IRUCAA@TDC : 象牙芽細胞感覚受容機構の解明（ＴＲＰ・電位依存性チャネル、神経共培養解析）

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(1)Title Author(s) Journal URL. 象牙芽細胞感覚受容機構の解明（ＴＲＰ・電位依存性チャネル、神経共培養解析）澁川, 義幸; 村松, 敬; 下野, 正基 , (): http://hdl.handle.net/10130/529. Right. Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/.

(2) 様式Ｃ−１８. 象牙芽細胞感覚受容機構の解明（ＴＲＰ・電位依存性チャネル、神経共培養解析）１８５９２０５０. 平成１８年度∼平成１９年度科学研究費補助金（基盤研究（Ｃ））研究成果報告書. 平成２０年４月. 研究代表者. 澁川義幸. 東京歯科大学歯学部講師.

(3) 様式Ｃ−１８. ＜はしがき＞歯髄痛覚「歯痛」を裏付ける象牙質・歯髄感覚の発現機序は未だに不明である。本研究では、象牙質/歯髄の感覚受容機序における象牙芽細胞の役割を明らかにする事を全体構想として、以下の 3 点に焦点を当て、象牙芽細胞が感覚受容細胞であるか否かを明らかにすることを目的とした。1) 象牙芽細胞における侵害刺激受容性 TRP（transient receptor potential）チャネルファミリー発現の検討、2) 象牙芽細胞に発現する電位依存性 K+ チャネル電流の生体物理学的特性の詳細検討と静止膜電位の脱分極シフトを説明する細胞膜 K+ コンダクタンスの解明、3) 象牙芽細胞と三叉神経節細胞の共培養系を確立し、象牙芽細胞に細胞内外刺激を与えた際の三叉神経節細胞との神経接触に伴う誘発電位記録の可能性の検討。以上によって象牙芽細胞が細胞外刺激を受容する感覚受容細胞であり、象牙芽細胞−三叉神経（歯髄分布神経）間でのシナプス伝達を介した象牙質/歯髄の感覚情報伝達機構について検討を行った。結果として、以下を明らかにした。 1) 象牙芽細胞に侵害・熱刺激感受性 TRP（TRPV1）チャネルが発現していた。 2) 象牙芽細胞に冷刺激感受性 TRP（TRPM8）チャネルが発現していた。 3) 象牙芽細胞に緩徐活性化・不活性化を示す時間-電位依存性 K+チャネルが発現していた。 4) 象牙芽細胞に Na+-Ca2+ exchanger（NCX）subtype 3 が発現していた。これらの事から、象牙質・歯髄に加えられた熱・冷刺激が、象牙芽細胞に発現する TRPV1 チャネルによって受容され、膜電位変動との機能協関を伴い、また細胞内 Ca2+を Na+-Ca2+ exchanger （NCX）subtype 3 によって排出することで、感覚受容ならびに、刺激に伴う象牙質形成を行っていることが示された。.

(4) 様式Ｃ−１８. 研究組織研究代表者研究分担者研究分担者. ：：：. 澁川村松下野. 義幸（東京歯科大学歯学部講師）敬（東京歯科大学歯学部講師）正基（東京歯科大学歯学部教授）. 交付決定額（配分額）. （金額単位：円）. 直接経費. 間接経費. 合計. 平成 18 年度. 2,900,000. 0. 2,900,000. 平成 19 年度. 600,000. 180,000. 780,000. 3,500,000. 180,000. 3,680,000. 総. 計.

(5) 様式Ｃ−１８. 研究発表（1）雑誌論文 Kubo, K., Shibukawa, Y., Shintani, M., Suzuki, T., Ichinohe, T., Kaneko, Y. Cortical Representation Area of Human Dental Pulp Journal of Dental Research, 87: 35-62, 2008.（査読有り） Ito E, Ichinohe T, Shibukawa Y, Aida H, Kaneko Y. Anesthetic duration of lidocaine with 10% dextran is comparable to lidocaine with 1:160 000 epinephrine after intraosseous injection in the rabbit. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 104: e26-31, 2007 （査読有り） MacCannell KA, Bazzazi H, Chilton L, Shibukawa Y, Clark RB, Giles WR A Mathematical Model of Electrotonic Interactions between Ventricular Myocytes and Fibroblasts Biophysical Journal 92:4121-4132, 2007（査読有り）. Kimura M, Shibukawa Y, Momose Y, Sugaya M, Yamamura S, Suzuki T, Hatakeyama N, Yamazaki M. Effects of thiopental on Ca2+ currents and intracellular Ca2+ transient in single atrial cells from guinea pig Pharmacology, 80: 33-39, 2007（査読有り） Shibukawa, Y., Kang, K.J., Kinjo, T., Szerencsei, R., Altimimi, H., Pratikhya, P., Schnetkamp, P. Structure- function relationships of the NCKX2 Na/Ca-K exchanger. Annals of the New York Academy of Sciences, 1099: 16-28, 2007 （査読有り）.

(6) 様式Ｃ−１８. Bessho, H., Shibukawa, Y., Shintani, M., Yajima. Y., Suzuki, T., Shibahara, T. Topographic Localization of the Palate Area in Human Somatosensory Cortex Journal of Dental Research, 86: 265-270, 2007（査読有り） Shibukawa, Y., Ishikawa, T., Kato, Y., Zhang, Z.K., Jiang, T., Shintani, M., Shimono, M., Kumai, T., Suzuki, T., Kato, M., Nakamura, Y. Cerebral Cortical Dysfunction in Patients with Temporomandibular Disorders in Association with Jaw Movement Observation PAIN, 128: 180-188, 2007 （査読有り） Kato Y, Muramatsu T, Kato M, Shibukawa Y, Shintani M, Yoshino F Cortical reorganization and somatic delusional psychosis: an MEG study Psychiatry Research: Neuroimaging, 146: 91-95, 2006（査読有り） Okumura, R, Shima K, Muramatsu T, Nakagawa K, Shimono M, Suzuki T, Magloire H, Shibukawa Y. Odontoblast as a sensory receptor cell? - Expression of TRPV1 (VR-1) channels Archives of Histology and Cytology, 68: 251-257, 2006. （査読有り）.

