L遺伝子欠損ウイルスを用いた狂犬病ウイルスRNAポリメラーゼL蛋白質の分子機能解析

Title L遺伝子欠損ウイルスを用いた狂犬病ウイルスRNAポリメ_{ラーゼL蛋白質の分子機能解析( 本文(Fulltext) )} Author(s) 中川, 賢人 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 甲第501号 Issue Date 2018-03-13 Type 博士論文 Version ETD URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/75224 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

L /#

! $

RNA 

L *%-)+

2017 

 0     1

.  "   & ( '

203




, 

L $



RNA 

L #!

†

†p

Ž œ




























1 L





8 ‰1ˆ
L ¥<Po`}|‚4#m‡  L “„¡

10 n‘›he€Zl WŸ

11 gcdv

12
N®Œ

12
.2#0)

13
L ¥<Po`4#>—

14
,8#'$

15
Nishi-ΔL/Nluc [j NA Œ”@Aj’

16
L “„¡ƒ  NA Œ Nishi-ΔL/Nluc OqZ

17
SDS-/3340) 4¬swI¯SDS-PAGE°

17
#&6-5'(
Nishi-ΔL/Nluc PR4#ŠPaEfl

19
0* +1'$

19
Nishi-ΔL/Nluc [j NA ŒY4",28%xZzT

20 i

22
L “„¡ƒ.2#0)VB NA Œ

22
Nishi-ΔL/Nluc Oq‘

#&6-5'(L “„¡lE

24
N®9y;PR4#aEfl

24
0* +1¢D7˜—‹mtL-SDD  L “„¡n‘Zl

24
Nishi-ΔL/Nluc € mtL-SDD  L “„¡n‘Zl

25 U

27 L•

30 ‰ ‰2ˆ
L ¥<P›h L “„¡štZ?Q­M^k
4 1 K­Mn‘…¨™Zlž WŸ

42 gcdv

44
N®Œ4#

44
}|‚4# 3'!4#L ¥<Pr£›h

44
.2#0)

45
Nishi-ΔL/Nluc [j NA ŒY4",28%xZzT

46
SDS-PAGE #&6-5'(

46 i

48
4#L ¥<P›h L “„¡n‘¨™_T

48
­M^k
Nishi-ΔL/Nluc € L “„¡ 1,914-33 =­M

49
n‘…¨™Zl

0* +1¢D7˜—‹L “„¡ 1,914-33 =­M

50
n‘…¨™Zl U

51 L•

55 ‰ ‰3ˆ
L “„¡ 1,929-33 =0+§¦G¯NPYNE°
6 4 ª: FPn‘l WŸ

65 gcdv

67
N®Œ4#

67
.2#0)

67
Nishi-ΔL/Nluc [j NA ŒY4",28%xZzT

67
SDS-PAGE #&6-5'(

68

[jŒRNA ]E  cDNA J\

68

34&1PCR

69
CAu«v

70 i

72
“„¡ƒ©OHmtL1929-33 n‘Z–Se{l

72
4#mRNA ¢D7 +1 RNA ˜— L “„¡

72
1,9292-33 =­M¨™Zl
4#P “„¡J L “„¡ 1,929-33 =­M

73
¨™Zl

U

75 L•

79  Ÿ
8 6  ¤
8 8 X€b~
8 9

ɭ

ɭʨ

ȒȐȨ/̥Ï'.ďœêȎɴŽ@JIˆ\Ż£ȕÐ˔ƂǏȩ( @ ǃ Ȩ,ɴŽ!si=2êȎ/̥ȢŝʈĮ̥ȪƤ̡̥ȫ+*.“ýˑȱ,˘ʗ @ɁɦȩȑDɀ!ů̥56 100%ǥ¡@(1, 2) ȒȐȨ,Ł@ƽé+‹ SdŒijĚ@Ư(̥énjȱ+ǰȬDZ/ǁ"ȾɍA'+ ȗĚ̥ǃ Ȩ/̥Ʋǃ̥N^GlG̥\OŒ[ktGðŐ+*.ˢěĞD˿ϕȟ, ŢÚř'@(3) .ǥɸƪ/̥ïÚ,‹SdŒƛɇƹö'+Ȯ ʼn˓‘ę,̇—'?̥Š˶ɞ59,000 £)ƜĹA'@(4) ǃȨ.ôĖ) +@Ȩôµ/̥ƒonPJIˆ\ȴ†wjJIˆ\Ƀ‡eXJIˆ\Ŋ.ȒȐ ȨJIˆ\( @ ǃJIˆ\/̥Ȯʼn˓‘ę(/Im̥Ê˘ę(/G†IT <Qfn+*.˫țêȎ.˶(ƂǏDɲˏ̥ʆȉȟ,ɬƔA'@ 7 !̥A>.êȎ,ç̥G‚‡OĪ̂(/ÿɇ.WJƒ‡;ȨôŔ)+$' @(1) ʉȱ,̥JIˆ\.¯Ơ/̥ƂǏÀµ.đǺ—,ijĚ@JIˆ\ ČÆD¥'ƂǏ@),=?Ɔɍ@ µÒ,½Î!JIˆ\/̥ǂ ǕɁɦ,ƂǏ!ů̥.ˇɢÒDǭŵŻ,Ʌê@ <'JIˆ\/—ǎ Ɂɦɜ,á˛̥ƂǏDƓĪ@)̥˪ɗ+ɁɦȩȑD°ʇǥȱ+̎ìʅ ŻʀȇDŧ˄ ª‘.=,̥ȒȐȨ.ʇǥȖ̞)<̥.ǥ¡ ɸƪ;ĩ)>̥ïÚ+‹SdŒƛɇ.ƹö,ç̥ǰȬDZ.˵Ȯźë )ʨ@
A7(,̥ȒȐȨǰȬDZ.˵ȮDȴƕ̥‹SdŒ<IŒbvKŠŒ+ *Dȝ!ǚ+îȬØɳʯ8>A'! +>̥A.ƯDZ,

';ïÚ+ƽéŻ/ȾʲA'+(5~7) .=+—̥2004 Š̥əę JH\WŒZŒœ,'̥‹SdŒƛɇǤ.+15 ǣ.įŻȒȐȨDȮȩ !,;C>̥̇—ȱ+ǰȬ,=?țˡ!ž¹ġĈA!(8) . Žɸ,Ł@Øɳ/̥Ƶȹȑƃ3.ʳńDȴȱ)!̡˦ʐ.Ub€Œ=2 ˲̍ʐ.€ca†̥+>2,ƍJIˆ\ʐ( @‡qt‡Œ=2GŒb [Œ.ƌ”,=?ǙƆA'@ .Øɳ/̥ů,€ˆJMQŽxŠ iWˆ)ĊăḀA7(“ǰ.Ȩ( $!ȒȐȨ,Ł@ǰȬDZ)' ƿŮA! ̥Ăǚ.Øɳ,=?ǰȭ!ȩ¹/‘ʫªĨ, 1 ¹.8( @.,Ł(9)̥ØɳDú';ǥ¡!Žɸ/ņ+); 26 ¹ġĈA' @)>(2)̥ǃǰȬDZ.ƽéŻ,/ȤĒƔ!A'@ >,̥ŽɸDƵ ȹȑƃ3ʳń@ǰȬDZ.ƽéŻ,%'ɃĴȱǓƒɀA'+) >̥ȒȐȨǰȬDZ)'€ˆJMQŽxŠiWˆDȝ@)DƜĭ+ ȽɊɸ;ijĚ@(10, 11) ª‘.=,̥ǰȬDZȾɍ,9'ǚ+ƯDZ ǜɢA'!;..̥ƽé+ǰȬDZȾɍ.ȴØ/ǁ"ɍ$'+ ¤ů̥ ȒȐȨǰȬDZDȾɍ@!:,/̥ȒȐȨJIˆ\.ĥǧǟţ=2ȨƃūƆ ǟţDǛȱ)!ǰȬʐ @/ǰȬDZD˵Ȯ@)˪ʢ)ɷ>A@ .=+Øɳ=2ʐȎD˵Ȯ@!:̥ÿJIˆ\ʓȰ˂.ÚIJǟɾDʰ ɣ,Șʧ̥ÿ.ǰȬǛȱ)'.ƽȝŻDʮ¼@)˪ʢ( @

ȒȐȨJIˆ\.Vo/̥ɞ12 QŠz\.̎ÚɕIk\˱ RNA (

?̥N̥P̥M̥G =2 L ʓȰ˂DWj'@(12) ĂJIˆ\.ɚIJ/ ȏŴȱ+ũ˜ȑ.ūƃD)?̥.Ǚ˖/LŒzŠx)mS‰NOxZj, ĪßA@(12) LŒzŠx/̥Ŀ™ɣɽȞLj.ɿ˂Ÿ˪ʄ)̥M =2 G

ʓȰ˂,=?ǙƆA'@(12) M ʓȰ˂/LŒzŠxDʜƉ#'?̥ JIˆ\ɚIJūƆ<Ùʋ,˪ʢ+ŭåDnj!(12~15) G ʓȰ˂/JIˆ\ɚ IJʛ̏>\rISȑ,ɌÙ'?̥Ŀ™ɣɽ3.ćȸ=2½Î̥+>2 ,JIˆ\—ċƍµ.Ȝțʳń,˷”@(12, 16) Ư̥mS‰NOxZj/̥

VoRNḀ+>2, N̥P =2 L ʓȰ˂,=?ǙƆA'@(12) N ʓ

Ȱ˂/VoRNA )ɧḀ̄JIˆ\ mRNA ˆÔ=2Vo RNA ʠʟ.

˯ĝ)+@N-RNA ʠĀµDūƆ@(12, 13) L ʓȰ˂/̥RNA »ijŻ RNA

~‡‚†_)'̥.ÐĖIJ( @ P ʓȰ˂));,̥JIˆ\ RNA Ā Ɔ,˷”@(12, 13, 17) .=,̥A.JIˆ\ʓȰ˂;JIˆ\. ūƆ=2ĥǧ.˚Ɇ,'Ŷʢ“ýǠ+ŭåDƐ$'@)>̥ȒȐ Ȩ.ǰȬǛȱ)+@ýɾŻɷ>A@
‘ʫ.JIˆ\ʓȰ˂.#̥RNA ~‡‚†_. L ʓȰ˂/̥ɣɽ, @JIˆ\ĥǧ,'—ŵȱ+ŭåDnj!ĩǟɾʓȰ˂( @ +C#̥ L ʓȰ˂/̥JIˆ\ mRNA ĀƆ,Ŷʢ+~‡‚†_ǶŻ"(+̥mRNA

. 5’ ǂɏ3.Q„euŒTǶŻ=2 3’ ǂɏ.~‡GhlˆìǶŻ+*̥

mRNA .Ɔȋ,˷@ǚ+ǶŻ;Ɣ%(12, 18~21) >,̥‘ʫ.ǟɾ,ç

̥VoRNA ʠʟǶŻDƽ@);Ȼ>A'@(12) .=,̥L ʓ

Ȱ˂/̥ƂǏɣɽ,@Ï'.JIˆ\RNA =2JIˆ\ʓȰ˂.Ȝț,

Ŷ̓( ?̥ƂǏů.JIˆ\.ĥǧ,˪ʢ+ŭåDƐ$'@)>̥ǰ

ȬǛȱ.ƽæ+Ãʞ)ʨ@ ĺ̅,̥IŒvˆLŒYJIˆ\.RNA ~‡‚

†_˻ļä.vFtu†tˆ<‡qt‡Œ+*̥JIˆ\.RNA ~‡‚†

\. RNA ~‡‚†_( @ L ʓȰ˂;Ăǚ,̥ǰȬǛȱ)'ƽé)+@ ýɾŻDɀĐ'@

7!̥L ʓȰ˂‘ʫ.ǟɾDȮȗ@!:,/̥§.ʓȰ˂).ȶ ·ȝ

˪ʢ)+@ ѵȱ,/̥L ʓȰ˂ RNA ~‡‚†_ǶŻDɀ!:,/̥

.ÐĖIJ( @JIˆ\ P ʓȰ˂).ɧĀ˪ʢ( @)Ȼ>A'@

(12) 7!̥JIˆ\ M ʓȰ˂JIˆ\ mRNA ˆÔ=2Vo RNA ʠʟ .q†Œ\.âŲDƐ)>(22)̥L ʓȰ˂) M ʓȰ˂.˶,¶>.ȶ  ·ȝijĚ@)ɀĐA@ Ư̥L ʓȰ˂/̥ƂǏɣɽÒ(Ŀ™Ė

IJ);ȶ ·ȝ'@)ɷ>A@ Ƽˎ̥Bauer >(23)/̥ȒȐȨJIˆ\

L ʓȰ˂̥ųŅɔ˷˗ʓȰ˂( @ dynein light chain 1 ,ɧĀ@)̥ >,.ɧĀƂǏɣɽÒ(.éȖȱ+ÝƿˆÔ,˪ʢ( @)DɀĐ' @ ª‘.=,̥L ʓȰ˂/̥RNA ĀƆ,˷”@ǚ+ǟɾDƔ$' @),ç̥.ǟɾ.Ȯȗ,ĩ.ÚIJ).ȶ ·ȝDŶʢ)@ . )>̥L ʓȰ˂.ÚIJǟɾDʧNj@)(̥ȒȐȨǰȬDZ.˵Ȯ,Ą !ƽȝ+Ȼʣű>A@)ɷ>A@ +>̥ȒȐȨJIˆ\ L ʓȰ ˂.ÚIJǟɾ,˷@ġĈ/̥‘ʫªĨ,ƪ¹.8( @!:(24~27)̥>+ @žġ.ʏɉǭ:>A'@
ʉȱ,̥ɣɽ,@ĥǧǚŦ.̚²Ż>̥ƒonPJIˆ\ȴ,Ŋ @ÿɇJIˆ\. L ʓȰ˂ǟɾ/̥ ,̚²'@)ɷ>A'! ĺ ̅,̥ƒonPJIˆ\ȴ.ÿɇJIˆ\. L ʓȰ˂.˶,/̥̞Ť,¿ij

A!ʩ6 ɒƇ.̔Ğ̢Conserved Region̩CR̪I ~ VỊijĚ@)ġĈ

RNA ~‡‚†_ǶŻ,˪ʢ+ƒdvĆ7A'@)(18)̥CR V = 2CR VI / mRNA .Q„euŒT,˷”@¿ij̔Ğ( @)(19~21, 29) +*ƴ>)A! A>.ǟɾ/̥‘ʫ.ƜĹ.˔?̥ȒȐȨJIˆ\̥ ǬȦŻûÒȇJIˆ\̥=2̡ȧJIˆ\+*̥ƒonPJIˆ\ȴ,Ŋ @ǚ+JIˆ\ɇ.L ʓȰ˂.˶(¿ijA'@)ȾʲA'@(20, 24~27, 30~32)
ª‘.=,̥A7(/̥ƒonPJIˆ\ȴ,Ŋ@JIˆ\.ǟɾȱ +̚²ŻDĠ,̥ĂJIˆ\L ʓȰ˂.ÚIJǟɾʧNjʗCA'! Ư(̥ ƒonPJIˆ\ȴ,/̥ĩǚ+Ŀ™Ğ<ɥɱƕĄŻDƽ@JIˆ\ɇĆ 7A'@);Ȼ>A'@ ¹0̥ȒȐȨJIˆ\/̥ďœ̚.Ɂɦɜ .ɥɱ,Ł@ƕĄŻŨƯ(̥r†€S`JIˆ\Ƀ.l…Oe\ˆ ȨJIˆ\/̥̠̚.ĉćĔɜ.ɥɱ,Ł@ƕĄŻŨ .=,̥ƒ onPJIˆ\ȴ,Ŋ@JIˆ\ɇ.˶( $';̥.ȏŴĪȢ+ $'@)DɷƄ@)̥ÿɇJIˆ\. L ʓȰ˂,/̥ƒonPJIˆ\ ȴ.JIˆ\˶(¿ijA!ÚIJǟɾ,ç̥A A.JIˆ\ɇ,ȏŴȱ +Ǚ˖<ÚIJǟɾ+*ijĚ'@ýɾŻ @ +>̥ȒȐȨJ Iˆ\DĆ:̥ÿɇJIˆ\,ȏŴȱ+ L ʓȰ˂.ÚIJǟɾ,˷@Ȼʣ/̥ Ǘ:'ņ+
A7(̥ƒonPJIˆ\ȴ.ÿɇJIˆ\. L ʓȰ˂ǟɾDʧNj@! :,/̥€lVoˆÔŽʠʟɜ)ĉ0A@ĺ̝ɜȝ>A'!̢ė Ị (32~37) ǃĺ̝ɜ/̥€lVo RNA̢ůː̣DȮȗ@€lVox†\ €j̥+>2,JIˆ\Vo.ˆÔŽʠʟ,Ŷ̓+N̥P =2 L ʓȰ˂D

Ȯȗ@x†\€jDğ̜ɣɽ,ÐńÎ@)(ʗCA@ ɣɽÒ(Ȯȗ

A@€lVoRNA /̥JIˆ\ RNA .ˆÔŽʠʟ,˪ʢ)+@Vo–ǂ

ɏ.̎Wj̔Ğ.˥ÜDƔ#̥.˶,|bˆˆZvK†_ˠ¯IJ+*.

