東北大学遺伝生態研究センター年報 2000

東北大学遺伝生態研究センター年報 2000

著者

東北大学遺伝生態研究センター

発行年

2000-03

は じ め に

本年度は,第2次の｢遺伝生態研究センター｣が発足して2年目であります｡新

しく発足した各研究部門や各研究分野の計画も,旧センターでの研究実績を基盤に

してスムースに軌道に乗るようになりました｡今年度は本センターの各研究室や実

験室などの整備統合を行い,教職員や学生がより密接な協力と情報交換が図られる

ようになり,研究活動がより機能的に行われるようになりました｡

本センターは全国共同利用施設であるため,全国の卓越した研究者と共同研究や

ワークショップを通して,より広い見解にたった多様性のある研究が可能でありま

す｡さらに本センターは｢遺伝生態研究｣の発祥の地として,またその中核的拠点

としてCOE機関に指定されております｡そのため外国人研究員, PD-F研究員,技

術補佐員等による強力な支援を受け,各部門分野での研究計画は加速的に進展しつ

つあります｡特に本センターが重点的に行っている｢遺伝的多様性を獲得するため

の配偶子形成における生物分子機構｣および｢持続的農業および環境保全を目指し

た植物と微生物の遺伝生態的解析｣のプロジェクト研究は順調に進み, 2年計画で

あった後者の研究は本年度一応の成果を得ることができました｡

本センターにおける研究組織,運営,研究計画や成果に関してはセンター外教授

も参加する運営委員会,共同研究および重点研究,そしてワークショップの計画と

成果に関してはセンター外の学内･学外教授や有識者の参加する運営協議会,さら

に重点研究プロジェクト研究の内容と成果に関しては国内外の研究者の参加する

ワークショップによって磨きをかけられ,そして学内外の専門の研究者による評価

委員会によって評価と助言を受けております｡このような諸委員会は,本センター

の種々の活動をより一層活性化するのに極めて有意義なものとなっております｡

今年度は国立大学の独立法人化など話題の多い1年でしたが,本センターでは常

に初心に帰って研究を遂行していく所存でありますので,関係各位のさらなる御支

援と御鞭鍵を心からお願い申し上げる次第です｡

平成12年3月

遺伝生態研究センター長

大 瀧   保 一一一 1

-日   次 は じめ に

第1章 遺伝生態研究センターの概要

1沿革,設置日的,運営

第2章 研究活動

1各研究分野の研究活動

2 研究業績等 7  8  9 3 COEの形成に係る中核的研究機関支援プログラム --- 45

第3章 共同研究等

1平成11年度ワークショップ報告 2 平成11年度重点共同研究報告 3 平成11年度一般共同研究報告

第4章 教育活動

大学院教育(大学院学生一覧)

第5章 刊 行 物

刊行物一覧〔昭和63年度∼平成1 1年度〕 ◎IGEシリーズ目次(No.27･28) ◎センター通信目次(NS No.3-6) - 3 -9  5  1 4   5  6 1   2   4 9  9  9

1沿革,設置日的,運営

(1)沿革 昭和14年8月1日 昭和24年5月31日 昭和63年4月 8日 平成 4年4月1日 平成10年4月 9日 昭和14年8月1日勅令第521号(官制)により農学研究所設置 国立大学設置法により東北大学附属研究所となる 国立大学設置法施行規則の一部改正により,遺伝生態研究センターに転換 ｢生態生理研究部門｣, ｢適応生態研究部門｣, ｢遺伝子生態研究部門｣, ｢環 境情報研究部門｣及び｢生態システム(客員)研究部門｣の計5研究部門 で発足 新たに｢臨界生態遺伝研究部門｣が設置 国立大学設置法施行規則の一部改正により,遺伝生態研究センターに改組 ｢遺伝子多様性研究部門｣及び｢環境変動遺伝生態研究部門｣の2大研究 部門の中に,それぞれ3研究分野を配置し, 6研究分野体制で発足 (2)設置日的 遺伝生態研究センターは, ｢生態系における生物種の遺伝的基礎に関する研究を行うと同時に, 国立大学の教員その他の者で,この分野の研究に従事するものの利用に供する｣研究機関として 設置され,種々の要因が作用し合う複合環境の変動に対して,植物や微生物がどのように反応し, 適応していくかなどの問題を,それぞれの生物の持つ遺伝子の多様性の面から解析することを目 的とする｡ (3)運営 (∋ 組織･運営体制 本センターには,その組織,人事,予算その他運営に関する重要事項を審議する｢運営委員 会｣及び,その共同利用に関する重要事項についてセンター長の諮問に応じる｢運営協議会｣が 設置されている｡ 運営委員会は,本センター教授6名,助教授6名及び学内他部局の教授3名により構成され, 運営協議会は,本センター教授6名,学内他部局の教授3名及び他大学の教授4名により構成 されている｡この運営協議会の下には,内規に基づき,本センターの共同研究計画等に関する 専門の事項を審議するための｢共同利用･共同研究専門委員会｣, ｢採択専門委員会｣及び｢研 究評価専門委員会｣が設置されている｡ また,運営委員会審議事項の検討及び議題整理のため,本センター教授･助教授により構成 する｢教授会議｣が置かれている｡ 研究部門･研究分野,実験施設,事務部の構成は,次頁の組織図のとおりである｡ (参 研究支援体制 本センター内には,研究活動を支援するため,施設整備委員会,図書委員会,共通施設運営 委員会など各種委員会が設けられている｡ また,電子顕微鏡操作,ラジオアイソトープ管理,実験植物管理,大型機器管理など特殊技 能を有する技官等による支援によって,研究活動は円滑に行われている｡

- 7 -2 組 級

- 8 -3 職   員 (平成12年2月1日現在) センター長(価)教授大瀧保 【研究部門.研究分野】 劍 倬ik YH ｢ ■遺伝子多様性研究部門 ﾈｬ(ｺｹ¥ :闔)6 i HﾊHｸiYInR 倬ik +xﾛ): 8ｶ ｸ 駝 ｧﾈ ﾂ ●遺伝子環境応答研究分野 ●臨界環境遺伝生態研究分野 教授大瀧保 教授熊谷忠 乂ﾉ+yY 皐 x r 助教授片岡博尚 助教授佐藤雅志 偃YD96饐8ﾏ 助手官署厚 助手日出間純 偃YD9 ｸﾋHﾏiOﾈ ｸ檍ﾇhｧﾈ ﾂ 技官金野弘記 中核的研究機関研究貞 技術補佐員千葉あけ美 成日慶 技術補佐員山口弘子 乂ﾉ+x汯 菇Oﾂ 益D8ﾛ( 盈姥育 ●遺伝子機能制御研究分野 ●地圏環境遺伝生態研究分野 教授亀谷義昭 劍駟k ｪ ﾉ{

助教授塩月(菅野)明 教授南洋究 倬ik ^(ﾛ(什$ nﾉ 2 ｸｺI: y駅 ｧﾈ ﾂ

助手庄司舜- 助教授三井久幸

中核的研究機関研究員 助手佐藤孜

中表沫 学術振興会外国人特別研究員 乂ﾉ+yY 68自

技官東海林英夫 AdelElsayedElbeltagy 日本学術振興会特別研究員 遊橋健一 偃YD8ﾝi: yz( ｹ ﾘ ｨ ﾂ

●遺伝子適応生態研究分野 教授高橋秀幸 生物系特定産業技術研究推進機構派遣研究員 倬ik ｪ ｸﾋH支 ｸｵｨｪ ｨ ﾂ 助教授東谷篤志 宮木太郎 助手藤井伸治 技術補佐員西岡きよ 教務職員西洋武明 技術補佐員東海林比呂子 亰ｨｪ ｩ 委X 中核的研究機関研究員 陳森 技術補佐員鈴木理 亰ｨｪ ﾄi$ｨｵh爾 ●遺伝生態情報システム碗究分野 教授津田雅孝 助教授永田裕二 助手石栗義雄 中核的研究機関研究員 安価尚志 〔客員教授〕 教授(併)百町満朗 (岐阜大学農学部) 【実験施設】

◆湛水生態系野外実験施設◆遺伝子実験室◆電子顕微鏡室

主任.助教授(併)主任.教授(併)主任.教授(併)

佐藤雅志津田雅孝大瀧保

技官-候邦夫◆ラジオアイソトープ実験室◆温室.ガラス室 ◆環境制御実験室主任.助手(併)主任.教授(併) 主任.助教授(併)佐藤孜亀谷寿昭 佐藤雅志 教務職員武蔵昭一

