ニホンウナギの種苗生産技術および育種技術の開発に関する研究
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(2) 一44一. 卵質 低 下お よび倍 数性 変 異 を誘 発 す る 主 な要 因 と な って い る こ とが 示唆 され た 。 さ らに 、. 1,51pg/C=1500Mbと. マ イ クロサ テ ライ トマー カ ー を 用 い た 遺伝 解 析 か ら、人 工 ふ化 仔 魚 に 含 まれ る三 倍 体仔 魚. 地 図 の 作 製 に は109個. は 受精 後 の第 二極 体 放 出異 常 に よ っ て 発 生 した と考 え られ た。 以 上 の 結 果 か ら、 排 卵 後 の. あ る サ イ ズ 選 択DNAラ. 卵 の過 熟化 に伴 い正 常 な減 数 分 裂 ステ ー ジ に ある 卵 の割 合 が減 り、 受 精 後 の第 二極 体 放 出. ー ン は50ク. な った 。 推 定 され た ゲ ノ ムサ イ ズか ら、 ゲ ノ ム全 体 を カバ ー す る連 鎖. ロ ー ン(1. 以 上 の マ ー カ ー 数 を マ ッ プ す る こ と が 必 要 と 考 え られ た 。 従 来 法 で イ ブ ラ リー か ら の 単 離 で は 、4300ク .16%)だ. が 阻害 され る こ とに よっ て 三倍 体 が 出 現す る こ とが 倍 数性 変 異 現象 の 主 な 要因 で あ る こ と. イ ブ ラ リ ー か らの 単 離 で は 、1404ク. が 明 らか となっ た。. 25倍. ロ ー ン の う ち の420ク. ロ ー ン が 陽 性 と な り(29.91%)、. 域 を 挟 み 込 む266セ. ソ トのPCR用. ッ トを 設 計 し た 。 開 発 し た こ れ ら の プ ラ イ マ ー セ ッ トの う ち 、164セ. 最 終成 熟誘 起 ス テ ロ イ ドホル モ ン投 与が 卵 質 に及 ぼす 影響 に つい て. 近年 開 発 され た ウナ ギ 人 為催 熟技 術 に よ り、比 較 的 安 定的 に 成 熟 配偶 子 を 得 る こ とが. 域 を持 っ ク ロ. 域 を 濃 縮 し たDNAラ. 以 上 効 率 的 な 単 離 が 可 能 だ っ た 。 こ れ ら の 手 法 に よ り 得 られ た 合 計470の. ン の 挿 入 領 域 の 塩 基 配 列 を 決 定 し 、MS領. 第2節. ロ ー ン 中MS領. っ た が 、 磁 気 ビー ズ を 用 い てMS領. PCR増. 陽 性 ク ロー プ ライ マー セ. ッ トに お い て 良 好 な. 幅 が認 め られ た。. 可能 に な った。 しか し、 この 方 法 に よ り得 られ る卵 の質 は雌 親 魚 ご とに 大 き くば らっ き安 定 しな い こ とが問 題 と な って い る 。 本研 究で は 、 現在 ウナ ギ の最 終 成 熟 の誘 起 に 用 い て い. 駆 体で あ る17α 一hydroxy・progesterone(17α 一 〇HP)の. 種 の効 果 を飛 躍 的 に 高 め る こ とに役 立 つ こ とが 期 待 され る 一 ニ ホ ン ウナ ギに お い て染 色 体. か ら9. 与濃 度 を 変 え て最 終 成 熟誘 起 を行 う と、排 卵 まで の 時 間や 排 卵 され る 卵. DHP投. 与濃 度(0.67mg/kgBW)に. 与 濃度(】8mg/kgBW)に. お い て は顕 著 な卵 質 の 低 下 がみ られ 、9倍 の. お い て は 卵質 の 向 上 がみ られ た。 また 、DHPの. ル モ ンで あ る17α 一 〇HP投 与 で も、 排卵 率 や 排卵 に 要す る時間 、 卵 質 はDHPと. 前駆 体 ホ 変 わ らず 、. 