‰~bˠ¯IJƗÎA!Ǚ˖DƔ% .€lVoRNA ̥x†\€

j>ȮȗA!N̥P =2 L ʓȰ˂)ɧĀ@)(̥mS‰NOxZj

£ŕȱ,ūƆA@ .ů̥RNA ~‡‚†_( @ L ʓȰ˂.ǟɾ,=

$'€lVoRNA .ʠʟ+>2, mRNA .ˆÔ˄$!ɧnj̥ɣɽÒ(

‰~bʓȰ˂ȜțA@ ª‘.ôȘ>̥€lVoˆÔŽʠʟɜD ȝ@)(̥¬Ɓ,ħȢńÎA! L ʓȰ˂.ǟɾŻD̥ÿɇ‰~b ˠ¯IJ.ǶŻ,Ġ&'ɘ¾,ʮ¼@)(@ +>̥ǃɜ/̥ ˆÔŽʠʟ,Ŷ̓)+@Ï'.JIˆ\ĖIJ.ºɩD£ŕȱ+x†\€jȮȗ ɜ,»ij'@)>̥ƂǏɣɽ,@ L ʓȰ˂ǟɾDŶ;Óȗ( '+ýɾŻɷ>A@ ĺ̅,̥˚õ.ġĈ,'̥€lVoRNA Ȯȗx†\€jDńÎ!ɣɽ,Ł̥Ȯȗx†\€j>N̥P =2 L ʓ

Ȱ˂Dºɩ!ĢḀ̄€lVoRNA ,WjA'@‰~bˠ¯IJ.

ȮȗŨʳńA!.,Ł(38)̥JIˆ\ƂǏ,=$'A>.JIˆ\ʓ Ȱ˂Dºɩ!ĢĀ/̥‰~bˠ¯IJ.Ȯȗ/5)E*ʲ:>A+$! (39) A>.)/̥€lVoˆÔŽʠʟɜ/̥ĺ̅.ƂǏɣɽ(˄@ˆ ԎʠʟǟţDŶ;Óȗ'+ýɾŻDɀ'@ !$'̥Ű Lj=?;ƂǏɣɽ,ˎLJ«( L ʓȰ˂ǟɾDʧNj(@Ʈ!+ĺ̝ɜ.˵Ȯ ƾ7)ɷ!
ǃȽɊDĺư@, !?̥ʎɸ/̥‰~bˠ¯IJDȮȗ@ L ˠ¯IJ

ǠƟȒȐȨJIˆ\DL ʓȰ˂.ǟɾʧNj,Ƕȝ@ĺ̝ɜDɷǔ!̢ė IỊ

Șʷȱ,̥Ȯȗx†\€j.ńÎ,=?L ʓȰ˂ºɩA!ɣɽ, L ˠ¯IJ

ǠƟJIˆ\ƂǏ!ĢḀ̄JIˆ\mRNA ˆÔ=2Vo RNA ʠʟ

ʗCA@!:̥L ˠ¯IJǠƟJIˆ\/éȖȱ,ĥǧ@ .JIˆ\ĥǧ ,°̥ƂǏɣɽÒ,‰~bʓȰ˂ȮȗA@ !$'̥¬Ɓ.ń ÎħȢ L ʓȰ˂ǟɾ,ö6Ŭ̑D̥‰~bʓȰ˂.Ȯȗ,=?ʮ¼( @)ɷ!  
 L ʓȰ˂.ǟɾʧNj,ƽȝ+Ʈʤĺ̝ɜD˵Ȯ@!:̥ NanoLuc ˆ Z v K †  _ D Ȯ ȗ  @ L ˠ ¯ IJ Ǡ Ɵ Ȓ Ȑ Ȩ J I ˆ \ ̢Nishi-ΔL/Nluc̣Dǝɍ! >,̥ǃJIˆ\Dĺ̅,ȝ!‘(̥ȒȐ Ȩ J I ˆ \ L ʓȰ˂.ÚIJǟɾDʧNj@))! ɐ 1 Ɏ(/̥ Nishi-ΔL/Nluc .țȎŻȑDȾʲ!ů̥L ʓȰ˂.ǟɾʧNj,@ĂJIˆ \.ƽȝŻDǖʪ! ɐ2 Ɏ(/̥ȒȐȨJIˆ\ L ʓȰ˂.ǟɾ,˪ʢ+ ǁȻ.¿ij̔ĞDƚǐ@!:̥©ʛȱ+ȒȐȨJIˆ\ǒ. L ˠ¯IJ,% 'ǪˈʧNjDʗ$! .ɧnj)'ĂĹA!̥L ʓȰ˂ 1,914-33 ³.¿ij ̔Ğǟɾȱ,˪ʢ( @D̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ'ʮ¼! ɐ 3 Ɏ(/̥ ǟɾȱ,˪ʢ)ɀA!1,929-33 ³.¿ij̔Ğ. L ʓȰ˂ǟɾ,@ŭåD

ÚIJ‰zˆ(ʧƴ@!:̥mRNA ˆÔ=2Vo RNA ʠʟ̥+>2, L

図 図 I. ミニゲノム転写・複製系の原理の模式図 培養細胞 ミ ミニゲノムRNA N 蛋白質 P 蛋白質 L 蛋白質 レポーター L N P N、P および L 蛋白質 発現プラスミド 導入 導入 転写・翻訳 転写・翻訳 複製 ヌクレオカプシド ウイルスゲノム両末端 非コード領域の遺伝子配列 ミニゲノムプラスミド レポーター 遺伝子

培 培養細胞 L 蛋白質 L L 蛋白質 発現プラスミド L遺伝子欠損ウイルス ヌクレオカプシド 接種 導入 P M G レポーター N ヌクレオカプシドの 放出 レポーター 転写・翻訳 転写・翻訳 複製 図 II. L遺伝子欠損狂犬病ウイルスを用いたL蛋白質機能解析の原理の模式図

ɐ

1 Ɏ

L ˠ¯IJǠƟȒȐȨJIˆ\.ǝɍ

+>2,

L ʓȰ˂ǟɾʧNj,@

ţ

ţʷ

A7(̥ƒonPJIˆ\ȴ.ÿɇJIˆ\. L ʓȰ˂ǟɾDʧNj@! :̥™,€lVoˆÔŽʠʟɜȝ>A'!(32~37) ̥4'. JIˆ\ĖIJ.ºɩD£ŕȱ+Ȯȗɜ,»ij!ǃɜ(/̥ƂǏɣɽ,@L ʓȰ˂ǟɾDŶ;Óȗ(+ýɾŻɷ>A@ (ǃȽɊ(/̥ ƂǏɣɽ,=?ˎLJ«( L ʓȰ˂ǟɾDʧNj(@Ʈ!+ĺ̝ɜD˵Ȯ@ ȴȱ(̥ˆZvK†_DȮȗ@ L ˠ¯IJǠƟȒȐȨJIˆ\Dǝɍ@ ))! ǃJIˆ\/̥x†\€jńÎ,=? L ʓȰ˂DȮȗ!ɣɽ( ĥǧ̥ˆZvK†_DȮȗ@)ƿŮ(@ .ȗʽDàȝ̥L ʓȰ ˂3.ħȢńΈZvK†_.Ȯȗ,ö6Ŭ̑Dʮ¼@),=?̥L ʓȰ˂ǟɾ,@ħȢńÎˢ³˪ʢ( @Dǖʪ(@)ɷ!
ɐ1 Ɏ(/̥ȒȐȨJIˆ\ʡôǒ(40).ˠ¯IJƣ·ɜDǶȝ̥NanoLuc ˠ¯IJDȮȗ@L ˠ¯IJǠƟJIˆ\̢Nishi-ΔL/Nluc̣Dǝɍ! .ů̥ ĂJIˆ\.țȎŻȑDǖʭ@!:̥L ʓȰ˂Ȯȗɣɽ,@ĂJIˆ\ .ĥǧŻ̥+>2,ˆZvK†_ȮȗɾDǖʪ! >,̥L ʓȰ˂.ǟ ɾʧNj,@Nishi-ΔL/Nluc .ƽȝŻDǖʪ@ȴȱ(̥RNA ~‡‚†_ ǶŻDǠĬ!ħȢĝ L ʓȰ˂.Ȯȗx†\€jDȝ'̥ĂJIˆ\.Ȯȗ @ˆZvK†_.ǶŻL ʓȰ˂ǟɾ.ƕǛ)+@Dǖʭ!

Dž

Džƭ=2ƯDZ

ğ̜ɣɽ
J\ɁɦʋɣɽʂȞLjNA ɣɽ(41)D̥CO2IŒQ…zb̢s†X‹̣ Ò(ğ̜!̢37̥5%CO2̥95%ɋǫ̣ NA ɣɽ.ĥǧȝğě̢GṂ) '̥10%ȍɼ¦ʖǾ̢FCṢ̢ʟčȡþ̧10437-028̥GibcọǽçITˆ MEM ̢E-MEṂ̢ʟčȡþ̧05900̥ƲǬ̣Dȝ! 7!̥T7 ~‡‚†_Dż ŝȱ,Ȯȗ@BHK ɣɽ̢BHK/T7-9 ɣɽ̣(42)D̥5%FCS =2 10%i‡ xi\Ž|\vKiŽwŠ\̢ʟčȡþ̧260300̥Becton Dickinsoṇǽ çE-MEM Dȝ'ğ̢̜37̥5%CO2̥95%ɋǫ̣̥ůː. L ˠ¯IJǠƟ ȒȐȨJIˆ\ǒ.·Ù,ȝ!
L ˠ¯IJǠƟȒȐȨJIˆ\.ƂǏ¼DȁĹ@!:̥Retro-X Tet-Off

Advanced Inducible Expression System̢ʟčȡþ̧632105̥ClontecḥDȝ

'̥gi†XIS‡Œ.̎ij̒(ʡôǒL ʓȰ˂DʳńȮȗ@ NA ɣ

ɽ̢TetOff-NiL-NA ɣɽ̣Dǝɍ! +̥ǃȽɊ(/̥ŝ, L ʓȰ˂.Ȯ

ȗDʳń!ȑƃ.ɣɽD¸ȝ! !$'̥Ăɣɽ. GM )'̥‘ʫ

.NA ɣɽȝ GM . FCS D̥gi†XIS‡ŒǚǶŻDɀ+)Ⱦʲ

A'@Tet System Approved FBS̢ʟčȡþ̧631106̥Clontecḥ,ɳ

ƞ!ğ̜ǺDȝ! 7!̥Ăɣɽ.ğ̜,%'/̥NA ɣɽ)Ăǚ.LJ«

x x†\€j
ȒȐȨJIˆ\ʡôǒ. L ʓȰ˂DȮȗ@x†\€jD̥ŝDZ. DNA SŠlŒTƊʘDȝ'Ǚɖ!̢ė 1-1̣ +C#̥ʡôǒ.Vox †\€j(43)D˯ĝ)'̥ʛ 1-1 .x†IDȝ! PCR Dʗ̥L ˠ¯ IJ̔ĞDĆ9 DNA DĥŞ! .ĥŞȜȎD̥ďœ̚ɣɽȮȗzSb pCAGGS/MCS̢lj¢ĪĴîɃĴȽɊƇ
ǯŎɵʝƨƘ=?ڔ̣.SŠlŒ Tˢ³,ƗÎ! ·ʟA!x†\€jDpCNiL )Ċă!
7!̥C ǂɏ, 3xFLAG bTDƔ% L ʓȰ˂.Ȯȗx†\€j;·ʟ!̢ė 1-1̣ ѵȱ,/̥ʡôǒ. L ˠ¯IJ̔Ğ+>2, 3xFLAG bTˠ¯IJ˥Ü DĆ9 DNA D PCR ,=?ĥŞ! .ů̥pCNiL .ĢĀ)Ăǚ,̥ pCAGGS/MCS . S Š  l Œ T ˢ ³ , Ɨ Î  ̥  . x † \ € j D pCNiL-3xFLAG )Ċă!
>,̥RNA »ijŻ RNA ~‡‚†_ǶŻDǠĬ!(18) mtL-SDD DȮ ȗ@x†\€jDǙɖ@!:̢ė1-1̣̥pCNiL-3xFLAG ,WjA' @L ʓȰ˂.ɐ 728 ³G€o˨. G  S ,̥ɐ 730 ³G€o˨. N  D ,ɳ ƞA@=ģĠ˥ÜDƦħ! ·ʟ!x†\€jD pCNiL-SDD )Ċă !

Nishi-ΔL/Nluc .Vo RNA DȮȗ@Vox†\€j̢pNishi-ΔL/Nluc̣

D·ʟ@!:̢ė1-2̣̥Yamaoka >(44)ġĈ!|bˆˆZvK†_D

Ȯȗ@ʡôǒȮȗx†\€j̢pNishi-luc̣,ˠ¯IJƦħDç! +C

#̥NanoLuc Ȯȗx†\€j( @ pNL1.1.CMV̢ʟčȡþ̧N1091̥xŠ‚

ů̥pNishi-luc .|bˆˆZvK†_ˠ¯IJ=2 L ˠ¯IJDĆ9ˠ¯IJ˥ Ü)̥‘ʫ.DNA Dɳƞ@)(̥pNishi-ΔL/Nluc DǙɖ!
€ l V o  x † \ € j · ʟ . ! : ̥Okada > (45) , = ? · ʟ  A ! pCAGGS-RVDI-Luc D˯ĝ)' PCR Dʗ̥pŒyejĝ‡}YI – ȒȐȨJIˆ\ʡôǒVo 5’i‰†˥Ü – |bˆˆZvK†_ – ʡôǒVo 3’‡c˥Ü – hˆbɺȇJIˆ\‡}YI.̒,ÿˠ ¯IJ̔ĞDĆ9 DNA DĥŞ! ‘ʫ.ĥŞȜȎD pCAGGS/MCS .xŠƒ b̔Ğ.’Ƿ,ƗÎ@)(̥€lVox†\€jpC-NiDI-Luc D· ʟ!̢ė 1-3̣ ʡôǒ N ʓȰ˂̥=2 P ʓȰ˂DA AȮȗ@ pCAGGS-NiN̥=2 pCAGGS-NiP ,%'/̥ªã.ȽɊ,'·ʟ A!;.D¸ȝ!(46) L L ˠ¯IJǠƟJIˆ\.·ʟ
Yamada > (43) , = ? Ⱦ ɍ  A ! ʡ  ô ǒ . ˠ ¯ IJ ƣ · ɜ D Ƕ ȝ  ̥ Nishi-ΔL/Nluc D·Ù! +C#̥1 JKˆ !?̥8.1 µl .TransIT-LT1 ̢ʟčȡþ̧MIR2300̥MiruṣD 50 µl . OPTI-MEM̢ʟčȡþ̧31985-070̥ Gibcọ)ǼĀ!ů̥ĻȀ( 20 Ú˶̍ɳ@),=?x†\€jńÎʯʐ Dʶʟ! ǡ,̥1 JKˆ !? pNishi-ΔL/Nluc̢2 µg̣̥+>2,ȒȐȨJ

Iˆ\RC-HL ǒ(47). N̥P =2 L ʓȰ˂DA AȮȗ@ pT7IRES-RN

(42)̢0.4 µg̣̥pT7IRES-RP (42)̢0.1 µg̣=2 pT7IRES-RL (42)̢0.2 µg̣ DĆ9x†\€jȄǺDʶƫ! A>.x†\€jńÎʯʐ=2x†\ €jȄǺDǼċ̥20 Ú˶ĻȀ(̍ɳ! .ů̥.ǼċǺDɥɱğ̜x

