肺癌,口腔癌患者におけるグルタチオン-S-トランスフェラーゼM1 (GSTM1)型遺伝子欠損の出現頻度

産 業 医 学 Jpn J Ind Health, 1994; 36: 435-439

原 著

_{肺 癌,口 腔 癌 患 者 に お け る グ ル タ チ オ}

ン-S-トラ ン ス フ ェ ラ ー ゼM1(GSTM1)型

遺 伝 子 欠 損 の 出 現 頻 度

加

藤

貴

彦*

THE FREQUENCY OF GLUTATHIONE-S-TRANSFERASE

M1

(GSTM1) GENE DELETION IN PATIENTS WITH

LUNG AND ORAL CANCER

Takahiko KATOH*

A homozygous gene deletion at the glutathione-S-transferase

(GST) Ml locus of genomic DNA

isolated from the peripheral blood was investigated for its relationship with lung and oral cancer

using the polymerase chain reaction (RCR) technique.

DNA samples were prepared from 91 healthy

controls, 53 lung cancer patients and 48 oral cancer patients. As for the genotype, 38 of 91 healthy

controls (41.7%), 27 of 53 lung cancer patients (50.9% [p>0.05], odds ratio 1.45, 95% confidence

interval 0.73-2.86) and 26 of 48 oral cancer patients (54.2% [p>0.05], odds ratio 1.65, 95% con

fidence interval 0.82-3.32) were GSTM1 deletion types.

When male-smoker patients and healthy controls were analyzed, the frequency

of GSTM1

deletion genotype was 41.6% in the healthy controls and 52.2% (p>0.05,

odds ratio 1.53, 95%

confidence interval 0.58-4.14),

54.5% (p>0.05,

odds ratio 1.68, 95% confidence interval

0.45

-6.26),

and 50.0% (p>0.05,

odds ratio 1.40, 95% confidence interval 0.55-3.60) in pulmonary

squamous cell carcinoma, small cell carcinoma, intraoral squamous cell carcinoma patients, respec

tively. Thus, the GSTM1 deletion genotype as a host factor predisposing to lung and oral cancer

could not be confirmed in this study.

Key words: glutathione-S-transferase;

gene deletion; PCR; lung cancer; oral cancer

I.緒 言 今 日,職 場 で の疾 病は 中毒 性疾 病 や 急性,慢 性 感染 症 は減 少 し,か わ って 癌,高 血 圧 症,心 臓病,糖 尿 病 とい った 成人 病 が増加 しつつ あ る.こ う した疾 病 は,中 毒 や 感染 症 の よ うに単 一 の主 病 因 に よって 発症 す るわ け で は な く.環 境要 因 と複 数 の遺伝 的 要 因が そ の発症 に関与 し て いる.し か し,こ れ まで の疾 病発 生 に関 す る研 究 は病 因 を含め た環 境要 因 に研 究 の重 点 がお かれ,個 体 の遺 伝 的要 因に つ いて はあ ま り研究 が な され て いな い.一 方, ワ トソン,ク リックのDNAら せ ん モデ ル の提 出以来 爆 発 的 に進 展 して きた分 子生 物学 は, 1980年 代 よ り医 学 へ も応 用 され,そ れ まで 難病 といわ れ手 が か りさえつ か め なか った い くつ か の遺伝 性 疾患 の病因 を あ き らか に しつ つ あ る.本 研 究 で は,分 子 生物 学 の手 法 を用 い,多 因子 疾 患 で あ る癌 発 症 の個体 要 因 と環 境 中発癌 物 質 との関連 性 を 明 らか にす る こ とを 目的 とした. 人 発癌 の大 きな要 因 は,生 活 環 境 中に 存在 して い る化 学 物 質 であ る と考 え られ てい る.し か し,環 境 中 の発癌 物 質 は直 接的 にDNAに 作 用 す る化学 物 質 ばか りでは な く,タ バ コに含 まれ るベ ンゾ(a)ピレンの よ うに 生体 内 に 入 り代謝 を受 け る ことに よ り,初 め て発 癌 物質 とな る発 癌 前駆 物 質 もあ る.そ こで著者 は,化 学 物 質に対 す る個 体 の薬 物 代謝 酵 素 の代 謝能 の違 いが発 癌 感受 性 の個 人 差 を うみ だ して い る とい う仮 説 をた て,薬 物 代謝酵 素 の一 つ で あ る グル タチ ン-S-トランス フ ェラ ー ゼ と 肺 癌,口 腔 癌 発症 との関 連 性に つ いて検 討 した. * 産業医科大学医療技術短期大学公衆衛生学 平成6年3月7日 受付

