ホウレン草における光合成電子伝達反応活性へのオゾン被爆の影響 II
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(2) 44 の濃度に稀釈して，曝露箱に導き，試料植物に被曝さ. せた。この稀釈のための空気には，コンプレッサーか らの空気を精製して用いた。即ち，三酸化クロム含浸. の游紙を用いてSOxを除去し，オゾンと活性炭を用 いてNOxを除去した。装置の図は回報5）に示した通り. である。オゾン濃度としては0．08ppmから1．9ppm の間を選び，被曝時間は2時間（実験の都合により！ および3時間のものを含む）とした。オゾン曝露に先. 1. 2. 一幽. のもとで，空気のみを流速51／minで30分間流した。. 6. 4ノ. だって，試料植物を曝露箱に入れ，光照射（東芝FL 20S BRF植物用とFL20SW白色蛍光灯で約3，0001x）. 5. 曾→. 1：Light source for the spectrophotometer，. 2：Monochromator，3＝Cell，4：lnter圭erence. 次いで上記濃度のオゾンを含む空気を5．2∼5．51／min. 丘lter，5：Photoelectric tube a且d ampli丘er，. で2時間流した。曝露箱の容量は181である。曝露中. 6：Recorder，7：Microscope lamp，8＝Heat. の空気は30分毎にサンプリングし，オゾン濃度を中性. abSOrbing 丘lter an（玉 CUt・OfE且lter. ヨウ化カリウム法により求めた。ブランク実験とし. Fig．1Spectrophotometer for the measurement. て，曝露箱に植物試料を入れ，オゾンを含まない空気. of the photosynthetic electron transport. を同様にして流して測定を行った。. 2．3葉縁体の単離. 反応の場合は614nmに透過極大を持つ干渉フィルタ. オゾン被曝後の試料から葉を採取，水洗いしさらに. ーを用いNADP−Hi11反応およびDPIP｝玉2−NADP光. 蒸留水でよくすすいだ後，水分をふき取って，サラン. 還元反応については，340nln付近に透過極大を持つガ. ラップに包み，冷蔵庫中で約30分冷却した。一方，サ. ラスフィルターを用いた。. ッカロース68．5g，塩化ナトリウム0．58g，リン二一. 2．4．1DPIP−Hi11反応活li生の測定. 水素ナトリウム1．78g及びリソ二二水素カリウム1．70. 光化学系1の活性を表わすDPIP−Hill反応活性につ. g，アルブミン0．5gに再蒸1留水を加え溶解後，水酸化. いては，葉緑体に対し人工的電子受容体として酸化型. カリウム水1容液でpH＝7．0土0．1に調整し，再蒸溜水. の2．6ジク・・フェノールインドフェノーノレ（DPIP）. により正確に500m1とし，緩衝溶液として冷却保存し. を与えて光照射し，DPIPの光還元速度を測定して活. た。冷却しておいた葉は，茎の部分を除いて細断し，. 性を求めた。. あらかじめ冷却しておいたホモジナイザーのカップに. 先ずDPIP−Naの水溶液と前記の緩衝溶液および再. 入れ，葉5gに対し約20mlの割合で冷却した緩衝溶. 蒸溜水を照いて，614nmにおける吸光度を測定し，. 液を加え，氷冷しながら18，000r・p・m．で30秒間破砕. DPIP濃度（μM）と吸光度の関係からμM吸光係数. した。この破砕液をまず8層のガーゼを通してよく絞. ε（1μmol−1）を求めた。. り，さらに16♪≧1のガーゼで瀕過した。濟液を2，000G. 次に遮光した試験管に400μMDPIP溶液0．2m1，. で50秒間冷却遠心分離して，葉緑体を沈殿させた。こ. 再蒸溜水2．8ml及び葉緑体を緩衝溶液中に懸濁した. の沈殿した葉緑体を少量の緩衝溶液に懸濁し，使用す. 溶液1ml（クロロフィル濃度3∼4μg／ml）を入れ. るまで冷却保存した。. て二二後，光照射しながら614nmにおける吸光度の. 2．4 光合成電子伝達反応活性の測定. 1分当りの減少量4A（min隔1）を測定した。また，再. 光合成電子伝達反応活性のうち，光化学系1の活性. 蒸溜水3．Om1と葉緑体懸濁液（緩衝溶液中）1mlを. はDPIPH2−NADP光還元反応活性から求め，光化学. 混合したものについても，嗣様に吸光度の1分当りの. 系丑の活性はDPIP−Hill反応活性から，また光化学系. 滅少量4B（miガ1）を測定した。. 全体の活性はNADP−Hi11反応活性の濁定から求めた。. クPロフィル濃度はAmonマ｝の方法により測定し. いずれも励起光照射の可能な分光光度計により測定し. た。即ち一定の葉緑体懸濁液から80％アセトン水溶液. た6｝。Fig．1にその二念図を示す。図研7は励起光光. でクロロフィルを抽出し，分光光度計を用いて645nm. 源で，タングステンランプを使用し，途中8に赤外線. と663nmにおける吸光度を測定して，クロロフィル. 吸収フィルターおよびカットオフフィルターを挿入. 濃度C（μgmD）を算出した。 以上の測定からDPIP−Hill反応活性は，クロロフ. し，透過光の波長を650∼790nmとした。また受光部 の光電管の前4には，測定光以外の迷光を防ぐため，. 反応に応じたフィルターを入れた。即ち，DPIP−Hill. ィル 1mg， 1時間当りに光還元されたDPIPの量 （μmol）として，次式から求めた。.