1各研究分野の研究活動

■遺伝子多様性研究部門 当研究部門では,光,重力,温度そして水分など環境要因の変化,およびこれらの要因の作用し合 う複合環境の変動に対して,生物の形態形成や行動,そして生活や生態がどのように変化し,適応し ていくか,また遺伝子を改変された生物が生態系の中でどのような動態を示すかを,生物の有する遺 伝子(秤)の違いや変異性から解明することを目的としている｡ 〔遺伝子環境応答研究分野〕 当研究分野においては,特に光や重力そして温度などの環境要因の変化,およびそれら要因の複合 的な変動に対する微生物や植物の形態形成や生殖の変化の機構を,これら生物の有する遺伝子群の多 様性と発現調節に視点を置きながら,遺伝学,分子遺伝学,細胞生物学および細胞生理学的な手法を 用いて解析を行っている｡具体的には接合菌類に属するヒゲカビ(Phycomyces)やミズタマカビ (Pilobolus),それに黄色藻類に属する( Vaucheria)を使用し,これら多核体に特有な核間の相互関係, 細胞の場と核の機能発現すなわち遺伝子発現との関係,光や重力刺激受容体と刺激受容部位の同定,刺 激応答反応の解析,刺激受容から応答反応までの間を架橋する刺激伝達機構の解明をめざして研究を 行っている｡平成11年度における研究課題と成果は次の通りである0 (1) ミズタマカビ胞子の2核性の解析:ミズタマカどの胞子は,その98%以上が2核性である｡こ れは他の菌類と比較して極めて特異的である｡この原因を明らかにするため,若い原胞子(protospor-e)の核数をDAPI染色によって調べたところ多くの1核原胞子が観察された｡また透過型電子顕微鏡 による観察でも1核性の原胞子が多く観察され,これらの結果からミズタマカビにおいては,ヒゲカ ビとは異なって初め1核性の原胞子が形成され,その後1回の核分裂によって2核になるものと推定 された｡これを遺伝学的手法を用いてより直接的に証明するために,遺伝的マーカーとしてカロチン 合成に変異の起こった突然変異体の単離を試みたところ,目的とする白色変異体の単離に成功した｡現 荏,もう一つの必要変異体である赤色変異体の単離を行っている｡この胞子の2核性は培養時の光条 件(明暗や波長)によっては影響を受けないが, 25度以上の高温では3核以上の胞子の出現頻度が増 加した｡ ■      (鄭 明淑,宮寄 厚,大瀧 保) (2)ヒゲカどのキチン合成酵素遺伝子の解析:ヒゲカビ(Pb)の菌糸や胞子葉柄の細胞壁は,比較 的多くのキチンやキトサンを含む｡光屈性,重力屈性,それに接合反応などヒゲカビにおける刺激応 答反応は,細胞壁の伸長の偏差やダイナミックな形態的変化を伴って起こる｡換言すれば,これら環 境応答反応には細胞壁の構造や生理的機能を制御している遺伝子(群)の発現が関与していると思わ れる｡本研究ではこれまでヒゲカビには10個のキチン合成酵素(CHS)遺伝子群が存在すること,そ の中で推定8.2kbのmRNAを転写しているPbSMl (PbCHS8)遺伝子をクローニングすることによ り接合菌類でははじめてクラスVのCHS遺伝子に属すること,その遺伝子に連続する上流にミオシ ンモータ一様ドメインが存在することを明らかにした｡さらに,野生株と種々の変異株を用いたノザ ン･ハイプリダイゼ-ションから菌糸や胞子嚢柄形成,有性生殖など異なる発生段階においては異な るCHS遺伝子群が発現している可能性を明らかにした｡また,他の接合菌類におけるPbSMl遺伝子 -

13 -の保存状況をサザン･ハイプリグイゼーションにより解析した｡ (三岡周子,宮等 厚,大瀧 保) (3)ヒゲカどの重力刺激受容体の検索:ヒゲカどの胞子葉柄は重力刺激に反応して負の屈性を示 す｡しかし,この重力刺激受容体に関する研究はほとんど行われてこなかった｡われわれは胞子嚢柄 内に存在する直径数〟mのタンパク質性の結晶体が重力刺激を与えてから短時間の内に沈着する現 象を兄いだし,これが一種の平衡石(statolith)として作用しているのではないか考え,その検証を行っ た｡また,重力屈性を示さない突然変異体の単離も試み,いくつかの候補株を得ることができた｡ (堀江直司,官尊 厚,大瀧 保) (4)細胞性粘菌の子実体形成の解析:微生物の形態形成を遺伝子レベルで理解するため,細胞性粘 菌の子実体形成時に発現するcDNA群をクローン化し,遺伝子破壊株作成用のプラスミド群を構築す ると共に,クローン化した遺伝子の塩基配列の解析を行った｡今後はこれらの遺伝子を基に,ヒゲカ ビ1こおいてホモロガスな配列を持つ遺伝子(群)が存在するかを検討する予定である｡ (高本耕三,官署 厚,大瀧 保) (5)青色光による側枝誘導: 1)黄色植物(ストラメノパイル)に属する多核細胞フシナシミドロ (Vaucheria)の細胞基部の狭い領域を適当な強度の青色光で照射すると,最短4時間で,照射域の中 央に成長点が誘導される｡青色光照射後の細胞内の変化,とくに,葉緑体集合(弱光定位運動),核の 集合,微小管束の形態,位置,および配向の変化を蛍光顕微鏡や電子顕微鏡を用いて観察し,各種の 阻害剤を用いて成長点誘導の時系列制御過程を調べた｡ 1)葉緑体集合:青色光強度が10Wm-2以下 のとき,青色光照射開始直後から照射域へ扇平紡錘体状の葉緑体が集合をはじめ, 30分後には照射域 は1層の葉緑体で占められる｡赤色光は無効である｡ 3時間後には原形質外層は3-4層の葉緑体で占 められるが,興味深いことに,葉緑体は表面に垂直に向きを変え密集している｡光の捕捉捕効率を高 めるのに役立っていると思われるが,その機構は不明である｡葉緑体の集合はcytochalasin A(B,C, Dは無効)によって阻害され,微小管脱重合剤Amiprophos-methyl (APM)では阻害されないことか らアクチンが関与すると考えられる｡ DCMUは葉緑体集合は阻害しないが枝の発生を阻害,あるいは 著しく逼らせる｡このように葉緑体集合は(光合成による)エネルギー供給源として間接的に枝発生 に必要であるが十分条件ではない｡ 2)核の集合:葉緑体より内側に存在している多数の核も,葉緑体 にやや遅れて,原形質とともに隣接領域から照射域へ移動を始める｡ 3-4時間後には,照射域の液胞が 分断されるほどに内部空間が原形質で埋められる｡時系列解析と各種の阻害剤の効果から,核が集合 することが枝発生誘導に必須であることがわかった｡微小管を破壊するAPMは核の集合を完全に阻 害し,枝は発生しない｡ 3)遺伝子発現: Actinomycin Dは核集合は許すが,枝発生を阻害すること から,集合した核による遺伝子発現がさらに必要であることがわかる｡照射域の中央の細胞壁直下に 分泌小胞からなる透明な斑点が生じ,約30分後にこの斑点は外に向かって突出し,原形質が流れ込む と同時に突出部が新しい枝として活発な先端成長を開始する｡既存細胞壁の溶解と新生に必要な分泌 小胞の生産が集合した核の遺伝子発現によって開始されることを示す｡活発に成長中の先端には常に 核が集合しているので,核の集合は先端成長に欠くべからざる条件と考えられる｡ 4)核の移動機構: 核の集合がAPMで強く阻害されること,細胞軸に平行な微小管束の配向が青色光照射域でランダム に変わり短くなること,および,照射域での核数の増加と微小管乗数増加は平行していることから,核 の運動は微小管が関係する運動であることがわかる｡蛍光顕微鏡と電子顕微鏡による観察から, 1個の 核は頭部にある1対の中心小体近傍から前方に50-60/′mの長さの微小管束を伸ばしていることを発 見した｡この微小管束は10-30本の微小管よりなり,通常は細胞長軸に平行に配向している｡この微 -

14 -小菅束が核を引っ張って原形質の中を移動することを観察した｡運動機構や光制御機構を考察した｡ (片岡博尚,高橋文雄,大瀧 保) 〔遺伝子機能制御研究分野〕 当研究分野においては,人為的に遺伝子群(ゲノム)を改変した植物の作出と遺伝子の発現の制御 機構および種々の環境下における植物の動態に関する研究を行っている｡本年度の研究課題と成果は 以下の通りである｡ (1)遺伝子改変法の検討と改変植物の遺伝子発現

