本文 総合研究大学院大学学術情報リポジトリ 甲1218 本文

神経細胞ネットワーク機能解析への応用を目指した

プヤーナーイオンチャネャバイオセンサーの開発

浅野 豪文

博士 ₍ 理学 ₎

総合研究大学院大学

物理科学研究科

構造分子科学専攻

2008

要

細胞 外界より えられた様々 情報に対し 、シグナャ伝達機構を用い 細胞の増

殖や分化、神経細胞のシナプス可塑性 の生命現象を展開し いる のシグナャ伝

達機構の実体 主にタンパク質等の分子 ら る巨大 生化学反応ネットワークであ

る 近年、それらの機能分子の同定や分子機構 徐々に明ら に りつつある 、細胞

間あるい 細胞集合体とし のネットワークにおける情報処理機構につい 明

点 多く、ネットワーク内の協調的作用機構の特性を明ら にする必要 ある 細胞内 外の情報のやり りの中心的役割を担っ いるの 、生体内の細胞膜 に存在する膜タ

ンパク質である さらに、それら 多くの疾病との関 示唆され おり、神経ネット

ワーク網の破綻 神経変性疾患における神経機能の障害を たらす直接的要因である

と 考えられる のように神経細胞 構成する細胞間ネットワークのシグナャ伝達

機構を解明するために 、膜タンパク質の活動ベィッゲムや生体システムとし の総合 的 理解 必要であり、それを実現で る研究方法論及びタバイスの創製 急務である 現在、細胞機能を計測する有力 手法とし パッチクメンプ法 挙 られる 微 ガ

メス管ピペットにより区 られた細胞膜における単一あるい 複数のチャネャ分子の

活動を、それを通り抜けるイオン電流とし 記録する手法である 生細胞のイオンチャ ネャ分子の機能をモアャタイムに観察で る優れた計測法である反面、 低いスャープ

ット性、 操作の熟練性、 型化の困難性、 多点計測の困難性、 神経回路の全容

解析の困難性 の欠点及び制限 ある れらの問題点に対し 、二次元平面に展開

したプヤーナー型のパッチクメンプ素子 提案され いる プヤーナー素子のベモット 表面微細加工技術を駆使し 、電極の微細ン集積化による多点計測やデイスャープッ ト化 実現で る点である さらに原子間力顕微鏡や共焦点ヤーギー顕微鏡、蛍光イベ

要

ーグング の手法との組 合わせ 容易に可能と る 近年、盛んに研究開発 進め

られ おり、 型化した素子や簡便性、多点計測を可能にした装置 開発され、

記 ～ の問題点に関し 解決されつつある し し、安定性におい 課題 残され いる とやタイムメプスの計測 で い と、剥 した直後の細胞の に測定 限

られる と の欠点 あり、 のよう 神経回路網全体を研究対象とする場合に 適

し い い

本研究で 従来法の持つ問題点を解決し、細胞 ら細胞への化学的、電気的にシグナ ャ伝達を行う神経ネットワークの機能を解析するためのバイオセンサー素子及び手法

の開発を行った れまでに報告され いる既存のプヤーナー型のパッチクメンプ素子

の基板材料に ガメスやプメスチック等 用いられ おり、特にシモコン_(Si) 高テイ ゲ性である点 問題視され いた れに対し酸化膜層を _Si 層でサンチウ゛ッチ状に したsilicon on insulator(SOI)^を用い 、さらに熱酸化処理により基板表面に非導電性の

酸化膜層を形成させる とで膜厚に応 基板の持つ浮遊容量を低減させた れによ

りバックグメンチテイゲの最大の要因と る基板固有の電気容量起因のテイゲを抑え

る と で 、_S/N比の大幅 向 を実現した 電極部に当たる基板の微細貫通孔₍直 1-1.5 µm) ^{、半導体プュセス}(異方性ウゟット゠ッチングと熱酸化処理₎及び 束イオン

ビーム_(FIB)加工を用いた 次元加工プュセスにより作製した さらに従来法で 困難 であった細胞間のシグナャ伝達やタイムメプスの計測を可能にする培養計測ペーチを 開発した れ 素子内で培養を行い、測定基板 に細胞間ネットワークを形成させた 後に電気測定を適用する とで、細胞間の応答や相互作用の観察 可能と る 細胞接 着 性 タ ン パ ク 質 を コ ー ト し た セ ン サ ー 基 板 で 培 養 し た モ ガ ン チ 作 動 型 _transient receptor potential vanilloid type 1(TRPV1)^{を 発 現 し た} Human embryonic kidney 293(HEK293)^{細胞に対し ホーャセャ電} 固定記録を行い、モガンチ₍ィプサイシン₎刺 激に応 たイオンチャネャの開閉によるイオン電流を観察する とに成 し、本研究開

発のプヤーナー型バイオセンサー 実用ヤベャでの高い _S/N 比で電流記録 実現で る とを実証した また、素子の電気等価回路ペタャを立 、培養ペーチにおける細胞

－基板 微細孔 間接着部を流れる電流波形の解析を行い、本素子の主要 テイゲ源

過剰電流テイゲである とを数値理論と実証実験で証明し、雑音低減の指針を示した

神経細胞 生体内におい 感覚器や効果器といった複数の細胞と結合し複雑 ネッ

トワークを形成させる とで情報伝達の処理機能を発揮し いるため、シグナャ解析 複雑困難である そ で、細胞体と突起部を空間的に分 させた神経ネットワークを素 子の測定基板 に形成させるために、microcontact printing(µCP)を用いたタンパク質の固 定化による細胞マイクュパターッングを行った 神経細胞をパターン整列させるための 形状と大 さの幾何学的パターンを持った polydimethylsiloxane(PDMS)^{製のスタンプを} ソフトモソグメフ゛により作製し、 のスタンプを用い 基板 にタンパク質パターン を 形成さ せた 神経 系の ペタャ 細胞 である メッ ト副腎 髄質 褐色細 胞腫 由来細 胞_(PC12) を用い 神経成長因子による分化誘導を行うと、タンパク質の特定の微細パターン形状 に従い、細胞体の配置及び軸索伸張 誘導され、測定基板 に細胞の形態、成長領域