* Division of Public Health , School of Nursing and Medical Technology, University of Occupational and Environmental Health, Japan

436 産 業 医 学 36巻, Jpn J Ind Health, vol. 36, 1994

Table 1. Characteristics of groups.

* Mean age of healthy controls did not significantly differ from those of lung cancer patients and oral cancer patients by t-tests.

グ ル タ チ オ ン-S-ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ(glutathione-S-transferase,以 下GST)は,グ ル タ チ オ ン を 抱 合 体 と して 用 い 多 数 の 薬 剤,生 体 外 異 物 の 抱 合,解 毒 に 関 す る 酵 素 で あ る1,2). GSTに は 多 数 の 分 子 種 が あ る こ と が 明 らか と な っ て い る.そ こ で,本 研 究 で は ベ ン ゾ(a)ピ レ ン の 代 謝 に 関 与 し3),人 に お い て40∼60%に 欠 損 型 が 存 在 す る こ と が 明 ら か とな って い る グル タ チ オ ン-S-ト ラ ンス フ ェ ラ ー ゼM1(glutathione-S-transferase M1, 以 下GSTM1)に 注 目 し, GSTM1欠 損 型 の 出 現 頻 度 を 肺 癌 患 者,口 腔 癌 患 者 で 分 析 し,健 常 者 に お け る 出 現 頻 度 と 比 較 し た. II.対 象 と 方 法 肺 癌 お よ び 口腔 癌 患 者 は,北 九 州 市 内S大 学 病 院, S 病 院 お よ びM病 院 に て 組 織 学 的 に 診 断 され た 症 例 を,健 常 者 群 に は 北 九 州 市 内 の 老 人 ホ ー ム の 健 常 者 を 選 定 した (Table 1).健 常 者 群 と 肺 癌 患 者 群,あ る い は 口腔 癌 患 者 群 と の 間 で 有 意 な 年 齢 差 を 認 め な か った. 末 梢 血 液5mlを 採 血 し,全 血 よ り 白血 球 分 離 を 行 っ た.分 離 した 白血 球 よ り ゲ ノ ムDNAを フ ェ ノ ー ル/ク ロ ロホ ル ム 法 に て 抽 出 し5), polymerase chain reaction (PCR法)の た め の 試 料 と した.抽 出 したDNAに 水 を 加 え,濃 度 を1μg/μlに 調 整 し た.ゲ ノ ムDNAに Primer, Taq DNA polymeraseを 加 え, GSTM1遺 伝 子 のExon 4か らExon 5を 増 幅 し た6). Primerの 塩 基 配 列 とPCRの 条 件 は 下 記 の と お りで あ る. 塩 基 配 列: Primer 1 5´-CTGCCCTACTTGATTGA-TGGG-3´ Primer 2 5´-CTGGATTGTAGCAGATC-ATGC-3´ 温 度 条 件: denaturing 94℃ 2分, annealing 59℃ 1 分, extension 72℃ 1.5分, cycle 35回 PCR後,産 物 を5%ボ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 を 行 っ た 後,臭 化 エ チ ジ ウ ム溶 液 中 に 浸 し, UVラ ン プ に て 発 色 蛍 光 させ, GSTM1遺 伝 子 増 幅 の 有 無 に よ り 欠 損 型 の 判 定 を した. ま た, GSTM1遺 伝 子 とGSTM1蛋 白 質 の 存 在 の 整 合 性 の 確 認 はELISA(Enzyme-Linked Immunosor-bent Assay)法 に よ っ て 行 っ た. ELISA法 は, MU KIT (Biotrin International, Dublin, Ireland)を 使 用 し, 添 付 資 料 に 従 っ て 行 っ た.簡 潔 に 記 す と,抗 ヒ トMu-GST抗 体 が 固 相 化 さ れ た マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー トの ウ ェル に,血 清 サ ン プ ル(Triton X-100 1v/v%),陽 性 コ ン ト ロ ー ル,陰 性 コ ン ト ロ ー ル を そ れ ぞ れ100μlず つ 分 注 し,室 温 で1時 間 イ ン キ ュベ ー シ ョン し た.反 応 後,各 ウ ェ ル を 洗 浄 し,ビ オ チ ン 化 抗 ヒ トMu-GSTウ サ ギ 抗 体50μlを 加 え て1時 間 室 温 で イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 後,洗 浄 し,ビ オ チ ン化 ス ト レ プ トア ビ ジ ンペ ル オ キ シ ダ ー ゼ を50μlず つ 分 注 した.室 温 で1時 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン後,洗 浄 し, 2種 類 の 酵 素 基 質 容 液 を100μl ず つ 添 加 した 後, 630nm(対 照450nm)に お け る 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リー ダ ー を 用 い て 測 定 した. 統 計 処 理 は, GSTM1欠 損 と肺 癌,口 腔 癌 発 症 と の関 連 性 の 強 さ を 評 価 す る た め に オ ッ ズ 比 を 求 め,そ の 有 意 差 の 検 定 に はx2検 定 を 用 い た7). III.結 果