昨年に引き続き, LEA (Late Embryogenesis Abundant)遺伝子をアグロバクテリュム法により

ダイズとインゲンマメの種子に注入し,形質転換体を育成することができた｡これらの形質転換体の 後代(Rl,R2,R3)の遺伝子発現について解析したところ,これらはLEAタンパク質を生成しNaCl および水分欠の条件下で,非形質転換(対照)植物と比較して,明らかに成長阻害が少なく耐塩性,耐 乾性を示すことがわかった｡本形質転換法は組織培養による再分化系を必要としないので,広範の植 物に適用できることが期待されるので形質転換率に影響する要因(種子の状態,発芽条件,品種,植 物の種類など)について検討を開始した｡

ダイコン(Raphanus satiuus L.)とキャベツ(Brassica ole71aCea)の属間細胞融合個体と･コマツナ

(B. campestris)と接ぎ木キメラ植物の後代において, PCR法によって,ミトコンドリアDNAの解析 をおこなったところ,両系統ともオグラ細胞質への量的移行(substoichiometricshifts)の可能性が 示された(共同利用研究)0 (2)雌雄異株植物の性分化機構 雌雄異株植物であるアスパラガス(A頭wagus obicinalis)の性分化機構を明らかにするために,食 用アスパラガスの花器官形成遺伝子の単離及び遺伝子発現に関する研究を進めた｡双子葉植物の ABCモデルで働く遺伝子群のうち,クラスC,クラスBに属するAGAMOUS-like遺伝子及び DEFICIENS-like遺伝子のcDNA断片をRACE法により単離した｡またこのcDNA断片をプロー ブに用いて,ゲノミックサザンハイプリグイゼ-ションを行い,それぞれのコピー数が112であるこ とを明らかにした｡またノーザンハイブリダイゼ-ションにより,これらの遺伝子が花特異的に発現 していることを明らかにした｡ また,同花被花のユリ科植物のモデルを構築するために,ユリ(Lilium regale)及びチューリップ (Tulipagesneriana)より, ABCモデルに関与するMADS-box遺伝子群を単離し,その構造及び発 現パターンを解析した｡  (朴 珍姫,河内義景,エフェンデー,塩月(菅野)明,亀谷寿昭) わが国自生の海浜性Zoysia属の資源植物生態について,とくにそれらの耐塩性を検討している｡本 年度は南西日本の臨海域に認められたコオニシバ(Z.sinica)やナガミノオニシバ(Z.sinica var. nil)i,onica)群落の植生調査を継続するとともに,大隈諸島の一つで外洋に面し飛砂の激しい種子島(温 度指数155-180oC)の南部海岸において地形の影響を考慮し海浜植生と本属植物の分布を調査した｡ その結果,コオニシバは外海に面し高さ5-10mの砂浜上に,コウシュンシバ(Z. matrella)は飛砂 のない砂浜に,さらにコウライシバ(Z. paclka)は中新統の茎永層の海蝕砂岩台地下段の海岸や岩隙 にそれぞれ生育していることが判明した｡また太平洋岸を走る寒さの指数OoC線以南にある房総半島 南部の外洋海浜上に生育するオニシバ(Z. macrostachya)では, 12月中旬の開花が観察され,このよ うな開花現象については今後の研究にまちたい｡       (庄司舜-) -

15 -〔遺伝子適応生態研究分野〕 当研究分野では,生物が環境ストレスあるいは特定環境の条件下で生活するために有用な形質･遺 伝的変異性および反応の生理･分子機構を解明するための研究を行っている｡本年度の研究成果は,以 下の通りである｡ スペースシャトルによる宇宙実験の結果,ウリ科植物の形態形成が重力によってネガティブに制御 されていることを発見し,微小重力下におけるオーキシン制御遺伝子の発現解析から,その機構をオー キシン閥値説によって説明した｡さらに,宇宙実験にinsituハイブリダイゼ-ションを適用すること, また,微小重力下におけるオーキシンの動態を解析することにはじめて成功した｡われわれが単離･ 同定したオーキシン制御遺伝子(CSIIAA遺伝子群)のキュウリ芽ばえの重力形態形成における機能

とオーキシン応答性シスエレメント(Auxin Response Elements, AuxREs)の発現活性を解析する

為,最も顕著なオーキシン応答性を示す合成AuxREsであるccTTTTGTCTC配列を7回タンデ ムに連結したダイレクトリピートであるDR5 (7Ⅹ)の下流にuidAを組込んだキメラ遺伝子のキュウ リへの遺伝子導入を試みた｡また, AuxREsに結合し,トランス因子として機能するARF (Auxin ResponseFactor) cDNAのキュウリからの単離を行い,いくつかのポジティブクローンを得ること に成功した｡また,宇宙実験の結果から,微小重力下で発達した根が水分屈性を顕著に発現すること がわかり,われわれが重力屈性突然変異体およびクリノスタット微小重力模擬実験装置で明らかにし てきた水分屈性と重力屈性の関係を,宇宙環境下で初めて証明した｡ コムギのわい性品種が｢緑の革命｣をもたらしたのは有名であるが,乾燥地帯では特定の器官が極 端に伸長するコムギ品種が栽培されている｡すなわち,乾燥ストレスを回避する目的で土壌深く播種 されても出芽が可能な深播き耐性品種が存在する｡深播き耐性品種は第1節間伸長能力に優れている が,われわれは深播き耐性品種がジベレリンに超感受性であることを発見した｡すなわち,深播きで は14-15cmが限界であった第1節問長は(深播き非耐性品種では約518cm),ジベレリンの処理に ょって40cmにも達したが,他の品種ではこのようなジベレリン反応がみとめられないか,わずかな 反応(感受性品種の約20%)がみられただけである｡このとき,ひとつのジベレリン結合タンパクの 発現量に差異があり,ジベレリン処理によって,感受性品種ではタンパク量が増大し,非感受性品種 では減少することが明らかになった｡これによって,感受性品種では,ジベレリンによってネガティ ブ制御されるジベレリン受容機構が他の品種と異なっている可能性が兄いだされた｡一方,内生ジベ レリン量には品種差異が兄いだされなかった｡また,ジベレリンによる第1節間伸長には細胞壁分解 酵素活性と浸透圧の著しい増大を伴い,それが感受性品種では非感受性品種に比較して常に高いこと がわかった｡さらに,深播き耐性コムギのジベレリンによる第1節間伸長にはカリウムイオンが不可 欠であることを発見した｡これらの知見は,深播き耐性にジベレリンと浸透圧調整物質としてのカリ ウムが主要な役割を果たしていることを示すとともに,その分子機構解明とストレス耐性コムギ新植 物の開発に道を開くものである｡ 遺伝的多様性を獲得するための配偶子形成における生物分子機構を解明するための実験を線虫とオ オムギを用いて行った｡なかでも本年度は,線虫における減数分裂期の遺伝子組換えに関わるCe-rdhJ (RecA様遺伝子)とCe-mre-ll,ならびにその分裂周期の制御に関わるCe-ail-1(ヒトATM 関連様遺伝子)の遺伝子発現について, RTIPCRおよびin situhybridization法を用いて調査した｡ その結果,これらの遺伝子は成虫の生殖腺の減数分裂期の細胞で強く発現していることを確認できた｡ -

16 -また線虫の全ゲノム配列情報から約100個のprotein kinase様遺伝子を抽出し,現在までに約30個 の遺伝子発現を調べ,うち4個が幼虫期ではほとんど発現がみられず,成虫で特異的に発現誘導がか かることを明らかにした｡またオオムギに関しては,走査型電子顕微鏡を用いて,花芽分化期,花器 官形成期,減数分裂期とそれ以降の生殖生長の発生･分化過程を詳細に観察した｡また高温障害に感 受性の時期と処理条件を検討し,花粉母細胞の前減数分裂期に5日間の高温処理(30oC/昼, 25oC/夜) を行うことで,処理の5日目にはすでに荷内の花粉母細胞の配置と生育が不均一になることを兄いだ した｡その結果,その後適温にもどして生育を続けても花粉形成は完全に阻害され全く花粉の無い桁

ができることを明らかにした｡これら各発生段階から全RNAを抽出し, serial analysis of gene expression (SAGE)法による遺伝子発現の全体像の解析系を構築し,その解析をはじめた｡また,ウ リ科植物の花の性決定にかかわるエチレン受容体遺伝子を単離･同定することに成功し, CS-ETR2/ CS-ERSの発現が雌性系統において顕著で且つエチレン誘導性のあることを兄いだした.さらに,両 性雄性同株系統のキュウリは,このエチレンリセプターのエチレン誘導性を欠損しており,部分的に エチレン非感受性であることが示された｡これらの結果から,性表現型を説明する新たな遺伝モデル を提唱した｡ (高橋秀幸,東谷篤志,藤井伸治,西洋武明,陳  森,青木秀年,山崎聖司,高浪タカ子,鎌田源 司,阪田 忠,水野英俊,森 亮之)