(3) 45. 出した。この場合NADPHの340nmにおけるμM. 反応灘一（4A−4B εC）×60 （μrnol reagent red． mg Ch1． h）・・…・……・…・・（・）. 吸光係数εとして6．3×103（1μlnol−1 at 25。C and. pH＝7）を用いた。クロロフィル濃度はDPIP−Hi11反 2．4．2聾ADP・1狙1反応活性の測定. 応の場合と同様にして求めた。. 光化学系全体の活性を示すNADP一美｛ill反応活性の. 2．4．3DPIPH2−NADP光還元反応活性の測定. 測定には，人工的電子受容体としてNADPを与えて. 光化学系1の活性を表わすDPIPH2−NADP光還元. 光照琳し，NADPの光還元速度を測定することによ. 反応では，未詳物質QからブラストキノンPQ（Fig．. り活性を求めた。. 2）8｝への電子伝達を阻害するDCMU（3一（3，4昭ichlo−. 遮光した試験管に再蒸溜水2．8ml，3mM NADP. rophenyl）一1，1・dimethylurea）の存在下で還元型DPIP. 水溶液0．2ml及び葉緑体を緩衝溶液中に懸濁した溶. を人工的電子供与体として与え，NADPを人工的電. 液1m1（クロロフィル濃度3∼4μgml柵1）を入れて. 子受容体として与えて光照射し，NADPの還元速度. 手竃絆後，光照射しながら340nmにおける吸光度の時. を測定して活性を求めた。. 間変化」A（miガ1）を測定した。 また葉緑体懸濁液. 遮光した試験管に再蒸溜水2．4m1，400μMアスコ. （緩衝溶液中）1m1と再蒸溜水3mlを混合したもの. ルビン酸水溶液02mL 400μM DPIP水溶液0．1m1，. 定した。. 4mM NADP水溶液0．2m1，葉緑体を緩衝溶液に懸 濁させた液1mlおよび400μM DCMUメタノール溶. NADP−Hi11反応活性はクロロフィル1mg，1時聞. 液をこの順に加えて，よく麗搾した。この溶液につい. 当りに光還元されたNADPの量（μmo1）で表わし，. て，光照射しながら340nmの吸光度の時間変化4A. ここに求めた4AおよびjBの樋を用いて（1）式から算. （min 1）を測定した。また再蒸溜水2．9m1，葉緑体. についても嗣様に吸光度の時間変化4B（min−1）を測. Z（P430） 一〇．5. ／ Fd ノ. Rd ／ NADP. 9. ／. PQ 7 ’. ＝ 讐 hレ夏. 四. Q（C550）. PS−1. 0. DPIP. 雪占，〆ytf. 重. PS−iI. ・8＋0．5. 2. 02. ，一群1㌔0. hレ2 ≒. ＋1．0. E. Chl一、リ，／1 （P680）. PS−1：Photosystem−I PS−1玉：Photosystem色取. Chl．：Antenna chlorophyl NADP＝Nicotinamide aden1n dinucleotide phosphate. Rd；Ferredoxin−NADP reductase Fd：Ferredoxin Z（P430）：Primary electron acceptor of PS−1. 王）Q：Plastoquinone P700：Trapp玉ng center of pS護. PC：Plastocyanin Cyt、 f：Cytochrome f Q（C550）；Primary electron acceptor of PS−II Y2（P680）：Trapping center of PS＿II. YI Reducing substances Fig．2 Photosynthetic electron transport system in higher p互ants.
