 4.67 5.42 6.60 7.29 7.78 8.538.909.229.3910.0310.46 11.42 11.58 12.4412.87

200.1 > 172.1 5.09e3 11.16 10.89 10.62 10.19 0.05 _9.49 2.04 0.59 4.13 6.70 7.51 12.4412.7112.87 metribuzin-DA metribuzin IS:simazine-d10 std0.0025mg/l 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00Time 26 100 % 31 100 % 0 100 %

212.2 > 134.1 5.47e5 10.78

metribuzin-IDL3-01 1: MRM of 2 Channels ES-

183 > 41.7 828 9.95 9.62 3.89 1.69 0.40 0.88 2.06 2.54 3.133.30 4.214.644.96 5.555.766.306.416.737.167.59 8.07 8.939.149.30 10.7010.91 11.9812.3112.57

metribuzin-IDL3-01 1: MRM of 2 Channels ES-

168 > 97 1000 10.37 0.99 0.08 0.83 _1.74 2.382.54 3.193.563.89 4.42 5.12 5.55 6.146.576.94 7.697.968.778.879.199.5710.00 11.07 11.93 12.52 metribuzin-DADK metribuzin-DK IS

(11)

図５．メトリブジンマススペクトルとプロダクトスキャンスペクトル図６メトリブジン DA マススペクトルとプロダクトスキャンスペクトル std-10mg/l 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z 0 100 %

metribuzin-scn02 246 (10.734) 2: Scan ES+

6.66e7 214.96 メトリブジン m/z=215 std-10mg/l 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250m/z 0 100 %

metribuzin-daughterscn01 124 (10.777) 2: Daughters of 215ES+ 2.70e6 187.05 83.83 57.52 56.72 _61.63 73.74 81.88 130.93 88.80 _96.86 114.86 144.94 170.95 215.06 メトリブジン 215→product scan 187 84 std-10mg/l 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z 0 100 %

metribuzin-scn02 251 (10.952) 2: Scan ES+

8.72e7 199.99 メトリブジンDA m/z=200 std-10mg/l 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250m/z 0 100 %

metribuzin-daughterscn01 127 (11.017) 1: Daughters of 200ES+ 6.44e6 172.02 115.91 56.73 83.83 88.80 156.98 129.93 200.02 メトリブジンDA 200→product scan 172

(12)

図７．メトリブジン DADK マススペクトルとプロダクトスキャンスペクトル図８メトリブジン DK マススペクトルとプロダクトスキャンスペクトル std-10mg/l 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z 0 100 %

metribuzin-scn02 237 (10.319) 1: Scan

ES-1.55e7 167.93 96.69 メトリブジンDADK m/z=168 std-10mg/l 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z 0 100 %

metribuzin-scn02 227 (9.883) 1: Scan

ES-1.51e7 182.96 メトリブジンDK m/z=183 std-10mg/l 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200m/z 0 100 %

metribuzin-daughterscn01 113 (9.860) 4: Daughters of 183ES-4.90e5 183.05 41.68 メトリブジンDK 183→product scan 41.7 std-10mg/l 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200m/z 0 100 %

metribuzin-daughterscn02 528 (10.568) 1: Daughters of 168ES-6.14e5 168.05 96.90 メトリブジンDADK 168→product scan 97

(13)

〔夾雑物の影響について〕 ① 移動相をアセトニトリル系とした場合のマトリックス増加による感度低下について移動相をメタノールの代わりにアセトニトリルにした場合、マトリックスが増えるにつれて感度が低下する傾向が見られた。図 9 にそれぞれのマトリックスを固相抽出した空試験液に標準液を添加（1 µg/mL を 5 µL 添加）した場合の、標準液と比較した応答率を示す。 0 20 40 60 80 100 120 内標メトリブジンメトリブジンDA メトリブジンDA DK メトリブジンDK 応答率（％）精製水河川水ヘドロ質抽出液図 9 アセトニトリル系のマトリックスによる感度低下（＊応答率は絶対検量線法により求めたものである。内標は検量線作成時の平均を 100%とした。）内標とメトリブジンはよく似た挙動を示すが、メトリブジンの分解物は内標とは異なる挙動を示した。又、マトリックスが増えるにつれて内標とメトリブジンは感度低下が大きくなったのでメタノール系を移動相とすることにした。メタノール系は図 11 に示すように感度低下が少なかった。 ②底質抽出法による夾雑物の影響について底質をアセトンで高速溶媒抽出法と超音波抽出法で抽出し、メタノール溶出による固相抽出、次いで Carbon／NH2 カートリッジでクリーンアップした空試験液に標準液を添加し（1 µg/mL を 5 µL 添加）、夾雑物の影響について試験した。移動相はメタノール系である。図 10、11 に抽出法による夾雑物の影響の違いを示す。高速溶媒抽出法による空試験液に標準液を添加した場合は、特にメトリブジン、メトリブジDA、内標の感度低下が大きく、砂質よりもヘドロ質で大きくなった。超音波抽出法による空試験液に標準液を添加した場合は、感度低下が少なくなり、物質毎の夾雑物の影響の割合が均一化されたので超音波抽出法を採用した。