■環境変動遺伝生態研究部門

〔臨界環境遺伝生態研究分野〕 今日,成層圏オゾン層の破壊による紫外線UVB量の増大や,大気CO2濃度の増大とそれに伴う温 度上昇など,地球規模での環境の変化が地球上の生物や生態系に及ぼす影響についての懸念が非常に 高まっており,その解明は世界的に緊要な課題となっている｡我々は,そのような地球環境の変化の なかで農耕地生態系に生息する植物や微生物の生活はどのように変わり,その変化が土壌に生息する 植物や微生物にどのような影響を及ぼすのか,ひいては,農耕地生態系はどのような変貌をとげるこ とになるのかに大変関心をもっている｡この課題に対処するために,われわれは想定される未来環境 を人工的に作りだし,そこで植物や微生物は未来環境にどのように適応し,作物生産はどのように変 化するのかを解析し,さらに,未来環境に適応した有用な植物遺伝資源の探索と新しい品種の作出の 基礎に役立たせる一連の遺伝生態研究を行っている｡今年明らかにした主要点を以下に記す｡ 1:イネのDNA損傷一光回復酵素誘導の光調節:連続暗黒下で生育したイネ黄化植物には,シクロ ブタン型ピリミジンダイマ- (CPDs)の光修復能は認められない｡黄化植物に短時間の青色光あるい は赤色光を照射するとCPD光修復能は誘導された｡この誘導効果は直後に与えた近赤外光によって 部分的に打ち消されたので,ファイトクロームによる光調節を受けることが判った｡なお, UVBはこ の光修復能の誘導には無効であった｡また,この赤色光による光修復能の誘導は,タンパク質合成阻 害剤であるシクロへシミドで処理された黄化植物では抑制された｡しかし,部分的に解読したイネの cpD光回復酵素遺伝子をプローブにして光回復酵素遺伝子の発現を調べたところ, mRNAは黄化植 物でも発現していることから,転写過程以降のタンパク質合成が光調節される可能性が示唆された｡ (6-4)型光産物の光回復酵素誘導の光調節反応についても現在解析を進めている｡これらについて,覗 荏,論文を作製しているところである｡ -

17 -2 : UVB感受性イネ品種(073,Za Sativa L.)農林1号は, UVB誘導Cyclobutylpyrimidinedimer (CPD)を修復する光修復能力が, UV抵抗性イネ品種ササニシキと比べ低下している｡この要因とし て, (1)光修復酵素の構造変異に由来すると考えられる基質(CPDト酵素複合体の安定性または光感 受性の違い, (2)生体内での本酵素の発現系の変異による発現量の違い等が考えられる｡そこで, (1) の可能性について検討した｡イネ第3葉に, UVB光照射により50CPD/Mbを生成させた後,暗所に 種々の時間(秒,分オーダ)放置した｡暗処理後直ちに,可視光パルスを照射して修復されたCPD量 を測定することで,基質一酵素複合体を形成し, CPDが修復されるまでの時間を比較した｡その結果, ササニシキでは暗処理後1分で可視光パルスで修復されるCPD量は飽和に達したのに対して,農林1 号では同量のCPDを修復するのに15分以上の暗処理を必要とした｡またさらに,基質一酵素複合体の 温度(0,28,45,60oC)に対する安定性について,一定量CPDを有するADNAを基質としてinuitro で検討した｡その結果,農林1号では45oC以上で活性が低下するのに対.し,ササニシキでは, 45oCで は安定であり, 60oCで活性の低下が認められた｡以上の結果から,農林1号の光修復酵素は構造上に 変異があることにより,その能力が低下している可能性が示唆された｡現在,論文を投稿中(CPD photorepair de缶ciency of UV-sensitive rice is due to structual mutation of photolyase. Hidema

J., T. Kumagai and B. Sutherland. Plant Cell)｡

3:紫外線感受性の異なるインド型イネ品種,アントシアニン含量の異なる日本型イネ品種,インゲ ン,ナス,キュウリなど幾つかの農作物のUVB誘導DNA損傷の感受性および光修復能力を解析し, 植物の紫外線感受性評価方法の確立を目指す研究を開始した｡ 4: UVB量の増加は,とくにRubisco含量が紫外線感受性イネ品種において著しく減少した｡一方, クロロフィル(Chl)含量はRubiscoほど影響を受けなかった｡そこで, Chlのおよそ50%が結合し ているクロロフィル結合タンパク質(LHCII)へのUVBの阻害効果について調べた｡その結果, Rubi-scoと同様,葉緑体内に局在するLHCIIは, Rubiscoのような顕著な減少は認められなかった｡前年 度に引き続いて15NをトレーサーとしてRubiscoとLHCIIの合成と分解にUVBが及ぼす影響につ いて解析を行っている｡また紫外線抵抗性の異なるイネ品種間で認められたUVBのRubiscoとChl に及ぼす阻害効果の差異は,紫外線抵抗性の異なる櫓物種間(UVB抵抗性の強いインゲンと弱いナス との比較解析)においても成立するのか検討中である｡ 5:紫外線耐性品種日本晴(日本型)と紫外線感受性品種Kasalath (インド型)とのBCIF5系統群 を用いたQTL解析で検出された,第10染色体上の紫外線感受性に関わる遺伝子の単離を目的とし て, BC3F2系統群に属する集団を用いて連鎖解析を進めている｡ 大気二酸化炭素濃度の上昇は植物のバイオマスの増加をもたらすが,イネなどにおいては生育後半 に葉身の老化が促進されることもある｡大気二酸化炭素濃度の上昇に有用なイネ遺伝資源を探索する ための予備試験をオープントップチェンバーを用いて行った｡また葉身の老化が早いインド型イネ品 種Kasalathと遅い日本型イネ品種日本晴に由来するバッククロスインブリット系統を用いて登熱時 期の葉身の老化に関するQTL解析を行い,葉身の老化に関わる遺伝子座を検出した｡ 94年からの圃場試験で,移植から登熱までのUV-B付加により収穫した玄米の粒サイズが小さく

なることが認められた(Effects of supplemental UV-B radiation on the growth and yield of two

cultivars of Japanese lowland rice (07γZa Satiua L.) underfield conditions in a cool region of Japan. Agriculture, Ecosystems & Environement, submitted)｡本年度は米の食味に関わる形質へ

の影響を調べるために,登熱期間に紫外線を照射した｡その結果,登熱期間のみの紫外線付加により

18 -粒サイズが小さくなることを確認した｡食味に関しては古川農試の協力を得て解析を進めている｡ 〔地国環境遺伝生態研究分野〕 当研究分野では,植物と相互作用を示す土壌微生物の生態･機能･遺伝子発現調節および土壌の化 学性を研究することによって,地圏についての理解を深めることを目標に研究活動を行っている｡本 年度は以下のような研究を行った｡ 土着ダイズ根粒菌の中には,多コピーの挿入配列(Insertionsequence; IS)を保有し,生育の極め て遅いBradyrhizobuium HRS株が存在し,環境微生物の多様化･培養の困難性･遺伝子水平伝達現 象につながる可能性のある生物材料と考え様々な角度から解析を行った｡HRS株に特異的に兄い出さ

れるIS1631は, Repliconfusionを起こす挿入配列であることを遺伝学的に証明した｡また, IS1631

を利用したHRS株の検出方法を確立し,アメリカ合衆国,タイ,韓国,中国にもダイズ根粒菌HRS 株が分布していることが判明した｡生育の極めて遅いHRS株の出現頻度が50%を超える圃場が存在 するので,土壌環境条件とHRS株の出現頻度を検討したところ,土壌還元および栄養条件や菌の死滅 が関わっている可能性が示唆された｡ HRS株の窒素固定遺伝子領域をnon-HRS株と比較したとこ ろ,挿入配列による分断や共生アイランドを超えた大規模なゲノム再編成の痕跡が観察された｡ HRS 株から土壌低栄養細菌Agromonas oligotrophicaへ根粒形成遺伝子の水平伝達が起こる可能性が示唆 された｡      (伊沢 剛,鮫島玲子,板倉 学,三井 久幸,南洋 究) 植物ホルモンであるエチレンは植物の種々の生理反応をコントロールしているが,根粒菌が宿主マ メ科植物に感染し根粒を形成する過程やその他の微生物感染にも影響する場合がある｡マメ科モデル