(4) 46 ygt?eq?l{1ml)tsxoeDCMUsfi7-ivusmao.Imlig DPIPH2-NADPXma'J-[5ZMS;}Ei'itke&,ik.6ofg6r mef.FLkigeitrc-[)Lx-cts,pmectzcu-cnYtRE{ictiB MuNv(,NADP-Hillis(ms}it･hltcDzaa,tre1ee(1)SlhN6. (rnin-') igVlll7ELtc. ell'bt)ko Table 1 Effect of ozone fumigation on the photosynthetic activities of chloroplasts and observation of leaves ?#iM;f･/j.gecgOF'1 ,O,L.Des,e, I/ v.ny (. PS-I Act.. "mol. c). NADPhred. ). (ReS)I. e). 22tl) l.(. PS-II Act,. "mo! DPIP red.. mg ChL h. mg Chl. 1-1 ( 7). i '". i. 132.0. 74.5. leo.e. i O.28×2. 44.8. 60.1. 1-3 ( 7). L12×2. 53.9. 72.3. 2-l ( 9). o.oo. 73.e. 94.3. 12e.5. 2--2 ( 9). o. oo. 81.7. 105.6 leo.o. 2--3 ( 9). O.23×2. 77.4 46.6. 2-4 ( 9). O.47×2. 54.9. 2-5 ( 9). L19×2. 2-6 ( 9). 1.49×2. 1-2 ( 7). o. oo. +÷ ---. Average. 2-7 ( 9) 3-1 ( 9). +. + { /. SIOgi IEII. 1.49×3. ll6.9 I. d) l･. (Rel. i Act.) I･ '. f) d) NADP--Hill Act. (Rel.. ) ,., I( ftmol NADP. mg Chl. h. ieo.o I 88.6 il. I 76.6 I-. red.. ). Act.). (%). 115.9. 100.0. 46.4. 40.0. 55.2. 47.6. 106.0. 90.8. 102.3. 106.9. 94.0. 86.7. 97.6. 113.7. 100.0. 88.8. loo.e. 60.2. 190.1. 167.2. 45.9. 70.9. 85.5. 75.2. 54.7. 5L7 6L6. 52.0. 67.2. 78.2. 68.8. 64,6. 72.7. 44.2. 57.1. 86.6. 76.2. 54.7. 6L6. 52.5. 67.8. 82.3. 72.4. 58.2. 65.5. 101.3. 107.0. 94.7. 100.0. 106.5. E. 11s.o I. IOI.1. 115.0 134.0. 84.6. g3.s I gl.4 l. 92.6. 100.0 'I. 134. 9. l 78.8 I, 60.3 ll. 121.0. 3-2 ( 9). 86.6. 3-3 ( 9). Average. 155.7. 3-4 ( 9). I O.12×2i. 73.0. 3-5 ( 9). I O.38y2,. 55.8. 3-6 ( 9). l- O.48×2 il. 60.9. 65.8 i. 128. 9. 3-7 ( 9). 68.4. 73.9. 139.4. 3-8 ( 9). I 1.09×2I I 1.32×2I. 619. 66.8 i-. 106.4. 3-9 ( 9). I- 1.ssx2 I- + I-. 49.8. i 53.8 I-. 112.5. 4-1(13) ii･ O.OO I･･･'. 79.1. 100.0. 4-2 a3) i':. o.nx2 l/ -i. 63.4. 80.2. 1 ltIIIi. gl:[lii il'gl,Og. 62.0. 97.0. 126.4. 85.2 i gg.3 I ns.4 l, ioo.o I. 88. 1. 93.0. 94.7. 100.0. sg.7 I 93.7 I. 69.3. 73.2. 64. 5. 68.1. 95.6 i･. 64.8. 68.4. 52.5. 55. 4. 37.2. 39.3. 57.3. 60.5. f. 89. 7. 100.0. I. 71.6. 79.8. l/ 103.3 I i' 78.9 I I 83.4 l. i. '. i'. 68.5. 98.4. 85.6. 100.0. 65.8. lo3.o l. 70.6. 101.4. 85.6. 100.0. 63.9. 100. 0. 69,6. 85.6. IOO.O. 67.0. los.o I. 68. 8. 100.0 98.9 l/. 82.5. 96.4. s--4(13) li o.ogx2 I. -i. 65.I. 101.9 1/. 7L2. 102.3 l/. 75,9. 88.7. s-5(13) ll e.20×2 I- - il. 47.2. 73.9 I. 70.7. 101.6 l.. 80.7. 94. 3. 8L 2. 92.1. 84.3. '"' I.. 95. 2. 107.9. 78. 