(14)

0 20 40 60 80 100 120 内標メトリブジンメトリブジンDA メトリブジンDA DK メトリブジンDK 応答率（％）砂質の抽出液ヘドロ質の抽出液図 10 高速溶媒抽出液に標準液を添加した場合の応答率 0 20 40 60 80 100 120 内標メトリブジンメトリブジンDA メトリブジンDAD K メトリブジンDK 応答率（％）砂質の抽出液ヘドロ質の抽出液図11 超音波抽出液に標準液を添加した場合の応答率〔Carbon／NH2 カートリッジのクリーンアップについて〕底質の固相抽出液が着色している場合のクリーンアップを、Carbon／NH2 カートリッジを用いる方法について検討した。 ① Carbon／NH2 カートリッジの前処理をメタノール洗浄のみとし、メタノールで溶出した場合はメトリブジンDA が全く溶出しない。 ② カートリッジの前処理をメタノールで行い、0.2%ギ酸メタノールで溶出した場合は、ギ酸の影響でメトリブジンDADK とメトリブジン DK の感度が上昇し、回収率が100%を大きく超える。 ③ カートリッジの前処理を0.2%ギ酸メタノール 10 mL で洗浄し、その後メタノール10 mL で洗浄する前処理法では、メタノールで溶出すると全項目が溶出される。標準液を前処理したカートリッジに添加し、メタノールの溶出量を検討した。その結果、15 mL のメタノールで溶出することが判明したが、実試料では20 mL 程度の溶出液量が必要な場合があり、安全性を考慮して溶出液量を30 mL とした。

(15)

0 20 40 60 80 100 120 メトリブジンメトリブジンDA メトリブジンDA DK メトリブジンDK 回収率（％） 5ｍＬ 10ｍＬ 15ｍＬ 20ｍＬ溶出メタノール量図 12 carbon/NH2 カートリッジからの溶出メタノール量〔添加回収実験結果〕（水質試料）河川水（新町川）と海水（播磨灘）への添加回収実験結果を表４に示す。表４．添加回収実験結果（水質）物質試料名試料量 (mL) 添加量 (ng) 測定回数検出濃度 (ng/L) 回収率 (%) 変動係数 (%) メトリブジン河川水 200 無添加 2 ND - -200 1 7 4.28(3.16) 86(63) 5.3(3.1) 200 10 7 46.2(33.7) 93(67) 2.9(2.4) メトリブジンDA 200 無添加 2 ND - -200 1 7 4.31(3.36) 86(67) 4.6(3.5) 200 10 7 41.7(30.8) 83(62) 2.6(4.6) メトリブジンDADK 200 無添加 2 ND - -200 10 7 44.6(34.5) 89(69) 6.2(5.2) メトリブジンDK 200 無添加 2 ND - -200 10 7 53.4(42.5) 107(85) 5.4(5.2) メトリブジン海水 200 無添加 2 ND - -200 1 7 4.45(3.37) 89(67) 3.1(3.3) 200 10 7 46.8(36.9) 94(74) 2.1(3.6) メトリブジンDA 200 無添加 2 ND - -200 1 7 4.00(3.20) 80(64) 5.0(5.4) 200 10 7 39.8(31.6) 80(63) 1.6(3.9) メトリブジンDADK 200 無添加 2 ND - -200 10 7 43.3(38.0) 87(76) 6.3(9.0) メトリブジンDK 200 無添加 2 ND - -200 10 7 44.1(38.3) 88(77) 7.3(7.6) ()は絶対検量線法による検出濃度、回収率と変動係数