Fig. 1はexon 4とexon 5を プ ラ イ マ ー と し てPCR を 行 った 後 の, DNA産 物 を 示 し て い る.数 字 は サ ン プ ル ナ ンバ ー を 示 し て い る が, 273bpの 位 置 に バ ン ドが 観 察 さ れ て い る サ ン プ ル1, 2, 3, 6, 7, 8は 非 欠 損 型 と判 定 し,バ ン ドが 認 め ら れ な い サ ン プ ル4, 5は 欠 損 型 と判 定 した.バ ン ドが 認 め られ な い サ ン プ ル に つ い て は2回 以 上PCRを 行 い,結 果 の 再 現 性 を 確 認 した. 20症 例 に つ い て273bpの 遺 伝 子 増 幅 の 有 無 と, ELISA 法 に よ る表 現 型 の 結 果 の 整 合 性 を 検 討 し た, PCR法 で

加藤 貴 彦:肺 癌,口 腔癌 患 者 に おけ る グル タ チオ ン-S-ト ラ ンス フ ェラ ーゼM1(GSTM1)型 遺 伝 子欠 損 の 出現 頻 度 437 欠 損 型 と判 定 さ れ た サ ン プ ル8例 は, ELISA法 で も す べ て 陰 性 と判 定 され,ふ た つ の 分 析 結 果 は 完 全 に 一 致 し た.以 上 の 結 果 よ り,今 回 の 研 究 で はexon 4とexon 5を プ ラ イ マ ー と し, 273bpのPCR産 物 の 有 無 に よ り, GSTM1欠 損 型 の 分 析 を 行 った. 分 析 結 果 をTable 2に 示 して い る.癌 患 者 群 でGSTM 1欠 損 型 の 出 現 頻 度 は 健 常 者 群 と 比 較 し や や 大 き い 傾 向 が 認 め ら れ,オ ッ ズ 比 は 肺 癌 患 者 で1.45(95%信 頼 区 間: 0.73∼2.86),口 腔 癌 患 者 で1.65(95%信 頼 区 間: 0.82∼3.32)で あ った.肺 癌 患 者 の うち,男 性 喫 煙 者 に つ い て,組 織 型 別 に 解 析 した 結 果 がTable 3で あ る. GSTM1欠 損 型 の 頻 度 は 扁 平 上 皮 癌52.2%(12/23),

Fig. 1. The polymerase chain reaction (PCR) amplification products of GSTM1 nucleotide sequence between exon 4 and exon 5 using

DNA samples from blood. GSTMl presence: lane 1-3, 6-8; GSTMI absence: lane 4, 5; M:

ƒÓ•~ 174 DNA digested with Hae III.