(7) 様式Ｃ−１８. （2）学会発表澁川義幸顎顔面領域の運動-感覚統合機構と関連するヒト高次脳機能− Orofacial sensory- motor integration mechanisms in human brain− 松本歯科大学大学院歯学独立研究科第 162 回大学院セミナー平成 19 年 12 月 7 日、塩尻市 (招待講演) 澁川義幸象牙芽細胞のカルシウムシグナリング：象牙質形成と感覚受容機構における役割北海道医療大学歯学会後援特別講演会、北海道医療大学歯科薬理学講座主催平成 17 年 12 月 14 日、当別市 (招待講演) 澁川義幸ヒト大脳皮質体性感覚機能の特殊性平成 19 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ、平成 20 年 2 月 29 日、千葉平成 19 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショッププログラム抄録集、p. 1 Shibukawa Y. Ca2+ signaling in odontoblasts: role in dentinogenesis and sensory transduction 2007 Symposium on Calcium Signaling, Seo Byung In’s Hall, Yonsei University College of Dentistry, Seoul, Korea, April 20, 2007. (招待講演) 澁川義幸、加藤元一郎、新谷益郎、加藤隆顎顔面領域における MEG を応用した高次脳機能研究平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ、平成 19 年 3 月 3 日、千葉平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショッププログラム抄録集、p. 1.

(8) 様式Ｃ−１８. 澁川義幸、加藤元一郎、新谷益郎、加藤隆口腔領域体性感覚と Mirror Neuron System の統合異常口腔内触圧覚認知の大脳皮質機能基盤平成 17 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショッププログラム抄録集、pp. 8-9 (招待講演) 田村洋平、久保浩太郎、新谷益郎、田崎雅和、澁川義幸、一戸達也口腔の痛覚誘発脳磁場に関する総合的研究：ピエゾ駆動触圧覚刺激装置を用いた頬・舌粘膜からの体性感覚誘発脳磁場応答平成 17 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショッププログラム抄録集、pp. 3-4 Tamura Y, Kubo K, Shintani M, Tazaki M, Shibukawa Y, Ichinohe T. Somtosensory-evoked magnetic fields (SEFs) from buccal and tongue mucosa using piezo-driven tactile stimulation device Program and Abstracts, Workshop 2007 in Oral Health Science Center, Tokyo Dental College, March 3, 2007, pp. 17-18 田村洋平、久保浩太郎、新谷益郎、田崎雅和、一戸達也、澁川義幸ピエゾ駆動触圧覚刺激装置を用いた頬・舌粘膜からの体性感覚誘発脳磁場応答平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ、平成 19 年 3 月 3 日、千葉平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショッププログラム抄録集、p. 1 加藤隆、加藤元一郎、澁川義幸、新谷益郎統合失調症群における顎運動関連 Mirror Neuron System 異常についての検討 −特に右頭頂・側頭領域における高周波応答異常について− 平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ、平成 19 年 3 月 3 日、千葉平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショッププログラム抄録集、p. 2.

(9) 様式Ｃ−１８. 加藤元一郎、加藤隆、澁川義幸、新谷益郎 Mirror Neuron System の神経基盤：特に精神障害（歯科口腔外科関連精神疾患を含む）における異常に関する研究：統合失調症群における顎運動関連 Mirror Neuron System異常についての検討 −特に右頭頂・側頭領域における高周波応答異常について− 平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショッププログラム抄録集、pp. 5-7 Kato M, Kato Y, Shibukawa Y, Shintani M. Aberrant component in high frequency range relating mirror neuron dysfunction in schizophrenia patients. Program and Abstracts, Workshop 2007 in Oral Health Science Center, Tokyo Dental College, March 3, 2007, pp. 19-20（年報未） Shibukawa Y, Kato M, Shintani M, Kato Y. Integration mechanisms between cortical somatosensory functions and mirror neuron system. Program and Abstracts, Workshop 2007 in Oral Health Science Center, Tokyo Dental College, March 3, 2007, pp. 19-20 (招待講演) 松浦信幸、富岡峻也、田村洋平、澁川義幸、新谷益郎、一戸達也先天性無痛無汗症における感覚認知機構の解明−脳磁図を用いた検討? 平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショッププログラム抄録集、pp. 16 橋本貞充、坂井隆之、澁川義幸、加藤靖浩、正岡孝康、奥村礼二郎細胞の活性化による anti-aging 平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ、平成 19 年 3 月 3 日、千葉平成 18 年度東京歯科大学口腔科学研究センターワークショッププログラム抄録集、p. 32-33.