5. li 'l O.30×2 1･ - I /tI' o.12x2I -II lt. 88.8. leo.o. 103.6 96.4 100.0. ･l. Et-geEa,g8 '1, ,.,,×i il - il. 6-i ao) I I. 6-2(le) I I Average I [ 6-3 (10) I 6-4 (10). o.oo ･-, o.oo. 85.7. 78.0. I. 8L 4. 97.2 l･. 67. 1. s8.4 lI. 79.6. ii ll. 75,3. 91.1. go.e. 108.8. l. 82. 7. l. 100.0. 74. 4. 90.0. 81. 9. 99.0. 82.4 1 97.8 j. a) Spinach (Atlas): 1-1 te 1--3, sowed on Sept. 11. 1979, 2unI to 2--7, sowed on Sept. 22. I979, 3--1 to 3-9 and. 4-1 to 4-2, sowed on Oct. 11. 1979, 5-1 to 5-5, sowed on Nov. 9. 1979 and 6-1 to 6-4, sowed on Dec. s. 1979 b) Degrees of injury expressed by the sign -: not detectable, by the sign +: mediurn injury and by the sign + -l-: severe injury. c) Photosystem--I activity: DPIPH2-NADP photoreduction rate d) Relative activities expressed as a percent of the average values (figures with underline) of the blank. experlments e) Photosystem-II activity: DP}P-Hill reaction rate f) NADP-Hill reaction activity; total photosystem reaction rate.
(5) 47 これらの値を縦軸に相対活性（％），横軸にオゾソド. 3．結果および考察. ーズ（オゾン濃度（ppm）x曝露時間（h））として表わ. 描物試料を種々の濃度のオゾンに一定時間曝露した. すとFig．3， F19．4およびFig．5のようになる。横軸. 後に葉を採取し，葉緑体を単離して，その光合成電子. にドーズをとったが，これはドーズが等しければ曝露. 伝達反応活性を測定した結果をTable 1に示す。反. 効果が厳密に等しいことを確認した結果ではなく，曝. 応活性は，光化学系1，光化学系∬および光化学系全. 露時間の異なる実験結果を罵一のグラフ上に表わすた. 体について測定したものである。相対活性は，オゾン. めに便宣的，近似的にとった手段である。実際には大. に無被曝の試料の活性の平均を100として表わした，. 部分の実験の曝露時間が2時間であるから，問題はな. それぞれの活性のパーセントである。なお，試料の栽. いと思われる。. 培時期等の影響を出来る限り除くため，無被曝試料の. 図および表から瞬らかなように，可視障審は2．4. 活性は被曝試料と同時期にまいた試料についてその鶴. ppm h以上で現われている。この値は前報の結果と. 度測定した。オゾン被曝の時間は主として2時間とし. はよく一致しているが，既に報告されている値（0．05. たが，実験の都合上1時間および3時間のものも含ん. PPm×1∼2hg’，0．07∼0．02PPm×2hlo’等）に比べ. でいる。. るとやや大きい。これは試料の違いのほか，曝露時の. 苫O vislble. ▽Σsible. i員コury. 120. inゴury. △. ワ. 100 つ ≧. 、. ♂. R. 緊60 〒8. sowed on SePヒユ1. 口. 露. Sept22. o. ●. Qct．11. ▽. 鱒. 鼓ov．7. ◇. n. Dec．5. 、. ＼ ◇. ＞80 【L’. ’唱. ▲. Samples. Qδ. ▽、＼ o o ▲. 。△＼途・2一一一＿＿．＿二一．＿．一．＿．＿一＿i．．， 嶺 ●. ￡睾4。 ε筍 。歪. 20 Q 0 1 2 3 4 5. 0zone dose（ppm h） Fig．3 Relation between DPIPH2−NAI）P Photoreduction activity（PS＿1）and ozone dose. 雀20. 沿0 な 忌8。. 、又 ▽ o ▽◇＼、 o . o’ム 、＼. ◇ 、、、 ●. ロ 、∼一∼一＿＿＿一一￡＿＿＿』＿一＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿一＿. 隣 署・・. 麺 ？ξ4。 呈量. 20. o. 践ovisible injury △. Visible inゴury ▲. SaπしP主es. sowed on Sepしユ1. 口. 墜. o. Sepし22. ●. Oc仁，U. ▽. 唇. Nov．7. ◇. 一. Dec．5. o 0 1 2 3 4 5 0zone dos2 （ppm h・） Fig．4 Relation between D王）IP−Hill reaction activity（ps−1王）and ozone dose.