制御された神経細胞のネットワークアヤイを形成させる と で た

細胞間のシグナャ伝達解析を精密に行うために、時間的ン空間的に解像度 優れ い る光を利用した光刺激法を開発した 遺伝子工学的手法を用い 生物由来の光受容体ュ チプシンブプモータンパク質の神経細胞への発現を試 た ュチプシンブプモータ ンパク質 、単細胞緑藻類の一種コナプチモムシの眼点に分布し、可視光に応答し イ オ ン を 透 過 さ せ る と で 膜 電 を 制 御 す る 光 受 容 チ ャ ネ ャ で あ る そ の 一 つ で あ る channelrhodopsin-2(ChR2)の光感受性とイオンチャネャの機能を利用し 、細胞に刺激を

える _µCPにより基板微細孔 に形成させた_ChR2-PC12 のネットワークよりホーャ セャ電 固定記録を行うと、光照射に同期した光電流の発生を確認した また、光電流 の活性化と脱活性化 と にプモセィンチオージーの時定数を示し、興奮性シナプス後

要

膜電流の立ち りの早さに匹 する と ら刺激と反応の同期性という点で、_ChR2 を用いた光刺激によっ 細胞を刺激し、細胞 ら細胞への信号の送受信制御 可能であ る とを示した

現在、神経系の研究で ガメス微 電極 による電気生理学的手法や電 感受性色

素 を用いたイベーグング法により個々のッューュンの電 変化を一細胞ヤベャで

記録し いる また、フューサイトベトモー法 により単 時間あたりに多くの細胞 を測定で る細胞分析技術により統計的 解析 行われ いる し し、本研究で対象

とする神経細胞ネットワークのよう 細胞間あるい 細胞集団における外的刺激前後

の応答や特定の細胞に対する応答 、多くの細胞を対象とした一細胞ヤベャの解析 困難である 開発したセンサー素子 測定基板 で機能発現した細胞に対する観察を可 能にし、細胞間のシグナャ伝達や相互作用を計測する と で る さらに電極の集積 化を行う とで、従来法で 技術的に困難であった多数のッューュンの活動や応答を同 時に記録する と で 、神経回路全体のシグナャ伝達機構の詳細 解析 可能と る また、神経細胞ネットワークシステムの機能を明ら にする と 、神経変性疾患の神

経細胞死の基礎過程との関係や発症機構の解明及び治療法の開発につ る のと期

待で る 本研究開発素子 半導体材料であるシモコンを基板とし 用い いる と ら、半導体微細加工技術を用い 素子の微細化や後段のタータ処理回路の集積化を行う

とで、 型且つ可搬型の細胞機能解析システムや非常に簡便 薬剤スクモーッングシ

ステム の応用 期待で る

Neuronal cells control the life phenomena such as the cell proliferation, differentiation and survival using the various signaling functions in the network for various external stimulations. However, the function of a neuronal network and the mechanism of a signal transduction is not fully understand. The function analysis of reproducible and well-defined artificial networks of neuronal cells in vitro offers a promising approach to refine existing neuronal models and to gain deeper understanding of the related processes. Membrane proteins are known as indispensably important molecules for the cell functions. In addition, many reports have shown that dysfunctions of membrane proteins strongly relate to severe diseases. The pipette patch-clamp is a very excellent technique which can be used to detect the electrical activity of cells and their networks. It, however, has several difficulties in monitoring multiple cells simultaneously, high-throughput screenings, and long time laps measurements and also has disadvantage of high level skill-requirement in operations. The planar patch-clamp method is suitable for the miniaturization of the experimental apparatus and moderates the requirement of high skill-level. However, some problems exist still even in the conventional planer patch-clamp method. The lifetime of the cells in the measurement is too short to be applied to cell function analysis.

In the present study, a new planar type ion channel biosensor was developed to overcome the problems in the conventional methods. This biosensor has advantages in time laps recording, applicability to the analysis of a neural network function, and significant miniaturization by combining with a Si integrated electrical circuit, retaining the advantages of the conventional planar patch-clamp methods. This sensor can be potentially applied to functional analysis of

Abstract

neural network, clarification of neurodegenerative disease mechanism, and development of their treatment method.

The micro fabrication of the sensor chip was achieved using a semiconductor technology and focused ion beam (FIB) process. The performance of the fabricated sensor was demonstrated with two measurement methods, the planar patch-clamp (conventional) mode and the incubation (newly developed) mode. The whole-cell current of the TRPV1-transfected HEK293 cells activated by capsaicin ligand stimulations was successfully recorded by both measurement modes. Current noise and its power spectrum have been measured by the incubation mode. The spectral density and the variance of these noises were formulated in the general form using an equivalent circuit. The observed noise in the present device was explained by the excess noise with 1/f dependence, which mainly originates from the current through the cleft between the cell membrane and the substrate surface.

Neuronal networks on the substrate in the sensor were formed by microcontact printing (µCP). Extracellular matrix (ECM) proteins have been patterned with polydimethylsiloxane (PDMS) stamp by this method, in order to control the neuronal cell growth on the substrate surface in the sensor. PC12 cells were seeded on the substrate printed with laminin (LN) micropatterns. After the cells were cultured for 2 - 6 days, the growth of the cell bodies and neurites were confined to the LN patterns on the surface. The light-gated channel (ChR2) was expressed in PC12 cells for transmission and reception of the signal as a optical stimulation method. The photostimulation is ideal for stimulating a selected point of the soma or axon of a single cell in a neuronal network. In this study, it was shown that the present planar biosensor, the neural network device combined with photostimulation methods has tremendous potential for the investigation of cell-cell interactions, synapse functions and network functions.