(10) 様式Ｃ−１８. 奥村礼二郎、村松敬、松田敏夫、馬場道明、中川寛一、下野正基、田崎雅和、鈴木恵子、Paul P. M. Schnetkamp、澁川義幸エナメル芽細胞に発現する NCX1,3 を介したエナメル質の石灰化機構トランスポーター研究会第一回関東部会、平成 19 年 12 月 10 日、東京工業大学（横浜市）トランスポーター研究会第一回関東部会要旨集上田彩香、甲田賢一郎、澁川義幸、Robert T. Szerencsei、田崎雅和、百瀬弥寿徳、Paul P. M. Schnetkamp NCKX2 の K+-binding に対する EDTA と La3+の効果トランスポーター研究会第一回関東部会、平成 19 年 12 月 10 日、東京工業大学（横浜市）トランスポーター研究会第一回関東部会要旨集 Y. TAMURA, K. KUBO, M. SHINTANI, M. TASAKI, Y. SHIBUKAWA, and T. ICHINOHE Oral Structure Representation in Human Somatosensory Cortex The 55th Annual Meeting of Japanese Association of Dental Research, November 17-18th 2007, Yokohama, Japan. 澁川義幸、福島美和子、橋本貞充唾液腺腺房細胞における AQP チャネルの電気生理学的検討第284回東京歯科大学学会（例会）、平成19年10月20日、千葉市歯科学報, in Press 新谷益郎、澁川義幸、一戸達也、奥田克爾、下野正基、石川達也東京歯科大学における脳科学研究のあゆみ（1999-2007）第284回東京歯科大学学会（例会）、平成19年10月20日、千葉市歯科学報, in Press.

(11) 様式Ｃ−１８. 松浦信幸、富岡俊也、田村洋平、澁川義幸、新谷益郎、一戸達也先天性無痛無汗症における感覚認識機構の解明? 脳磁図を用いた検討− 第284回東京歯科大学学会（例会）、平成19年10月20日、千葉市歯科学報, in Press 田村洋平、久保浩太郎、新谷益郎、田崎雅和、澁川義幸、一戸達也口腔粘膜からの体性感覚誘発脳磁場応答第284回東京歯科大学学会（例会）、平成19年10月20日、千葉市歯科学報, in Press 澁川義幸、石川達也、新谷益朗、田崎雅和、下野正基、熊井敏文、中村嘉男顎関節症患者における大脳皮質機能障害：脳磁場応答解析第 49 回歯科基礎医学会総会、平成 19 年 8 月 29-31 日、札幌 Journal od Oral Biosciences 49 (Supple): 106, 2007 Matsuura M, Tomioka T, Tamura Y, Shibukawa Y, Shintani M, Shimono M, Ichinohe T. Sensory recognition mechanisms in the congential insensitivity to pain and anhidrosis patient: a magnetoencephalography study. First Conference of International Society for the Advancement of Clinical Magnetoencephalography, August 27-30, 2007, Matsushima. Programs and Abstarcts of ISCAM, pp. 56 Shibukawa Y, Ishikawa T, Kato Y, Zhang ZK, Jiang T, Shintani M, Shimono M, Kumai T, Suzuki T, Kato M and Nakamura Y. Cerebral Cortical Dysfunction visuomotor integration mechanisms in Patients with Temporomandibular Disorders in Association with Jaw Movement Observation First Conference of International Society for the Advancement of Clinical Magnetoencephalography, August 27-30, 2007, Matsushima. Programs and Abstarcts of ISCAM, pp. 57.

(12) 様式Ｃ−１８. Tamura Y, Kubo K, Shintani M, Tazaki M, Shibukawa Y, Ichinohe T. Somatosensory evoked magnetic fields (SEFs) from buccal and tongue mucosa using piezo-driven tactile stimulation device: a magnetoencephalography study. First Conference of International Society for the Advancement of Clinical Magnetoencephalography, August 27-30, 2007, Matsushima. Programs and Abstarcts of ISCAM, pp. 72 澁川義幸，上田彩香, 奥村礼二郎，村松敬，松田敏夫,馬場明道, 田崎雅和，中川寛一,下野正基，鈴木恵子，Paul PM Schnetkamp, 百瀬弥寿徳歯牙硬組織（エナメル質・象牙質）形成にかかわる方向性Ca2+輸送とNa+ / Ca2+交換の連関第二回トランスポーター研究会、平成 19 年 6 月 9-10 日、昭和大学、東京都 Shibukawa Y, Okumura R, Yamamoto T, Muramatsu T, Matsuda T, Baba A, Nakagawa K-I, Shimono M, Suzuki K, Schnetkamp PPM. Directional Ca2+ transport via sodium/calcium exchangers, NCX3, in rat odontoblasts during dentinogenesis. 84th Annual Meeting for The Physiological Society of Japan, Osaka, Japan, March 20-22, 2007. J Physiol Sci (suppl) 57, S76. Okumura R, Suzuki K, Muramatsu T, Nakagawa K-I, Shimono M, Schnetkamp PPM, Shibukawa Y. Ca2+ transporting/signaling mechanisms mediated by sodium/calcium exchangers in rat ameloblasts. 84th Annual Meeting for The Physiological Society of Japan, Osaka, Japan, March 20-22, 2007. J Physiol Sci (suppl) 57, S134..

(13) 様式Ｃ−１８. 田村洋平、久保浩太郎、新谷益郎、田崎雅和、澁川義幸、一戸達也ピエゾ駆動触圧覚刺激装置を用いた頬・舌粘膜からの体性感覚誘発脳磁場応答第 9 回日本ヒト脳機能マッピング学会大会,p. 36 平成 19 年 3 月 16−17 日、秋田市奥村礼二郎，村松敬，鈴木恵子，中川寛一，下野正基， Paul P. M. Schnetkamp，澁川義幸エナメル芽細胞の直接的な Ca2+輸送は NCX1･3 によって仲介される第一回トランスポーター研究会、P. 41 平成 18 年 12 月 16-17 日、共立薬科大学、東京都奥村礼二郎，村松敬，松田敏夫, 馬場明道, 中川寛一, 下野正基，鈴木恵子，Paul PM Schnetkamp，澁川義幸 NCX3 による象牙質石灰化過程における象牙芽細胞の方向性 Ca2+ 輸送第一回トランスポーター研究会、P. 40 平成 18 年 12 月 16-17 日、共立薬科大学、東京都澁川義幸、Haider F. Altimimi, Robert T. Szerencsei, Paul P. M. Schnetkamp NCKX2 の Asn572 残基は Na+-binding と干渉せずに Ca2+ と K+-binding pocket を構成する第一回トランスポーター研究会、P. 58 平成 18 年 12 月 16-17 日、共立薬科大学、東京都.