‰i̢24 JKˆ̥ʟčȡþ̧662160̥Greiner Bio-Onẹ,ğ̜! BHK/T7-9 ɣɽ(42),Ȇ’! CO2IŒQ…zbÒ̢37̥5%CO2̥95%ɋǫ̣( 3 Ʋ˶ğ̜!ů̥^ˆ\S‰r̢ʟčȡþ̧353085̥BD FalcoṇDȝ 'BHK/T7-9 ɣɽDğ̜Ǻ)Ïˬĕø! TetOff-NiL-NA ɣɽȝ GM 3 ml )ǼĀ!ů̥ >:ɥɱğ̜x‰i̢6 JKˆ̥ʟčȡþ̧657160̥ Greiner Bio-One ̣ ‘ , ñ ŋ ğ ̜  ̥  % ğ ̜ Ǻ D ˿ õ  '   ! TetOff-NiL-NA ɣɽ3ƛɇ! 37̢ǫȶ̧5%CO2̥95%ɋǫ̣( 6 Ʋ˶ğ ̜!ɣɽ.ğ̜ǺD1,400g̥10 Ú˶̥ĻȀ.LJ«(˝ŵ!ů̥ű>A! ‘ǾDNishi-ΔL/Nluc .\ieSJIˆ\)̥80(¿ij! v vMO\Ge^I
ɥɱğ̜x‰i̢24 JKˆ̣,ğ̜! TetOff-NiL-NA ɣɽDȝ'̥v MO\Ge^I,=@JIˆ\ƂǏ¼.ȁĹDʗ$! +C#̥ɥɱğ̜ x‰i‘,ñŋğ̜A!TetOff-NiL-NA ɣɽD 0.5 ml .pŒS\Ǻ̢ʟč ȡþ̧05905̥ƲǬ̣(ǵǸ!ů̥TetOff-NiL-NA ɣɽȝ GM Dȝ' 10 Á̄ǨŚ˩!ÿJIˆ\ǺD̥1 JKˆ !? 0.1 ml %ƛɇ! 37̥1 Ʒ˶̢ǫȶ̧5%CO2̥95%ɋǫ̣.LJ«(JIˆ\Dɣɽ,ćȸ!ů̥p ŒS\Ǻ̢0.5 ml / JKˆ̣(ǵǸ! ǡ,̥0.5%‚dˆ^ˆŠ\̢ʟč

ȡþ̧22224-55̥kO†Ig\Ṣ̥5% Tet System Approved FBS Ćƽ E-MEM

DÿJKˆ, 0.5 ml %ç̥CO2 IŒQ…zbÒ(ğ̜!̢37̥

5%CO2̥95%ɋǫ̣ ƛɇ 4 Ʋů,̥4%r†|ˆGˆhsj-‡Œ˨ɯʚǺ̢ʟ

!ů̥100%‚boˆ̢ʟčȡþ̧134-01833̥ċËɟʐ̣Dȝ'ʄ˒˚Ø ȘD1 Ú˶ʗ$! ǡ,̥˶ƛʔËƍµDZ̢IFẠ,=?ƂǏɣɽDǏʊ!ů̥ ÿJKˆ,ūƆA!vMO\̢JIˆ\ƍỗŻɣɽ×̇@\~eị .ƪ,Ġ&JIˆ\ƂǏ¼DɓÙ! +̥IFA ,/ǡƍµ)'ƍȒ ȐȨJIˆ\N ʓȰ˂ƒoSŠkˆƍµ 13-27 (48)D̥Ÿǡƍµ)'vˆ NŠ^IŒŽI`dNZGni̢FITC̣ǛʻƍJ\ IgG̢ʟčȡþ̧55514̥ CappeḷDȝ! vMO\.ʦŀ,/ Axiovert200 ̙ų˳̢Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.̣Dȝ!

N

Nishi-L/Nluc ƂǏ NA ɣɽ.ʔËÌȥǏʊ

ɥɱğ̜x‰i̢24 JKˆ̣,ğ̜! NA ɣɽ̢ğ̜LJ«̧37̥5%CO2̥

95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !? 0.5 µg . pCAGGS/MCS 7!/ pCNiL DA

AńÎ! .)̥x†\€jńÎʯʐ)'TransIT-2020̢ʟčȡþ̧

MIR5400̥MiruṣD¸ȝ! ńÎ 2 Ʋů,̥ÿJKˆ, Nishi-ΔL/Nluc ǒ DƂǏĩ˪Ť̢MOI̥ɣɽ 1 À !?.ƂǏJIˆ\ɚIJƪ̣= 0.01 (ƛɇ

! ƂǏ2 Ʋů̥4%r†|ˆGˆhsj-‡Œ˨ɯʚǺDȝ'ÿJKˆÒ.

ɣɽDĘĹ!ů̥100%‚boˆ,=?ʄ˒˚ØȘDʗ$! .ů̥ǡ

ƍµ)'13-27 (48)̥Ÿǡƍµ)' FITC ǛʻƍJ\ IgG Dȝ' IFA

Dʗ̥Âɍĝʔ˳ȶŗ̙ų˳. BZ-8000̢QLŒ\̣Dȝ' FITC ʔ

L

L ʓȰ˂DȮȗ@ NA ɣɽ,@ Nishi-L/Nluc .ĥǧŻ

ɥɱğ̜x‰i̢24 JKˆ̣,ğ̜! NA ɣɽ̢ğ̜LJ«̧37̥5%CO2̥

95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !? 0.5 µg . pCAGGS/MCS̥pCNiL 7!/ pCNiL-3xFLAG D ń Î  !  . )  ̥ x † \ € j ń Î ʯ ʐ )  ' TransIT-2020 D¸ȝ! ńÎ 2 Ʋů̥Nishi-ΔL/Nluc ǒD MOI = 0.01 )+ @=ƛɇ̥1̥3 =2 5 Ʋů,ğ̜‘ǾDĕø! .ů̥‘ʫ.vM O\Ge^I,=?ğ̜‘Ǿ—.JIˆ\ƂǏ¼DȁĹ! 7!̥.Ʒ̥

ğ̜‘Ǿ.ĕø,ȝ!ɣɽDcˆzeWPBṢ̢̢ʟčȡþ̧05913̥ƲǬ̣

Dȝ'ǵǸ!ů̥100 µl . Passive Lysis Buffer̢ʟčȡþ̧E1941̥ PromegạDȝ'Ȅʧ̥80(Öɧ! ʕʧ!ɣɽȄʧǺDơƑ̥ 12,000g̥4̥2 Ú˶.LJ«(˝ŵů̥NanoGlo Luciferase Assay System̢ʟ

čȡþ̧N1110̥Promegạ=2 1254 Luminometer̢BioOrbiṭDȝ'̥

10 µl .‘Ǿ—.ˆZvK†_ǶŻDȁĹ! ˆZvK†_ǶŻ/̥ Relative Light Unit (RLU)/sec )'ʛʫ! +̥‘ʫ.JIˆ\ƛɇ,

%'/̥1 LJ« !? 3 %.JKˆDȝ'ʗ̥ÿğ̜‘Ǿ—.JIˆ\Ƃ Ǐ¼̥+>2,ÿğ̜ɣɽ=?ű>A!ˆZvK†_ǶŻÄ.şĜÄ=2 ǛȃʵŗDɓÙ! ɪʩØȘ,/
ǖĹD˞ȝ! SDS-~‡GS‡ˆG€jVˆ̊ǫdzê̢SDS-PAGẸ=2JL\bŒ wŠei
ɥɱğ̜x‰i̢24 JKˆ̣,ğ̜! NA ɣɽ̢ğ̜LJ«̧37̥5%CO2̥ 95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !? 1.5 µg . pCAGGS/MCS̥pCNiL @/

pCNiL-3xFLAG D ń Î  !  . )  ̥ x † \ € j ń Î ʯ ʐ )  ' TransIT-2020 D¸ȝ! ńÎ 3 Ʋů̥ÿɣɽD‡Œ˨ɯʚțȘ̛ģǬ̢PBṢ

,=$'ǵǸ!ů̥50 µl . Sample Buffer Solution (2ME+)(2)̢ʟčȡþ̧

196-11022̥ċËɟʐ̣Dȝ'ɣɽDȄʧŽĕø! ÿɣɽȄʧǺ—.ʓȰ

˂D37̥30 Ú˶.ØȘ(ȌħŻ!ů̥5%7!/ 10%~‡GS‡ˆG€

jVˆDȝ!̊ǫdzê,=?Ú̉! ̊ǫdzêů̥X Cell II Blot Module ̢Invitrogeṇ7!/i†Œ\wŠei Turbo wŠeiZ\g̢Bio-RaḍD

ȝ'̥Vˆ—.ʓȰ˂DPolyvinylidene difluoride̢PVDF̣ʄ̢ʟčȡþ̧

IPVH00010̥Milliporẹ,ˆÔ! ǡ,̥5%\Q€ˆS=2 0.1% Tween20 DĆ9 PBS Dȝ'̥ˆÔØȘA! PVDF ʄDwŠeQŒT!

ů̥ǡƍµ)'̥1%\Q€ˆS=2 0.1%Tween20 DĆ9 PBS Dȝ '500 Á7!/ 2000 ÁŚ˩!ƍ FLAG M2 J\ƒoSŠkˆƍµ̢ʟ čȡþ̧F3165̥SIGMẠ7!/ƍd…w‡ŒJ\ƒoSŠkˆƍµ ̢ʟčȡþ̧T5168̥SIGMẠD÷Ÿ! >,ǵǸ!ů̥Ÿǡƍµ) 'ʡǴ‹Xt{ˆNQZc_̢HRP̣ǛʻƍJ\ IgG ƍµ̢ʟčȡþ̧ 55567̥CappeḷD 1%\Q€ˆS=2 0.1%Tween20 DĆ9 PBS ,=? 2000 Á,Ś˩'÷Ÿ! Western Lightning Plus ECL kit̢ʟčȡþ̧ NEL103001EḀPerkin-Elmeṛȝ'ìĴȮË!ů̥ChemiDoc XRS+ Z\g̢Bio-Raḍ,=? PVDF ʄ‘.ZTkˆDǖÙ!

7!̥ůː.ˆZvK†_ǶŻ.ȁĹ,ȝ>A!̥Nishi-ΔL/Nluc .ƂǏ

!L ʓȰ˂Ȯȗ NA ɣɽ.ȄʧǺ;̥JL\bŒwŠeiDZ,=?ʧNj!

(2ME+)(2)Dǽç̥ơƑ! ÿȄʧǺ—.ʓȰ˂D 37̥30 Ú˶.ØȘ (ȌħŻ!ů̥‘ʫ.ƯDZ,Ű̥SDS-PAGE =2JL\bŒwŠei

DZ D ʗ $ ! ! "  ̥  . )  ̥ ƍ µ Ś ˩ Ǻ )  ' Can Get Signal

Immunoreaction Enhancer Solution̢ʟčȡþ̧NKB-101̥ljǴɡ̣D̥ìĴ

ȮËȝʯʐ)'Immunostar LD̢ʟčȡþ̧296-69901̥ċËɟʐ̣D¸ȝ ! N Nishi-L/Nluc .IJĵJIˆ\ɚIJ.ƧÙƿ.ǖʪ
ɥɱğ̜x‰i̢24 JKˆ̣,ğ̜! NA ɣɽ̢ğ̜LJ«̧37̥5%CO2̥ 95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !? 0.5 µg . pCNiL-3xFLAG DńÎ! .)̥ x † \ € j ń Î ʯ ʐ )  ' TransIT-2020 D ¸ ȝ  ! ń Î 2 Ʋ ů ̥ Nishi-ΔL/Nluc D MOI = 0.01 )+@=ƛɇ̥1̥9̥24 =2 48 Ʒ˶ů, ğ̜‘ǾDĕø̥‘ʫ.vMO\Ge^I,=?ÿğ̜‘Ǿ—.JIˆ\ ƂǏ¼DȁĹ! +̥‘ʫ.JIˆ\ƛɇ,%'/̥1 LJ« !? 3 %. JKˆDȝ'ʗ̥ÿğ̜‘Ǿ—.JIˆ\ƂǏ¼.şĜÄ=2Ǜȃʵŗ DɓÙ! €lVoGe^I
ɥɱğ̜x‰i̢24 JKˆ̣,ğ̜! NA ɣɽ̢ğ̜LJ«̧37̥5%CO2̥ 95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !? 0.4 µg . pCNiL-3xFLAG̥pCNiL-SDD 7!/ pCAGGS/MCS ));,̥0.4 µg . pC-NiDI-Luc̥0.4 µg . pCAGGS-NiN 

'Lipofectamine 2000̢ʟčȡþ̧11668027̥InvitrogeṇD¸ȝ! 37

(2 Ʋ˶ğ̜!ɣɽDcˆzeW PBS()Dȝ'ǵǸ!ů̥100 µl . Cell

Culture Lysis Reagent̢ʟčȡþ̧E1531̥PromegạDȝ'Ȅʧ̥80 (Öɧ! ʕʧ!ɣɽȄʧǺDơƑ̥12,000g̥4̥2 Ú˶.LJ«(

˝ŵů̥Luciferase Assay System̢ʟčȡþ̧E1500̥Promegạ=2 1254

Luminometer̢BioOrbiṭDȝ'̥10 µl .‘Ǿ—.ˆZvK†_ǶŻDȁ Ĺ! +̥‘ʫ.x†\€jńÎɣɽ,%'/̥1 LJ« !? 3 JKˆȝ Ɓ̥A A.ˆZvK†_ǶŻÄ.şĜÄ=2ǛȃʵŗDɓÙ! ɪʩØȘ,/̥ÚƩÚNj=2Tukey .ĩ˪ǖĹDȝ! N Nishi-ΔL/Nluc ƂǏ NA ɣɽ=?ű>A@ˆZvK†_ǶŻ.ȁĹ
ɥɱğ̜x‰i̢24 JKˆ̣,ğ̜! NA ɣɽ̢ğ̜LJ«̧37̥5%CO2̥ 95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !? 0.5 µg . pCAGGS/MCS̥pCNiL-3xFLAG 7!

/ pCNiL-SDD DA AńÎ! .)̥x†\€jńÎʯʐ)'

TransIT-2020 D¸ȝ! ńÎ 2 Ʋů̥Nishi-ΔL/Nluc ǒD MOI = 0.01 )+

@=ƛɇ̥9 7!/ 48 Ʒ˶ů,ğ̜‘ǾD˿õ! cˆzeW PBṢ̢

Dȝ'ǵǸ!ů̥100 µl . Passive Lysis Buffer Dȝ'Ȅʧ̥80(

Öɧ! ʕʧ!ɣɽȄʧǺDơƑ̥12,000g̥4̥2 Ú˶.LJ«(˝

ŵů̥NanoGlo Luciferase Assay System =2 1254 Luminometer̢BioOrbiṭ

Dȝ'̥10 µl .‘Ǿ—.ˆZvK†_ǶŻDȁĹ! +̥‘ʫJIˆ

\ƂǏ,%'/̥1 LJ« !? 3 %.JKˆDȝ'ʗ̥A A.ˆZv

ɧ

ɧnj

L ʓȰ˂Ȯȗx†\€jDńÎ! NA ɣɽ,@ Nishi-ΔL/Nluc . ĥǧɾ
L ʓȰ˂Ȯȗɣɽ,@ Nishi-ΔL/Nluc .ĥǧɾ+>2,ƂǏƓĪɾDǖ ʪ@ȴȱ(̥pCNiL .ńÎů, Nishi-ΔL/Nluc Dƛɇ! NA ɣɽDȝ'̥ JIˆ\N ʓȰ˂,Ł@ÌȥǏʊDĺư! .ɧnj̥ʠƪ. N ʓȰ˂̃ ŻɣɽȾʲA!̢ė 1-4Ạ 7!̥̃Żɣɽ(/̥ɣɽ˂ÒłÎµ,̚² !̗ɚȑ.ʔËZTkˆʠƪʲ:>A!̢ė 1-4Ḅ Ứ̥ŻŁȊ) 'ɋzSbDńÎ!ɣɽ, Nishi-ΔL/Nluc Dƛɇ!ĢḀ̄N ʓȰ˂/ǖ ÙA+$!̢ė1-4C̣ .)>̥Nishi-ΔL/Nluc /̥L ʓȰ˂Ȯȗɣ ɽ,'ĥǧ̥ƂǏƓĪ@)ɀA!
ǡ,̥L ʓȰ˂Ȯȗɣɽ,@ Nishi-ΔL/Nluc .ĥǧéȖDǖʪ@!:̥ pCNiL DńÎ! NA ɣɽ,ĂJIˆ\Dƛɇ̥ɦƲȱ,ĕøA!ğ̜‘ Ǿ—.JIˆ\ƂǏ¼DȁĹ!̢ė 1-5Ạ .ɧnj̥Ăɣɽ.ğ̜‘Ǿ— .JIˆ\ƂǏ¼/ƛɇůƲƪ.ɦ˚));,‘Ƴ̥ƛɇ 5 Ʋů,@ğ

̜‘Ǿ—.JIˆ\ƂǏ¼/3.9105 _{Focus Forming Units̢FFỤ/ml ,˛}

! Ư̥ɋzSbDńÎ!ɣɽ.ğ̜‘Ǿ—>ƂǏŻJIˆ\/ǖ ÙA+$!̢< 3.0 FFU/mḷ .)>̥Nishi-ΔL/Nluc /̥L ʓȰ˂ Ȯȗɣɽ,'ƕƪ˷ƪȱ,ĥǧ@)ȾʲA!