植物ミヤコグサ(Lotus japonicus)や根粒菌の宿主域が広いサイラトロ(Macropitilium

atropuゆur-eum)は,エチレンにより根粒形成が阻害されるタイプのマメ科植物であることが明らかになった.そ こで,変異エチレンレセプターcm-ERSl/H70Aを導入することによりエチレン非(低)感受性ミヤ コグサの作出を試みた｡ダイズ根粒菌B71adyrhizobium elkaniiが生産するリゾビトキシンは,植物の エチレン生合成系のACC合成酵素を強く括抗的に阻害し,宿主植物のエチレン生成を抑え根粒形成 を促進した｡さらにリゾビトキシンの生合成遺伝子群の構造を明らかにした｡ (遊橋健一,貫井憲之,市川徳一,安田 剛,南洋 究) 近年,野生植物体内に内生している細菌や菌類(Endophytes)の存在がしだいに明らかになりつつ ある｡野生イネおよび荒廃地に自生しているパイオニア植物から窒素固定菌の検出および分離を試み た｡本センターの野生イネ,ミャンマー･カンボジア･タイに自生している大部分の野生イネ,フィ リピン･ピナツボと雲仙普賢岳の火山泥流のパイオニア植物から窒素固定菌が高頻度で検出された｡こ れらの植物体内における窒素固定菌数は高く, 105 (cells/g tissue)オーダーに達する場合があった｡

本センターの野生イネ0り′Za Ojficinalis WOO12から単離されたHerba頭irillum seropedicae B501株

をg砂遺伝子で標識を行い,分離源である野生イネWOO12に接種したところ,茎や葉の細胞間隙に菌 がコロナイズした｡一方,栽培イネではB501株はコロナイぢしなかった｡今後,収集された窒素固定 菌の同定,宿主特異性,群集構造を解明すると伴に,植物組織の細胞間隙で実際窒素固定を行ってい るか否かを明らかにする予定である｡ (AdelElbeltagy,鈴木 永,宮木太郎,西岡キヨ,東海林比呂子,三井久幸,南洋 究) 根粒菌の共生能の背景にある遺伝子発現のグローバルな制御機構を明らかにするための手がかりと して,知見の少ないRNAポリメラーゼ･シグマ因子に注目した｡新たにクローン化したゆoH -

19 -homologについて,根粒菌の生活史中でほぼ一定の比較的高いレベルの発現が確認されたが,単生状 態よりむしろ共生状態において重要な役割を果たしていることを示すことができた｡その遺伝子破壊 株は,共生窒素固定不能の根粒形成となり(Nod+ Fix-),また,培養状態では一群のHspの発現 が消えることを兄い出した｡       (三井久幸,尾野由紀江,佐藤俊文,南洋 究) 土壌有機物の熱変成の程度の違いによる反応性の差を利用して,火山灰土壌多腐植層の有機物の生 成過程を明らかにしようとした｡土壌に供給された熱変成有機物は続生作用の影響を受け,モデル的 な実験のようには明確な差異を示さなかった｡東北地方で環境問題になっている融雪剤の環境への影 響について,これまでの成果をまとめ環境学会(第25回)に発表した｡    (佐藤 孜) 〔遺伝子生態情報システム研究分野〕 当研究分野では,環境要因及び複合環境の変動に伴う生態系変化の研究を,生態系を構成する生物 種の遺伝子群の再編成や水平伝達,機能発現の観点からと異なった環境に適応した植物や微生物の集 団分化に関する遺伝生態的観点から行っている｡本年度は以下のような成果を得た｡

pseudomonas Putida m卜2株に内在するプラスミドpWWO上のトルエン分解遺伝子群を担う56

kbのトランスポゾンTn4651の部位特異的解離系は,本転移因子内の2.4kbの領域に支配されてい た｡この領域内に存在する組換え部位(res)とその両側にコードされているtnPSとtnpTの両遺伝子 産物が部位特異的解離に必要であった｡部位特異的インテグラ-ゼファミリーの共通モチーフを有す るTnpSの特定チロシン残基は解離反応に必須であること,そして, resは140bp以下の塩基配列中 に存在することを兄いだいた｡       (源河浩之,保科美英子,津田宏之,津田雅孝) ナフタレン分解遺伝子群を担う37.5kbのII型トランスポゾンTn4655はPseudomonas Putida G7株由来のプラスミドNAH7上に存在する｡ Tn4655の部位特異的解離系は部位特異的組込み能を も有し,また解離酵素は部位特異的インテグラ-ゼファミリーに典型的なアミノ酸配列を持つことが 判明したQ NAH7とpWWOはトランスポゾン以外の領域に関して,構造と機能の両面で共通性が高 いことが示唆されており,この共通性を追求するために, NAH7上のTn4655以外の領域の解析も進 めている｡      (大石健朗,安価尚志,津田雅孝)

軟腐病菌(Erwinia carotovora subsp. carotouora)のバクテリオシン合成の制御遺伝子群PhDCの

クローニングに成功した｡この遺伝子群は大腸菌の鞭毛を合成するための正の転写制御遺伝子群 jlhDCと高い相同性があった｡軟腐病菌の低分子量バクテリオシンの産生にはjlhCとjlhDの両遺伝 子機能が必要であったが,高分子量バクテリオシンの産生にはJthD遺伝子機能だけで十分であった0 両遺伝子とも多面的機能をもち, jlhC遺伝子機能は細胞分裂の制御に,また, jlhD遺伝子機能は細胞 伸長の制御に少なくとも関与していることが判明した｡       (荘 敦尭,菊本敏雄) バクテリオシン産生能を有し,他の病原性株の生育を実験室内で阻止する能力を持つ軟腐病菌を EMSで処理し,病原性のみが喪失した2株の突然変異体(A-f-39株とB-e-19株)を単離した｡これ ら突然変異菌株単独や実用化されている微生物農薬であるM403株との混合使用で,野外でのハクサ イ軟腐病生物防除の可能性を2年間にわたり追求した｡突然変異株とM403株の混合区での防除価は 単用区のそれらより高かった｡特に, A-f-39株とM403株との混合区では他の併用区よりも非常に高

い防除結果を得られた｡      (Ampaabeng Gyedu Kyeremeh,菊本敏雄)

タネツケバナ属4種の生活環制御機構と形質発現の解析を試みている｡山間渓流地にのみ分布する タチタネツケバナ,高緯度地域では撹乱環境に分布を広げつつあるオオバタネツケバナおよび近年日

- 20 -本に定着し急速に分布を拡大しているミチタネツケバナを用いた｡これらの種は共通してロゼットで 栄養成長期を経過することから頂芽優勢性による生活環制御が形質発現に強く反映する｡環境によっ て頂芽優勢性が強く弱められる種と常に一定の強さを残す種が存在する｡タネツケバナ,オオバタネ ツケバナは前者に属し,ミチタネツケバナ,タチタネツケバナは後者に属する｡タネツケバナ属植物 は基本的に低温と長日条件によって花芽分化が強く促進される｡しかし,ミチタネツケバナは低温や 日長に大きな影響を受けずに開花に至る｡このように環境による生活環制御の制約からの脱却が本種 の急速な分布の拡大につながっていると考えられる｡オオバタネツケバナ,タチタネツケバナは短日 条件では開花に至らず春期の一斉開花を示すフェノロジーと一致した｡これは競合的な生育環境に適 応した性質である｡とりわけ,ロゼット葉を主茎基部に多数残して開花するタチタネツケバナは葉か らの物質転流による高い草丈の形質が共存他種との競合的環境に適応している｡  (石栗義雄) 広宿主域伝達性プラスミドR388の宿主域決定機構の解明のために本プラスミドの全塩基配列33, 907bpを決定した｡蛋白質コード領域の予測と類似性検索などによる構造解析を行った結果, R388全 体の遺伝子構造,既知のプラスミドや遺伝子群との高い類似性, 560bpの機能不明の繰り返し配列の 存在を明らかにした｡さらに,相同組換えやトランスポゾンの挿入により任意の遺伝子を破壊した R388誘導体を取得し,進化系統的に類縁性の低い2種の宿主菌株でのプラスミド誘導体の安定性や接 合頻度の違いを検討している｡       (安価尚志,津田雅孝)

pseudomonas syringae pv. actinidiaeやpv. Phaseolicolaのゲノム上に存在しているフアゼオロト

キシン産生遺伝子群(argK-lox cluster)は外来性であり,水平移動によって分布を拡大してきたと 示唆されている｡この仮説を検証するために, cluster内にカナマイシン耐性遺伝子をマーカーとして 挿入した上でcluster全体がpBR322誘導体上に担われるものを供与レプリコン,広宿主域伝達性プ ラスミドR388を標的レプリコンとした転移実験を大腸菌背景下で行ったところ,マーカー遺伝子挿 入部位を含むclusterの一部がR388上へと転移する現象が認められた｡転移領域はさらに,別の広宿 主域伝達性プラスミドへと再転移を起こすこと,その際の挿入部位はランダムであることも判明した｡ (津田宏之,津田雅孝) 〔客員研究分野〕 本研究分野では,植物の根に深くかかわっている土壌伝染性の植物病原菌類,根系生息性の生物防 除要員となりうる有用菌類,および菌根菌の遺伝生態的側面を明らかにすることを当面の研究活動の 目標にして,病原性変異機構,病原性制御機構,植物への全身的な病害抵抗の誘導機構,および共生 機構の解析研究を展開している｡主要な研究成果は以下の通りである0 Fusarium solaniの核型解析および遺伝子マッピング:土壌伝染性の植物病原糸状菌である