AFM Atomic force microscope BHK Baby hamster kidney BOX Buried oxide

CaM Calmodulin CAP Capsaicin

Chop2 Channelopsin-2 ChR1 Channelrhodopsin-1 ChR2 Channelrhodopsin-2

CMOS Complementary metal oxide semiconductor DMEM Doulbecco's modified Eagle's medium DNA Deoxyribonucleic acid

EB Electron beam ECM Extracellular matrix EGF Epidermal growth factor FBS Fetal bovine serum FFT Fast Fourier transform FIB Focused ion beam FITC Fluorescein isothiocyanate FN Fibronectin

HEK293 Human embryonic kidney 293

HIV-1 Human immunodeficiency virus type 1 IPA Isopropyl alcohol

LN Laminin

LSI Large scale integration

MEMS Micro elector mechanical systems NGF Nerve growth factor

PBS Phosphate buffered saline PC12 Pheochromocytoma-12 PDMS Polydimethylsiloxane PKC Protein kinase

PLL Poly-L-lysin

RCA Radio corporation of America

略語一覧

SIMOX Separation by implantation of oxygen SOI Silicon on insulator

S/N Signal-to-noise TE Trypsin-EDTA

TEM Transmission electron microscope

TMAH Tetra methyl ammonium hydroxide TRPV1 Transient receptor potential vanilloid type 1 UV Ultraviolet

WCA Water contact angle µCP Microcontact printing

第 ₁ 章 緒論

1.1 ^{研究目的と背景} ……… ₁

1.2 ^構成 ……… ₄

参 考 文 献 … … … …… … … ₆

第 ₂ 章 プ ヤ ー ナ ー イ オ ン チ ャ ネ ャ バ イ オ セ ン サ ー の 提 案

と作製

2.1 ^緒言 ……… ₁₂

2.2 プヤーナーイオンチャネャバイオセンサーの概念と設計 ………… ₁₃

2.3 イオンチャネャ電流計測法

2.3.1 ピペット‐パッチクメンプ法の原理 ……… ₁₄

2.3.2 プヤーナー‐パッチクメンプ法 ……… ₁₇

2.3.3 プヤーナー‐培養ペーチ ……… ₁₈

2.4 ^SOI 基板を用いたセンサーチップの作製

2.4.1 ^{シモコン基板洗浄} ……… ₁₉

2.4.2 センサー電極部－微細貫通孔の作製 ……… ₂₁

2.5 熱酸化処理による基板修飾及び電気的特性評価 ……… ₂₄

2.6 センサーチップ洗浄方法 ……… ₂₇

2.7 ^結言 ……… ₂₈

参考文献 ……… ₂₉

目次

第 ₃ 章 プ ヤ ー ナ ー 型 イ オ ン チ ャ ネ ャ バ イ オ セ ン サ ー の 特

性評価

3.1 ^緒言 ……… ₃₄

3.2 ^実験方法

3.2.1 細胞培養及びモガンチ作動型イオンチャネャ－ _TRPV1 ………… ₃₄

3.2.2 ^{電気測定システム} ……… ₃₇

3.2.3 プヤーナーパッチクメンプペーチ ……… ₃₇

3.2.4 ^{穿孔パッチ法} ……… ₃₉

3.2.5 ^{培養ペーチ} ……… ₄₀

3.2.6 ^{電気テイゲ解析} ……… ₄₂

3.3 ^{実験結果及び考察}

3.3.1 ^TRPV1 チャネャ電流記録－プヤーナーパッチクメンプペーチ… ₄₃

3.3.2 システム内における細胞培養 ……… ₄₆

3.3.3 ^TRPV1 チャネャ電流記録－培養ペーチ ……… ₄₈

3.3.4 ^{電気テイゲ特性評価} ……… ₅₀

3.4 ^結言 ……… ₅₅

参考文献 ……… ₅₆

第 ₄ 章 神 経 細 胞 ネ ッ ト ワ ー ク 機 能 解 析 素 子 へ の 展 開

－要素技術の開発－

4.1 ^緒言 ……… ₆₃

4.2 ^実験方法

4.2.1 神経細胞ネットワークアヤイパターンの設計 ……… ₆₄

4.2.2 ^µCP 法を用いた細胞マイクュパターッング ……… ₆₆

4.2.3 光感受性イオンチャネャの遺伝子導入 ……… ₆₉

4.3.2 神経細胞ネットワークの構築と評価 ……… ₇₄

4.3.3 ^{光感受性 PC12} 細胞を用いた光刺激法 ……… ₇₆

4.4 ^結言 ……… ₇₉

参考文献 ……… ₈₀

第 ₅ 章 総括 ……… ₈₅

研究業績 ……… ₈₉

参考資料

謝辞

第 ₁ 章

緒言

1.1 研究目的と背景

1.2 構成

参考文献

1.1 ^{研究目的と背景}

細胞 外界より えられた様々 情報₍シグナャ₎に対し 、シグナャ伝達機構を用い

細胞の増殖や分化、神経細胞のシナプス可塑性 の様々 生命現象を展開し い

る_[1] のシグナャ伝達機構の実体 主にタンパク質等の分子 ら る巨大 生化学 反応ネットワークである_[2-4] 近年、それらの機能分子の同定や分子機構 徐々に明

ら に りつつある 、細胞間あるい 細胞集合体とし のネットワークにおける情

報処理機構につい 明 点 多い れまでにシグナャ伝達ネットワークに 非

線形性 存在する と 報告され おり_[5-7]、個々の分子の構造や機能と連関させた

ネットワーク内の協調的作用機構の特性を明ら にする必要 ある 細胞内外の情報

のやり りの中心的役割を担っ いるの 、チャネャやトメンスフーター、ヤセプタ

ーとし 生体内の細胞膜 に存在する膜タンパク質である_[8] れらの膜タンパク質

生体機能維持に大 役割を果たし、 可欠 重要分子である と 知られ いる

[9,10] ^{さらに近年で 様々 疾病との関 示唆され おり}[11,12]^{、その一つに難治}

性の神経変性疾患であるアャゼデイマー病 挙 られる 神経細胞の顕著 脱落を伴 う進行性の疾患で_[13,14]、 の疾患の症状である認知機能低 と神経細胞シナプスの 機能変性との間の因果関係 示唆され いる _[15-18]、発症ベィッゲム 明ら にさ

れ おら 、有効 治療法 見出され い い し し、神経変性疾患における神経

機能の障害を たらす直接的要因 、神経ネットワーク網の破綻である 神経細胞

構成する細胞間ネットワークのシグナャ伝達機構を解明するために 、膜タンパク質

の活動ベィッゲムや生体システムとし の総合的 理解 必要であり、それを実現で

る研究方法論及びタバイスの創製 急務である

脳神経系の活動におい イオンチャネャ 膜電 変化を発生させ、電気信号による

情報伝達の重要 役割を果たし いる_[10] 現在、細胞₍イオンチャネャ₎機能を計測す る有力 手法とし 、パッチクメンプ法 挙 られる_[19-23] 微 ガメス管ピペット