(14) 様式Ｃ−１８. 田村洋平、久保浩太郎、須賀典男、新谷益郎、一戸達也、澁川義幸ピエゾ駆動触圧覚刺激装置を用いた頬・舌粘膜からの体性感覚誘発脳磁場応答第 23 回日本脳電磁図トポグラフィー研究会、第 5 回釧路ニューロサイエンスワークショップ合同会議、平成 18 年 6 月 23-24 日、釧路プリンスホテル、釧路市第 23 回日本脳電磁図トポグラフィー研究会、第 5 回釧路ニューロサイエンスワークショップ合同会議抄録 p. 40 奥村礼二郎、嶋香織、村松敬、中川寛一、下野正基、鈴木隆、鈴木恵子、Henry Magloire, Paul PM Schnetkamp, 澁川義幸エナメル芽細胞の Ca2+輸送は Na+/Ca2+ exchanger (NCX) によって制御されるか？第281回東京歯科大学学会（例会）、平成18年6月3日、千葉市歯科学報 106： 49、2006 Okumura, R., Shima, K., Muramatsu, T., Nakagawa, K-I., Shimono, M., Suzuki, T., Suzuki, K., Magloire, H., Schnetkamp, P.P.M., Shibukawa, Y. Ca2+ transporting/signaling mechanisms mediated by sodium/calcium exchangers in rat ameloblasts. 84th General Session of the International Association for Dental Research, June 28 - July 1, 2006, Brisbane, Australia. Journal of Dental Research 85B on CD-ROM: 0824, 2006. Kato, Y., Kato, M., Shibukawa, Y., Shintani, M., Takahata, K., Maeda, T., Kashima, H. Right Parietal Lobe Dysfunction of Evoked Human Mirror Neuron System in Schizophrenia Patients. 12th Annual Meeting of the Organization for Human Brain Mapping, Florence, Italy, June 11-15, 2006 NeuroImage Special Issue 31(2006) S144: 646 W-PM.

(15) 様式Ｃ−１８. （3）図書 Schnetkamp, P.P.M., Shibukawa, Y., Altimimi, H.F., Kinjo, T.G., Pratikhya, P., Kang, K.J. and Szerencsei, R.T. The retinal rod NCKX1 and cone/ganglion cell NCKX2 Na+/Ca2+-K+ exchangers In: Ocular Transporters in Ophthalmic Diseases and Drug Delivery Edited by: J.F. Rizzo, J. Tombran-Tink, and C.J. Barnstable Humana Press Inc., Totowa, NJ, in Press. 研究成果による産業財産権の出願・取得状況なし.

(16) 様式Ｃ−１８. ＜研究成果＞目的象牙質表面に加えられた温度的・化学的刺激あるいは触・侵害刺激が、象牙質を介して、どのように受容されるかに関しては、自由神経終末説・動水力学説・知覚受容複合体説・象牙芽細胞受容体説などの考え方が存在するが（図 A）、現在のところ完全に理解されていない。すなわち、歯髄痛覚「歯痛」を裏付ける象牙質・歯髄感覚の発現機序は、未だに不明である。図 A：象牙質・歯髄の感覚受容機序の仮説 a: 自由神経終末説：象牙質内に神経終末が存在する。 b: 動水力学説：歯髄内に感覚受容器が存在し、象牙細管内液の動きによって刺激が受容される。 c: 知覚受容複合体説：象牙芽細胞突起の変形が、直接接触している神経終末を興奮させる。 d: 象牙芽細胞受容体説：象牙芽細胞が感覚受容体である。. 現在、象牙質/歯髄の感覚受容機構として動水力学説が最も有力である。しかし、近年、Lambrichts ら（J Dent Res 82B: p250, 2003）は、象牙芽細胞突起と歯髄内ニューロンの間にシナプス様構造が見られ、象牙芽細胞に神経伝達物質を含むシナプス小胞が見られる事を報告している。また象牙芽細胞膜における機械刺激受容機構として、機械感受性 Ca2+依存性 K+チャネル（Allard et al., J Biol Chem, 275: 25556-25561, 2000）、伸展活性化 Ca2+流入チャネル（Shibukawa and Suzuki, Bulletin of Tokyo Dental College 38: 177-185, 1997）、TREK-1 K+チャネル (Magloire et al., J Dent Res 82: 542-545, 2003)の発現が報告されている。さらに、象牙芽細胞と三叉神経節細胞の初代共培養系では、象牙芽細胞と神経軸索末端の接触が報告されている (Maurin et al., Matrix Biol 23: 277-285, 2004)。これらの事実を元に、象牙質・歯髄の感覚受容機序における象牙芽細胞の役割が、再び.