(16)

（底質試料）底質（東京湾）への添加回収試験結果を表５に示す。表５．添加回収試験結果（底質）物質試料量 (g) 添加量 (ng) 測定回数検出濃度 (ng/L) 回収率 (%) 変動係数 (%) メトリブジン 5 無添加 2 ND - -5 10 5 1.63(1.16) 82(58) 3.1(10.3) メトリブジンDA 5 無添加 2 ND - -5 10 5 1.85(1.32) 93(66) 2.9(9.7) メトリブジンDADK 5 無添加 2 ND - -5 10 5 2.25(1.63) 112(81) 8.5(7.6) メトリブジンDK 5 無添加 2 ND - -5 10 5 1.96(1.39) 98(70) 10.7(9.3) （）は絶対検量線法による検出濃度、回収率と変動係数〔分解性スクリーニング結果〕分解性スクリーニング結果を表６に示す。表６．分解性スクリーニング試験結果５日後の残存率 (%) 物質 pH 初期濃度（μg/L） 1 時間後の残存率 (%) 暗所(%) 明所(%) 5 5 99 103 メトリブジン 7 5 101 102 97 9 5 99 100 5 5 101 104 メトリブジンDA 7 5 102 103 102 9 5 102 102 5 5 102 105 メトリブジンDADK 7 5 100 102 98 9 5 98 98 5 5 100 108 メトリブジンDK 7 5 100 110 111 9 5 100 110

(17)

〔環境試料分析例〕（水質試料）河川水（新町川）、海水（播磨灘）からは検出されなかった。 river-blnk 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00Time 63 100 % 63 100 % 22 100 % 5 100 % 0 100 %

metribuzin-rec01 2: MRM of 4 Channels ES+

212.2 > 134.1 3.89e5 10.94

200.1 > 172.1 4.96e3 11.42 11.21 10.46 10.03 9.76 9.39 9.06 8.64 8.15 0.05 _7.83 7.51 7.29 6.97 2.09 10.89 12.28 11.96 12.87

215.1 > 84 1.06e3 9.76 9.60 8.47 6.87 4.45 3.16 2.68 2.09 1.72 0.75 0.05 _1.39 3.333.59 4.774.99 5.425.90 6.65 8.15 7.99 7.56 _8.96_9.28 10.57 10.08 10.89 11.75 11.26 12.6012.93

metribuzin-rec01 1: MRM of 2 Channels ES-

168 > 97 399 11.23 8.77 8.07 7.05 2.06 1.04 0.24 _{0.77 1.26} 1.95 5.55 3.51 2.22 2.76 3.40 3.724.05 4.64 5.12 5.716.036.416.57 7.96 7.21 8.39 9.36 9.19 10.37 9.84 9.62 9.95 10.96 11.4511.55 12.90 11.93 12.63

183 > 41.7 386 11.45 11.13 8.60 6.35 1.58 0.99 0.40 1.20 2.062.38 2.92 3.56_3.994.314.53_4.805.175.55 6.256.08 7.91 7.59 7.16 6.57 6.94 8.39 9.46 9.25 8.93 10.59 10.32 9.62 12.09 12.52_12.68 metribuzinDK metribuzinDADK metribuzin metribuzinDA IS 図 13 河川水無添加クロマトグラム river-10ng 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00Time 12 100 % 12 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 %

212.2 > 134.1 4.45e5 10.83

200.1 > 172.1 4.60e5 11.10

215.1 > 84 8.27e4 10.89

168 > 97 2.11e3 10.43 9.19 1.95 0.29 1.47 2.49 6.306.73 9.52 10.11 11.02 12.31

183 > 41.7 2.17e3 9.95 1.36 4.42 5.66 7.05 7.59 8.508.77 10.43 metribuzinDK metribuzinDADK metribuzin metribuzinDA IS 図 14 河川水 10 ng 添加クロマトグラム

(18)

sea-blnk 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00Time 63 100 % 65 100 % 36 100 % 7 100 % 0 100 %

212.2 > 134.1 3.76e5 10.89

200.1 > 172.1 3.26e3 11.37 11.16 10.08 8.53 8.15 7.94 7.51 7.19 6.81 2.31 0.05 2.09 0.80 1.23 2.473.06 3.754.134.454.72 5.745.856.54 9.23 9.01 9.49 12.17 11.64 _{12.66 12.82}