17α一〇HPを 高 濃 度 で投 与 して も卵質 の向 上 はみ られ な い こ と も明 らか とな っ た。. 第3節. 飼 育水 へ の 高物 質 物 質 添加 が仔 魚 の 生残 に及 ぼす 影 響. ウナ ギ人 工ふ 化 仔魚 の 飼 育 に お い て 、特 に 給餌 飼 育 初 期 に しば しば 大 量艶 死 が 起 こ り、 安 定 した飼 育 が困 難 とな って い る。 そ こ で、 給餌 飼 育 初 期 の大 量 驚 死 を防 ぐ こ とを 目的 と して、飼 育 水 への 高 分 子物 質 添 加 が 仔魚 の成 長や 生残 に 与 え る影 響 を調 べた 。 ウナ ギ 仔魚 の飼 育 水 に、 水溶 性 多糖 類(10mg1L)、. 大 豆 タ ンパ ク質(10mg/L)、. 卵 白(80μ1/L)な. どの. 高 分子 物質 を加 えて 生残 率 を比 較 した とこ ろ、 無 添加 の 対 照 区 に比 べ 、 卵 白添 加 区 で 顕 著 に 生残 率 が向 上 した 。そ こで 、卵 白の 添 加 濃度 に っ い て検 討 した と こ ろ、飼 育 水 に3.7・11ド1/L の 範囲 で 卵 白を添 加 す る と 、仔 魚 の 成 長 を阻 害 せ ず に生 残 率 を 向上 させ る こ と が明 らか と な っ た。 また 、 死亡 した仔 魚 の形 態 観 察 か ら、 卵 白添加 は 主 に 夜間 に起 こる仔 魚 の浮 上 艶 死 を防 ぐこ とが 明 らか とな っ た。 さ らに 、 卵 白の 添 加 は海 水 の 表 面張 力 を低 下 させ 、そ れ に よ り仔 魚 の浮 上蛯 死 が 防 除 され る と考 え られ た 。 本成 果 に よ り、 ウナ ギ仔魚 飼 育 にお け る初期 の 大 量驚 死 を防 ぐこ とが 可能 に な り、安 定 した 飼 育が 可 能 とな った。. 第2章. ニ ホ ン ウナ ギ にお け る 育種 技 術 の 開発. 第1節. マ イ ク ロサテ ライ トDNAマ. 二極 体 放 出 阻 止 条 件 の 検 討). 投 与 が排 卵 まで の 時間 や 排 卵 され る. 数 に は変 化 が起 こ らず 、 得 られ る卵 の 質 に は影 響 が み られ るこ とが明 らか とな っ た。 通 常 の1!3倍 のDHP投. 染 色 体 操 作技 術 の 開発(第. 染 色 体 操 作 技 術 は 、QTL解 析 に好 適 な材 料 家 系 の構 築や そ の 応 用 で あ るマ ー カー 選 抜 育. 卵 の量 、得 られ る卵 や仔 魚 の 質 に 及 ぼ す 影響 を調 査 した 。 そ の結 果 、 通 常 の1/3倍 倍 の範 囲 でDHP投. 第2節. 前. る ステ ロイ ドホル モ ン 、17,20β。dihydroxy-4-pregnen-3・one(DHP)の 投 与 濃 度や 、DHPの. ー カー の 開 発. 効 率的 な 育種 選 抜 に必 要 な 遺伝 連 鎖 地 図 の 作製 には 、 大 量の マ イ ク ロサ テ ラ イ ト(MS) マー カー が 必要 とな る。FCM分 析 に よ りニ ホ ン ウナ ギ のゲ ノ ム サイ ズ を推 定 した と こ ろ、. 操 作 育 種 技 術 を確 立す る こ とを 目的 に 、受 精 卵 の 三 倍 体 化(第2極 高 温 処 理 条 件 を検 討 した。そ の結 果 、通 常 受 精 の10分 す る こ と に よ り、仔 魚 の 三 倍 体 率が 最 高 値(839%)を. 体放 出阻 止)に 好 適 な. 後 に 、37℃ の海 水 に3分 間 浸漬 処理 示 す こ とが 明 らか とな っ た。 作 出. した 人為 三 倍 体 仔 魚 は 、FCM分 析 お よび染 色 体 標 本 の 核 型 分 析 か ら3セ を持 つ 正 常 な 三倍 体 で あ る こ とが確 認 され た。. ッ トの 相 同染 色 体.