により区 られた細胞膜の一部における単一あるい 複数のチャネャ分子の活動を、

それを通り抜けるイオン電流とし 記録する手法である パッチクメンプ法の特徴

高抵抗シーャを形成するために モーク電流 極少_[19]、 バックグメンチテイゲ 極 少_[21]、 細胞におい 電 固定 での膜電流記録 可能_[22]、 直接細胞内環境 のコントューャ 可能_[23] と 長所とし 挙 られる し し、生細胞のイオンチ

ャネャ分子の機能をモアャタイムに観察で る優れた計測法である反面、以 に示す

欠点及び制限 ある

1) スャープット 低い 2) 操作に熟練性 要求される

3) 除振 ^{装置 大掛 り ために 型化 困難である} 4) 多点同時計測 困難である

5) 神経回路のよう 生体システムの全容解析 困難である

れらの問題点に対し 、ピペットパッチクメンプ素子を二次元平面に展開したプ

ヤーナー型のパッチクメンプ素子 提案され いる プヤーナー素子のベモット 表

面微細加工技術を駆使し 、電極の 型ン集積化による多点計測やデイスャープット

化 実現で る点である_[24] さらに原子間力顕微鏡(AFM; atomic force microscope)[25] や共焦点ヤーギー顕微鏡_[26]、蛍光イベーグング_[27]、分光分析_[28] の物理学的手 法との組 合わせ 容易に可能と る 近年盛んに研究開発 進められ おり、 型ン 微細化した素子_[29-38]や簡便性、多点計測を可能にした装置_[39,40] 開発され、

記 ₁₎～₄₎の問題点に関し 解決されつつある し し、感度や安定性におい 課

題 残され いる とやタイムメプスの計測 で い と、剥 した直後の細胞の

に測定 限られる と の欠点 あり、₅₎のよう 神経回路網全体を研究対象と する場合に 適し い い

そ で、従来法の持つ問題点を解決し、細胞 ら細胞への化学的、電気的 シグナ

ャ伝達を行う神経ネットワークの機能を解析するためのバイオセンサー素子及び手法

の開発を目的とし 本研究を行った 具体的に プヤーナー型パッチクメンプ素子構

造とし、神経細胞ネットワークをセンサー に形成させ、単純化された_{in vitro}の測定

系を構築する とで、細胞間の相互作用や信号伝達の観察を可能にするセンサーとし

た れにより神経ネットワークにおけるシグナャ伝達機構の定量的 解析 可能と

る また、神経細胞 構成する情報処理システムを明ら にする と 、神経変性

疾患過程で観察される神経細胞死の基礎過程との関係や発症機構の解明及び治療法の

開発につ る のと期待で る

1.2 ^構成

本論文 提案したプヤーナーイオンチャネャバイオセンサー及び研究手法につい 、

素子の有用性を検証すると に、神経細胞ネットワークの機能解析に応用するために

行った要素技術及び手法の開発につい まとめた のであり、₅ つの章より構成され る

第 ₁ 章で 緒論とし 、神経科学分野における研究手法と現状及び、近年盛んに研

究 行われ いるバイオセンサーの研究動向につい 言及し、本研究の 置付けと目

的につい 述 た

第 ₂ 章で 提案したプヤーナーイオンチャネャバイオセンサーの概念及び作製方法

につい 述 た 神経細胞ネットワークの機能解析に応用するために、培養中の細胞

に対するタイムメプス測定 可能 培養測定ペーチを開発した 半導体プュセスと集

束イオンビーム(FIB; focused ion beam)^を用いた 次元微細加工法を確立し、基板微細

孔の作製を行った 作製した基板の電気的特性を検証し、熱酸化プュセスを用いた基

板修飾による最適構造化を行った

第 ₃ 章で 作製したセンサー素子の特性評価とし 、二つの測定ペーチによる全細

胞膜電流記録及びテイゲ解析を行った 基板表面に細胞外基質修飾を行い、測定基板

での細胞培養 らイオンチャネャ電流計測までの一連の操作を素子内で実現した

またシステムの電気的特性を検証し、数値理論計算と実証実験によるテイゲ解析を行 い、雑音低減の指針を示した

第 ₄ 章で タンパク質分子パターッングによる神経細胞ネットワークの構築法及び 光 感 受 性 イ オ ン チ ャ ネ ャ を 用 い た 光 刺 激 法 の 要 素 技 術 の 構 築 を 行 っ た Microcontact printing (µCP)^法を用い 形成した細胞外基質のパターンによる細胞マイクュパターッ

ングを行い、パターン形状によるネットワーク構築特性を評価した 遺伝子工学手法

を用い 生物由来の光受容体ュチプシンブプモータンパク質を神経細胞に発現させ、

光照射により細胞を刺激する細胞興奮法を開発した

第₅章で 総括とし 本論文内容をまとめると共に、今後の展望につい 述 た

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第 ₂ 章

プ ヤ ー ナ ー イ オ ン チ ャ ネ ャ バ イ オ セ ン サ ー

の提案と作製

原著論文 _: 表面科学 , (2007), 28, 385-390.

2.1 緒言

2.2 プヤーナーイオンチャネャバイオセンサーの設計

2.3 イオンチャネャ電流計測法

2.3.1 ピペット‐パッチクメンプ法の原理

2.3.2 プヤーナー‐パッチクメンプペーチ

2.3.3 プヤーナー‐培養ペーチ

2.4 SOI 基板を用いたセンサーチップの作製

2.4.1 シモコン基板洗浄

2.4.2 センサー電極部－微細貫通孔の作製

2.5 熱酸化処理による基板修飾及び電気的特性評価

2.6 センサーチップ洗浄方法

2.7 結言

参考文献

2.1 緒言

れ までに報告 され いる 既存のプヤ ーナー型素 子の基板材 料に ガメ ス_[1,2]や プ メスチック_[3,4]、polydimethylsiloxane(PDMS)[5,6]^{、シモコン}[7]^{等 用いられ おり、特}