Fusarium solani (有性世代Nectria haematococca)は宿主特異性により10の分化型(f. sp. Phaseoli,

f. sp. pisi, f. sp. xanthoxyli, f･ sp･ batatas, f･ sp･ piperis, f･ sp. mori, f･ sp･ robiniae, f･ sp･ radicicola, f. sp. cucurbitae, f. sp. eumartii)に分けられている｡本研究ではパルスフィールドゲル電気泳動法

(PFGE)により, f. sp. cucurbitaeとf. sp. eumartiiを除くF. solaniの8分化型24菌株の核型を調

べた｡その結果, 0.6-5.7 Mbpの間にf. sp. phaseoliで7-8本, f. sp. pisiで9-12本, f･ sp･ xanthoxyli

で5-6本, f. sp. batatasで7-8本, f. sp. piperisで7本, f. sp. moriで6-7本, f･ sp･ robiniaeで

10本, f. sp. radicicolaで6-7本のバンドが確認できた｡これらの分化型においては,同一分化型内

の菌株で核型に違いがあったが,各分化型の核型を全体的に比較してみると,同じ分化型に属する菌

-株同士では,それらのパターンは類似していた｡次にサザンハイプリグイゼ-ションによりrRNA遺 伝子と,病原性関連遺伝子であるキーピトンハイドラタ-ゼ遺伝子(khs),ペクチン酸リア-ゼ遺伝 千(PelA)およびピサチンデメチラーゼ遺伝子(PDAT9)が座乗する染色体の同定を試みた｡病原性 関連遺伝子については,各遺伝子に特異的なプライマーを用いてF. solani各分化型のゲノムを鋳型 としたPCRを行った後,各遺伝子の存在が確認された菌株についてサザンハイブリダイゼ-ション を行った｡その結果, rRNA遺伝子は,いずれの分化型の菌株も5.2-5.7Mbpの染色体に, PelAはf. sp. pisi, f. sp. xanthoxyli, f. sp. batatas, f. sp. moriにおいて2.3-2.9Mbpの染色体に,またkhsはf･ sp.phaseoliとf.sp.pisiにおいて, 1菌株を除き2.8-3.4Mbpの染色体に座乗していることが明らか となった｡さらにPDAT9は, f. sp.pisiにおいて1.1-5.6Mbpの染色体に座乗していたが,それら のサイズは菌株により大きく異なることが明らかとなった｡

ハイグロマイシン耐性遺伝子を利用したFusarium soalni f. sp. phaseoliの形質転換: TrpCプロ

モーターにハイグロマイシン耐性遺伝子を連結したプラスミドを用い, 2種類のポリエチレングリ コール(PEG)法によりF. solanif.sp.phaseoliの形質転換を試みたo方法Iには18% PEGを含む D-Sorbitol系緩衝液を,また方法ⅠⅠには50% & PEGを含むKCl系緩衝液を用いた｡その結果,方 法Iではハイグロマイシン耐性コロニーが得られた.また,それらはハイグロマイシンを含まない培地 で培養させた後もハイグロマイシン耐性は消失しなかった0 -万,方法IIでもハイグロマイシン耐性

は得られたが,ハイグロマイシンを含まない培地で培養後に耐性の消失がみられた｡プラスミド

pcB1003を用いた方法IではPEG処理の際に制限酵素PstIを用いたところ,用いなかった場合に比 べて約7倍のハイグロマイシン耐性コロニーが得られた｡方法Ⅰで得られたハイグロマイシン耐性コ ロニーについては導入された耐性遺伝子がpolymerase chain reactionおよびサザンハイプリグイ ゼ-ションにより確認できた｡

植物生育促進菌類の葉面処理による誘導抵抗性:植物生育促進菌類(plant growth promoting

fungi: PGPF)を植物の根部に処理すると生育を促進するばかりでなく,発病抑制効果も認められる｡ この発病抑制効果は土壌病害のみならず地上病害も抑制することが分かっている｡このことから誘導 抵抗性の関与が示唆され,本研究室ではPGPFによる誘導抵抗性が地上部処理,すなわち葉面処理に

おいても示されるかを検討した. PGPFのFusarium sp. (F), Pencillium sp. (P), Phoma sp. (Ph)

各1菌株の培養ろ液をキュウリの本葉第1葉に1分間浸す浸潰処理を用いた｡浸潰処理24時間後に本 葉第2葉に炭そ病菌を接種し, 1週間後に病徴調査を行った｡その結果, F, P, Phの培養ろ液を用い ると病斑は対照の病原菌のみの接種葉に比べて著しく少なく,それぞれ34.3%, 57.8%, 61.8%の病斑 面積の抑制が見られた｡また,これらの培養ろ液をキュウリの幼根に処理後,腔軸部に炭そ病菌を接 種すると病原菌侵入部にリグニン集積が多く見られた｡さらに,これらの培養ろ液をキュウリ果実の スライスに処理すると顕著な活性酸素生成が誘導された｡

ー 22 -2 研究業績

(1)論文

■遺伝子多様性研究部門

〔遺伝子環境応答研究分野〕

Schimek, C., P. Eibel, T. Horie, P. Galland and T. Ootaki : Protein crystals in Phycomyces spor-angiophores are involved in graviperception. Adv. Space Res. 24 : 687-696, 1999.

The sporangiophores of the zygomycete fungus Phycomyces blakesleeanus contain octahedral crystals with

diameters of up to 5 /〃n in their vacuole. The crystals are associated with the intracellular membrane system.

In tilted or horizontally placed sporangiophores, the crystals sediment to the respective lower face of the

vacuole with a velocity of up to 100 /Jm per minute. The sedimentation is completed within about 2 minutes,

wellwithinthe latency period for the negative gravitropic response of Phycomyces. Crystalllacking mutant strains display a smaller maximal bending angle and a reduced gravitropic bending rate in comparison to the wild type. We therefore conclude that the crystals serve as statoliths for gravitropism in Phycomyces.

Schimek, C., P.Eibel, F.Grolig, T.Horie, T.Ootaki and P.Galland: Gravitropism in

Phycomyces : a role for sedimenting protein crystals and月oating lipidglobules. Planta 210 : 132-142, 1999.

To elucidate the graviperception of the unicellular fungus, Phycomyces blakesleeanus, sporangiOphores

were inspected for intracellular structures which relocate with respect to gravity. Two structures,

paracrysta1-1ine proteins (so called octahedral crystals) and an aggregate of lipid globules, Were identified which showed

redistribution upon reorientation of the sporangiophore. Octahedral crystals occur throughout the

sporangio-phore, including the aplCal growlng zone, and are localized inside vacuoles in which they reside singly or in

clusters of up to 40 loosely associated individuals, Upon a 900 reorientation of sporangiophores, crystal

clusters sedimented in approximately 50-200 s from the upper to the lower side, corresponding to a speed of O.5-2 /Jm/S. Stage-4 sporangiophores (with sporangium) of three mutants wich lack the crystals displayed abnormal kinetics of gravitropism and substantially reduced bending angles in comparison to sporangiophores of the wild type. While horizontally placed wild-type sporangiophores reached the vertical position after 10-12 h, the crystaHacking mutants bent maximally 40-500 upward. In stage-1 sporangiOphores a conspicuous

aggregate of lipid globules is positioned about 50 pm below the apex. The globulesflOated upwards when the

sporangiophore was placed horizontally formlng in this way a cap-like aggregate. It is proposed that both

the sedimenting protein crystals and the upward-floating globules are involved in gravisensing.

Sasaki, H., Kataoka, HリKamiya, M., Kawai, H∴ Accumulation of sulfuric acid in Dictyotales (Phaeophyceae) : taxonomic distribution and ion chromatpgraphy of cell extracts. ∫. Phycol. 35 : 732-739, 1999

Four species in the order Dictyotales (Dictyopten's latiuscula (Okamura) Okamura, D. proltfera (Okamura)

Okamura, a repens (Okamura) B少rgesen, and Spatoglossum crassum J. Tanaka) were found to be highly

acidic as in some species of the order Desmarestiales (Phaeophyceae). The pH within their cells, presumably that of the vacuole, was estimated to be 0.5 to 0.9 by pH measurements of their cell extracts in distilled water.