Nishi-ΔL/Nluc ƂǏɣɽ,@ˆZvK†_.ȮȗDȾʲ@!:̥‘ʫ

! .ɧnj̥pCNiL DńÎ!ƂǏɣɽ,@ˆZvK†_ǶŻ/̥ Ʒ˶ɦ˚));,‘Ƴ̥ƛɇ5 Ʋů,/ 1.0105 _{RLU/sec )+$! Ư̥} ɋzSbDńÎ!ů,ĂJIˆ\Dƛɇ!ÿɣɽ>ű>A@ĂǶŻ/̥ ´‰zˆ(ƜɅ̥ƛɇ5 Ʋů(; 38.7 RLU/sec ( $!̢ė 1-5Ḅ A >.ɧnj=?̥Nishi-ΔL/Nluc ƂǏɣɽ(/̥ĂJIˆ\.ĥǧ,°̥ˆZv K†_ǶŻƕƪ˷ƪȱ,‘Ƴ@)ɀA!
>,̥x†\€j>.L ʓȰ˂.ȮȗD̥ƍ FLAG ƍµDȝ'ǖÙ @!:̥L ʓȰ˂ C ǂɏ, 3xFLAG bTD¨ç! L ʓȰ˂.Ȯȗx†\€j D·ʟ! ĂbT.¨ç L ʓȰ˂.ǟɾ,ö6Ŭ̑Dǖʪ@ȴȱ(̥ pCNiL-3xFLAG DńÎ! NA ɣɽ,@ Nishi-ΔL/Nluc .ĥǧéȖ̥+> 2,ĂJIˆ\ƂǏɣɽ,@ˆZvK†_.ȮȗDȾʲ! .ɧnj̥ Ăɣɽ.ğ̜‘Ǿ—.JIˆ\ƂǏ¼/̥Ʒ˶ɦ˚));,‘Ƴ̥JIˆ\ ƛɇ5 Ʋů,/ 1.2106 _{FFU/ml ,˛!̢ė 1-5Ạ 7!̥pCNiL DńÎ} !ĢĀ.JIˆ\ƂǏ¼)Ǫˈ'̥A.ƛɇůƲƪ,';ƽƁ+ŗ /ʲ:>A+$!̢p0.05̣ 7!̥pCNiL-3xFLAG DńÎ!ÿƂǏɣɽ Ò.ˆZvK†_ǶŻDȁĹ!ɧnj̥ĂǶŻ/Ʒ˶ɦ˚));,‘Ƴ̥ ƛɇ5 Ʋů,/ 2.0105 _{RLU/sec )+$!̢ė 1-5Ḅ pCNiL DńÎ!ĢĀ} .ˆZvK†_ǶŻ)Ǫˈ!)B̥ƛɇ 1 Ʋů(/ƽƁ,̞$!Ư ̢p<0.05̣̥ƛɇ 3 Ʋů=2 5 Ʋů(/ƽƁ+ŗ/ʲ:>A+$!̢p0.05̣ ª‘.ɧnj>̥L ʓȰ˂ C ǂɏ3. 3xFLAG bT.¨ç/̥.ʓȰ˂ǟɾ D˻ļ+)ɀA!

J

JL\bŒwŠei,=@ L ʓȰ˂.ǖÙ

3xFLAG bTDƔ% L ʓȰ˂ƍ FLAG ƍµ,=?ǖÙA@Ⱦʲ@!

:̥pCNiL-3xFLAG DńÎ! NA ɣɽDJL\bŒwŠeiDZ,=?ʧNj ! .ɧnj̥Ăx†\€jńÎɣɽ,'̥L ʓȰ˂.ÚIJˬ,ȶŪ@̥ ɞ240kDa .ʓȰ˂.ȮȗDɀqŒjȾʲA!̢ė 1-6̣ Ư̥ɋzS b7!/pCNiL DńÎ!ɣɽ(/̥.=+qŒj/ȾʲA+$! .)>̥ƍFLAG ƍµDȝ@)(̥3xFLAG bTDƔ% L ʓȰ˂ ǖÙA@)ɀA! ğ̜‘Ǿ—3.IJĵJIˆ\.ƧÙƿ.ǖʪ
L ʓȰ˂Ȯȗɣɽ, Nishi-ΔL/Nluc Dƛɇ!ů̥Ʈ!,IJĵJIˆ\ɚIJ ƧÙA@7(.ƿ˶Dǖʪ@ȴȱ(̥pCNiL-3xFLAG DńÎ! NA ɣ ɽ3ĂJIˆ\Dƛɇ!ů̥1̥9̥12̥24 =2 48 Ʒ˶ů.ğ̜‘Ǿ—. JIˆ\ƂǏ¼DȁĹ!̢ė1-7̣ .ɧnj̥ƂǏ 1 Ʒ˶ů=2 9 Ʒ˶ů .ğ̜‘Ǿ—>ƂǏŻJIˆ\/ǖÙA+$!̢<3.0 FFU/mḷ.,Ł '̥12̥24 =2 48 Ʒ˶ů.ğ̜‘Ǿ—>ƂǏŻJIˆ\ɚIJ̢6.7 FFU/ml̥ 7.1102 _{FFU/ml =2 1.010}3 _{FFU/mḷǖÙA! .)>̥Ƃ} Ǐ12 Ʒ˶ª˼.ğ̜ɣɽ(/̥IJĵJIˆ\ɣɽĨ,ƧÙA'@) ɀA! €lVoˆÔŽʠʟɜ,=@ mtL-SDD . L ʓȰ˂ǟɾŻ.ǖʪ
RNA »ijŻ RNA ~‡‚†_ǶŻDǠĬ@ƱȻ.ħȢ(18)DńÎ!ħ

ȢĝL ʓȰ˂̥mtL-SDD .ǟɾȱǠ̀DȾʲ@!:̥€lVoˆÔŽʠʟ ɜ,=?̥3xFLAG bT.¨çA!˫țĝ L ʓȰ˂̢wtḶ) mtL-SDD . ǟɾŻDǪˈ!̢ė 1-8̣ ɋzSbDńÎ!ɣɽ,@ˆZvK† _ǶŻ/ 1.8103 _{RLU/sec ( $!.,Ł̥wtL DȮȗ!ɣɽ>/} 5.0103 _{RLU/sec )ƽƁ,̞ˆZvK†_ǶŻǖÙA!̢p<0.01̣} .ɧnj=?̥wtL Ȯȗɣɽ,'€lVo RNA .ˆÔŽʠʟ,=?ˆZ vK†_ȮȗA!)ȾʲA! Ư̥mtL-SDD DȮȗ!ɣɽ .ˆZvK†_ǶŻ/1.7103 _{RLU/sec (̥ɋzSbńÎɣɽ,@Ă} ǶŻ)Ăɑ( ?̢p0.05̣̥% wtL DȮȗ!ɣɽ,@ĂǶŻ)Ǫ ˈ'ƽƁ,´$!̢p<0.01̣ !$'̥mtL-SDD /̥~‡‚†_Ƕ ŻDǹĬ'@)ɀA! Nishi-ΔL/Nluc Dȝ! mtL-SDD . L ʓȰ˂ǟɾŻ.ǖʪ
L ʓȰ˂.ǟɾʧNj,@ Nishi-ΔL/Nluc .ƽȝŻDʮ¼@ȴȱ(̥wtL =2 mtL-SDD DȮȗ! NA ɣɽ,ĂJIˆ\Dƛɇ̥JIˆ\.Ƨ Ùʲ:>A+ƂǏ 9 Ʒ˶ů.Ăɣɽ,@ˆZvK†_.ǶŻDȁĹ !̢ė 1-9Ạ .ɧnj̥ɋzSbDńÎ!ɣɽ,@ˆZvK† _ǶŻ/ 3.1102 _{RLU/sec ( $!.,Ł̥wtL DȮȗ!ɣɽ>/} 1.2103 _{RLU/sec )ƽƁ,̞ǶŻű>A!̢p<0.01̣ Ư̥mtL-SDD D} Ȯȗ!ɣɽ.ˆZvK†_ǶŻ/2.7102 _{RLU/sec (̥ɋzSbńÎ} ɣɽ,@ĂǶŻ)Ăɑ( ?̢p0.05̣̥% wtL Ȯȗɣɽ.ĢĀ)Ǫˈ 'ƽƁ,´$!̢p<0.01̣

>,̥Nishi-ΔL/Nluc .IJĵJIˆ\.ƧÙʲ:>A!ƛɇů 48 Ʒ˶ȴ .ɣɽDȝ'̥ˆZvK†_ǶŻDȁĹ! ̢ė 1-9Ḅ .ɧnj̥ mtL-SDD DȮȗ!ɣɽ,@ˆZvK†_ǶŻ/ 1.8103 _RLU/se ( $!.,Ł̥ɋzSbDńÎ!LJ«(/2.0103 _{RLU/sec )Ăɑ.} ǶŻDɀ!̢p0.05̣ Ư̥wtL Ȯȗɣɽ>/ 2.3105 _{RLU/sec .ˆZ} vK†_ǶŻʲ:>ḀmtL-SDD Ȯȗ.ĢĀ)Ǫˈ'ƽƁ,̞$! ̢p<0.01̣
7!̥ńÎħȢL ʓȰ˂.Ȯȗˬ,ö6Ŭ̑Dǖʪ@!:̥ƂǏ 9 Ʒ ˶ů.ɣɽȄʧǺ—. L ʓȰ˂DJL\bŒwŠeiDZ,=?ʧNj!̢ė 1-10̣ A A. L ʓȰ˂.ȮȗDɀqŒj.ZTkˆŨŤDĹˬ!ɧnj̥ mtL-SDD .Ȯȗˬ/̥wtL .Ȯȗˬ)Ǫˈ' 1.28 Áĩ$!;..̥–ɸ .˶,ƽƁŗ/ʲ:>A+$!̢p0.05̣
ª‘=?̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ!ǟɾʧNj.ɧnj̥mtL-SDD /̥.Ȯȗ ,'ˬȱĒ̘/+;..̥~‡‚†_ǶŻDǹĬ'@)ɀ A! +C#̥Nishi-ΔL/Nluc  L ʓȰ˂.ÚIJǟɾʧNj,Ÿȝ(@) ɀA!

ɷ

ɷŀ

ǃɎ(/̥ȒȐȨJIˆ\ʡôǒ.ˠ¯IJƣ·ɜDȝ'̥L ˠ¯IJǠƟ

JIˆ\. Nishi-ΔL/Nluc Dǝɍ! ȒȐȨJIˆ\DĆ9ƒonPJIˆ

\ȴ.ÿɇJIˆ\,'̥ˠ¯IJƣ·,=? L ˠ¯IJǠƟJIˆ\.ǝɍ DġĈ!¹/A7(ijĚ̥¤ĕÝ:'.ȽɊ)+@
L ʓȰ˂Ȯȗ NA ɣɽ,@ Nishi-ΔL/Nluc .ĥǧŻDǖʪ!ɧnj̥Ă JIˆ\/ƕƪ˷ƪȱ,ĥǧ@)ƴ>)+$!̢ė 1-5Ạ .Ʒ̥ Nishi-ΔL/Nluc .ĥǧƻɮ/̥˚õ,ġĈA!̥ˠ¯ȱ,ķÏ+ʡôǒ.ĥ ǧƻɮ)̚²'!(43, 49) >,̥Nishi-ΔL/Nluc ƂǏɣɽ.ʔËÌȥǏ ʊDĺư!)B̥JIˆ\ʠʟʠĀµ)'Ȼ>A@nT‡ǚŅµ(50))̚ ²!̗ɚȑ.ʔËZTkˆDɀɣɽ˂ÒłÎµDĆ9ɣɽĩƪʲ:>A !̢ė 1-4Ḅ A>.ɧnj=?̥x†\€jńÎ,=? L ʓȰ˂Dºɩ@ )(̥˔ŝ.JIˆ\)̚²!ǟţ,=? Nishi-ΔL/Nluc ĥǧ@)ɷ >A! 7!̥Nishi-ΔL/Nluc ƂǏɣɽÒ,@ˆZvK†_ǶŻ.ǖʪ .ɧnj̢ė1-5Ḅ̥JIˆ\ĥǧ,°̥ƂǏɣɽÒ( NanoLuc ˆZvK† _ȮȗA!)ƴ>)+$! .)>̥Nishi-ΔL/Nluc /̥ˆZ vK†_ǶŻDƕǛ)! L ʓȰ˂ǟɾ.ǖʪ,ƽȝ)+@ýɾŻɷ> A!
Nishi-ΔL/Nluc Dȝ! L ʓȰ˂ǟɾʧNj(/̥ħȢĝ L ʓȰ˂.Ȯȗ,= ?ˆZvK†_ǶŻ´’!ĢḀ̄L ʓȰ˂.ǟɾŻ.´’,=@.̥ @/.ȮȗĶĹŻ.´’,=@;.Díß(+)ſĹA!

–ɸDíß@!:,/̥JL\bŒwŠeiDZ,=$'̥L ʓȰ˂.Ȯȗˬ Dǖʪ@ŶʢŻ @)ɷ! (̥L ʓȰ˂.ǖÙDȴȱ,̥22 À. G€o˨˥Ü>+@3xFLAG bTD¨ç@))! ǃȽɊ(¸ȝ! ʡôǒDĆ9ĩ.ȒȐȨJIˆ\ǒ.L ʓȰ˂)Ȣ+?̥PV ǒ(51, 52). L ʓȰ˂,/̥C ǂɏ, 15 ǦĠ.G€o˨¨çȾʲA'@̢GenBank ȯ˰ȡþ̧AFR56628.1̣ .)/̥C ǂɏ3.G€o˨˥Ü.¨ç,=?̥ Ŷ; L ʓȰ˂.ǟɾŻ,Ŭ̑Dö6)/˽>+)DɀĐ'@ ĺ̅,̥3xFLAG DƔ% L ʓȰ˂.ǟɾŻDǖʪ!ɧnj̥C ǂɏ3. 3xFLAG bT.¨ç/̥L ʓȰ˂.ǟɾŻ,Ŭ̑+)ɀA!̢ė 1-5̣ 7!̥

ƍFLAG ƍµDȝ!JL\bŒwŠeiDZ,=?̥L ʓȰ˂ǖÙA!̢ė

1-6̥ė 1-10̣ ª‘.)>̥3xFLAG bT.¨ç,=$'̥L ʓȰ˂Ȯȗ ˬ.ǖʪýɾ)+$! !$'̥ǃȽɊ,@ǟɾʧNj,/̥ĂbT DƔ%L ʓȰ˂Dȝ@))!
IJĵJIˆ\ɚIJ.ƧÙƿ.ǖʪ,'̥ƂǏ 9 Ʒ˶ů(/IJĵJIˆ\ /ƧÙA+)ȾʲA!̢ė1-7̣ .)>̥ƂǏ 9 Ʒ˶ů.ɣ ɽÒ,@ˆZvK†_ǶŻDȁĹ@)(̥Ý:,ƂǏ!ɣɽ.8

,@JIˆ\RNA ĀƆéȖDʮ¼(@)ɷ>A! Ư̥ƂǏ 48 Ʒ

˶ů.ğ̜ɣɽ(/̥Ʈ!,IJĵJIˆ\ƧÙḀƂǏƓĪ˘ʗ' @)ɷ>A@ !$'̥.=+ƂǏƓĪ.ɧnj̥ˆZvK†_Ƕ

Ż.ŗ=?ŨʶA@!:̥ńÎħȢ L ʓȰ˂ǟɾ,ö6È+Ŭ̑;

ǖÙ(@)ɷ! ª‘.)>̥ǃȽɊ(/ƂǏ9 Ʒ˶ů=2 48 Ʒ˶

L ʓȰ˂ǟɾʧNj,@ Nishi-ΔL/Nluc .ƽȝŻ.ǖʪ,'̥ mtL-SDD Dºɩ!ƂǏɣɽ,@ˆZvK†_ǶŻ/̥wtL DȮȗ! LJ«.;.)Ǫˈ'ƽƁ,´̥%ɋzSbDńÎ!LJ«)Ăɑ( $!̢ė1-9̣ ɣɽÒ,@ wtL =2 mtL-SDD .ʓȰ˂Ȯȗˬ.˶,ƽ Ɓŗ/ʲ:>A+$!)>̢ė1-10̣̥mtL-SDD Ȯȗɣɽ,@ˆZ vK†_ǶŻ.´’/̥ʓȰ˂.ĶĹŻ.´’,=@;.(/+̥~‡‚ †_ǶŻ.ǠĬ,=@)ƴ>)+$! 7!̥.Ɔɰ/̥€lVo ˆÔŽʠʟɜ,=@mtL-SDD .ǟɾʧNj.ɧnj);ʇ'!̢ė 1-8̣ ª‘.)>̥Nishi-ΔL/Nluc ƂǏɣɽ,@ˆZvK†_ǶŻDƕǛ,̥ ħȢńÎA!L ʓȰ˂.ǟɾŻ,%'ǖʪ(@)Þƴ!
ª‘̥ɐ1 Ɏ(/̥Nishi-ΔL/Nluc / L ʓȰ˂.ºɩ,=?ĥǧ@)̥ +>2,ƂǏɣɽÒ, NanoLuc ˆZvK†_ȮȗA@)DȾʲ! 7!̥L ʓȰ˂3.ħȢńÎ,=?̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ' L ʓȰ˂ǟɾD ʧNj(@)Dƴ>,!