にシモコン 高テイゲ性である点 問題視され いた の問題に対し シモコン酸化

膜_(SiO2)の にシモコン_(Si)単結晶層を形成させた構造のsilicon on insulator (SOI)^を基板 とし 用いる ととした _{SOI CMOS LSI}の高 性ン低消費電力化を向 させる目的 で開発された基板で、サイペックス(SIMOX: separation by implantation of oxygen)^方式と 張り合わせ方式の₂つの製造法 ある_{[8,9] SIMOX}方式 _Siウゟーデに酸素イオンを 注入し埋め込 、それを高熱で酸化させる とでシモコン結晶中に _SiO2 の絶縁膜を形 成させる 張り合わせ方式 、_SiO2層をウゟーデ に直接成長させ、その に別のウゟ ーデを り合わせ 作製する 酸化膜 絶縁体とし 作用する とで、シモコンに吸 される電気゠ネャウー量 低減され、寄生容量を大幅に抑制する特徴を持っ いる 本 研究で 寄生容量及び基板強度を考慮し 、厚い _SiO2 層を形成で る張り合わせ方式 で作製された_SOIを用いた

本章で 提案したプヤーナーイオンチャネャバイオセンサーの概念及びパッチク メ ンプ法、新しく開発した測定法につい 述 、作製方法並びに熱酸化処理プュセスを用 いた基板修飾による素子の特性評価と構造の最適化を行った結果を詳述する

2.2 プヤーナーイオンチャネャバイオセンサーの設計

本研究開発のセンサー 細胞間におい 化学的ン電気的に情報伝達を担う神経細胞の 機能計測への応用を念頭に置 、素子設計を行った 神経ネットワークにおける細胞間 の観察を行うために、システム内で細胞培養により神経細胞ネットワークを測定基板 に形成させる とで、生理機能発現後の細胞に対し 計測 可能 センサーとした 図 2.1 に提案したプヤーナーイオンチャネャバイオセンサーの素子構造及び測定ペーチの

概略図を示す プヤーナーパッチクメンプペーチ及び培養ペーチの測定法の詳細につい

、第_2.3.2及び_2.3.3節に それ れ述 る 素子 ₂層のチャンバーで構成さ れ おり、電極と るセンサーチップを _PDMS によっ チャンバー間にシーャする システム内培養を行うために必要と る素子の滅菌 アャコーャ洗浄と ultraviolet(UV) 照射により行う そのため、素子の材質とし 培養部である チャンバーに フッ素 系樹脂₍ジイフュン₎、 チャンバーに 加工 容易 塩化ビッャ樹脂を用いた また、

チャンバー部の電極に 銀管を用い アンプとの電気的接続点に加え 、薬物や電解 液の溶液交換をするための還流用の流路とし 利用した

2.3 イオンチャネャ電流計測法

2.3.1 ピペット‐パッチクメンプ法の原理

パッチクメンプ法 、細胞膜における単一あるい 複数のイオンチャネャ分子の活動 や機能をモアャタイムに計測で る手法である_[10-14] 細胞膜に微 ガメス管ピペット を高抵抗で密着させ、その先端開口部の微 膜領域を電気的に他の領域と隔絶した状態

で電 固定する とで、そ に含まれるイオンチャネャを通るイオン電流を計測する

(^図 2.2) ^{パッチクメンプ法} 高抵抗シーャを形成するため、モーク電流 極め 少 く、電 固定を正確に行う と 可能である_[11] 熱テイゲ及びパッチクメンプアンプ

図_2.1 提案したプヤーナーイオンチャネャバイオセンサーの概略図 (a) ^{素子構造の全体図、}(b, c) 本素子による二つの測定ペーチの概略図 プ ヤーナーパッチクメンプペーチ_(b), 培養ペーチ_(c)

(a)

(b)

(c)

装置に生 る電流雑音 シーャ抵抗に反比例し さく るため、高抵抗シーャ で バ ックグメンチテイゲ 極め 低く る_[13] また、 細胞におい 電 固定 での膜

電流記録を可能とする とや直接細胞内環境のコントューャ 可能 と 長所

とし 挙 られる_[14]

パッチクメンプ法 _OPアンプで構成される_I-Vコンバーター 基本回路と っ い る₍図 _{2.2) OP} アンプの電圧利得を無限大とすると、両端₍₊と_-)の入力端子 等電 と り、₊の入力端子にコマンチ電 を加えるとバーチャャンショートによっ －端子₍パ ッチ膜₎ 同電 にクメンプされる 細胞膜とピペットとの間を高抵抗でシーャする とで、シャント電流 極 と り、_{Ip = I}と る れを_I-Vコンバーター内のフ゛ー チバック抵抗_(Rf)における電圧降 とし 検出する とで、パッチ膜を横 る電流_(I)の 100^{％をパッチ電極 らの記録電流}(Ip)^{とし 計測する また、初段} OP ^アンプ A1

の出力に 、膜電 成分 含まれるため_A2で差し引い いる のように_{nA - pA}オ ージーヤベャの極 電流の測定を実現し いる

図_2.2 ピペットパッチクメンプ法の原理図と計測回路

ピペット電極抵抗_(Rs) 通常_{1 - 5 MΩ}程度で_Rs≪_Rsealと れば、_{Ip / I = Rseal} / (Rs + Rseal) ~ 1 ^{と る} Ip^をI-V^{コンバータ}(^点線)^{内の高抵抗}Rf (feedback resister)に お け る 電 圧 降 と し 検 出 す る と で 細 胞 膜 を 通 過 す る 電 流

計測で る 初段_OPアンプ_(A1)に含まれる膜電 成分を次段_OPアンプ (A2)^{で差し引い いる}

補足：_Rs パッチ膜に直列に入るピペット電極抵抗(access resistance^また series resistance)^、Rseal ピペット－細胞膜間のシーャ抵抗を示す

パッチクメンプ法に 実験目的、方法に応 種々の測定ペーチ ある 単一チャネ ャ記録(single channel recording)^{法とし 、セャアタッチペーチ}(cell-attached mode) [12]^、 インサイチアウト(inside-out mode) [14]、アウトサイチアウトペーチ(outside-out mode) [14]^、また全細胞膜を流れる電流の記録法とし ホーャセャペーチ(whole-cell mode^また

conventional whole-cell mode) [14]^{、穿孔パッチペーチ}(perforated patch mode) [15,16] ある₍図_2.3) セャアタッチペーチ パッチ電極を細胞 に装着したままで単一チャネ