However, other species of these genera (D. divan-cata (Okamura) Okamura, D. undulata Holmes, and SI

pacljicum Yendo) did not show highacidity. Ion chromatography of the cell extracts showed that those

species contained high concentrations of SO｡2 within their cells, up to 10 times that in seawater but relatively

low CI-. The sum of cations examined (Na+, NHJ, K+, Mg2', Ca2') was significantly lower than that of

anions (Cl , B｢, NO3 , SO｡2 ), and the difference is persumed to represent protons (H+), causing the extremely low cell sap pH. Estimated fellular proton concentrations calculated from the pH data roughly

agreedwith those calculated from differences between the sum of cations and anions and that of anions･

Although certain other, nonactidic, dictyotalean species also contained high concentrations of SO42 , these

species contained high concentrations of Mg2+, and the sums of cations and anions were balanced･

〔遺伝子機能制御研究分野〕

Kanno, A. and T. Kameya : Cloning and variation of ribosomal DNA from Asparagus ojWcinalis

L. Proceeding of International Asparagus Sympojium. Acta Horiticulturae 479 : 365-372 (1999).

The nuclear ribosomal RNA genes (rDNA) in higher plaIltS are Organized in long tandem repeats･ The 18S, 5.8S and 25S genes are clustered and intergenic spacer (IGS) region located between 18S and 25S genes･ Ribosomal DNA are highly variable both in copy number and length of IGS region. This variability exists

among the members on the same genus or species･ In this study, We have analyzed the structure and the

variation of rDNA in AsPwagus species and especially in A. obicinalis.

The restriction pattern of rDNA repeats of A. ojficinalis L. (cv. Mary Washington 500W) was analyzed by Southern hybridizationwith rice rDNA cloneas probe. Since XbaI cuts rDNA repeats into one fragment,

rDNA of A. ojWcinalis was cloned into XbaI site of pBluescript vector. The restriction map of asparagus

rDNA showed that the size of the rDNA repeat was about 10 kb, To investigate the restriction pattern of

rDNA, total DNAs were prepared from 9 cultivars of A. obicinalis, namely, Cito, Larac, Gijnlim, Franklim,

Uc157Fl, Mary Washington 500 W, Tainan No. 1, Hokkai 100, Zuiyou, and the twowi1d species, A･ schober-ioides and A. Cochinchinensis which are distributed in Asia. These total DNAs were digestedwith XbaI, EcoRI, and BamHI and Southern hybridization was carried outwith asparagus rDNA as probe. The

restric-tion pattern of rDNA of A. ojlicinalis was differed from those of two other species, however, there are no

variation of restriction pattern within 9 cultivars of A. obicz'nalis. This indicates that the cultivars

investigat-ed in this study are closely relatinvestigat-ed.

Hirata, Y., T. Motegi and T. Kameya : Stoichiometric shifts of cytoplasmic genomes with

cytoplasmic male sterility induced by chimera synthesis and somatic hybridization･ Eucarpia

Leafy Vegetables 99, 263-267 (1999).

In the present study, molecular genome structure and variations have been investigated in a chimera derived cytoplasmic male sterile line (CDC line) , which was derived from an interspecific B71aSSica chimera, and

in a CMS cabbage line, which was derived from asymmetric intergeneric celHusion. For the comparison with the already analyzed radish CMS, cytoplasmic variations have been analyzed with sixteen mitochondrial genes

and one chloroplast genome clone･ The results show strong similarity in the plasmagenes of the two lines,

which are on different originwith the CMS radish line. However, it is quite di斤icultto explain the phenomena

by recomination and reconstruction of the analyzed genes･ Thus, substoichiometric shifts were thought to be

the probable mechanism of these dynamic changes in the genome structure･

- 24 -〔遺伝子適応生態研究分野〕

Takano, M., N. Fujii, A. Higashitani, K. Nishitani, T. Hirasawa and H. Takahashi : Endoxylog-lucan transferase CDNA Isolated from pea roots and its fluctuating expression in hydrotropically

responding roots. Plant Cell Physiol. 40 : 135-142 (1999)

We isolated an endoxyloglucan transferase CDNA (PsIEXGTl) from the roots of agravitropic pea

mutant, (材eOtrOPum. The putative product of the CDNA was 34.1 kDa consisting of 293 amino acid residues. The predicted amino acid sequence was 75.ト88.60/. identical to those of EXGT genes in other plants. The

Ps-EXGTI CDNA was strongly expressed in elongating roots and stems but not in either mature stems or young

leaves. In roots, the transcription level of Ps-EXGTI was most abundant in the rapidly growing region. When root elongation was inhibited by a water stress, Ps-EXGTl transcription was repressed. The roots curved hydrotropically due to the differential growth of the cortical cells in the elongation zone when the root cap was exposed to a gradient of water potential ; the length of cells on the side of lower water potential was

much longer than those on the side of higher water potential. The expression pattern of Ps-EXGTlinthe

hydrotropically responding roots仇lCtuated between the side of the higher water potential and that of the lower

water potentialinthe elongation zone. That is, the accumulation of Ps-EXGTl mRNA was much greater on

the side of lower water potential than on that of higher potential just prior to the commencement of positive hydrotropism. When roots started to curve slightly away from the side of higher water potential causing

rhythmic osciHatory movement [Takano et al. (1995) Planta 197 : 410], there was more transcript'ion of

Ps-EXGTl on the side of higher water potential. These results suggest that the transcription of Ps-Ps-EXGTl is

involved in cell growth and that this regulation of transcription plays a roleinthe differential growth of

hydrotroplCally responding roots.

Asano, S., A. Higashitani and K. Horiuchi : Filamentous phage replication initiator protein gpII

forms a covalent complex with the 5′ end of the nick it introduced. Nucleic Acids Research 27 :

1882-1889 (1999)

Rolling cycle type DNA replication is initiated by introduction of a nick in the leading strand of the origin

by the initiator protein, which in most cases binds covalently to the 5′ end of the nick. Infilamentous phage,

however, such a covalent complex has not been detected. Using suitable substrate and short reaction time,

We show thatfilamentous phage initiator gpII forms a covalent complex with nicked DNA, which rapidly

dissociates unless gpII is inactivated. A peptide-DNA complex was isolated from trypsin digest of the complex by ion-exchange column chromatography and gel filtration, and its peptide sequence was determined, The result indicated that gpII was linked to DNA by the tyrosine residue at position 197 from the N-terminus. The mutant protein in which this tyrosine was replaced by phenylalanine did not show any detectable activity

to complement gene II amber mutant phage in vivo. In vitro, the mutant protein recognized the origin and

bent DNA as well as the wild-type does, but failed to introduce a nick and to relax the superhelicity of cognate DNA.

Godbole, R., H. Takahashi and R. Hertel : The lazy mutation in rice affects a step between

statoliths and gravity-induced lateral auxin transport. Plant Biology 1 : 3791381 (1999) Compared to wild type, the lazy mutant in Oryza sativa L shows a reduced gravitropic response. In order

to locate the lesion in the stimulus-response chain, coleoptile segments of lazy rice were investigated with

respect to auxin transport. Gravity-induced lateral movement of radio-labeled indoleacetic acid (IAA) was

strongly inhibited by the lazy mutation compared to wild type while uptake and longitudinal transport of IAA, as well as amyloplast sedimentation, were not significantly affected. These findings suggest that LAZY

- 25 -Controls a step ln the slgnalling chain between statoliths and auxin secretion.

Takahashi, H., M.Takano, N.Fujii, A.Higashitani, M.Yamashita, T.Hirasawa and K.

Nishitani : Agravitropic mutant for the study of hydrotropism in seedling roots. Adv. Space Res. 23 : 2021-2028 (1999)

Roots have been shown to respond to a moisture gradient by positive hydrotropism. Agravitropic mutant plants are useful for the study of the hydrotropism in roots because on Earth hydrotropism is obviously altered by the gravity response in the roots of normally gravitropic plants. The roots are able to sense water

potential gradient as small as 0.5 MPa mm-1. The root cap includes the senslng apparatus that causes a

differential growth at the elongation region of roots. a gradient in apoplastic calcium and calcium influx through plasmamembrane in the root cap are somehow involved in the signal transduction mechanism in hydrotropism, which may cause a differential change in cell wall extensibility at the elongation region. We have isolated an endoxyloglucan transferase (EXGT) gene that is strongly expressed in pea roots and appears

to be involved in the differential growth in hydrotropically responding roots. Thus, it is now possible to study hydrotropism in roots by comparing with or separate from gravitropism. These results also imply that

microgravity conditions in space are useful for the study of hydrotroplSm and its interaction with gravitroplSm.