プライマー 方向a 配配列（5 → 3 ） NiL1 F F TTTTGGCAAAGAATTCATGCTAGACCCAGGAGAGGT NiL1 R R CAGCAGGATTGCCTCTCGAAACTCTGAATTCT NiL2 F F GAGGCAATCCTGCTGTCCAAGACCC NiL2 R R AAAAAGATCTGCTAGCTTACAAGCAGCTGTAGTCTAA 表 表1-1. pCNiLの作製に使用したプライマー a _{F（フォワードプライマー）、R（リバースプライマー）}

m mt L-SDD N- 2,127 1 -C G  D  N N- -C 3x FLAG 728-730 西ヶ原株 L蛋白質 3xFLAG付加 西ヶ原株 L蛋白質 （wt L） S  D  D N- -C 3x FLAG 728-730 発現プラスミド pCNiL pCNiL-3xFLAG pCNiL-SDD 図1-1. 第一章で用いた各種L蛋白質の一次構造の模式図ならびに発現プラスミド名 白色の枠は、狂犬病ウイルス西ヶ原株のL蛋白質由来のアミノ酸領域を表す。 灰色の枠は、3xFLAGタグのアミノ酸領域を表す。

TCA GAC GAT 塩基配列：

GGA GAC AAC 塩基配列：

西 西ヶ原株 Nishi-ΔL/Nluc ₅ N P M G Nluc ₃ L G M P N 5 3 図1-2. 西ヶ原株 および Nishi-ΔL/Nlucのゲノム構造の模式図 白色の枠は、狂犬病ウイルス西ヶ原株の蛋白質のコード領域を表す。 灰色の枠は、NanoLucルシフェラーゼのコード領域を表す。

ホタルルシフェラーゼ遺伝子 ：ハンマーヘッド型リボザイム配列 ：西ヶ原株ゲノム3 リーダー配列 ：西ヶ原株ゲノム5 トレーラー配列 ：デルタ肝炎ウイルスリボザイム配列 図1-3. ミニゲノムプラスミドpC-NiDI-Lucの模式図

100 µm (A)
10 µm (B)
100 µm (C) 図1-4. L蛋白質発現プラスミドを導入したNA細胞におけるNishi-ΔL/Nlucの増殖 空ベクターまたはpCNiLを導入したNA細胞にNishi-ΔL/NlucをMOI = 0.01の条件で接 種した。接種後2日目の細胞を固定し、狂犬病ウイルスN蛋白質に対するマウスモノク ローナル抗体13-27（48）を用いて同細胞を染色した。 （A、B）pCNiLの導入されたNishi-ΔL/Nluc感染細胞における蛍光免疫染色像。白色の 矢頭は細胞質内封入体様の顆粒を示す。（C）空ベクターの導入されたNishi-ΔL/Nluc 感染細胞における蛍光免疫染色像。

図 図1-5. L蛋白質発現NA細胞における（A）Nishi-ΔL/Nlucの増殖効率ならびに （B）感染細胞内におけるルシフェラーゼ活性の推移 空ベクター、pCNiLまたはpCNiL-3xFLAGを導入したNA細胞にNishi-ΔL/Nlucを MOI = 0.01の条件で接種した。（A）接種後1、３および5日目の細胞の培養上清を 回収し、ウイルス感染価を測定した。（B）培養上清の回収に用られた各感染細胞内 におけるルシフェラーゼ活性を測定した。エラーバーは標準誤差を示す（n=3）。 ＊：p < 0.05 1.E+00 1.E+01 1.E+02 1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06 1.E+07 1 3 5 Days post-infection Empty vector L L-3xFLAG 1 3 5 7 L蛋白質（3xFLAG なし） L蛋白質（3xFLAG あり） 空ベクター ウ イ ル ス 感 染 価 (Log 10 FFU/ml) 感染後日数 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 1 3 5 Days post-infection Empty vector L L-3xFLAG 0 2 4 6 N a n o L u c ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 (Log 10 RLU/sec) L蛋白質（3xFLAG なし） L蛋白質（3xFLAG あり） 空ベクター 感染後日数 (A) (B)

*

図 図1-6. 抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロットによるL蛋白質の検出 空ベクター、pCNiLおよびpCNiL-3xFLAGをそれぞれNA細胞に導入した。2 日後の細胞溶解液を、抗FLAG抗体および抗αチューブリン抗体を用いたウエ スタンブロット法により解析した。 245 ­ 190 ­ (kDa) 58 ­ 46 ­ ­ L ­ αチューブリン 空 ベ ク タ ー   L 蛋 白 質 （ 3 x F L A G な し ） L 蛋 白 質 （ 3 x F L A G あ り ）

図 図1-7. L蛋白質発現細胞におけるNishi-ΔL/Nlucのウイルス放出期の検討 1.E+00 1.E+01 1.E+02 1.E+03 1.E+04 1 9 12 24 48 感染後時間 ND 1 2 3 4 ウ イ ル ス 感 染 価 （log 10 FFU/ml） pCNiL-3xFLAGを導入したNA細胞にNishi-ΔL/NlucをMOI = 0.01の条件で 接種した。接種後1時間目から48時間目の細胞の培養上清を回収し、ウイル ス感染価を測定した。エラーバーは標準誤差を示す（n=3）。ND：検出限界 以下（<3.0 FFU/ml）

0 1 2 3 4 5 6 mcs NiL SDD

**

**

ホ タ ル ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 (x10 3 RLU/sec) 空 ベ ク タ ー w t L m t L -S D D ns 図1-8. ミニゲノム転写・複製系によるwt Lおよびmt L-SDDの蛋白質機能性の検討 空ベクター、pCNiL-3xFLAGまたはpCNiL-SDDを、ルシフェラーゼ発現ミニ ゲノムプラスミド、N蛋白質発現プラスミドおよびP蛋白質発現プラスミドと 共にNA細胞へ導入した。導入2日後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を 測定した。エラーバーは標準誤差を示す（n=3）。 ns ： p 㱢 0.05、＊＊：p < 0.01

図 図1-9. 空ベクター、pCNiL-3xFLAGおよびpCNiL-SDDを導入したNA細胞に Nishi-ΔL/NlucをMOI=0.01の条件で接種した。（A）接種後9時間目、ま たは（B）48時間目の細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。エ ラーバーは標準誤差を示す（n=3）。ns ： p 㱢 0.05、＊＊：p < 0.01 Nishi-ΔL/Nlucを用いたwt Lおよびmt L-SDDの蛋白質機能性の検討 0 2 4 6 8 10 12 14 16 MCS NiL SDD

**

**

N a n o L u c ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 (x10 2 RLU/sec) 空 ベ ク タ ー w t L m t L -S D D (A) ns 0 5 10 15 20 25 30 MCS NiL SDD

**

**

N a n o L u c ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 (x10 4 RLU/sec) 空 ベ ク タ ー w t L m t L -S D D (B) _ns

図 図1-10. pCNiL-3xFLAGならびにpCNiL-SDDを導入したNA細胞における wt L および mt L-SDDの蛋白質発現量の検討 図1-8において、ルシフェラーゼ活性の測定用に回収された感染9時間後の各細胞溶解 液から、抗FLAG抗体および抗αチューブリン抗体を用いたウエスタンブロットにより、 各種L蛋白質およびαチューブリンを検出した。各バンドのシグナル強度より、L蛋白 質の発現量を測定した結果をグラフに示した。エラーバーは標準誤差を示す。 ns ： p 㱢 0.05 0 0.5 1 1.5 2 2.5 ns L 蛋 白 質 相 対 発 現 量 （L / αチューブリン） 245 ­ 190 ­ (kDa) 58 ­ 46 ­ ­ L ­ αチューブリン 空 ベ ク タ ー w t L m t L -S D D

ɐ

ɐ

2Ɏ

Lˠ¯IJʧNj,=@

LʓȰ˂.ʥǬŻ¿ij̔Ğ.ƚǐ

+>2,Ă̔Ğ.ǟɾȱ˪ʢŻ.ǖʭ

ţ

ţʷ

ȒȐȨJIˆ\ L ʓȰ˂,/̥ƒonPJIˆ\ȴ.ÿɇJIˆ\˶(¿ij A!̥ǟɾȱ,˪ʢ+̔ĞijĚ'@(26, 28) Ư(̥ĂJIˆ\ȴ, Ć7A@ÿɇJIˆ\,ȏŴȱ+̥%ǟɾȱ,˪ʢ+§.̔Ğ,˷@žġ /Ǘ:'ņ+ ȒȐȨJIˆ\. L ʓȰ˂ǟɾ.ÏľDʰɣ,Șʧ@!: ,/̥.=+ǁȻ.¿ij̔Ğ.ĂĹ).ǟɾȱ˪ʢŻ.ʧƴ“ýǠ) ʨ@
ĩǟɾŻʓȰ˂( @ L ʓȰ˂ǟɾDïÚ,Ȯȗ@!:,/̥§.JI ˆ\ʓȰ˂<Ŀ™ĖIJ+*̥ǚ+ÚIJ).ɧĀ˪ʢ)ɷ>A@  +>̥.=+ȶ ·ȝ,˪ʢ+ L ʓȰ˂‘.̔Ğ,%'.žġ/Ǘ: 'ņ+ (ǃɎ(/̥§ÚIJ).ɧĀ,˪ʢ+̔Ğ.ȏĹDŹ̕,̥ǚ +JIˆ\ǒ. L ˠ¯IJ.ǪˈʧNj,=?̥L ʓȰ˂ÚIJ.ʛ̏,ŇĚ̥ %ǟɾȱ,˪ʢ)ƜĹA@̔ĞDǖɢ@))!
ʉȱ,̥ʓȰ˂.˪ʢ+ǟɾDƐ̔Ğ,/̥ÚIJ˘ì.˚Ɇ,@ʾ .ʆȉ˟Ǝ̥+C#ǟɾȱâɞ.ɧnj̥G€o˨˥Ü̞Ť,¿ijA@ .=+ǟɾȱâɞ.Ũ̔Ğ.ƚǐ,/̥G€o˨̎ĂɵɳƞȖ(dN) / G€ o˨ĂɵɳƞȖ(dS) ǪʧNjŢȝ>A'@(53~55) ǃʧNj(/̥Łʽ) +@ˠ¯IJ.G€o˨Wj̔Ğ.ģĠ˥Ü.#̥dS ̞̥dN .´̔ Ğ̥+C#̥G€o˨ɳƞ˄?,̔ĞDƚǐ@)ýɾ( @ .=,G€o˨˥Ü.¿ijA!̔ĞDĂĹ@)(̥ʓȰ˂ǟɾ,˪ ʢ+̔ĞDƜĹ@)ýɾ( @

Ư̥ʓȰ˂.ʉȱ+Ż˂)'̥.ÚIJʛ̏,ʥǬŻÇĄ.Ũ̔Ğ

̇ɧ<)Ȼ>A'@ ʩ20 ɇ.G€o˨.ʥǬŻŽȣǬŻÇĄ

/A AȢ+$'?̥Kyte =2 Doolittle(56),=$'.țìĴȱŻȑ

,Ġ&!ȣǬŻ\WGÿG€o˨,å?Ɩ>A'@ ¹0̥Ƽ;ȣǬ Ż.̞I`ŠIZŒǦĠ,/4.5̥Ƽ;ʥǬŻ.̞GˆRlŒǦĠ,/4.5 .ȣǬŻ\WGå?Ū'>A'@ !$'̥Ă\WG.´̔ĞDƚ ǐ@)(̥ʓȰ˂.ʛ̏,ŇĚ@ýɾŻ.̞ʥǬŻ̔ĞDȁ(@
.=,̥dN / dS Ǫ=2ȣǬŻ\WG.A;´̔ĞDƚǐ@ )(̥ʓȰ˂ʛ̏,ŇĚ@̥ǟɾȱ,˪ʢ+̔ĞDƜĹ(@)ɷ!  (ǃɎ(/̥‘ʫ.2 %.ʧNjDZDȝ'̥ȒȐȨJIˆ\ L ʓȰ˂.ʛ̏ ,ijĚ̥%ǟɾȱ˪ʢŻ̞)ƜĹA@̔ĞDƮ!,ĂĹ@)) ! >,̥ĂĹA!¿ij̔Ğ.ǟɾȱ˪ʢŻD̥ɐ 1 Ɏ(ǝɍ! Nishi-ΔL/Nluc DǶȝ'ǖʭ@))!

Dž

Džƭ=2ƯDZ

ğ̜ɣɽ=2JIˆ\
NA ɣɽ=2 TetOff-NiL-NA ɣɽDɐ 1 Ɏ,ʫˉ!ƯDZ,=$'ğ̜ ! Nishi-ΔL/Nluc ,%'/̥ɐ 1 Ɏ,ʫː!;.D¸ȝ! ȒȐȨJIˆ\+>2,‡eXJIˆ\ L ˠ¯IJ.ǪˈʧNj
GenBank hbz\=?̥ʩ 15 ǒ.ȒȐȨJIˆ\̢ʛ 2-1̣̥+>2, ʩ12 ɇ.‡eXJIˆ\̢ʛ 2-2̣. L ˠ¯IJG€o˨Wj̔Ğ.ģĠ˥Ü Dùű! .ů̥MAFFT xŠT†(57)Dȝ'̥ģĠ˥Ü=2.G

€o˨˥Ü.ĩ˪˥ÜǪˈDʗ$! +̥Australian bat lyssavirus . L ʓ

Ȱ˂.ɐ23 ³.G€o˨ǦĠ/̥§.JIˆ\ɇ,/ʲ:>A+ƗÎħȢ(

$!!:̥ĂG€o˨ǦĠD˿õ!‘(§.ǒ)ĩ˪ǪˈDʗ$!

ADAPTSITE xŠT†(58)Dȝ'̥ȒȐȨJIˆ\ 14 ǒ̥7!/‡eX

JIˆ\11 ɇ,Ł@ȒȐȨJIˆ\ Ni-CE ǒ.dN / dS ǪDʧNj! .

)̥L ˠ¯IJÏģĠ˥Ü,C!@dN / dS Ǫ.ʧNj,/̥\†IhHŒTJH

ŒjJ̢SẈʧNjDZDȝ! +C#̥˗ɫ@ 20 WjŒD̦%.JHŒ

jJ)̥JHŒjJǍÒ.şĜdN / dS ǪDA AɓÙ! ǡ,̥L ˠ¯

IJmRNA . 5’ ǂɏÅ> 1 WjŒ% 3’ ǂɏÅ3JHŒjJǍD\†Ij

@)(̥L ˠ¯IJÏ˴,C!@şĜdN / dS Ǫ.ƜɅDʧNj!