ペーチ 計測対象 利点 欠点

(a) cell-attached ^{単一チャネャ電流 細胞内環境の保持} セィンチベッセングャーの予見

細胞内液のコントューャ 可

実行電 明

(b) inside-out ^{単一チャネャ電流 細胞内液 コントューャ可} セィンチベッセングャーの予見

細胞内環境の欠落 (c) outside-out ^{単一チャネャ電流 細胞外液 コントューャ可}

モガンチ活性の観察

細胞内環境の欠落

(d) whole-cell ^{全細胞膜電流}

細胞内環境 コントューャ可 細胞内電 の測定 モガンチ活性の観察

チャネャの_rundown

(e) perforated patch ^{全細胞膜電流}

細胞内環境の保持 細胞内電 の測定 モガンチ活性の観察

R_a ^高い

細胞内液のコントューャ 可

図_2.3 パッチクメンプ法の各種の測定ペーチ模式図と特徴

単一チャネャ記録(single channel recording)^{法とし 、}(a) cell-attached mode^、 (b) inside-out mode^、(c) outside-out、全細胞膜を流れる電流(whole-cell mode) 法とし (d) whole-cell^、(e) perforated patch mode ^{ある 各測定ペーチに 表}

に示すよう 特徴をそれ れ持っ いる

(a)

(b)

(c) (d) _(e)

ャ電流を記録する_(a) セャアタッチペーチ らパッチ電極を引 、細胞 らパッ チ膜を り り、細胞内をバス液に露出させた状態での記録 インサイチアウトペーチ である_(b) アウトサイチアウトペーチ 細胞内側 電極内液に面したペーチで後述す るホーャセャペーチ らパッチ電極を引 る とで形成される_(c) セャアタッチペ ーチでパッチ膜を破り穴を開け、パッチ膜以外の全細胞膜を流れるイオン電流を記録す るの ホーャセャペーチである_(d) ホーャセャペーチの細胞内液の_washout問題を克服 するためにイオン透過性の高い 孔 イオテファア を形成させる とで全細胞膜電流 を測定するの 穿孔パッチペーチである_{(e) (}詳細 第₃章_3.2.4節に 述 る₎

2.3.2 プヤーナー‐パッチクメンプペーチ

プヤーナーパッチクメンプ法 、平面基板 に形成した微細貫通孔を従来のピペット 電極部の暶わりとし 用い 、細胞膜を捉え計測する手法である₍図_{2.1 b)} システム構 造 二次元平面に展開されたプヤーナー素子のベモット 、表面微細加工技術を駆使し 型化や電極のアヤイ化を行う と で 、多点計測やデイスャープット化 実現で る_[17] また、ピペット電極を配置する必要 く素子 部の空間自由度 高いため に、_AFM[18]や共焦点ヤーギー顕微鏡_[19]、蛍光イベーグング_[20]、分光分析_[21] 物 理学的手法との組 合わせ 容易と る プヤーナーパッチクメンプで インサイチア ウトやアウトサイチアウトペーチによる記録 困難である 、セャアタッチやホーャセ ャペーチの記録 可能である また、素子内に流路を持たせる とで還流による電極内 液の交換を容易にする と で 、ピペットパッチクメンプで 比較的困難である穿孔

パッチペーチによる記録 再現性良く実現で る

2.3.3 プヤーナー‐培養ペーチ

培養ペーチ測定で プヤーナーパッチクメンプペーチと同様に基板 の微細貫通 孔 を電極とし 用い 、システム内の測定基板 で細胞培養を行い、細胞膜の接着、伸展 により微細孔を覆わせた後に電流記録を行う₍図_{2.1 c)} 生理機能を発現した細胞を観察 する と で 、剥 した直後の細胞の に限られ に、培養中の細胞に対し タイム

メプスの計測や細胞間の相互作用の計測 可能と る 培養ペーチによる電流記録

実験で 長時間の観察、測定を考慮し、細胞内の機能分子の_washoutを抑制し低侵襲的

に測定で る穿孔パッチ法によるホーャセャ電流記録を行う

2.4 SOI 基板を用いたセンサーチップの作製

第_2.1節に 述 たようにシモコン 抵抗 低いためにバックグメンチ雑音電流 大 いという問題 指摘され いた そ で、本研究で シモコン基板の高テイゲ問題を トップ _Si 層とバャク _Si 間に張り合わせ法で形成した厚い _SiO

2^層(4µm)を BOX(buried oxide)^{層とし 挟ん 構造の}SOI^{を基板とし 用いた 使用した}SOI^{基板断面の電子顕}

微鏡(SEM; scanning electron microscope)^像を図2.4^{に、 様を表}2.1^{に示す シモコン基} 板 半導体プュセスである異方性ウゟット゠ッチングを利用する と で 、微細貫通 孔構造を正確に作製する と で る また、表面平坦性 高く、種々の表面化学修飾 を容易に可能とする点でシモコン基板 有利と る さらに電子回路を集積する とで 超 型素子の開発 期待で る点 利点とし 挙 られる

表_{2.1 SOI}基板の 様表

type P-type

抵抗率 _{50 - 75 Ωcm}

面方 < 100 >

Overall thickness 532 ± 5 µm SOI (Si) thickness 3 ± 0.5 µm Oxide thickness 4 ± 0.2 µm

2.4.1 シモコン基板洗浄

大気中でシモコン表面 自然酸化によっ _SiO2層 形成され、また有機物 の汚 染を受ける 、_RCA洗浄(Radio corporation of America社考案のシモコン基板洗浄方法₎ による十分 洗浄を行う とで清浄 表面を得る と で る 以 の操作 全 クモ

SiO2

) SOI ( Si

Si 図_{2.4 SOI}基板の断面_SEM像

SiO₂^層 Si^{層に挟まれ いる様子 確認で る 部最表面層に 熱酸化} 処理による酸化膜層_{1 µm} 堆積し いる_(2.4.2節を参照) (scale bar : 1µm)

ーンャーム内に 行い、各工程間に 超純水₍≧ 18.2 MΩ cm, Advantech, Millipore Ltd.,) によるすす 工程を含んでいる また、フッ化水素酸水溶液処理₍工程 ₅₎で フッ素樹 脂製ビーィーを使用し、それ以外の工程で ガメス製ビーィーを用いた

1. アセトン中で超音波洗浄(RT, 5 min) 2. ベタテーャ中で超音波洗浄(RT, 5 min)

3. Piranha 溶液(硫酸：過酸化水素水 = 4：1 [v/v])中で煮沸(90℃, 10 min)

4. アンペッア水：過酸化水素水：純水 = 1：4：20 [v/v]溶液中で煮沸(90℃, 10 min) 5. 1%フッ化水素酸水溶液中で静置(RT, 10 min)