(3) 論. 文. 審. 査. 結. 果. の. 要. 旨 を 行 い 、従 来 法 に 比 べ25倍. ウナ ギは 東 ア ジア にお け る重 要 養 殖 対 象 種 で あ るが,現 在 の ウナ ギ養 殖 は 不安 定 な 種 苗 供 給 とそれ に伴 う種 苗価 格 の乱 高 下 が 安 定 的 な 養 鰻 経 営 を 困難 に して い る。 こ の よ うな 問題 を根 本的 に 解決 し、安 定 的 で健 全 な ウナ ギ養 殖 事 業 を 存 続 させ る た めに は 、 ウナ ギの 人 工種 苗 生 産技 術 の確 立 、す な わ ち ウ ナ ギ の完 全 養 殖 化 に よ る産業 形 態 の転 換 が 必要 不 可 欠 で あ る。 申請 者 は 、 この ウナ ギ の 人 工種 苗 生産 技 術 の開 発 を 第一 の 目的 と し、 得 られ る 卵 や 仔魚 の 質 を向 上 させ うる人 為 催 熟 技 術 や 人 工授 精 技 術 、仔 魚 の飼 育 技術 の 開 発 ・改 善 に 取 り組 んだ。 また 、本 種 にお け る 将 来 の 育 種 に 必 要 な遺 伝 学 的 基礎 情 報や 育 種 技 術 の 基 盤 を先 行的 に 整 え る ことを 第 二の 目的 と し、 染 色 体 操 作技 術 やDNAマ. ー カ ー の開 発 を 行 う. とと もに 、遺 伝 地図 を 作成 した。 人為 催 熟 由来 の ウナ ギ仔 魚 に は、三倍 体や 二倍 体 一三 倍 体 モ ザイ クな どの 倍 数性 変 異 を示 す個 体 が しば しば 高率 で含 ま れ る が 、 この よ うな 倍 数 性 変 異 の原 因 や 詳 しい 実態 は不 明 で あ っ た。 そ こで,フ. ロー サイ トメ ト リー(FCM)分. 析 に よ り21家 系 の倍 数 性 異 常 にっ いて. 調 査 を行 い,倍 数 性 変異 個体 の 大部 分 は 三倍 体 で あ る こ と,そ れ らが 生存 可 能 で あ る こ と を明 らか に した。 次 に倍 数性 変 異 を誘 発す る 要 因 に つい て 検 討 を加 え,そ の 要 因 と して排 卵 した卵 の過 熟化 によ る第2減 数 分 裂 の 異 常 で あ る こ と を実 験 的 に明 らか に した。さ らに 、 マイ ク ロサテ ラ イ トマー カ ー を用 い た 遺 伝 解 析 か ら、 人 工ふ 化 仔魚 に含 まれ る三倍 体仔 魚 は受 精 後 の第 二極 体 放 出異 常 に よ って 発 生 す る こ とを確 認 した 。 以 上の 結 果か ら、排 卵後 の卵 の 過 熟化 に伴 い正 常な 減 数分 裂 ステ ー ジに あ る 卵 の割 合が 減 り、受 精 後 の第 二 極 体放 出 が阻 害 され る ことに よ っ て三倍 体 が 出 現 す る こ とが倍 数 性 変 異 現 象の 主 な要 因 で あ る こ とを 明 らか に した。 次 に. 現 在 ウナ ギ の最 終 成 熟 の 誘 起 に 用 い て い る ス テ ロイ ドホ ル モ ン. 17,20・-dihydroxy-4-pregnen-3-one(DHP)の 17・-hydroxy-progesterone(17α. 投 与 濃 度 や 、DHPの. 前駆体 で あ る. 一〇HP)の 投 与 が 排 卵 ま で の時 間 や排 卵 され る卵 の 量 、. 得 られ る卵 や 仔魚 の 質 に及 ぼす 影 響 を 調 査 した。そ の 結 果,9倍 のDHP投 与濃 度(18mg/kgBW) にお い て は卵 質 の向 上 がみ られ,ま. た 、DHPの 前 駆 体 ホ ル モ ン で ある17α 一〇HP投 与 で も、. 排 卵 率 や排 卵 に 要す る時 間 、卵質 はDHPと. 変 わ らな い こ と、17ザOHPを. 高 濃 度 で投 与 して. も卵 質 の 向 上は み られ ない こ とを明 らか に した。 次 に給 餌飼 育 初期 に 起 こ る大 量艶 死 の 防 除 を 目的 と して 、飼 育 水へ の 高分 子 物 質添 加 が 仔魚 の成 長や 生 残 率 に及 ぼす 影響 を調 べ,飼 育水 に3.7-11μ1/Lの 範 囲 で卵 白 を添加 す る と、. 以 上効 率 的 な 単 離 が 可能 で あ る こ とを 示 した。 得 られ た 合 計. 470の 陽 性 ク ロー ン の挿 入 領 域 の 塩 基 配 列 を決 定 し、MS領 域 を挟 み 込 む266セ 用 プ ラ イ マー セ ッ トを 設 計 し、 こ の うち164セ. ッ トにお い て 良 好 なPCR増. ッ トのPCR. 幅 を確 認 して い. る。 染 色体 操 作 技 術 は 、QTL解. 析 に好 適 な材 料 家 系 の構 築 や そ の 応 用 で あ るマ ー カー 選 抜 育. 