215.1 > 84 685 9.28 9.12 6.49 3.11 2.90 2.47 2.15 0.91 0.59 0.11 1.341.93 3.49_{3.814.13 4.72}4.83 _5.586.176.33 5.47 7.88 6.76 7.56 6.92 8.108.318.58 9.98 9.82 10.35 11.1611.85_12.07 _12.44

168 > 97 405 11.23 10.43 8.87 7.80 2.17 0.45 0.29 1.20 0.99 _1.692.01 2.813.08 3.62 4.855.01 4.15 5.495.87 6.466.84 7.48 8.55 8.02 9.46 9.03 9.95 11.39 12.47 11.55 12.63

183 > 41.7 403 10.96 10.80 7.43 7.16 6.25 6.08 3.89 2.33 0.67 0.08 1.361.532.06 2.92 3.62 3.30 5.87 5.44 4.96 4.58 6.35 7.00 10.32 9.19 9.03 7.53 8.93 8.44 9.57 10.16 11.77 11.39 _12.04 12.79 12.90 metribuzinDK metribuzinDADK metribuzin metribuzinDA IS 図 15 海水無添加クロマトグラム sea-10ng 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00Time 13 100 % 14 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 %

212.2 > 134.1 4.09e5 10.83

200.1 > 172.1 4.37e5 11.05

215.1 > 84 1.07e5 10.89

168 > 97 1.83e3 10.43 1.53 9.89 9.30 8.34 7.10 3.51 4.80 5.71 6.08 7.64 11.07 11.77 12.41

183 > 41.7 1.97e3 9.95 7.69 3.67 8.71 10.37 12.04 metribuzinDK metribuzinDADK metribuzin metribuzinDA IS 図 16 海水 10 ng 添加クロマトグラム

(19)

（底質試料）吉野川、東京湾とも検出されなかった。 teisitu-hedoro-blnk 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00Time 54 100 % 43 100 % 14 100 % 3 100 % 0 100 %

metribuzin-tei-recov-01 2: MRM of 4 Channels ES+

212.2 > 134.1 2.82e5 10.73

200.1 > 172.1 3.97e3 9.98 2.15 0.05 1.66 9.39 8.80 8.47 8.26 2.472.90 3.59 7.03 7.67 12.07 11.05 10.62 11.69 12.34 12.66

215.1 > 84 655 9.98 2.09 0.59 0.16 0.861.34_1.66 2.412.793.11 3.753.974.344.615.20 5.745.95 6.76 7.567.838.05 9.76 9.65 9.12 8.21 10.41 11.64 11.10 11.21 _12.12 12.76 12.55

metribuzin-tei-recov-01 1: MRM of 2 Channels ES-

168 > 97 248 11.77 9.46 8.77 8.50 0.51 _2.06 1.20 0.94 1.47 2.282.76 _3.353.674.10 4.645.015.335.496.196.466.947.16 8.07 7.32 9.30 10.1110.3711.18 11.55

183 > 41.7 183 7.85 7.16 5.01 3.99 0.02 1.10 0.35 _1.79 _3.35 2.44 2.71 4.214.42 5.55_5.87 6.576.73 7.64 12.79 10.86 9.95 9.84 8.82 8.60 8.07 9.36 10.43 11.66 12.68 metribuzinDK metribuzinDADK metribuzin metribuzinDA IS 図 17 底質（東京湾）無添加クロマトグラム teisitu-hedoro-10ng-rec 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00Time 5 100 % 4 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 %

212.2 > 134.1 4.33e5 10.73

200.1 > 172.1 5.03e5 11.05

215.1 > 84 6.72e4 10.83

168 > 97 2.52e3 10.32

8.55

2.06 10.86 12.47

183 > 41.7 2.02e3 9.89 3.67 2.01 metribuzinDK metribuzinDADK metribuzin metribuzinDA IS 図 18 底質 10 ng 添加クロマトグラム

(20)

【評価】本法により、水質中メトリブジンの 0.14 ng/L 及び底質中のメトリブジン 0.0054 µg/kg-dry レベルの測定が可能である。メトリブジンの分解化合物については、水質中の0.14～6.5 ng/L、底質中の 0.033～0.22 µg/kg-dry レベルの測定が可能である。【担当者氏名・連絡先】担当徳島県保健環境センター住所〒770-0941 徳島市万代町 5-71 TEL:088-625-7751 FAX:088-625-1732 担当者大野ちづ子織田まゆみ E-mail:[email protected] :[email protected]

(21)

4-amino-6-(1,1-dimethylethyl)-3-(methylthio)-1,2,4-triazin-5(4H)-one

（Metribuzin）

An analytical method was developed for metribuzin and the decomposed compounds of Metribuzin in water and sediment by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS).