小 細 胞 癌54.5%(6/11),腺 癌22.2%(2/9)で あ っ た. 男 性 喫 煙 者 の 全 肺 癌 の オ ッ ズ 比 は1.22,喫 煙 と関 連 性 が あ る こ とが 知 られ て い る 扁 平 上 皮 癌,小 細 胞 癌 に お い て オ ッ ズ 比 は そ れ ぞ れ1.53, 1.68と 有 意 で は な か った が や や 高 い 傾 向 が 認 め ら れ た.一 方,口 腔 癌 に つ い て は, 48症 例 中, 46例 が 扁 平 上 皮 癌 で あ り,扁 平 上 皮 癌 に お け る 欠 損 型 の 頻 度 は54.3%,オ ッ ズ 比 は1.66(p>0.05, 95%信 頼 区 間: 0.81∼3.39)で あ り,男 性 喫 煙 老(28 症 例)に お い て,欠 損 型 の 頻 度 は50.0%,オ ッ ズ比1.40 (p>0.05, 95%信 頼 区 間: 0.55∼3.60)で あ っ た. IV.考 察 GSTM1と 癌 発 生 と の 関 連 性 に つ い て は,胃 癌8,9),膀 胱 癌10),脳 下 垂 体 腺 腫11),脳 星 状 膠 腫 瘍12)な ど で 報 告 が あ り,欠 損 型 で 有 意 に 高 い 発 生 が あ る と報 告 さ れ て い る.肺 癌 発 症 とGSTM1遺 伝 子 欠 損 型 との 関 連 性 に つ い て も これ ま で い くつ か の 報 告 が あ り,欧 米 で は 肯 定 的 な 報 告13,14)と 否 定 的 な 報 告15)が あ り,い ま だ は っ き り と し た 結 論 は で て い な い.日 本 人 で 行 わ れ た も の で は, Kiharaら が,そ の 割 合 が 扁 平 上 皮 癌,小 細 胞 癌 で統 計 学 的 に 有 意 に 高 い と報 告 し て い る が16),そ の オ ッ ズ 比 は そ れ ぞ れ2.71, 2.72と そ れ ほ ど 高 い も の で は な い.今 回 の 研 究 結 果 で も,肺 癌 全 体(Table 2),男 性 喫 煙 者 の 扁 平 上 皮 癌,小 細 胞 癌 に お い て, GSTM1遺 伝 子 欠 損 型 の オ ッズ 比 は2以 下 と 小 さ く(Table 3),こ れ ま で の 報 告 と矛 盾 す る も の で は な い.今 後,症 例 数 を 増 や せ ば 有

Table 2. Frequency of GSTM1 deletion in healthy controls, lung cancer patients, and oral cancer patients.

