Title 超好熱菌Aquifex aeolicus Leucy1-tRNA合成酵素の構造と機能( 内容の要旨(Summary) ) Author(s) 合田, 正貴 Report No.(Doctoral Degree) 博士(工学) 甲第185号 Issue Date 2002-09-11 Type 博士論文 Version URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/1906 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏名(本籍) 学 位 の 種 類 学位記号番号 学位授与年月日 専 攻 学位論文題 目 合 田 正 貴･(滋賀県) 博 士(工学) 甲 第 185 号 平成14年 9月11日 物質工学専攻 超好熟菌d卿了知8eOJJ亡ぼLeueyトtR肌合成辞素の構造と機能 (StruCture aJldfunCtionofleucyl-tR仙8ynthetaBe frⅧ ab押ert肋Ⅷ鵬ile d卿J触aeoノブ亡び) 学位論文審査委員 (主査) 教 授 西 川 一 八 (副査)教 授 長 澤 透 教 授 北 出 幸 夫 講師 横 川 隆 ■志
論文内容の要旨
アミノアシルーtRNA合成酵素(aaRS)は､原核生物から真核生卿こ垂るまで普遍的 に機能が保存されており､生命にとっては必須の反応に関わちていることから､極め て起源が古いと考えられている｡aaRSは､遺伝暗号表にコードされた20種類のアミ ノ酸それぞれに対応して20種類存在し､単一のアミノ酸とそれに対応する1セット のtRNAを認識している｡20種類のaaRS.は､共通の基質である∬Pの結合モチーフ から10種類ずつの2つのクラス(ClassIとClassII)に分類される｡ClassI■のaaRSは､ Rossmann-仙dと呼ばれるジヌクレオチド結合ドメインを構成しており､その上でヒ スチジルイソロイシルーグリシルーヒスチジン(HIGH)とリシルーメチオニルーセリルーリ シルーセリン(KMSKS)をコンセンサスとしたÅrP結合モチーフを有している｡C)asslI のaaRSは､逆平行βシートによって構成されるÅrP結合ドメインを有している｡ C】assIに属するaaRSは､今まで知られる限りにおいて､すべて一本のポリペプチド 鎖からなるモノマーか､もしくはホモダイマーである｡ところが､最近全ゲノム配列 が決定された超好熱菌A曾〟陶rα〃旋〟∫では､ClassIに分類されるロイシルーtRNA合 成酵素(buRS)の予想アミノ酸配列のホモロジーからこの酵素が二つに分断された ポリペプチド鎖によって形成される可能性が示唆された｡しかも､基質となる∬P やtRNAの結合に関わる重要な二つの保存配列､HIGIlとKMSKSのモチ｢フが各々 の鎖に分離して存在していることも興味深いことであった｡本論文では､既知のaaRSに一般的に当てはまる準則に合敦しない特徴を持?と考えられるA.αeOJ血∫buRSに
ついて､その構造と機能の両面から研究した結果をまとめて報告している｡ ｢第一章｣では､aaRSの普遍的機能､構造についてのこれまでの知見をわかりや すく解説し､本研究の背景および意義について述べている｡｢第二章｣では特異的と考えられるA.αeO旋〟∫LeuRSの四次構造の解析を行うため､ 二つの分断されたイ遺伝子｣(J蝕∫とJe〟∫り をA.de∂J血∫のゲノムからクローニン グしてそれぞれを大腸菌菌体内で発現後精製し､それらの生物活性の所在を明らかに し､この酵素が今までに例をみない吋β型のヘテロダイマー構造をもつアミノアシル 1RNA合成酵素であることをはじめて実証したことを報告している｡さらに､その調 製したA.ββ〃〃仙∫LeuRSα伸複合体を用いてロイシル化活性の至適条件の検討を行い､ この条件下で速度論的解析を行った結果についても述べている｡ ｢第三章｣では､ユニークなサブユニット構成に注目し､それぞれのサブユニット 単独での役割や機能を探る目的で行った研究の結果を報告している｡すなわち､山川RS の触媒するロイシルーtRNA合成反応は二段階の素反応で表すことができることに着目 し､それぞれのサブユニットが個々の索反応を触媒する可能性について検討している｡ アミノアシル化反応の一段階目の索反応であるロイシンの活性化についてノ汀トPPi交 換反応で分析を行い､〟β複合体としてはLeucyトAMPの形成を確認することができ
たが､それぞれサブユニット単独での分析ではL飢沌yトAMPの形成を確認することが
できなかったと述べている｡続く二段階目の素反応において重要なaaRS-tRNA間の 結合については､.ゲルシフトによる分析を行い､tRNAとの結合は扉β複合体のみな らず､βサブユニット単独でもtRNA結合能があることを見いだすと共に､βサブユ ニットにはtRNAに対する基質特異性も備えていることを発見している｡ ｢第四章｣では､以上の結果について総括すると共に､本研究で明らかにされた新 しい四次構造を新規機能性タンパク質の創製に利用する上で考慮すべき問題点とその 解決策について論じている｡また､アミノアシルtRNA合成酵素の形成過程について 分子進化学的な見地からの考察を展開している｡ 論文審査結果の要旨 この論文は､超好熱菌丞両桓=肌血朋ロイシルー収NA合成酵素のサブユニット構 造とその生物学的機嘩の相関について述べたものであり､既存酵素を改変して新規機 能をもつ酵素を人為的に創成するための系を構築する上で有用性が認められる｡この 論文は以下キこ詳しく示すよ▲ぅに重要な研究結果を含んでいる｡特に､従来は単一ポリ ペプチドから成るものと考えられていたアミノアシルーtRNA.合成酵素の酵素活性が二 つのサブユニットに分割可能であることを初めて実証したこと､およびその_ひとつが 単独でも酵素としての部分活性を持つことを示したことは高く評価される｡したがっ て､･審査の結果､この論文を学位論文に催するものと判定した｡ (1)超好熱菌A曾〟綿貫αg￠J血∫ロイシルーtRNA合成酵素の遺伝子(血∫とね〟∫りを A.dedわふ∫のゲノムからそれぞれクローニングして大腸菌の菌体内で効率よく大量発 現させる系を確立した｡また､それぞれの遺伝子産物であるタンパク質は両者が共存 するときに初めてロイシルーtRNAの合成活性を持つことを示した｡ (2)精製したA.α￠J血∫ロイシルーtRNA合成酵素の分子量の解析から､この酵素は-6-扉β型のヘテロダイマー構造をとっていること､すなわちお〟∫遺伝子産物がα-サブ ユニット､Je〟∫,遺伝子産物がβ-サブユニットに相当することを証明した｡このよう な四次構造はClassIに分類されるアミノアシルーtRNA合成酵素としては初めての例 である｡ (3)A.αe￠〟蝕∫･ロイシルーtRNA合成酵素のユニークなサブユニット構成に注目し､ それぞれのサブユニット単独での役割や機能を探る目的の研究を行った｡すなわち､ この酵素の触媒するロイシルーtRNA合成反応は二段階の素反応で表すことができるの