7!̥GENETYX `viJKG ver. 10.1.1̢_ngHeS\̣Dȝ'̥L

Ǜ,Ġ&'ʧNj! +̥ǃʧNj,'; SW ʧNjDZDȝ! +C #̥˗ɫ@20 G€o˨ǦĠD 1 %.JHŒjJ)̥JHŒjJǍÒ.şĜ .ȣǬŻ\WGDɓÙ! N ǂɏÅ> 1 G€o˨% C ǂɏÅ3JHŒj JǍD\†Ij̥L ʓȰ˂Ï˴,C!@şĜȣǬŻ\WG.ƜɅDʧNj ! x x†\€j
wtL .Ȯȗx†\€j)'̥ɐ 1 Ɏ,ʫː! pCNiL-3xFLAG D¸ȝ ! 7!̥‘ʫ. L ˠ¯IJǪˈʧNj,=?ȏĹA!ʥǬŻ¿ij̔Ğ̢G€o ˨ǦĠ ɐ 1,914-33 ³̣,'̥ʧNj,ȝ!χeXJIˆ\ɇ˶(¿ij A!ʥǬŻG€o˨DȣǬŻ.G†lŒ̢Ạ,ħȢ!Ȯȗx†\€jD̥ ŝDZ. DNA SŠlŒTƊʘDȝ'Ǚɖ! ѵȱ,/̥wtL .ɐ

1,914-17 ³.G€o˨ǦĠ̢NYQḌ AYQḀɐ 1,920-25 ³G€o˨ǦĠ ̢RGFPEẸ AGFPEḀ7!/ɐ 1,929-33 ³G€o˨ǦĠ̢NPYNẸ APYAA ,A AɳƞA@=ģĠ˥ÜDƦħ!ÿɇħȢĝ L ʓȰ˂ ̢mtL1914-17̥mtL1920-25 =2 mtL1929-33̢̣ė 2-1̣DȮȗ@x†\

€jD·ʟ! ÿ.x†\€jD pCNiL-mt1914-17̥pCNiL-mt1920-25

=2pCNiL-mt1929-33 )Ċă!

€lVox†\€j)'̥ɐ1 Ɏ,'·ʟ! pC-NiDI-luc D¸ȝ

! N ʓȰ˂=2 P ʓȰ˂Ȯȗx†\€j,/̥ɐ 1 Ɏ)Ăǚ,̥ pCAGGS-NiN =2 pCAGGS-NiP DA A¸ȝ!

N

Nishi-ΔL/Nluc ƂǏ NA ɣɽ=?ű>A@ˆZvK†_ǶŻ.ȁĹ
ɥɱğ̜x‰i̢24 JKˆ̥ʟčȡþ̧662160̥Greiner Bio-Onẹ,ğ

̜!NA ɣɽ̢ğ̜LJ«̧37̥5%CO2̥95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !? 0.5 µg . pCAGGS/MCS̥pCNiL-3xFLAG̥pCNiL-mt1914-17̥pCNiL-mt1920-25 7!/ pCNiL-mt1929-33 DńÎ! .)̥x†\€jńÎʯʐ)' TransIT-2020̢ʟčȡþ̧MIR5400̥MiruṣD¸ȝ! ńÎ 2 Ʋů̥ Nishi-ΔL/Nluc ǒD MOI = 0.01 .LJ«(ƛɇ̥9 7!/ 48 Ʒ˶ů,ğ̜‘ ǾD˿õ! cˆzeW PBṢ̢̢ʟčȡþ̧05913̥ƲǬ̣Dȝ'ǵǸ

!ů̥100 µl . Passive Lysis Buffer̢ʟčȡþ̧E1941̥PromegạDȝ

'Ȅʧ̥80(Öɧ! ʕʧ!ɣɽȄʧǺDơƑ̥12,000g̥4̥ 2 Ú˶.LJ«(˝ŵů̥NanoGlo Luciferase Assay System̢ʟčȡþ̧N1110̥ Promegạ=2 1254 Luminometer̢BioOrbiṭDȝ'̥10 µl .‘Ǿ—. ˆZvK†_ǶŻDȁĹ! +̥‘ʫJIˆ\ƂǏ,%'/̥1 LJ« !? 3 %.JKˆDȝ'ʗ̥A A.ˆZvK†_ǶŻÄ.şĜÄ =2ǛȃʵŗDɓÙ! ɪʩØȘ,/̥ÚƩÚNj=2Dunnett .ĩ˪ǖĹ Dȝ! SDS-PAGE =2JL\bŒwŠei
‘ʫ.ˆZvK†_ǶŻ.ȁĹ,ȝ>A!̥Nishi-ΔL/Nluc ƂǏ 9 Ʒ˶ů

.ÿɣɽȄʧǺ̢50 µḷ,Ł̥50 µl . Sample Buffer Solution (2ME+)( 2)̢ʟčȡþ̧196-11022̥ċËɟʐ̣DǽçơƑ! ÿȄʧǺ—.ʓȰ˂

SDS-PAGE =2JL\bŒwŠeiDZDʗ$! +̥ƍµŚ˩Ǻ)' Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution̢ʟčȡþ̧NKB-101̥

ljǴɡ̣D̥ìĴȮËȝʯʐ)' Immunostar LD̢ʟčȡþ̧296-69901̥

ɧ

ɧnj

JIˆ\ L ˠ¯IJʧNj,=@ L ʓȰ˂ǟɾ,˪ʢ)ƜĹA@̔Ğ.ƚ ǐ
ȒȐȨJIˆ\ L ʓȰ˂.ʛ̏,ŇĚ̥%ǟɾȱ,˪ʢ)ƜĹA@ˠ ¯IJ̔ĞDƚǐ@ȴȱ(̥©ʛȱ+15 ǒ.ȒȐȨJIˆ\. L ˠ¯IJģĠ˥ ÜDȝ'̥dN / dS Ǫ̥+>2,ȣǬŻ\WG.SW ʧNjDʗ$! .ɧnj̥ dN / dS Ǫ=2ȣǬŻ\WG.A;´̔Ğ)'̥L ʓȰ˂ 1,870-1,930 ³.̔ĞȏĹA! .̔Ğ/̥ƱȻ.¿ij̔Ğ( @CR I ~ VI(28))/ ƴ>,Ȣ+$'!̢ė 2-2̥̌Ǎ(ʛɀ̣ >,ʰɣ,ǖʭ!)B̥ ȣǬŻ\WG.rbŒ,=?̥1,870-1,930 ³.̔Ğ/̥1,870-90 ³=2 1,900-30 ³. 2 ̔Ğ,íßA!̢ė 2-3Ạ .#. 1,900-30 ³,%' /̥12 ɇ.‡eXJIˆ\ L ˠ¯IJ˥ÜDȝ! SW ʧNj(;̥dN / dS Ǫ= 2ȣǬŻ\WG.–ɸ´$!̢ė2-3Ḅ ǡ,̥12 ɇ.‡eXJIˆ\ L ʓȰ˂.1,890-1,940 ³G€o˨˥ÜDȝ'̥ĩ˪˥ÜǪˈDʗ$! .ɧ nj̥ȏ,̥1,914-33 ³,/̥ʧNj!χeXJIˆ\ɇ.˶(ĩ.ʥǬŻ G€o˨ǦĠ¿ijA'@)ƴ>)+$!̢ė2-4̥˃ʊ.̤ó(ʛ ɀ̣ A>.ˠ¯IJʧNj.ɧnj̥L ʓȰ˂.ɐ 1,914-33 ³G€o˨/̥Ũǟ ɾȱâɞ,=?G€o˨ħȢ˄?,̥%ÚIJ.ʛ̏,̋Ù!̔Ğ ( @)ƜĹA!

N Nishi-ΔL/Nluc Dȝ! L ʓȰ˂ 1,914-33 ³.̔Ğ.ǟɾȱ˪ʢŻ. ǖʪ
L ʓȰ˂ǟɾ,@ 1,914-33 ³.̔Ğ.˪ʢŻDǖʪ@!:̥Ă̔Ğ, 'χeXJIˆ\ɇ.˶(¿ijA!ʥǬŻG€o˨DȣǬŻ.G†l Œ ̢A ̣ , ɳ ƞ  ! L ʓ Ȱ ˂ . Ȯ ȗ x † \ € j ̢ pCNiL-mt1914-17 ̥ pCNiL-mt1920-25 7!/ pCNiL-mt1929-33̣DǙɖ!̢ė 2-1̣ ÿx†\ €jDńÎ!ɣɽ,Nishi-ΔL/Nluc Dƛɇ̥9 Ʒ˶ů.ÿɣɽ,@ˆZ vK†_ǶŻDȁĹ!̢ė 2-5Ạ .ɧnj̥wtL Dºɩ!ɣɽ, @ ˆ Z v K †  _ Ƕ Ż ̢1.2  103 _{RLU/sec ̣ ) ̥ mtL1914-17 @  /} mtL1920-25 Dºɩ!ĢĀ.;.).˶,̥A;ƽƁŗ/ʲ:>A+$ !̢p0.05̣ Ư̥mtL1929-33 Dºɩ!ɣɽ>/ 2.9102 _{RLU/sec .} ˆZvK†_ǶŻű>ḀwtL Dºɩ!LJ«.ĂǶŻ=?;ƽƁ,´ $!̢p<0.05̣ 7!̥ƛɇů 48 Ʒ˶ȴ.ɣɽ(;Ăǚ.ɧnjű>A!̢ė 2-5Ḅ
ǡ,̥ħȢńÎL ʓȰ˂.Ȯȗˬ,ö6Ŭ̑Dǖʪ@!:̥ƂǏ 9 Ʒ ˶ů.ɣɽDJL\bŒwŠeiDZ,=?ʧNj!̢ė2-6̣ ÿ L ʓȰ˂.Ȯ ȗDɀqŒj.ZTkˆŨŤDĹˬ!ɧnj̥mtL1914-17̥mtL1920-25̥ @/mtL1929-33 .Ȯȗˬ)̥wtL .Ȯȗˬ.ŗ/̥A;ɪʩĴȱ, ƽƁ+;.(/+$!̢p0.05̣
ª‘=?̥1,929-33 ³,ħȢDƔ% mtL1929-33 .Ȯȗˬ/ wtL )Ăɑ( $!Ư̥mtL1929-33 DȮȗ! Nishi-ΔL/Nluc ƂǏɣɽ=?ű>A@ˆZ vK†_ǶŻƽƁ,´)ɀA!

€ €lVoˆÔŽʠʟɜ,=@ L ʓȰ˂ 1,914-33 ³̔Ğ.ǟɾȱ˪ʢŻ .ǖʪ
ǡ,̥ŰLj> L ʓȰ˂ǟɾ.ʧNj,ǶȝA'!€lVoˆÔŽʠʟ ɜ,=$'̥1,914-33 ³̔Ğ.ǟɾȱ˪ʢŻDǖʭ!̢ė 2-7̣ mtL1920-25 DȮȗ!ɣɽ(.ˆZvK†_ǶŻ)̥wtL DȮȗ!ĢĀ.ĂǶŻ ̢5.0103 _{RLU/sec̣.˶,ƽƁŗ/ʲ:>A+$!̢p0.05̣ Ư̥} mtL1914-17 =2 mtL1929-33 Ȯȗɣɽ,@ˆZvK†_ǶŻ/̥

A A2.7103 _{RLU/sec =2 1.510}3 _{RLU/sec ( ?̥A; wtL Ȯȗ}

ɷ

ɷŀ

ǃɎ(/̥ȒȐȨJIˆ\ L ʓȰ˂§.ÚIJ)ɧĀ@ýɾŻɷ>A @̥¿ijŻ.̞ʥǬŻ̔ĞDƚǐ@))! (̥L ʓȰ˂.ʛ̏ ,ŇĚ̥%ǟɾȱ,˪ʢ)ƜĹA@̔ĞDƚǐ@!:̥©ʛȱ+JI ˆ\ǒ.L ˠ¯IJ˥ÜDȝ'dN / dS Ǫ=2ȣǬŻ\WG.SW ʧNjDʗ$ ! +̥ǃʧNj,/̥ɜɪĴȱ,Ȣ+@ʩ15 ǒ.ȒȐȨJIˆ\. L ˠ¯IJ ˥ÜDȝ!̢ʛ 2-1̣ . 15 ǒ,=@ SW ʧNj.ɧnj/̛̥ɹȴȞLjǒ =2ɶƈȴȞLjǒ>+@ʩ 197 ǒ.ȒȐȨJIˆ\Dȝ'ű>A!ɧnj) 56Ăɑ( $!̢hbǁƝˉ̣ .)>̥‘ʫ. 15 ǒ.ʧNj,=$ ';̥ʆȉȟ,ijĚ@Ï'.ȒȐȨJIˆ\.L ˠ¯IJ @/ L ʓȰ˂. ȏŴDȻ@)ýɾ( @)ɷ!
SW ʧNj.ɧnj̥ȒȐȨJIˆ\ L ʓȰ˂.ɐ 1,870-90 ³̥+>2, 1,900-30 ³.̔Ğ/̥¿ijŻ.̞ʥǬŻ̔Ğ( @)ɀA!̢ė2-2̥ė 2-3Ạ A.̔Ğ;̥ƒonPJIˆ\ȴ,Ŋ@ÿɇJIˆ\˶(¿ijA' @ƱȻ.̔Ğ̢CR I ~ VỊ)/ƴ>,Ȣ+$'!)>(28)̢ė 2-2̣̥ ȒȐȨJIˆ\,ȏƽ.¿ij̔Ğ( @)ɷ>A! ǡ,̥‡eXJIˆ\ ÿɇ.L ˠ¯IJ˥Ü̢ʛ 2-2̣Dȝ'Ăǚ,ʧNj!)B̢ė 2-3Ḅ̥L ʓ Ȱ˂.ɐ1,870-90 ³.̔Ğ/ȒȐȨJIˆ\,ȏȢȱ+¿ij̔Ğ( @Ư(̥ 1,900-30 ³/̥ȒȐȨJIˆ\"(+̥ÿɇ‡eXJIˆ\.˶(;¿ij A!̔Ğ( @)ƴ>)+$! A.̔Ğ;ȒȐȨJIˆ\ L ʓ Ȱ˂.ǟɾ,˪ʢ)ɷ>A! ǃȽɊ(/̥ȒȐȨJIˆ\DĆ9ÿɇ‡e

XJIˆ\˶(¿ijA!1,900-30 ³̔Ğ.ǟɾȱ˪ʢŻDǖʭ@)) !
‘ʫ.SW ʧNj(/̥L ˠ¯IJ˥ܑ(˗ɫ@ 20 WjŒ>+@JHŒj JD\†Ij+>̥ÿJHŒjJ,@dN / dS Ǫ=2ȣǬŻ\WG .şĜDA AɓÙ@)(̥¿ijŻ.̞ʥǬŻ̔ĞDƚǐ'@ +>̥.ƯDZ(/̥¿ij̔Ğ.ǘ-.³ɳDƚǐ(@Ư(̥ 7(JHŒjJÒ.şĜ\WG.ʧNj( @!:̥¿ijŻ.̞G€o˨Ǧ Ġ.ȏĹ7(/ʗ+ (̥‡eXJIˆ\ L ʓȰ˂. 1,890-1,940 ³ G€o˨˥Ü.ĩ˪ǪˈʧNjDʗ$!ɧnj̢ė2-4̣̥1,914-33 ³,/̥ʧNj, ȝ!‡eXJIˆ\ɇ˶(¿ijA!ʥǬŻG€o˨ĩĆ7A'@ )ƴ>)+$! ª‘.)>̥1,914-33 ³.̔Ğ/̥ȒȐȨJIˆ\ L ʓȰ˂ʛ̏,ŇĚ@¿ij̔Ğ( @)ƜĹA!
L ʓȰ˂ǟɾ,@ 1,914-33 ³.̔Ğ.˪ʢŻDǖʪ@!:,̥ 1,914-17 ³̥1,920-25 ³7!/ 1,929-33 ³,ħȢDńÎ! L ʓȰ˂Ȯȗx †\€jDǙɖ!̢ė2-1̣ Nishi-ΔL/Nluc Dȝ!ǟɾʧNj.ɧnj̥1,929-33 ³,ħȢDƔ% mtL1929-33 DȮȗ@ƂǏɣɽ,@ˆZvK†_ǶŻ  wtL Ȯȗɣɽ.ĂǶŻ=?;ƽƁ,´’'!̢ė 2-5̣ .)>̥ mtL1929-33 .ʓȰ˂ǟɾŻ´’'@)ɀA! 1,914-17 ³G€ o˨˥Ü̢NYQḌ=2 1,920-25 ³G€o˨˥Ü̢RGFPEẸ.—,/̥§ .‡eXJIˆ\(/¿ijA'+G€o˨;Ć7A'@Ư(̥ 1,929-33 ³.G€o˨˥Ü̢NPYNẸ/̥ǃȽɊ(.ʧNj,ȝ!‡eXJ Iˆ\ɇ.˶(Ï'.G€o˨ķÏ,¿ijA'!̔Ğ( $!̢ė2-4̣