(17) 様式Ｃ−１８. 着目されている。そこで、本研究では、象牙質/歯髄の感覚受容機序における象牙芽細胞の役割を明らかにする事を全体構想として、 1) 象牙芽細胞における TRP（transient receptor potential）チャネルファミリーの同定、 2) 象牙芽細胞は、興奮性細胞膜を有するか？ 3) 象牙芽細胞刺激によって生じる三叉神経節細胞からの電位記録の 3 点に焦点を当て、象牙芽細胞が感覚受容細胞であるか否かを明らかにすることを目的とした。. 1) 象牙芽細胞における TRP（transient receptor potential）チャネルファミリーの同定 TRP チャネルは、主に Ca2+の透過性を有するイオンチャネルファミリーである。これらは、TRP-C、TRP-V、TRP-M、TRP-P、TRP-ML、TRP- A、TRP-N の各ファミリーに分類される（TRP channels: An overview, Pedersen et al., Cell Calcium 38: 233-252, 2005）。これらの TRP チャネルは様々な感覚受容チャネルとしても働く事が知られている。TRP-V チャネルは侵害刺激（化学・熱・機械刺激）を受容するチャネルであり、TRP-M チャネルの一つである TRP-M8 チャネルは、冷却刺激を受容する。また、TRP-P2 チャネルは機械感受性を制御する primary cilia に集積する。最近象牙芽細胞に、 primary cilia の発現が報告 (Odontoblast primary cilia: facts and hypotheses, Magloire et al., Cell Biol Int 28: 93-99, 2004) されている。また本研究代表者は、TRP-C チャネルファミリーに属する Store-Operated Ca2+ channels の象牙芽細胞における発現を報告しており (Shibukawa and Suzuki, J Bone Miner Res 18: 30-38, 2003）、本細胞が侵害刺激に応答する TRP チャネルファミリーを発現する可能性は高い。そこで象牙芽細胞が、化学・熱・冷却・機械などの侵害刺激を受容する感覚受容細胞であるか決定付けるために、TRP-V チャネル・TRP-M8 チャネル・TRP-P2 チャネルの発現の有無を検討した。.

(18) 様式Ｃ−１８. 2) 象牙芽細胞は、興奮性細胞膜を有するか？: 電位依存性 K+チャネルおよび Na+-Ca2+ exchanger（NCX）の電気生理学的・生体物理学的特性象牙芽細胞が感覚受容機序に関連するならば、本細胞が興奮性細胞膜を有する必要性がある。多くの研究報告は、象牙芽細胞の静止膜電位が約-30 mV 付近にあると報告しており（例えば、Ionic currents in odontoblasts and dental pulp cells. Shibukawa and Suzuki, In: Neurobiology of Mastication: From Molecular to Systems Approach. Elsevier Science B.V., Amsterdam, pp. 165-168.）(Potassium and chloride channels in freshly isolated rat odontoblasts, Guo and Davidson, J Dent Res 77: 341-350, 1998)、一般的な興奮性細胞における K+平衡電位と一致する静止電位と離れている事が指摘されている。そこで、象牙芽細胞から電位依存性 K+ チャネル電流を記録し、電気生理学的・生体物理学的特性の詳細を検討した。加えて、 -30 mV 付近の象牙芽細胞の静止膜電位の脱分極シフトと関連すると考えられる、細胞膜 Na+-Ca2+ exchanger 発現ならびに、その電気生理学的・生体物理学的特性を検討した。.

(19) 様式Ｃ−１８. 方法新生仔 Wistar 系ラットから下顎骨を摘出し、厚さ 400 µm の歯髄スライス標本を得る（DTK-100，Dosaka EM）。得られた標本は、酵素処理を行った後、カバーガラス上のチャンバーに固定し光学顕微鏡（Zeiss, Axiovert）を用いて、単一象牙芽細胞を同定する。これより、象牙芽細胞から、A)細胞膜イオン電流記録、B) 細胞内 Ca2+濃度計測、C) 免疫組織化学染色を行なう。. A）イオン電流記録（研究代表者：渋川）チャージキャリアとしてのイオンは、細胞膜上に存在するイオンチャネルを通して流入あるいは流出する。このチャージキャリアの動きはイオン電流として記録される。このイオン電流をパッチクランプ法にて細胞膜を電位固定し記録する。約 3-10MΩのガラス管電極を作成し、3 次元水圧マニピュレータ（MHW-3, Narishige：本申請により購入）を用いて、単離された単一象牙芽細胞にガラス管電極（パッチ電極）を密着させる。パッチ電極と細胞間でギガオーム単位の高抵抗シールを形成し、イオン電流を記録する。イオン電流は、パッチクランプ増幅器を用いて増幅した後、アナログ‐デジタル変換 (DigiData 1440A, Axon 社：本申請により購入)し、オンライン･コンピューター上のデータ取得ソフトウエアー(PCLAMP10, Axon 社：本申請にて既設 PCLAMP8 からのバージョンアップ)を用いてモニター、記録、解析を行う。. B）細胞内 Ca2+濃度計測（研究代表者：渋川）イオンチャネルから流入した Ca2+は、細胞内にトラップされた Ca2+結合色素（Fura-2）と結合し、蛍光を発する。この蛍光強度を指標に、細胞内 Ca2+濃度を計測し、細胞内 Ca2+動態を記録する。歯髄スライス標本にあらかじめ Ca2+指示薬である Fura-2/AM を導入する。Fura-2 を導入された歯髄スライス標本を固定したチャンバーは、正立型蛍光顕微鏡 (Zeiss，Attofluor システム)、もしくは倒立型顕微鏡（Olympus, Hamamatsu Photonics, Aquacosmos システム）に置き、二波長測定（380, 340 nm）による蛍光強度比を CCD カメラで取得したイメージ.