Kobayashi, M., T. Murata, N. Fujii, M. Yamashita, A. Higashitani and H. Takahashi : A role of

cytoskeltal structure of cortical cells in the gravity-regulated formation of a peg ln Cucumber seedlings. Adv. Space Res. 24 : 77ト773 (1999)

Seedlings of cucurbitaceous plants develop a protuberant tissue, Peg, on the lower side of the transition region between root and hypocotyl when germinated in a horizontal position. Peg develops due to a change in growth polarity of the cortical cells. We have examined the role of cytoskeketal structure in peg formation

of cucumber seedlings. It was observed that in both Peg cells and normal cortical cells of 36と卜01d seedlings

microtubules (MTs) Were arranged perpendicular to the longitudinal axis of the elongating cells. Application of colchicine perturbed the MTs structure and was inhibitory to the formation of peg in cucumber seedlings. In 24h-old seedlings. Mts in the cortical cells destined to be a peg were arranged as in those of 36h-old seedlings, although peg initiation was not obviously started. In 20 h-old seedlings, MTs were randomly observed in the cortical cells destined to be a peg tissue, whereas MTs in normal cortical cells were transver-sely organized, These results suggest that reorganization of MTs is required for peg formation caused by the

change in growth polarlty Of the cortical cells.

Takahashi, H., H. Mizuno, M. Kamada, N. Fujii, A. Higashitani, S. Aizawa, S. Kamigaichi, C.

Mukai, T. Shimazu, K. Fukui and M. Yamashita : A space flight experiment for the study of

gravimorphogenesis and hydrotropism of cucumber seedlings. J. Plant Res, 112 : 497-505 (1999)

Seedlings of Cucurbitaceae plants form a protuberance, Peg, on the transition zone (TR zone) between hypocotyl and root. Our space-flight experiment verified that the lateral positioning of a peg in cucumber

seedlings is controlled by gravity. It was suggested that auxin plays an important role in the gravity-contro11ed positioning of a peg on the ground. Furthermore, cucumber seedlings grown in microgravity developed a number of the lateral roots that grew towards the water-containing substrate in the culture vessel,

whereas on the ground they oriented perpendicular to the primary root growing down. The response of the lateral roots in microgravity was successfully mimicked by clinorotation of cucumber seedlings. However,

this bending response of the lateral roots was observed only in an aeroponic culture of the seedlings but not in solid medium. We considered the response of the lateral roots in microgravity and on clinostat as positive

- 26 -hydrotopism that could easily be interfered by gravitropism on the ground. This system with cucumber

seedlings is thus a model of space flight experiment for the study of the gravimorphogenesis, root hydrotropISm

and their interaction.

Kobayashi, Y., T. Saito, T. Shiga, Y. Arakawa, M. Takai, M. Shimanuki, A. Tani, Y. Kitaya, T. Goto and H. Takahashi : Development of measurement system of plant water uptake in para-bolic flight. CELSS JOURNAL 12 : 9-14, (1999)

This paper presents the results of study on a prototype design and its set up to measure plant water uptake

under the in臥lenCe Of microgravity (〟G). The results are summarized as follows : 1) A proposed prototype

system smoothly functioned and was controlled throughout the flight. 2) Leaf temperature increased by 0.8

-1.60C during /JG condition. 3) Water uptake rate rapidly dropped when the gravity condition changed into

〝G from. 4) The water uptake recovered as the gravity increased to l･5 G which created by the ascending 伽ght following to the /`Gflight. Uptake rate change took place at the time of gravity change (high一G to /

from JLG) but it did not sustain and its relaxation time varied.

Tani, A., T.Okuma, S. Tanaka, T. Saito, Y.Kitaya, E.Goto and H. Takahashi : Preliminary

experiment on water vapor recovery and recycling for plant cultivation under microgravity.

CELSS JOURNAL 12 : 21-25, (1999)

Development of water recovery and recycling system in a plant growth chamber is most important

challenge for plant cultivation under micro-gravity. In this paper, a water recycling system consisting of Peltier cooler unit and capillaryfibrous mat for water transport is proposed as a suitable technology for small-scale closed plant growth chamber under micro-gravity. In the preliminary experiment, maximum water

condensation rate by the fin of Peltier cooler unit 100 g/day. This value is not high enough to support water

circulation in plant growth chamber when mature plants are densely grown. Water could be successfully

transferred from the丘n to the plant growth medium through the斤brous mat in the short-term experiment (144

h). A long-term experiment is required to evaluate the system performance and stability･ Key factors controlling water movement of the system, including hydraulic conductivity of the fibrous mat medium and

water condensation capacity of cooling丘n, are discussed.

西洋武明,菅  洋,高橋秀幸:コムギの第一節間伸長に対するジベレリンの作用と被覆土壌の種類. 日作東北支部報42: 45-46 (1999). ジベレリンの作用発現が土以外の物質による被覆で代替え出来るかどうかについて,土の代替え物質として,サ イズの異なるガラスビーズや土の種類を異にした場合の第一節間伸長に対するジベレリンの影響について検討し た.その結果,土の違いによって明らかに第-節間の伸長に差異が認められた.特に,興味あることに無機養分を 含む比率の低いと思われる土ほど第-節間の伸長が低下する傾向がみられた.このことから推察して土に含まれて いる何らかの成分とジベレリンが反応している可能性が示唆された.

1 27 -■環境変動遺伝子生態研究部門

〔臨界環境遺伝生態研究分野〕

Hidema, J., H-S Kang and T. Kumagai : Changes in cyclobutyl pyrimidine dimer levels in rice

(Oyyza stiua L.) growing indoors and outdoors with or without supplemental UV-B radiation,

Journal of Photochemistry and Photobiology B : Biology, 52 : 7-13, 1999.

We have examined the changes in the steady-state levels of cyclobutyl pyrimidine dimer (CPD) in rice plants (07yZa tqatiua L.) growing indoors and outdoors with or without supplemental UV-B radiation. The

CPD levels remain between 3 and 6 CPD Mb-i throughout the dayinplants grown under sunlight athoughthe levels mlCtuate. The CPD levels are slightly elevatedwith UV-B (1 Wm 2) supplementation, but remain

constant (between 5 and 8 CP Mb 1) throtlghout the day. In plants grown under visible radiation in a growth

chamber, the CPD levels remain constant but are lower compared with those in outdoor-grown plants ; they are slightly elevated by supplementation with UV-B radiati()n. Under exposure to UV-B radiation without visible radiation, the CPD levels gradually increase with lengthening of the irradiation time and reach a level

of approximately 35 CPD Mb l at dusk. However, this level decreases during the night and then increases

again the nex day. It is thus evident that the CPD levels are strictly maintained within constant limits throughout the day in plants growing indoors and outdoors with or without supplemental UV-B radiation. It is also found that excision repair occurs during the night in plants having higher CPD levels.

Kumagaり., H. Katoh, T. Miyazaki, J. Hidema and T. Kumagai : Differences in the sensitibity to

UVB radiation of two cultivars of rice (073,Za Satia L.) based on observation of long-lived radicals. Journal of Radiation Biology, 40 : 303-310, 1999.

Free radicalswith long lifetime were observed in the leaves of two rice cultivars (07γZa Satiua L.) of

Sasanishiki (UVB resisant) and Norin-1 (UVB sensitive) by electron spin resonance spectroscopy. The leaves of both cultivar grown with visible light shows very similar ESR spectra composed of radical 1 (Rl) and radical 2 (R2), which may be attributable to P7｡｡ Cation radicals in a reaction center of photosystem I, and tyrosine cation radicals in a reaction center of photosystem II, respectively. The ESR spectrum composed of Rl and R2 radicals in the leaves of Sasanishiki grown under visible light with supplemental UVB was similar to that in the plant grown without supplemental UVB. On the other hand, the amounts of R2 radicals in the

一eaves of Norin-1 grown undervisible lightwith supplemental UVB was significantly lower than that in the

plant grown without supplemental UVB. It is suggested that the decrease of R2 radicals in Norin-1 upon the UVB irradiation may be related to the instability of the plant upon UVB irradiation.

Kihara, J. and T. Kumagai : PhotoICOntrOl of conidial development in the fungus Bipolaris

oyyzae. Recent Research Development in Photochemistry and Photobiology, 3 : 51-64, 1999.

This report provides an overview of our studies on the geIletic ecology and molecular biology of photo-contr｡l ()f conidial development by the antagonistic action of blue/UVA and near-UV radiation mediated through the mycochrome system in B. oyyzae. As mentioned above, there are three kinds of sporulator

physiotypes of B. ()ryzae, induced and non-induced (I) and (II). We demonstrated that photo-induced sporulators are widely distributed in paddyfields in Japan, while only a few non-photo-photo-induced

isolates exist. No intraspecific variation of rDNA was found among the three physiotypes. However, RAPD

analysis revealed polymorphisms between photo-induced and non-photo-induced isolates and showed that

non-photo-induced (I) ad (ⅠⅠ) strains were clustered in the same group, indicating that they are genetically