6. 塩酸：過酸化水素水：純水 = 1：1：6 [v/v]溶液中で煮沸(90℃, 10 min) 7. 窒素ガスに 乾燥

以 の方法により清浄 _SiO2層を基板表面に形成させた 各溶液による処理 以 の 目的のために行った

1 ~ 3 ^： 有機汚染物と金属の除去 4 ^： 塵埃吸着物と金属の除去 5 ^{： 自然酸化膜除去}

6 ^{： 表面酸化}

2.4.2 微細貫通孔作製

ピペット電極部にあたる基板の微細貫通孔の作製プュセスを図_2.5に示す サノマイ クュベーターオージーの精度で微細 次元加工を実現するため、異方性ウゟット゠ッ チング及び_FIB加工を用い 作製を行った 作製手順を以 に示す 水酸化テトメベチ ャアンペッウム (TMAH; tetra methyl ammonium hydroxide)゠ッチングの保護及び基板の 寄生容量を抑制₍詳細 第 _2.5節に 述 る₎させるためにウゟット熱酸化処理による酸 化膜を形成させた 熱酸化プュセス 、酸化性雰 気中で高温に加熱する とでシモコ ン表面に二酸化珪素_(SiO2)を形成させる方法である_[22,23] 表面に形成された_SiO2膜中 の拡散 度 酸素イオンより水酸イオンの方 大 いため_[24]、水蒸気 での加熱によ っ 酸素 より 短い時間で膜厚の大 _SiO2層を形成する と で る 電気炉に 95℃で水中をバノモングさせた酸素_{(1 L/min)}雰 気 で熱酸化を行った _Si/SiO2の゠ッ チングヤート比の差を利用した _TMAH ゠ッチング_[25-27]によっ バャク _Si 層を削り BOX^層のSiO2^{を露出させ、}SOI^層とBOX^層の を残した薄膜部分を形成させた そし

、_FIBを用い ゠ッチング加工する とで直 約0.7- 1.5 µm^{の貫通孔を作製した} FIB 加工 透過型電子顕微鏡(TEM; transmission electron microscope)^{試料の作製ゼーャとし} 使用され おり、試料表面のイオンビームの照射された部分 けを選択的に゠ッチ ングする と で るためマスクヤス加工を可能とし、高精度に微細加工 で る特徴 を持っ いる_[28,29] お、工程₂と₅ 分子科学研究所 装置開発室と゠スアイアイン ナテテクテュグー㈱にそれ れ依頼し加工を行った

1. 基板表面に熱酸化処理[900℃, 10 h, O₂ + H2^{O (95℃}, bubbling)]^{によっ 約}1 µm の_SiO

2^{層を形成する}

2. φ1 mm のジイアペンチグメインジーにより、SiO₂^{層及びバャクSiを 削する} 深さ0.40 - 0.45 mm

3. 8% (v/v) TMAH により残りの Si の異方性ウゟット゠ッチング(90℃, 50 min)を 行い、_BOX層である_SiO2層まで到達させる

4. 熱酸化処理[900℃, 10 h, O₂ + H2^O(95℃, bubbling)]^{によっ ゠ッチングされ}Si 露出した部分を含めた基板表面全体に約_{1 µm}の_SiO

2^{層を形成する}

5. FIB を用い 直 約 0.7- 1.5 µm の微細貫通孔を形成する

1. 1^st Thermal oxidation

2. Drill milling

3. TMAH etching

4. 2^nd Thermal oxidation

5. FIB milling

SOI (Si) Si SiO2

1 mm in diameter and 400 - 450 µm deep is formed on the backside by diamond grinding

Anisotropic wet etching using 8% TMAH at 90^℃ for 100 - 120 min

O2+H2O (95^℃, bubbling) at 900^℃ for 10 h

Micropore with ^φ0.7 - 1.5 µm penetrated to the bottom of the well is formed by focused ion beam

O2+H2O(95^℃, bubbling) at 900^℃ for 10 h

図_2.5 異方性ウゟット゠ッチング及び_FIB加工を用いたセンサーチップの 作製方法

Si/SiO2の゠ッチングヤート差を利用し 、貫通孔のピトムにあたる_BOX層 の _SiO2で゠ッチングを精確に停 させた ゠ッチング後に再び熱酸化処理 を施し、露出した_Si表面に絶縁体である酸化膜層を形成させた

作製した微細貫通孔の_SEM像を図_2.6に示す 基板 に _FIB加工によっ 平滑 壁

面を持ったプクュンオージーの微細 貫通孔 高精度に形成され いる と 確認で

る_(a) また、基板裏側で _TMAH異方性ウゟット゠ッチングにより_SiO2層で正確に

゠ッチング 停 され いるの 観察された_(b) 約300 µm×300 µm^{の領域の を薄膜}

化する とで基板強度を維持しつつ、プクュンオージーの貫通孔加工を可能にした

(a)

0.5 µm

図_{2.6 SOI}基板に形成された微細貫通孔の光学顕微鏡像_{( )}と_SEM像₍右₎ (a) ^{基板 面}, (b) ^{基板 面} FIB^{加工によっ 直 約}1 µm^{の貫通孔 精密} 且つ滑ら に形成され いる と 確認で る _TMAH異方性゠ッチング によっ _SiO2層で正確に゠ッチング 停 され いる また貫通孔部_(SOI + SiO2^層＝約8 µm) ^{厚いために十分 機械的強度 保持され いる}

1 µm 100 µm

10 µm

(b)

2.5 熱酸化処理による基板修飾及び電気的特性評価

極め 短い時間内におい イオンチャネャの高周波開閉現象を記録するパッチク メ ンプ記録で 、バックグメンチテイゲ 大 問題と る_[30] その原因とし 熱テ イゲやショットテイゲ 挙 られる 、最 大 く起因するの 浮遊容量性テイゲであ る_[14] 電流測定を行う際に基板 電解液と接触するために電極基板の寄生容量由来の テイゲ 発生する よっ 、テイゲを抑えるために低容量の基板 要求される_[31] そ