(20) 様式Ｃ−１８. より算出し細胞内遊離 Ca2+濃度測定を行なう。また、A)、B)共に、過去の科学研究費（第 13771103 号）にて購入した多チャンネル薬物刺激装置（Valve Bank、オートメイト社）を用いて、チャネル遮断薬・活性薬を細胞外から投与し、同時に薬理学的特性を検索する。 C) 免疫組織化学染色（研究代表者：渋川、分担者：村松・下野）歯髄スライス標本を、24 時間初代培養する事で、スライス外側縁に存在する象牙芽細胞は、その細胞体を伸張させる。ここに、TRP チャネルファミリー、 K+ チャネルファミリーの一次抗体を作用させ、FITC 標識を行い蛍光顕微鏡（Zeiss, Axiovision）にて観察を行なう。 D) Single-cell RT-PCR（研究代表者：渋川、分担者：村松）：24 時間初代培養を行なった歯髄スライス標本からパッチピペットを用いて細胞質を吸引する。この吸引された細胞質から mRNA を調整し、RT-PCR を行なう。また、得られた歯髄スライス標本から、レーザーマイクロダイセクション法によって、象牙芽細胞のみを分離し、同様に RT-PCR を行なう。. 1) 象牙芽細胞における TRP（transient receptor potential）チャネルファミリーの同定象牙芽細胞に TRP チャネルの特異的活性薬あるいは温度・機械刺激を与えることで TRP チャネルファミリーを活性化させ、細胞内遊離 Ca2+濃度イメージングおよびパッチクランプ法（DigiData 1440A および PCLAMP10 を含む記録システム：本申請にて購入）にて、その細胞内への Ca2+流入あるいは TRP チャネル電流を記録する。また選択的阻害薬のこれらに対する効果を検討する。渋川と分担者の村松・下野は、TRP チャネルファミリーの象牙芽細胞における局在を明らかにするために、免疫組織学的検索を行ない、どのような TRP サブタイプが存在するか組織学的に検討する。.

(21) 様式Ｃ−１８. 2) 象牙芽細胞は、興奮性細胞膜を有するか？: 電位依存性 K+チャネルおよび Na+-Ca2+ exchanger（NCX）の電気生理学的・生体物理学的特性同様に、象牙芽細胞にパッチクランプ法を行い電位依存性 K+電流を電位固定下にて記録する（DigiData 1440A および PCLAMP10 を含む記録システム：本申請にて購入）。購入した PCLAMP10 を用いて、K+チャネル電流の活性化・不活性化速度、定常状態における不活性化様式を解析する。加えて、象牙芽細胞に細胞内遊離 Ca2+濃度イメージングおよびパッチクランプ法（DigiData 1440A および PCLAMP10 を含む記録システム：本申請にて購入）を行い、細胞膜 Na+-Ca2+ exchanger 活性を記録する。細胞膜 Na+-Ca2+ exchanger は二方向性の起電性交換体である。細胞内遊離 Ca2+濃度イメージングにおいては細胞外溶液を Na+を主とする溶液から Li+を主とする溶液に、モル濃度・浸透圧を変えることなく置換することで、細胞内から外への Na+の一過性 gradient を作り出し、Na+の外向き流出に伴う Ca2+の細胞内への流入（ Ca 流入モード交換； reverse 交換）を引き起こし、そのイオン選択制ならびに薬理学的特性を検討する。パッチクランプ法においては、細胞外溶液を Li+を主とする溶液から Na+を主とする溶液に、モル濃度・浸透圧を変えることなく置換することで、細胞外から内への Na+の一過性 gradient を作り出し、Na+の内向き流入に伴う Ca2+の細胞外への排出（流出）（Ca 流出モード交換；forward 交換）を引き起こし、そのイオン選択制を検討する。.

(22) 様式Ｃ−１８. 結果、成果および考察 1) 象牙芽細胞における TRP（transient receptor potential）チャネルファミリーの同定. a) 象牙芽細胞における侵害・熱刺激感受性 TRP（TRPV1）チャネル発現免疫組織化学染色によって、象牙質と接する部位である象牙芽細胞の細胞突起部に TRPV1 の免疫応答が見られた（Okumura et al., Arch. Histol. Cytol. 68: 251-257; 2005）。初代培養を行ったラット歯髄スライス標本の象牙芽細胞から mRNA を抽出し、RT-PCR を行った（国外との共同研究：Yonsei Univ）ところ、象牙芽細胞に TRPV subfamily 1, 2, 3 発現が見られた（unpublished）。パッチクランプ法にて、ラット象牙芽細胞からキャプサイシン（10 µM；TRPV1 アゴニスト）で活性化される内向き電流が記録された。このキャプサイシン-誘発性内向き電流は、キャプサゼピン（10 µM）によって抑制された（Okumura et al., Arch. Histol. Cytol. 68: 251-257; 2005）。しかしながら、キャプサイシン-誘発性内向き電流の振幅は極めて小さかった（∼10 pA）。そこで、細胞内遊離 Ca2+濃度イメージングを行った。象牙芽細胞に、内因性 TRPV1 活性薬アナンダマイドを細胞外投与すると、1-2 分の遅延時間を持って細胞内 Ca2+濃度の増加がみられた。この増加は、細胞外無 Ca2+外液下では誘発されず、また、TRPV1 抑制薬のキャプサゼピンで抑制された。これらの事は、アナンダマイドが細胞外からのキャプサゼピンで抑制される Ca2+流入（すなわち TRPV1 による Ca2+流入）を誘発することを示していた。しかしながら、細胞外から高濃度のキャプサイシン（100 µM）を投与しても細胞内 Ca2+濃度の増加は見られなかった。以上の結果（アナンダマイドによって活性化される TRPV1 による Ca2+流入が見られるにも関らず、高濃度キャプサイシンで細胞内 Ca2+濃度の増加がみられず、またキャプサイシン細胞外投与による TRPV1 電流振幅がきわめて小さい）ならびに、アナンダマイドによる細胞内 Ca2+濃度の増加の遅延は、細胞膜 TRPV1 の活性過程に依存した TRPV1 のリガンド結合部位が細胞.