(6) 48. N。。i，ibl。［vi。ib1。 S。預Ples. ・・」・r一・喰y ・・噸・・. 120. ム. ▲. ロ. 田. 。. 。. つもロエエ. 、。；し2，. 100. ヲ・ ◇. ▽. ＼ ▽. ◇. 『◇＼. 寡. 一80 宅 ξ6。 含ぎ. Ocし hL l：∴. 、 O 、. o、. o. ＼ ＼go 灘 、 、［し 国 ● 、、『一一一一一一一一〇一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一嚇一一一 口. ▲. 琵蜜. 警篇40. 02. △ o. ￡象. 20 0. 0 1 2 3 4 5 0zone dQse （pprn h） F圭9．5 Relat玉on between NADP−Hill reaction activity（total PS）and ozone dose. 照度，湿度等実験条件の違いによるものと考えられる。. 可視障害の現れない濃度範囲においても，光合成電. h）においても光合成電子四達反応活性には低下が 検出された。. 子｛云達反応活性は，いずれも明らかな低下を示した。. 2） 光化学系∬の活性低下は光化学系1及び光化学系. 例えば，1．Oppm hにおいて，光化学系1と光化学系. 全体の活性低下に比べるとやや小さいことが示され. 全体活性では約40％の低下を示し，光化学系皿活性は. た。. 約20％の低下を示した。Fig．3とFig．5を比較すると. 3） 光化学系1と光化学系全体の活性低下の傾向はほ. 明らかなように，光化学系1と光化学系全体活性の低. ぼ等しく，光化学系の阻害の中では，光化学系王の. 下の傾向は極めて類似している。そしていずれも光化. 阻害が支配的であることが明らかになった。. 学系Hの活性の低下（Fig．4）より著しい。 このこと. から考えて，光化学反応系の中でも，光化学系1の活. 5． 謝 醇. 性の低下が系全体の活性の低下を支配しているものと. 本研究を行うにあたり，植物試料の栽培について有. 思われる。. 益な御助言を賜った横浜国立大学麻生武夫教授に心か. Ng．3とFig．4を比較すると，データにばらつきは. ら感謝の意を表する。. あるが，低濃度（0。3ppm以下）での活性低下は光化. 学系1の方が系∬より著しい。光化学系1は葉緑体ラ. 文. 献. メラ欝造中のチラコイド膜の外側に近い部分に存在す. 1）松中昭一，cぐ指標植物”，講談社（1975）. るとされ，光化学系皿は内側に近い部分に存在すると. 2）W．MDugger，1． P。 Ting， Ann， Rev． Plant. されている1U12’。従ってオゾンによる損傷は，先ずチ. Physio1．，21，215（1970）. ラコイド膜の外側の部分の不活性化から始まるのでは. 3）遠山益，遺伝，30，7，47（1976）. ないかと推測された。. 4） 菅原淳，近藤矩明，島1埼研一郎，霞添生物環境. 菅原ら13｝1｛）はSO2曝露により光化学系匪の活性，. 調節学会第15回大会講演要旨集（1977）. すなわちDPIP一口ill反応活性が特異的に阻害されるこ. 5） 粟屋優，村林真行，松野武雄，横浜国大環寛研. とを示している。測定条件の違いの影響がないものと. 示己要， 6， 1， 59 （1980）. すれば，これはSO2の場合とオゾンの場合とで電子. 6） 日本生化学会編，“生化学実験講座12：エネル. 伝達反応阻害の機構が異なっていることを示している. ギー代謝と生体酸化”，東京化学同人（1976）. ものと考えられる。. 7） D，J． Arnon， Plant PhysloL，24，1（1976）. 4． 総 括 1） 可視障害の現れないオゾンドース（0．2∼2．4ppm. 8） 加藤栄，“光合成入門”，共立出版（1973） 9）C．S． Bra且dt， W． W・薮eck，更虻Air Pollution”，. 2nd Ed．， voL I， Academic Press（1968）P．401.
(7) 49 10）大喜多敏一，（佐々木忠義他編），“環境工学”，. ／3）島崎研一郎，菅原淳，国立公害研究斬特別研究. 言緯［淡老L （1977）. 成果報告R−2，35（！978）. 11） 柴日ヨ不日法焦， イヒ学総貢兇， 12， 45 （1976）. 14）島崎研…郎，菅原淳，岡田光正，滝本道明，国. 12）A．Trebst， Ann． Rev。 Plant Physio1．，25，45. 立公害研究所特別研究成果報告R−2，47G978）. （1976）.
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