で、熱酸化処理を用い 酸化膜を形成させ、寄生容量の抑制を行った 実験方法

2.4.2節と同様の方法で行った

素子の電気的特性を評価するために等価回路ペタャ₍図 _2.7)を立 、基板抵抗及び容 量につい 検証した 基板抵抗(access resistance) Rs (_Ω) 、センサーチップの微細貫通 孔の伝導性により定義され、_(2.1)式より電解液の電気抵抗率_{ρ (Ω m)}、微細孔の断面積_A (m²)^{、微細孔の長さ}l (m) ^{ら求められる}[32]

A

R_s

₌ ^{ρ ⋅}

図_2.7 センサーチップの電気的等価回路ペタャ C₁

C2

C₄ C3

Rs

図 _2.8 に _Rsの測定結果と_(2.1)式 ら求めた計算値を示す 微細孔の断面積_(A)に対し

抵抗 反比例し おり、実験値と 一致した また、その抵抗値 ピペットパッチ

クメンプで使用するピペット抵抗(1 - 5 × 10⁶ Ω)^{と同等 しく 低い値を示し いる ホ} ーャセャ記録時に 、膜容量_{(Cm) Rs}を介し チャーグされる_(RsCm) とによる _slow transient の発生や単一チャネャ計測時に比 流れる電流 大 いために _Rs での電圧

降 無視で い問題 生 る そのために _Rs で る限り さく抑える必要 あ る_[1]

基板の浮遊容量_{Cs (F)} 、_{(2.2, 2.3)}式より真空誘電率

12

0

^{8 . 854 10}

×

ε =

ε

(SiO2 = 4.5)^、面積S (m²)^、厚 d (m) ^{ら求められる}[32] (Si^{層の寄生容量 寄 さ} いため考慮し い₎

d

C_i

_{= ε}

_{⋅ ε}

_⋅

1

4 3 2 1

1

1

1

⎟⎟⎠ ⎞

⎜⎜⎝ ⎛

+ +

+

=

C_s ……… (2.3)

0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

5.0x10⁵ 1.0x10⁶ 1.5x10⁶ 2.0x10⁶ 2.5x10⁶ 3.0x10⁶

Experimental data Theory

Access resistance [Ω]

Micropore diameter [

^μ

図_2.8 センサーチップ基板の抵抗_Rsの実測値と計算値₍式_2.1)

熱酸化処理を行った基板を直 _{3 mm}の_{PDMS (S = 7.069} × ₁₀

-6 m²)^{によりシーャを}

し センサーシステムに組 込 、容量を測定した結果を図_{2.9 (a)}に示す れより 基板表面に非導電性の酸化膜層を形成させる とで、基板固有の寄生容量 酸化膜厚 に応 減少し いる と わ る また、図_{2.9 (b)} 基板の電解液と接触する面積 と容量の関係を示した ので、接触面積を減少させる とで容量を抑制で る とを

示し いる プヤーナー型のベモットである素子のジウンサイグングを行い、マイク

ュ 流 体回 路と 組 合 わせ 微細 化す る と でさ ら に低 テイ ゲ 化 可能 と る と 示唆される

図_2.9 センサーチップ基板の電気容量_Csの実測値と計算値₍式_{2.2, 2.3)} (a) 熱酸化処理により形成した酸化膜厚に対する基板容量の関係(S = 7.069

× 10^-6 m^2一定)^と(b) 電解液との接触面積に対する容量の関係_{(SiO2 = 2.0 µm} )

0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 50 100 150 200 250 300

Capacitance [pF]

SiO₂ thickness [^μm]

0 2 4 6 8 10 12 14

0 50 100 150 200

Capacitance [pF]

Contact area [mm²] (a)

(b)

Experimental data Theory

Experimental data Theory

次にAFM (SPA400, Seiko Instruments Inc.)^を用い 熱酸化処理前後の基板表面を観察 した₍タッピングペーチ_{, RT,} 大気中₎ 図 _2.10に示すように熱酸化処理によっ 基板表 面の粗さ 低 し、より平坦化され いる と 確認で る れ 基板 での培養時

及び電流測定時の基板と細胞膜との間の密着性の向 期待で る

2.6 センサーチップ洗浄方法

シ モ コ ン製の セ ン サーチ ッ プ 基板 強 酸 化洗浄 プ ュ セスに よ り 種々の タ ン パ ク 質

や細胞膜片 の有機物を除去し、十分に洗浄する とで再使用する と で る

以 の操作 全 クモーンャーム内に 行い、各工程の間に 超純水によるすす 工

程を含んでいる 微細貫通孔を壊さ いために超音波洗浄 行わ 、各溶液中に静置

図_2.10 熱酸化処理前_(a)と処理後_(b)の_SOI基板表面の_AFM像_{(3 × 3 µm}

2₎

と断 面プュブイャ

熱酸化処理を施す とによっ 表面粗さ 低 し、より平坦化され いる と 確認で る RMS : (a) 0.15 nm, (b) 0.08 nm

(a) (b)

1 nm

させ洗浄を行う

1. アセトン中に浸漬(RT, 20 min ~ ) 2. ベタテーャ中に浸漬(RT, 20 min ~ )

3. Piranha 溶液(硫酸：過酸化水素水 = 4：1 [v/v])中で煮沸(90℃, 20 min ~ )

2.7 結言

本章で 新しく提案したプヤーナーイオンチャネャバイオセンサーの概念及び作 製

方法、作製したセンサーチップ基板の特性評価の結果につい 述 た

プヤーナーパッチクメンプ素子の基板材料とし シモコンを用いる際の問題点で あ った高テイゲ性を、絶縁体とし 働く_SiO2層を挟 込ん _SOIを用い 、熱酸化処理に

よる最適構造化を行う とで解決した 電極と る基板の微細貫通孔 半導体プュセス

の異方性ウゟット゠ッチングと _FIB 加工による精密 次元加工プュセスにより作製 した 微細孔の抵抗 孔 側 大 く広 った構造と っ いるためにピペットパッチ クメンプで使用されるガメスピペットと比較し さく、パッチクメンプ電極とし 適 用で る とを示した また、熱酸化処理によっ 基板表面に非導電性の酸化膜層を形 成させる とで、基板固有の浮遊容量を膜厚に応 減少させた _SOIをセンサー素子

の基板とし 用いる とで精密 微細加工と電気特性の向 の両者を実現する と

で た また、半導体材料であるシモコンを用いる と 微細加工技術を駆使し 素子

の微細化や電子回路の集積化による超 型素子の開発を期待する と で る

参考文献

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