種 の 効果 を飛 躍 的 に 高 め る こ とに役 立 つ こ とが 期待 され る。 そ こで,ニ. ホ ン ウナ ギ に お い. て 染 色体 操 作 育種 技 術 を 確 立す る こ と を 目的 に 、受 精 卵 の 三倍 体 化(第2極. 体 放 出 阻 止). に 好 適 な 高 温処 理 条 件 を 検 討 し、通 常受 精 の10分 後 に 、37℃ の 海 水 に3分 間 浸 漬 処 理 す る こ とに よ り、仔 魚 の三 倍 体 率 が最 高値(83,9%)を 体 は,FCM分. 示 す こ とを 明 らか に した。作 出 した 三倍. 析 お よび 染色 体 標 本 の 核 型 分 析 か ら3セ. ッ トの 相 同 染 色 体 を持 つ 正 常 な 三倍. 体 で あ る こ と を確 認 した 。 次 に,上 述 のMSマ ー カー,お よ び 人為 三 倍 体 作 出 技術 を利 用 す る こ とで 、ウナ ギ の 人 為 三 倍 体 家 系 を用 いた マ ー カ ー一動 原 体 間 の マ ッピ ン グを行 った 。26座 のMSマ. ーカーについ. て 、 二倍 体家 系 を用 い て 遺伝 様 式 を調 べ た と ころ 、 メ ンデ ル の 法 則 に従 った 遺 伝 分 離 が観 察 され た。 三倍 体 家 系 を 用 い て26座 を 調 べ た とこ ろ 、0.008-0.968の. のMSマ. ー カ … に っ いて 動 原 体 との組 換 え率(y値). 範 囲 で 平 均 は0.645で. あ っ た。y値. の分 布 は 一 様 で は な. く、 テ ロ メ ア側 へ の 偏 りが み られ た こ とか ら、 強 い キア ズマ 干 渉 の存 在 が 示 唆 され た。 MSマ ー カー を用 い て 、 ニ ホ ン ウナ ギ に お け る遺 伝 連鎖 地 図 作 製 を試 み 、18連 鎖 群 、109 座 のMSマ. ー カ ー か らな る遺 伝 連 鎖 地 図 を作 製 した 。この連 鎖 地 図 は 、用 い た マ ー カー の ほ. とん どが マ ップ され た こ とか ら、本 種 の 全 ゲ ノ ム領 城 をほ ぼ カバ ー す る もの で あ る と考 え られ た。 以 上 の よ うに、 申請 者 は 完全 養 殖 の 実 現 が 重要 課 題 で あ る ニ ホ ン ウナ ギ を材 料 と して 、 そ の 種 苗 生 産技 術 、 並 び に 育種 技 術 の 開 発 に 資す る多 くの 知 見 を得 て い る。 得 られ た知 見 は,本. 種 の健 全 な種 苗 を 生産 す る た めの 抜 本 的 な技 術 改 良 を導 くと と もに,本. 種 の完 全 養. 殖 実 現 に 先行 して育 種 基盤 の構 築 を行 った もの で あ り,高 い評 価 を 与 え うる 業 績 と考 え ら れ る。 よっ て 本 論 文は 博 士(農. 学)論. 文 と して 価 値 あ る もの と認 め る。. な お 、 審査 に 当た っ て は 、論 文 に関 す る専 攻 内審 査 お よ び公 聴 会 な ど所 定 の 手続 き を経 た 上 、 平成20年2月8日. の農 学 研 究 科 教 授 会 にお い て 、 論文 の価 値 な らび に博 士の 学 位. を授 与 され る学 力が ←分 で あ る と認 め られ た。. 仔 魚 の成 長 を阻 害 せず に 生残 率 を 向上 させ る こ とを 明 らか に した 。 また 、 死亡 した仔 魚 の 形 態 観察 か ら、卵 白添 加 は 主に 夜 間 に 起 こ る仔 魚 の 浮 上 驚 死 を防 ぐこ とを 明 らか に した、 さ らに 、卵 白の添 加 は海 水 の表 面 張 力 を低 下 させ 、 そ れ に よ り仔 魚 の浮 上 驚死 が 防 除 され る事 を示 した。 本 成 果に よ り、 ウナ ギ 仔魚 飼 育 にお け る初 期 の大 量 驚死 を 防 ぐ こ とが 可 能 に な り、安 定 した飼 育 が可能 とな っ た 。 効 率 的 な育 種選 抜 に必 要 な遺 伝 連 鎖 地 図 の 作製 に は 、大 量 のマ イ クロサ テ ラ イ ト(MS) マー カー が必 要 とな る。FCM分 析 に よ りニ ホ ン ウナ ギ のゲ ノムサ イ ズ を推 定 し,ゲ ノム 全 体 を カバ ーす る連 鎖 地 図の 作製 に は109個. 以 上 のマ ー カー 数 をマ ップす る こ とが必 要 で あ. るこ とを 明 らか に した。磁気 ビー ズ を 用 い てMS領 域 を濃 縮 したDNAラ. イブ ラ リー か ら単 離. 一45一.
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