438 産 業 医 学 36巻

, Jpn J Ind Health, Vol-36, 1994

意 差 に至 る可能 性 も十 分 に あ る と思わ れ,人 種 差 を含 め 今 後 も重 要 な検 討 課題 だ と思 わ れ る.ま た,最 近 曝露 要 因 と して,喫 煙本 数 との関連 性 に つい て の検討 された 報 告 もあ り16,17),今後 これ らの相 互 作用 につ い て も検討 し てい くことが重 要 だ と考 えて い る.一 方,腺 癌 に関 して は,症 例 は少 な い もの の,む しろ正常 型 の頻 度 が高 か っ た(Table 3).同 様 の結 果 につ い ては, Brockmollerら も報 告 してお り15),腺 癌 で はRas遺 伝 子 の変異 が 多 く 認 め られ る こ とか ら, GSTM1の 存 在 がRas遺 伝 子変 異 へ なん らか の 影響 を 与 えて い る可能 性 が推 測 され る. 口腔 癌 に関 しては これ までGSTM1遺 伝子 欠 損型 との 関連 性 に つ いて の報 告 は全 くな い.口 腔 癌発 症 に関 して もGSTM1欠 損 型 の オ ッズ比 は小 さ く,肺 癌 同 様,遺 伝 的背 景 と してGSTM1遺 伝 子 欠損 型 の関 与 の割 合 はあ ま り高 くな い と推測 され る。 多 環 芳香 属 化 合物 は タバ コだけ で はな く,都 市 大 気, 自動 車 排 ガ スか らも検 出 され,カ ー ボ ン ブ ラ ック,コ ー ル タ ール等 の関連 職 場 で も使 用 され て い る.こ れ らの事 実 か ら,薬 物 代謝 酵 素 の遺 伝 的多 型性 は,喫 煙 とい った 個 人 の ライ フス タイ ルのみ で な く,環 境 中物 質 に よ る発 癌 リス クを高 め る可 能性 が あ り,産 業 保健 上 の重 要 な問 題 も抱 え てい る と思わ れ る. 今 回 の結 果 で は,肺 癌,口 腔 癌 発症 に 関 してGSTM1 が遺 伝 的 背景 とな って い る こ とを 明 らか にす る ことは で きなか った.し か し,シ トクロー ムP450, N-ア セチ ル トランス フ ェラ ーゼな ど他 の薬 物 代謝 酵 素 も要 因 と して 加 え る こ とに よ り,将 来的 に は個 人 レベ ル での癌 危 険 度 を予 測 す る こ とが可 能 に な るで あろ う.個 人 の遺 伝 的特 性 を 明 らかに す るこ とは,個 人 に対応 した よ り積極 的 な 健康 管 理 を可 能 とし,集 団か ら個 人へ とい うよ りきめ こ まやか な産業 保 健活 動 へ の道 を広 げ る ので は ない だろ う か. V.ま と め 肺 癌 患 者53名,口 腔 癌 患 者48名,健 常 者91名 の GSTM1遺 伝子 欠 損型 の出現 頻 度 につ い て解 析 し,以 下 の結 果 を えた. 1)GSTM1遺 伝 子 欠 損型 の出 現 頻 度 は,健 常者 群 41.7%,肺 癌 患 者群50.9%,口 腔 癌 患者 群54.2%,そ れ ぞれ の癌患 者 群 でのGSTM1欠 損型 の オ ッ ズ 比 は 1.45, 1.65で あ った. 2)男 性喫 煙 者 の肺癌 に限 ってみ る と, GSTM1遺 伝 子 欠損 型 の 出現 頻 度は,全 肺 癌,扁 平上 皮 癌,小 細胞 癌 で46,5%, 52,2%, 54.5%,そ れ ぞ れ の癌 患者 群 で の GSTM1欠 損型 の オ ッズ比は1.22, 1.53, 1.68で あ っ た. 3)口 腔 癌 に つ い て は, 48症 例 中, 46例 が 扁 平 上 皮 癌 で あ り,扁 平 上 皮 癌 に お け るGSTM1欠 損 型 の 出 現 頻 度 は54.3%,オ ッ ズ 比 は1.66で あ り,男 性 喫 煙 者 に 限 っ て み る と 欠 損 型 の 出 現 頻 度 は50.0%,オ ッ ズ比1.40 で あ っ た. 今 回 の 結 果 か ら, GSTM1遺 伝 子 欠 損 型 が 肺 癌,口 腔 癌 の 遺 伝 的 背 景 と な っ て い る 可 能 性 を 明 ら か に す る こ と は で き な か っ た.し か し,今 後,症 例 数 を 増 し,他 の 要 因 も加 え 検 討 して い き た い と 考 え.てい る. 稿 を 終 え るに あた り,本 研 究 に 協 力 をい た だい た産 業医 大歯 科 口腔外 科 教 室 池 村邦 男教授,金 子 茂 氏,環 境 疫 学 教 室 佐 伯 覚 氏に 深甚 の謝 意 を表 します.ま た,本 研究 は平 成4年 度 貝 原 守一 医 学振 興 財 団 の助成 に よっ て行わ れ た. 文 献

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著 者 へ の 通 信 先:加 藤 貴 彦, 〒807  北 九 州 市 八 幡 西 区 医 生 ケ丘1-1  産 業 医 科 大 学 医 療 技 術 短 期 大 学 公 衆 衛 生 学  Reprint requests to Division of Public Health, School of Nursing and Medical Technology, University of Occupational and Environmental Health, Japan, 1-1, Iseigaoka,