.=,̥NPYNE ˥Ü.¿ijŻȏ,̞$!)/̥Ă̔Ğ.ʓȰ ˂ǟɾ,˪ʢ( @)DŨɀĐ'! 7!̥€lVoˆÔŽʠʟɜ Dȝ!ʧNj,'̥mtL1929-33 Ȯȗɣɽ,@ˆZvK†_ǶŻ wtL Ȯȗɣɽ.ĢĀ=?;ƽƁ,´’'!)>̢ė 2-7̣̥mtL1929-33 .´ǟɾŻĂǚ,ʲ:>A! A>.ɧnj>̥1,929-33 ³. NPYNE ˥Ü/̥L ʓȰ˂ǟɾ,˪ʢ( @)ƴ>,A!
ǃȽɊ(/̥ÿɇħȢĝ L ʓȰ˂.ǟɾʧNj,'̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ !ĺ̝ɜ̢ė2-5̣̥+>2,€lVoˆÔŽʠʟɜ.Ÿ%.ĺ̝ɜ̢ė 2-7̣ DǶȝ! mtL1920-25 =2 mtL1929-33 .ǟɾŻDɀɧnj/̥–ĺ̝ ɜ.˶(Ăǚ( $!;..̥mtL1914-17 ,˷'/̥–ĺ̝ɜ.˶(ŗȢ ț'! +C#̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ!ĢĀ(/̥mtL1914-17 .ǟɾ Ż/wtL .;.)Ăɑ)ɀA!.,Ł̥€lVoˆÔŽʠʟɜDȝ! ĢḀ̄mtL1914-17 .ǟɾŻ/ wtL =?;´’'@)ɀA! .= +Ⱥȷț!ʢĖ/ƴ>(/+;..̥Ï'.JIˆ\ĖIJ.ºɩ,£ ŕȱ+Ȯȗɜȝ>A@€lVoˆÔŽʠʟɜ)Ȣ+?̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ!ĺ̝ɜ(/̥L ʓȰ˂Ȯȗx†\€j.ńÎ.8,=$'Vo RNA .éȖȱ+ĀƆDÓȗ(@ .žĺ>̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ'ű>A! ɧnj/̥˔ŝ.JIˆ\ƂǏɣɽ,=?ˎ̥ʆȉ+LJ«,@ L ʓȰ˂ǟ ɾ÷ƶA'@)ɷ>A@ ¤ů̥1,914-17 ³.̔Ğ L ʓȰ˂.ǟɾ Ż,˷”@Dǖʪ@)(̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ!ĺ̝ɜ.ƽȝŻDƴ >,(@)ɷ>A@
ȒȐȨJIˆ\L ˠ¯IJ.ǪˈʧNj,=?ȏĹ! 2 %.¿ij̔Ğ.#̥

ǃȽɊ(/̥ÿɇ‡eXJIˆ\.˶(;¿ijA'!1,900-30 ³.̔Ğ, ȸȴ!̢ė 2-2̣ ʉȱ,̥‡eXJIˆ\ƂǏȩ/̥ȒȐȨ)Ǘ:'̚² !ȩȑDɀ̥.ǰȬDZ;ȾɍA'+ !$'̥ȒȐȨJIˆ \Dƒhˆ)'̥Ă̔Ğ˷”@ÚIJǟɾDʰɣ,ʧNj@),=?̥ ȒȐȨ"(+̥‡eXJIˆ\ƂǏȩ,;ƽé+ǰȬDZDȾɍ@‘(˪ ʢ+Ġȳžġű>A@)ɷ>A!
ª‘̥ɐ2 Ɏ(/̥L ˠ¯IJʧNj,=?̥L ʓȰ˂ǟɾ,˪ʢ)ƜĹA@¿ ij̔ĞDĂĹ! >,̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ!ǟɾʧNj,=?̥L ʓȰ˂ 1,929-33 ³. NPYNE ˥Ü/̥.ʓȰ˂ǟɾ,˪ʢ( @)Dƴ>, !

GenBank 登録番号 株名 宿主 分離された 国名 分離された 年 EU643590 HN10 Homo sapiens 中華人民共和国 2006 KC595280 Rus(Lipetsk)8052f_2011 Vulpes vulpes ロシア連邦 2011 EU311738 RRV ON-99-2 Procyon lotor カナダ 1999 KM594036 IP 542/10 Nyctinomops laticaudatus ブラジル連邦共和国 2010 KM594024 IP 1770/12 Callithrix jacchus ブラジル連邦共和国 2012 KT336437 34312 Canis lupus familiaris 南アフリカ共和国 2012 AB519642 BR-DR1 Desmodus rotundus ブラジル連邦共和国 2000 KF155000 RV2516 Bos taurus イラク共和国 2010 JQ685952 A02-2971 Parastrellus hesperus アメリカ合衆国 2002 JQ685947 TN310 Lasiurus cinereus アメリカ合衆国 2004 JQ685942 AZBAT-65094 Eptesicus fuscus アメリカ合衆国 1981 JQ685929 MEXSK3644 Spilogale putorius メキシコ合衆国 2009 JQ685916 FL1010 Lasiurus intermedius アメリカ合衆国 2002

AB128149 Ni-CE （実験室株） 日本 -

AB645847 1088 Marmota monax アメリカ合衆国 不明 表

GenBank 登録番号 ウイルス種名（略号） 遺伝子型 分離された 国名 分離された 年 AB128149 狂犬病ウイルス Ni-CE株 (RABV) 1 日本 (実験室株) EU293108 Lagos bat virus (LBV) 2 セネガル共和国 1985 NC_006429 Mokola virus (MOKV) 3 不明 不明

EU293119 Duvenhage virus (DUVV) 4 南アフリカ共和国 1971 NC_009527 European bat lyssavirus 1 (EBLV1) 5 ドイツ連邦共和国 1968 NC_009528 European bat lyssavirus 2 (EBLV2) 6 イギリス 2002 NC_003243 Australian bat lyssavirus (ABLV) 7 オーストラリア連邦 1996 EF614259 Aravan virus (ARAV) 未分類 キルギス共和国 1991 EF614261 Khujand virus (KHUV) 未分類 タジキスタン共和国 2001 EF614260 Irkut virus (IRKV) 未分類 ロシア連邦 2002 EF614258 West Caucasian bat virus (WCBV) 未分類 ロシア連邦 2002 GU170201 Shimoni bat virus (SHIBV) 未分類 ケニア共和国 2009 表

図 図2-1. 1,914-33位に変異導入された各種L蛋白質の一次構造の模式図 wtLの1,914-33位アミノ酸領域のうち、解析に用いられた全リッサウイ ルス種間で保存されていたアミノ酸残基（図2-3を参照）を青字で示し た。アミノ酸の下部に印した括弧内には、そのアミノ酸をコードする塩 基配列を示した。 3x FLAG 1,914 - 33 N- 2,127 1 -C wt L N Y Q D L V R G F P E E I I S N P Y N E 発現プラスミド pCNiL-3xFLAG mt L1914-17 A - - A - - - pCNiL-mt1914-17 mt L1920-25 - - - - A - - - - A - - - pCNiL-mt1920-25 mt L1929-33 - - - A - - A A pCNiL-mt1929-33

(AAC) (GAT) (AGG) (GAG) (AAT) (AAT)(GAG)

(GCA) (GCT)

(GCA) (GCT)

10 110 210 310 410 510 610 710 810 910 1010 1110 1210 1310 1410 1510 1610 1710 1810 1910 2010 2110 2.0 1.0 0 -1.0 -2.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 (aa) I II III IV V VI dN /d S 比 疎 水 性 ス コ ア 図2-2. 狂犬病ウイルスL蛋白質コード領域全長にわたる d_N / d_S 比および疎水性スコアのSW解析 計15株の狂犬病ウイルスのL遺伝子アミノ酸コード領域全長の塩基配列を用いて、d_N / d_S 比、ならびにKyte & Doolittleによる疎水性指標（56）に基づく疎水性スコアのSW 解析を行った。黄色の枠は、CR I VIの領域を示す。青色の枠は、d_N/d_S 値の低い親水 性領域を示す。赤色の点線は、L遺伝子全域の平均d_N/d_S 値を示す。青色の点線は、疎 水性領域（疎水性スコア > 0）、親水性領域（疎水性スコア < 0）のカットオフ値を示 す。エラーバーは各平均値の標準偏差を示す。

((A) 疎 水 性 ス コ ア dN /d S 比 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1.5 1.0 0.5 -0.5 -1.0 -1.5 0 1850 1870 1890 1910 1930 1950 疎 水 性 ス コ ア dN /d S 比 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1.5 1.0 0.5 -0.5 -1.0 -1.5 0 (aa) (B) 1850 1870 1890 1910 1930 1950 (aa) 図2-3. L蛋白質の部分的アミノ酸コード領域におけるd_N / d_S 比および疎水性スコアのSW解析 （A）計15株の狂犬病ウイルス、または（B）計12種のリッサウイルスのL遺伝子アミ ノ酸コード領域の部分的塩基配列を用いて、d_N /d_S 比、ならびにKyte & Doolittleによ る疎水性指標（56）に基づく疎水性スコアのSW解析を行った。青色の枠は、d_N/d_S 値 の低い親水性領域を示す。赤色の点線は、L遺伝子全域の平均d_N/d_S 値を示す。青色の 点線は、疎水性領域（疎水性スコア > 0）、親水性領域（疎水性スコア < 0）のカット オフ値を示す。エラーバーは各平均値の標準偏差を示す。

1890 1900 1910 1920 1930 1940 RABV L R E M S L V L F N C S S P K S E M Q R A R S L N Y Q D L V R G F P E E I I S N P Y N E M I I T L I D DUVV ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ S ・ ・ ・ ・ L ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ EBLV1 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ S ・ ・ ・ ・ L ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ IRKV ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ S ・ ・ ・ ・ L ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ EBLV2 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ KHUV ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ARAV ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ABLV ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ ・ ・ ・ T ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ V ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ MOKV V ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ N ・ ・ ・ ・ ・ L ・ ・ ・ T ・ ・ ・ ・ ・ ・ I ・ ・ ・ ・ P ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ LBV I ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ N T ・ ・ ・ ・ L ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ SHIBV I ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ N ・ ・ ・ ・ ・ L ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ I ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ WCBV V H ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ R T ・ ・ ・ ・ ・ L ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ S ・ ・ I ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 1 1914 1933 図2-4. 12種のリッサウイルスL蛋白質の1,890-1,940位アミノ酸配列を用いた多重比較解析 12種のリッサウイルスのL蛋白質アミノ酸配列を用いて、多重比較解析を行った。各種 リッサウイルスL蛋白質アミノ酸配列のうち、狂犬病ウイルスL蛋白質のものと同一のア ミノ酸残基をそれぞれドットで表記した。青色の枠は、Kyte & Doolittleらの疎水性指標 に基づく疎水性スコアが-3.2 -4.5の親水性アミノ酸を示す。赤色の＊印は、1,914-33 位の内で、全12種のリッサウイルスの間で保存されていたアミノ酸残基を示す。

RABV：Rabies virus（狂犬病ウイルス）、DUVV：Duvenhage virus、EBLV1： European bat lyssavirus 1、IRKV：Irkut virus、EBLV2：European bat lyssavirus 2、KHUV：Khujand virus、ARAV：Aravan virus、ABLV：Australian bat lyssavirus、MOKV：Mokola virus、LBV：Lagos bat virus、SHIBV：Shimoni bat virus、WCBV：West Caucasian bat virus

0 2 4 6 8 10 12 14 16 N a n o L u c ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 (x10 2 RLU/sec) (A) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 N a n o L u c ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 (x10 4 RLU/sec) (B) 空 ベ ク タ ー m t L 1 9 1 4 -1 7 m t L 1 9 2 0 -2 5 m t L 1 9 2 9 -3 3 w t L w t L m t L 1 9 1 4 -1 7 m t L 1 9 2 0 -2 5 m t L 1 9 2 9 -3 3 空 ベ ク タ ー

*

*

ns ns

**

**

ns ns 空ベクター、pCNiL-3xFLAG、pCNiL-mt1914-17、pCNiL-mt1920-25 およびpCNiL-mt1929-33を導入したNA細胞にNishi-ΔL/Nlucを MOI=0.01の条件で接種した。（A）接種後9時間目、または（B）48時間 目の細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。エラーバーは標準誤 差を示す（n=3）。ns ： p 㱢 0.05、＊：p < 0.05、＊＊：p < 0.01 図2-5. Nishi-ΔL/Nlucを用いた各種変異型L蛋白質の機能性の検討

相相 対 発 現 量 （L / αチューブリン） ­ L 245 ­ 190 ­ 空 ベ ク タ ー w t L m t L 1 9 1 4 -1 7 m t L 1 9 2 0 -2 5 m t L 1 9 2 9 -3 3 ­ αチューブリン (kDa) 58 ­ 46 ­ 0 0.5 1 1.5 2 2.5 

 

 
ns ns ns 2 5 1 3 4 レーンNo. 図2-6. Nishi-ΔL/Nluc感染細胞における各種変異型L蛋白質の蛋白質発現量の検討 図2-5において、ルシフェラーゼ活性の測定用に回収された感染9時間後の細胞溶解液 から、抗FLAG抗体および抗αチューブリン抗体を用いたウエスタンブロットにより、 各種L蛋白質およびαチューブリンを検出した。各バンドのシグナル強度より、L蛋白 質の発現量を測定した結果をグラフに示した。なお、左右のブロット像は、同一のゲル での電気泳動の結果から得られたものである。エラーバーは標準誤差を示す。（n=3） ns ： p 㱢 0.05

図 図2-7. ミニゲノム転写・複製系を用いた各種変異型L蛋白質の機能性の検討 







 
 


1 2 3 4 5 6 0 空 ベ ク タ ー w t L m tL 1 9 1 4 -1 7 m tL 1 9 2 0 -2 5 m tL 1 9 2 9 -3 3 ns

*

*

ホ タ ル ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 (x10 3 RLU/sec) 空ベクター、pCNiL-3xFLAG、pCNiL-mt1914-17、pCNiL-mt1920-25ま たはpCNiL-mt1929-33を、ルシフェラーゼ発現ミニゲノムプラスミド、N蛋 白質発現プラスミドおよびP蛋白質発現プラスミドと共にNA細胞へ導入した。 導入2日後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。エラーバーは標 準誤差を示す（n=3）。ns ： p 㱢 0.05、＊：p < 0.05

ɐ

ɐ

3Ɏ

LʓȰ˂1,929-33³.G€o˨˥Ü̢NPYNẸ

˷”@ÚIJǟɾ.ǖʪ

ţ

ţʷ

ɐ2 Ɏ(/̥ȒȐȨJIˆ\=2ÿɇ‡eXJIˆ\ L ˠ¯IJ.ǪˈʧNj̥ +>2,Nishi-ΔL/Nluc DǶȝ! L ʓȰ˂.ǟɾʧNj,=$'̥ȒȐȨJI ˆ\L ʓȰ˂ 1929-33 ³. NPYNE ˥Ü.ʓȰ˂ǟɾ,˪ʢ( @)D ƴ>,!̢ė2-5̥ė 2-6̣ +>̥Ă˥Ü*.=+ÚIJǟɾ, ˷”'@/“ƴ.77( @ (̥ǃɎ(/̥Ă˥Ü,ħȢDƔ% mtL1929-33 .ǟɾȢŝ*.=+ÚIJǟţ(Ȯț@.Dǖʭ@) )!
mtL1929-33 .ǟɾŻ wtL =?;´’'@žĺ>̥NPYNE ˥Ü3 .ħȢńÎ.ɧnj̥.˧ɠǶŻ<§ÚIJ).ɧĀɾ.´’7!/ǠĬ+*̥ ¶>.ǟţ,=$'L ʓȰ˂ǟɾ˻ļA'@)ɷ>A!̢ė 2-5̥ė 2-6 ̣ ń Î ħ Ȣ , = ? ñ ɟ + ˧ ɠ Ƕ Ż . ´ ’  ƀ ˄  A '  ! Ģ Ā ̥ mtL1929-33 .Ȯȗˬ.ĥç,=?ĂʓȰ˂.ǟɾŻʞķA@)ſA @ !$'̥.=+ǟɾŻʞķ.ƽȈDǖʪ@)(̥mtL1929-33 ,ǟɾȢŝDŧ˄ÚIJǟţDʧƴ@ƈƙ?ű>A@)ɷ!