(23) 様式Ｃ−１８. 内ドメインにあることを示唆している。そこで、パッチクランプ法による細胞内環流法を行った。パッチ電極内に、キャプサイシン（10 µM）を充填した直径 0.1 mm のチューブを挿入した。このチューブには 1 ml のシリンジを接続してある。Conventional patch-clamp 法を行い、パッチ電極と細胞膜の高抵抗シールが確立された後に、界面の細胞膜を陰圧で破り（rapture）、保持電位-60 mV で連続的に細胞膜電流を記録した。電流記録が安定したところで、キャプサイシンを充填したパッチ電極内チューブに接続するシリンジから陽圧を加えることで、キャプサイシン（10 µM）を細胞内に還流投与した。キャプサイシン細胞内投与により、内向き電流（数 500 pA）が記録された。以上の事から、象牙芽細胞には、 TRPV1 チャネルが発現しており、そのリガンド結合部位が細胞内に存在することが明らかとなった。したがって象牙芽細胞が機能的な TRPV1 を発現することで象牙芽細胞機能を維持し、また、象牙質・歯髄感覚が象牙質に加えられた熱刺激・機械刺激を TRPV1 が受容することで生じる可能性が示唆された（in Preparation）。. b) 象牙芽細胞における冷刺激感受性 TRP（TRPM8）チャネル発現細胞内遊離 Ca2+濃度イメージングによって、ラット象牙芽細胞にメントール（TRPM8 アゴニスト）を投与すると、細胞内 Ca2+濃度が増加した。加えて、象牙芽細胞の特異的マーカーである dentin matrix protein -1 および dentin sialophosphoprotein に陽性反応を示した単離象牙芽細胞は、TRPM8 免疫組織化学染色に陽性を示した。しかしながら、メントール（TRPM8 アゴニスト）による細胞内 Ca2+濃度増加はきわめて緩徐な立ち上がりを示し、投与の中止によってもきわめて緩徐に静止状態に戻る特性を示した（in Preparation）。. c) 象牙芽細胞における TRPV1 および TRPM8 発現：考察および展望以上の結果は、象牙質/歯髄に加えられた熱・冷刺激が、象牙芽細胞に発現する TRPV1・TRPM8 チャネルによって受容されることを示している。従って、象牙芽細胞が感覚受容細胞としての細胞機能を有することが示唆された。.

(24) 様式Ｃ−１８. しかしながら、メントール（TRPM8 アゴニスト）による緩徐な細胞内 Ca2+ 濃度増加応答は、TRPV1 と同様に、活性過程あるいはリガンド結合部位に依存すると示唆している。今後、メントールによるパッチクランプ法を用いた細胞内環流法を行いこれを明らかにする。また、TRPV1・M8 発現ともに、さらに詳細な薬理学的検討を加えて、近日中に論文投稿を行う予定である。.

(25) 様式Ｃ−１８. 2) 象牙芽細胞は、興奮性細胞膜を有するか？: 電位依存性 K+チャネルおよび Na+-Ca2+ exchanger（NCX）の電気生理学的・生体物理学的特性. a) 象牙芽細胞における電位依存性 K+チャネル発現象牙芽細胞の時間-電位依存性 K+チャネルは、ピーク振幅に至る活性化時間が約 30 ms で、不活性化過程における時定数は約 400 ms（いずれも膜電位+50 mV）を示し、緩徐活性化・不活性化を示すことが明らかとなった。これらの事から、象牙質・歯髄に加えられた熱・冷刺激が、象牙芽細胞に発現する TRPV1 チャネルによって受容され、膜電位変動との機能協関を伴い、また細胞内 Ca2+ を Na+-Ca2+ exchanger（NCX）subtype 3（以下記述）によって排出することで、感覚受容ならびに、刺激に伴う象牙質形成を行っていることが示された（in Preparation）。. b) 象牙芽細胞における Na+-Ca2+ exchanger（NCX）発現免疫組織化学染色において、NCX 陽性反応が、象牙芽細胞の細胞突起部ならびに象牙質形成部位に見られた。細胞膜 Na+-Ca2+ exchanger は二方向性の起電性交換体である。細胞内遊離 Ca2+濃度イメージングを用いて、細胞外溶液を Na+ を主とする溶液から Li+ を主とする溶液に置換すると Ca 流入モード交換（Reverse 交換）が誘発された。リバース交換による Ca2+流入は細胞外 Ca2+濃度に依存し（Kd = 0.23 mM）、KB-R7943 により抑制された（IC 50 = 2.4 µM）が、 SEA0400 によって抑制されなかった。パッチクランプ法を用いて、細胞外溶液を Li+を主とする溶液から Na+を主とする溶液に置換すると Na+の内向き流入と Ca2+の細胞外への排出（流出）を伴う Ca 流出モード交換電流（Forward 交換）が記録された。フォワード交換電流は細胞外 Na+濃度に依存した（Kd = 43.7 mM）。これらの結果は、象牙芽細胞が NCX subtype 3（NCX3）を発現していることを示している。従って、NCX3 が細胞内 Ca2+動員/信号による細胞内 Ca2+を排出することで象牙質石灰化を駆動することが示唆され、また、NCX が、細胞膜静止電位の脱分極シフトを構成するかもしれない（投稿中）。.

(26) 様式Ｃ−１８. c) 象牙芽細胞における電位依存性 K+チャネルおよび Na+-Ca2+ exchanger （NCX）発現：考察および展望象牙芽細胞の時間-電位依存性 K+チャネル特性に関して、さらに詳細な検討が必要である。.