［Water sample］

The target compounds in 200 mL of water were extracted using a solid phase extraction cartridge (Sep-Pak Plus PS-2) at the flow rate of 10 mL/min, and then eluted with 2 mL of methanol. The sample solution was concentrated to 1 mL under a gentle nitrogen

flow. Simazine-d10 was added to the extracts as an internal standard, and the resulting

mixture was analyzed by positive and negative ion ESI-LC/MS/MS-SRM. The method detection limit (MDL) of metribuzin was 0.14 ng/L. The MDL of metribuzin DA was 0.14 ng/L. The MDL of metribuzin DADK was 5.3 ng/L. The MDL of metribuzin DK was 6.5 ng/L.

［Sediment sample］

The target compounds in 5 g of sediment were extracted and centrifuged twice with 20 mL of acetone. The extracts were evaporated to about 2 mL under reduced pressure, and 200mL of water was then added to the residue. The target compounds were extracted using a solid phase cartridge (Sep-Pak Plus PS-2). The PS-2 cartridge was eluted with 2 mL of methanol, and the solution was applied to a Carbon/NH2 cartridge. The target compounds adsorbed on the cartridge were eluted with 30 mL of methanol. The extracts were evaporated under reduced pressure and then the sample solution was concentrated

to 1 mL under a gentle nitrogen flow. Simazine-d10 was added to the extract as an

internal standard, and the resulting mixture was analyzed by ESI-LC/MS/MS-SRM. The MDL of metribuzin was 0.0054 microg/kg-dry. The MDL of metribuzin DA was 0.033 microg/kg-dry. The MDL of metribuzin DADK was 0.11 microg/kg-dry. The MDL of metribuzin DK was 0.22 microg/kg-dry.

Flow chart

［Water sample］

Water sample Solid Phase Dehydration Elution

200mL Extraction

PS-2 Nitrogen Methanol 2 mL Concentration Addition of LC/MS/MS-SRM

(1mL) internal standard ESI-pos.,neg

(22)

［Sediment sample］

Wet Sediment Ultrasonic Extraction Centrifugation Evaporation Sample

5 g (dry) about 2 mL 2 times

Acetone 3000 rpm 20 mL 10 min 10 min

Addition Solid phase Washed with Dehydration Elution of Water Extraction Water

200 mL PS-2 10 mL nitrogen Methanol 2 mL Clean up Evaporation and Addition of LC/MS/MS

Concentration internal standard SRM

Carbon/NH2 1 mL Simazine-d10

(23)

物質名分析法フローチャート備考メトリブジンとその分解物〔水質〕試料水固相抽出脱水溶出 200mL PS-2 窒素ガスメタノール 2 mL 濃縮内標添加 LC/MS/MS-SRM ESI-pos.,neg. 1 mL シマジン-d10 〔底質〕湿泥試料超音波抽出遠心分離濃縮水添加 5g（乾泥換算）２回アセトン 3000 rpm 10分約 2 mL 200 mL 20 mL,10 分固相抽出水洗脱水溶出クリーンアップ PS-2 精製水窒素ガスメタノール Carbon/NH2 10 mL 2 mL メタノール 30 mL 濃縮内標添加 LC/MS/MS-SRM ESI-pos.,neg. ロータリーシマジン-d10 エバポレーター窒素ガス 1 mL 定容 LC/MS/MS メトリブジン ESI-positive メトリブジンDA ESI-positive メトリブジン DADK ESI-negative メトリブジン DK ESI-negative カラム Mightysil RP-18 MS (2.0 mm φ × 150 mm 5 µm) 検出下限(MDL) メトリブジン水質：0.14 ng/L 底質：0.0054 µg/kg-dry メトリブジンDA 水質：0.14 ng/L 底質：0.033 µg/kg-dry メトリブジンDADK 水質：5.3 ng/L 底質：0.11 µg/kg-dry メトリブジンDK 水質：6.5 ng/L 底質：0.22 µg/kg-dry