RNA ~‡‚†_( @ L ʓȰ˂/̥JIˆ\ mRNA ˆÔǶŻ=2Vo

RNA ʠʟǶŻDƔ$'@ A>.ǶŻ/̥JIˆ\ĥǧș.ÿǨ̄,

'Ŗİ,ʶɕA'@)ɷ>A'@(12) !$'̥NPYNE ˥Ü3 .ńÎħȢ̥¶>.ǟţ,=?A.ǶŻ̥;/–ɸ,Ŭ̑Dö 6ýɾŻɷ>A@

ˆ\ P ʓȰ˂).ȶ ·ȝ˪ʢ( @ ªã.ȽɊ,=?̥P ʓȰ˂).ɧ Ā̔Ğ/̥L ʓȰ˂. C ǂɏ̥1,562-2,127 ³.̔Ğ,ijĚ@)ġĈA '@(59) NPYNE ˥Ü̢1,929-33 ³̣/.̔ĞÒ,Ć7A'@) >̥Ă˥Ü P ʓȰ˂).ɧĀ,˷”'@ýɾŻ;ɷ>A@ .ýɾ ŻDǖʪ@!:,/̥mtL1929-33 ) P ʓȰ˂.ɧĀŻDĺ̝ȱ,ǖʭ@ Ŷʢ @
(ɐ 3 Ɏ(/̥mtL1929-33 .Ȯȗˬ.ĥç,=?̥.´’!ǟɾ ŻʞķA@D̥Nishi-ΔL/Nluc Dȝ'ǖʭ! ǡ,̥mtL1929-33 D ºɩ! Nishi-ΔL/Nluc ƂǏɣɽDȝ!‡GˆbI RT-PCR Dʗ̥

mRNA ˬ=2Vo RNA ˬDA AȁĹ! >,̥mtL1929-33 ) P

ʓȰ˂.ɧĀŻDÐÌȥǮ˼DZ,=?ǖʭ! A> 3 %.ǖʭ,=?̥

1,929-33 ³. NPYNE ˥Ü̥*.=+ǟţ( L ʓȰ˂ǟɾ,˷”@D ǖʪ@))!

Dž

Džƭ=2ƯDZ

ğ̜ɣɽ=2JIˆ\
NA ɣɽ̥+>2, TetOff-NiL-NA ɣɽDɐ 1 Ɏ,ʫˉ!ƯDZ,=$'ğ ̜! siɼÍʁɣɽȞLjHEK293T ɣɽ(60, 61)̢ęɍȽɊ˵ȮDZ£ Șì ĴȽɊƇ
˶ ̃IJòĦ=?ڔ̣D CO2IŒQ…zb̢s†X‹̣Ò(ğ ̜!̢37̥5%CO2̥95%ɋǫ̣ HEK293T ɣɽȝ GM )'̥10%FCS ǽçcˆzeWƦħITˆğě̢D-MEṂ̢ʟčȡþ̧11995-065̥Gibcọ Dȝ! Nishi-ΔL/Nluc ,%'/̥ɐ 1 Ɏ,ʫː!;.D¸ȝ! x†\€j
wtL .Ȯȗx†\€j)'̥ɐ 1 Ɏ,ʫː! pCNiL-3xFLAG D¸ȝ ! 1,929-33 ³,ħȢńÎA! L ʓȰ˂( @ mtL1929-33 .Ȯȗx†\€ j)'̥ɐ2 Ɏ,'·ʟ! pCNiL-mt1929-33 D¸ȝ! 7!̥P ʓ Ȱ˂Ȯȗx†\€j)'̥ɐ1 Ɏ)Ăǚ, pCAGGS-NiP Dȝ! Nishi-ΔL/Nluc ƂǏ NA ɣɽ=?ű>A@ˆZvK†_ǶŻ.ȁĹ
ɥɱğ̜x‰i̢24 JKˆ̥ʟčȡþ̧662160̥Greiner Bio-Onẹ,ğ

̜!NA ɣɽ̢ğ̜LJ«̧37̥5%CO2̥95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !? 0.5

µg 7!/ 1.0 µg . pCAGGS/MCS̥pCNiL-3xFLAG =2 pCNiL-mt1929-33

DA AńÎ! .)̥x†\€jńÎʯʐ)'TransIT-2020̢ʟ

= 0.01 )+@=ƛɇ̥9 Ʒ˶ů,ğ̜‘ǾD˿õ! cˆzeW PBṢ̢

̢ʟčȡþ̧05913̥ƲǬ̣Dȝ'ǵǸ!ů̥100 µl . Passive Lysis Buffer

̢ʟčȡþ̧E1941̥PromegạDȝ'Ȅʧ̥80(Öɧ! ʕʧ! ɣɽȄʧǺDơƑ̥12,000g̥4̥2 Ú˶.LJ«(˝ŵů̥NanoGlo Luciferase Assay System ̢ ʟ č ȡ þ ̧ N1110 ̥ Promega ̣  = 2 1254 Luminometer̢BioOrbiṭDȝ'̥10 µl .‘Ǿ—.ˆZvK†_ǶŻDȁ Ĺ! +̥‘ʫJIˆ\ƂǏ,%'/̥1 LJ« !? 3 %.JKˆDȝ 'ʗ̥A A.ˆZvK†_ǶŻÄ.şĜÄ=2ǛȃʵŗDɓÙ! ɪʩØȘ,/̥ÚƩÚNj=2Dunnett .ĩ˪ǖĹDȝ! S SDS-PAGE =2JL\bŒwŠei
‘ʫ.ˆZvK†_ǶŻ.ȁĹ,ȝ>A!̥Nishi-ΔL/Nluc ƂǏ 9 Ʒ˶ů

.ÿɣɽȄʧǺ̢50 µḷ,Ł̥50 µl . Sample Buffer Solution (2ME+)( 2)̢ʟčȡþ̧196-11022̥ċËɟʐ̣Dǽç̥ơƑ! ÿȄʧǺ—.ʓȰ

˂D 37̥30 Ú˶.ØȘ(ȌħŻ!ů̥ɐ 1 Ɏ,ʫˉ!ƯDZ,Ű̥

SDS-PAGE =2JL\bŒwŠeiDZDʗ$! +̥ƍµŚ˩Ǻ)' Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution̢ʟčȡþ̧NKB-101̥

ljǴɡ̣D̥ìĴȮËȝʯʐ)' Immunostar LD̢ʟčȡþ̧296-69901̥

ċËɟʐ̣D¸ȝ!

ƂǏɣɽ>. RNA ƏÙ+>2, cDNA ĀƆ

95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !? 0.5 µg . pCAGGS/MCS̥pCNiL-3xFLAG =

2pCNiL-mt1929-33 DA AńÎ! .)̥x†\€jńÎʯʐ)

'TransIT-2020 D¸ȝ! ńÎ 2 Ʋů̥Nishi-ΔL/Nluc ǒD MOI = 0.01 )

+@=ƛɇ̥9 7!/ 48 Ʒ˶ů,ğ̜‘ǾD˿õ! cˆzeW PBṢ̢

Dȝ'ǵǸ!ů̥RNeasy mini kit̢ʟčȡþ̧74134̥QIAGEṆDȝ

'ƂǏɣɽ>RNA DƏÙ! ƏÙ! RNA D˯ĝ)'̥Super Script IV

ˑˆÔ˧ɠ̢ʟčȡþ̧18090010̥Invitrogeṇ));,̥Random Primer

̢hexadeoxyribonucleotide mixturępd(N)6̢̣ʟčȡþ̧3801̥TaKaRạ̥

oligo (dT)20 Primer̢ʟčȡþ̧18418-020̥Invitrogeṇ̥ @/JIˆ\V

oRNA ,ȶʞȱ+x†I̢x†Iă̧RT primer for genomẹ̢ʛ

3-1̣Dȝ' cDNA DĀƆ! +̥RT ÷ŸLJ«/̥Random Primer D

ȝ!ĢĀ(/̥23/10 Ú˶̥68/15 Ú˶̥80/10 Ú˶)̥oligo(dT)20

Primer =2Vo RNA ȝx†IDȝ!ĢĀ(/̥68/15 Ú˶̥80 /10 Ú˶)! ĀƆ! cDNA /̥ůː.‡GˆbI PCR (¸ȝ@7( 20(¿ij!

‡

‡GˆbI PCR

RT primer for genome̥oligo(dT)20 Primer 7!/ Random Primer =?ű>

A!ÿcDNA —.Vo RNḀJIˆ\ mRNA 7!/ 18s ‡}` rRNA

.ȮȗˬD̥SYBR Green DZ,Ġ&!‡GˆbI PCR ,=?ȁĹ! 

+C#̥10 µl . Power SYBR Green PCR Master Mix (2)̢ʟčȡþ̧4367659̥

VoRNḀJIˆ\ N ˠ¯IJ mRNA̢N mRNẠ7!/ 18s rRNA .ǖÙ

ȝ,ʬʩA!ÿɇx†I̢ʛ3-1̣D 6 pmol %ç̥ȅʍ˅ɟǬDç

'Ƽɤˬ20 µl ,+@=,ʶƫ! .ʶƫǺD̥StepOnePlus ‡G

ˆbIPCR Z\g̢Applied BiosystemṣDȝ'ª’.LJ«(÷Ÿ

! 95/10 Ú˶.Ȍ÷Ÿ.ů̥95/15 Ʉ˶.ȌħŻ=2 60/1 Ú˶.G

l‡ŒTŽ±˴÷ŸD 40 XISˆɲ?ˏ! ÿXŒxˆ,@Vo

RNA 7!/ N mRNA ȮȗˬD 18s rRNA .Ȯȗˬ(å@),=?̥XŒx

ˆ˶.ɣɽƪ=2RNA ƏÙéȖ.ŗȢ,=@Ŭ̑DʞǢ! +̥‘ʫ. ‡GˆbI PCR ,%'/̥1 LJ« !? 3 JKˆ.ɣɽDȝ'ĺư̥ 18s rRNA ,=?ʞǢ!ÿ.ˠ¯IJȮȗˬ.şĜÄ=2ǛȃʵŗDɓÙ ! ɪʩØȘ,/̥ÚƩÚNj=2Dunnett .ĩ˪ǖĹDȝ! Ð ÐÌȥǮ˼DZ

ɥɱğ̜x‰i̢6 JKˆ̥ʟčȡþ̧657160̥Greiner Bio-Onẹ,ğ̜

!HEK293T ɣɽ̢ğ̜LJ«̧37̥5%CO2̥95%ɋǫ̣,̥1 JKˆ !

? 2.5 µg . pCAGGS-NiP ));,̥7.5 µg . pCNiL-3xFLAG 7!/

pCNiL-mt1929-33 DÐńÎ! .)̥x†\€jńÎʯʐ)' TransIT-X2̢ʟčȡþ̧MIR6000̥MiruṣD¸ȝ! ńÎ 48 Ʒ˶ů.ɣ ɽDȄʧɯʚǺ̢50 mM Tris-HCl[pH 8.0]̥150 mM NaCl̥1% NP-40̥Ć Complete mini-protease inhibiter [ʟčȡþ̧04693124001̥Roche]̣,Ȅʧ ̥15,000g̥10 Ú˶̥4.LJ«(˝ŵÚ̉! ˝ŵ‘Ǿ,̥ >:

ǢŝJ\IgG̢ʟčȡþ̧SC-2025̥Santa CruẓDƂ·! Protein A/G Plus-Agarose t]̢ʟčȡþ̧SC-2003̥Santa CruẓDç̥4(Ƹ

÷Ÿ! ÷Ÿů.Ǯ˼ȎDȄʧɯʚǺ(5 ĕǵǸ̥50 µl .ȄʧɯʚǺ

=250 µl . Sample Buffer Solution (2ME+)(2)Dç̥37̥30 Ú˶.LJ

«(ȌØȘ! Ǯ˼Ȏ,Ć7A@JIˆ\L ʓȰ˂=2 P ʓȰ˂D‘ʫ. SDS-PAGE =2JL\bŒwŠeiDZ,=?ǖÙ! 7!̥t])÷Ÿ @ã.˝ŵ‘Ǿ—,Ć7A@ L ʓȰ˂̥P ʓȰ˂̥+>2,d…w‡ ŒDJL\bŒwŠeiDZ,=?ǖÙ̥ADIŒxei)! +̥P ʓȰ˂,Ł@ƍµ)'̥ȒȐȨJIˆ\RC-HL ǒ(47).ɥƞ P ʓȰ˂, Ł@JXRƍʖǾD·Ù! +C#̥ĪʃʍȮȗɜDȝ'̥P ʓȰ˂ 83-297 ³.G€o˨˥Ü)̥. N ǂɏÅ, His bTD¨ç!ʓȰ˂D·Ù ! His GraviTrap Qei̢ʟčȡþ̧72AS0084GE̥yˆ\UG̣Dȝ '‘ʫ.ʓȰ˂Dɛʟ!ů̥îĴțȎĴȽɊƇ̢ọ̌,=@~‡SŠkˆ

ƍµ·ʟW\̢LWo€^ei C̣,»̖̥JXRƍʖǾD·ʟ!

ĂƍʖǾ.P ʓȰ˂,Ł@ȏȢŻ,%'/̥ʡôǒ. P ʓȰ˂Ȯȗx†

\€jDńÎ!ɣɽDȝ!JL\bŒwŠei,=?ȾʲDʗ$!̢h

ɧ

ɧnj

ʓȰ˂Ȯȗˬ.ĥç,=@ mtL1929-33 .ǟɾŻʞķ.ƽȈ.ǖʪ
Nishi-ΔL/Nluc ƂǏɣɽÒ,@ mtL1929-33 .Ȯȗˬ.ĥç,=?̥´ ’!ǟɾŻʞCA@Dǖʭ@!:̥0.5 µg 7!/ 1.0 µg . mtL1929-33 Ȯȗx†\€jD NA ɣɽ,ńÎ!ů, Nishi-ΔL/Nluc Dƛɇ! ƛɇ 9 Ʒ˶ů.ɣɽ,@ L ʓȰ˂ȮȗˬDJL\bŒwŠeiDZ,=?ȁĹ! ɧnj̥x†\€jńÎˬ.ĥç,°̥wtL =2 mtL1929-33 .Ȯȗˬ/̥ A;ƽƁ,ĥç'!̢p<0.01̢̣ė 3-1̣ Ư̥Ăɣɽ,@ˆZv K†_ǶŻDȁĹ!ɧnj̥mtL1929-33 .Ȯȗˬĥç!,;C>̥ ˆZvK†_ǶŻ.ƽƁ+‘Ƴ/ʲ:>A+$!̢p0.05̢̣ė 3-2̣  .ɧnj>̥mtL1929-33 .ǟɾŻ´’/̥.Ȯȗˬ.ĥç,=$'/ʞķ A+)ɀA!

JIˆ\ mRNA ˆÔŽVo RNA ʠʟ,@ L ʓȰ˂ 1,929-33 ³

.̔Ğ.˪ʢŻ.ǖʪ

L ʓȰ˂G€o˨ɐ 1,929-33 ³3.ħȢńÎJIˆ\ mRNA ˆÔŽVo

RNA ʠʟéȖ,ö6Ŭ̑Dǖʪ@!:̥‡GˆbI RT-PCR ,=?̥

mtL1929-33 Dºɩ! Nishi-ΔL/Nluc ƂǏɣɽÒ,@ N mRNA =2V

oRNA .ĹˬDʗ$! ƂǏ 9 Ʒ˶ů.ɣɽDȝ!ǖʭ.ɧnj̢ė 3-3̣̥

mtL1929-33 Ȯȗɣɽ,@ N mRNA ˬ/̥wtL Ȯȗɣɽ.;.=?;ƽƁ ,´’'!̢p<0.01̣ 7!̥mtL1929-33 Ȯȗɣɽ,@Vo RNA