(27) 様式Ｃ−１８. 3) 象牙芽細胞刺激によって生じる三叉神経節細胞からの電位記録：象牙芽細胞と三叉神経節細胞の共培養系解析象牙芽細胞と三叉神経節細胞の初代共培養系において、神経の可塑性や神経間接触に重要な細胞外基質糖蛋白質である reelin を介する象牙芽細胞と神経細胞軸索末端の接触が報告されている (Expression and localization of reelin in human odontoblasts, Maurin et al., Matrix Biol 23: 277-285, 2004)。そこで、同様の共培養系において、象牙芽細胞に電位（電流）刺激・機械刺激、侵害刺激を与え、三叉神経節細胞から、両細胞の神経接触に伴う誘発電位が記録されるか否か検討する予定であったが、残念ながら、TRPV1・M8 チャネル、電位依存性 K+チャネルおよび Na+-Ca2+ exchanger（NCX）の発現解析にとどまった。今後、継続して、本課題を行う予定である。現在、すでにラット三叉神経節の初代培養を行っているところである。近く、象牙芽細胞と三叉神経節細胞の共培養系を確立したい。.

(28) 様式Ｃ−１８. 4) 象牙芽細胞感覚受容機構の解明：展望象牙芽細胞には、TRPV1 チャネル・TRPM8 チャネルが発現していた。これらの事は、象牙質・歯髄に加えられた熱・冷刺激が、象牙芽細胞の細胞膜に発現する TRPV1・M8 チャネルによって受容されることを示している。加えて、これら TRP チャネルの活性化は、細胞内への Ca2+流入を引き起こす結果、脱分極を引き起こす。この膜電位変動は、電位依存性 K+チャネルあるいは電位依存性 Na+チャネル（Allard et al., J Biol Chem, 2006）を活性化し、象牙芽細胞に活動電位生成を起こすかもしれない。また TRP チャネルから流入した細胞内 Ca2+は Na+-Ca2+ exchanger（NCX）subtype 3 によって排出される。従って、象牙質・歯髄局所への熱・冷刺激は、TRPV1 チャネル・TRPM8 チャネルによって受容され、電位依存性 K+チャネルと電位依存性 Na+チャネルによる活動電位生成を伴い、神経伝達物質により歯髄内ニューロンへ伝達され、結果として象牙質・歯髄感覚が生成されるかもしれない。加えて、刺激局所では、感覚受容機構に伴って流入してきた細胞内 Ca2+を排出することで、防御機転としての第 3 象牙質形成を行っていることが示される。今後、象牙芽細胞と三叉神経節細胞の初代共培養系において、象牙芽細胞に電位（電流）刺激・機械刺激、侵害刺激を与え、三叉神経節細胞から、両細胞の神経接触に伴う誘発電位が記録されるか否か検討する予定である。.

(29) 様式Ｃ−１８. 5) 象牙芽細胞感覚受容機構の解明：その他の成果象牙芽細胞感覚受容機構の検討に加えて、きわめて関連するいくつかの補足的研究成果を得ている。簡単に報告する。. a) 象牙質・歯髄感覚受容機構と大脳皮質投射部位の検討ヒト大脳皮質一次体性感覚野における歯髄感覚再現領域を、体性感覚誘発脳磁場応答記録によって検討した。右側上顎第一小臼歯に痛みを伴わない電気刺激を行ったところ、短潜時（27 ms）の皮質磁場応答が記録された。この磁場応答を構成する電流双極子は、一次体性感覚野の手指領域の前下方に局在した。これらの成果は、ヒト大脳皮質一次体性感覚野における歯髄感覚再現領域を始めて明らかにしたものである。. b) 象牙質・歯髄感覚に誘発される開口反射を指標にした歯科用局所麻酔薬の骨内投与における添加薬の検討リドカインの骨内投与における10%デキストランとエピネフリン添加の効果を比較した。歯髄電気刺激に伴う開口反射（顎二腹筋からの筋電図記録）に対する歯髄への局所麻酔（骨内麻酔）の影響を検討した。局所麻酔薬は、2%リドカイン単味（L）、1:80000エピネフリン添加2%リドカイン(LE8), 1: 160 000エピネフリン添加2%リドカイン(LE16)、10%デキストラン添加2%リドカイン（LD）であった。局所麻酔薬の奏功時間に対して、4者の局所麻酔薬間で差はなかった。しかし奏功持続時間は、LE8 ＞ LE16 ＞ LD ＞ Lの順で長かった。10%デキストランは、2%リドカインの局所麻酔作用を増強し、それは1: 160 000エピネフリン添加2%リドカインの作用と等しかった。.

(30) 様式Ｃ−１８. c) K+依存性Na+-Ca2+ exchanger（NCKX）の構造機能ヒトに発現するK+依存性Na+-Ca2+ exchanger（NCKX）subtype 2 (NCKX2)の La3+依存性、Mg2+依存性に関して検討を行った。. d) 口腔領域疼痛・幻覚に関する研究口腔領域の慢性疼痛に顎関節症がある。顎関節症は国民の6%が罹患している。本疾患のヒト大脳皮質における機能障害を明らかとするために、他者の顎運動を観察しているときの皮質応答を健康被験者・顎関節症患者間で比較した。健康被験者では顎運動行為観察によって、左脳半球優位性を示す連続的な皮質活動が記録された：1）ヒトMT/V5領域、2）下頭頂葉皮質（IPC）、3）中心前回外側部領域（PrCG）。しかしながら、顎関節症患者では健康被験者と比べ、 MT/V5領域活動に差は無いもののPrCGとIPCの脳磁場応答が消失あるいは著しく減弱していた。このことは、顎運動行為（開口運動）観察に関連した大脳皮質機能が、口腔領域疼痛と深く関連することを示している。加えて、口腔内幻覚を有する患者では、痛覚中枢である二次体性感覚野の機能障害が、同側一次体性感覚野によって保障されることで、幻覚症状を起こすことが示唆された。. e) 心筋−線維芽細胞間電気緊張的相互作用および、心房筋に対するチオペンタールの効果について.

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