日本ウズラに発見された糖原病II型（成人型）に関する研究　：　組織学的，生化学的，　酵素学的研究および臨床神経学的検討

(1)

( 東女医大誌第54巻第10

号

)

頁 1002-1013昭和59年10月J

日本ウズラに発見された糖原病

I

型(成人型〉に関する研究

一組織学的，生化学的，酵素学的研究および臨床神経学的検討-東京女子医科大学脳神経センター神経内科学教室(主任:丸山勝一教授〉

村上

博彦

( 受付昭和59年8月2日〉

Studies on Type 11 Glycogen Storage Disease (Adult type) Discovered in Japanese Quails -Morphological

，

biochemical and enzymological

studies and neurological evaluationsー Hirohiko MURAKAMI

，

M.D. Department of Neurology(Director: Prof.Shoichi MARUYAMA)， Neurological Institute， Tokyo Women's a Mdical College Several ]apanese quails presented dysfuction of wings in about six months after hatching Musc1e fibers contained many vacuoles filled with PAS-positive materials. Contents of vacuoles disappeared after digestion with diastase， suggesting the pres巴nseof glycogen. The variation in fiber size was also demonstrated.

Electronmicroscopy disc10sed many glycogen partic1es between myofibrils. There were many in -c1usions such as myelin figures， aggregates of glycogen partic1es and autophagic vaculoes.

Glycogen content in all tissues examined was markedly increased

，

amounting to about twenty times more than that of normal in femoral and heart musc1es and to two hundred times more than that of nomal is liver. The lactate production in vitro by the anerobic glycolsis was normal as well as the activity of glycolytic enzymes of the a妊ectedmusc1e.

Acid maltase was mesured with maltose or 4-MUG as substrates. The activity was reduced to1/ 3-1/20 of control values in skeletal musc1es， heart and liver of the a妊ectedquail.However， there was no

change in the activity of neutral maltase and other lysosomal enzymes of these tissues.

Isozymes of maltase was analyzed by an electrophoresis on the cellulose acetate membrane. Three isozymes of maltase w巴redemonstrated. Two of them were acid maltase and one was neutral.The ac

-tivity of neutral isozyme was presented in the a丘ectedquails. However， the acid isozymes of maltase was much reduced on enzymogram.

These studies indicated that disable quails suffered from the adult type of glycogen storage disease type 2.

This mutant quail might be a useful disease model for human glycogenosis type 2.

序論対象および方法成績目次 1.組織学的，組織化学的所見 2. 電子顕微鏡的所見 3.組織グリコーゲン含量 -1002ー 4.嫌気性解糖 5.ライソゾーム酵素活性 6. maltase(α-1，4-g1ucosidase)活性 7. maltaseのpH依存性 8.電気泳動による acid maltaseおよびneutral maltaseのisozyme分析 9.血清maltase活性

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考察 1.組織学的検討 2. 生化学的検討 3.臨床神経学的考察 a)ヒト糖原病II型とウズラについて b) maltase活性測定法の検討 c) maltaseの酵素学的検討 d)動物モデルとしての臨床上の有用性について総括および結論文献序論翼の機能障害を主徴とする日本ウズラ(Japa -nese Quail， Coturnix coturnix japonica)の突然変異種が日本生物科学研究所・小淵沢養鶏所で発見された.筋ジストロフィ一類似の症状を呈することから，動物モデ、ルとしての有用性を検討する目的で，このウズラの骨格筋，心筋，肝臓などを組織学的および生化学的に検索した.筋組織に著明なグリコーゲンの蓄積およびmaltase (α-1，4 -glucosidase)の欠損を認め，糖原病II型の自然発症モデルで、あることを確認した. ヒトの糖原病II型は，乳児期に発症する致命的な疾患であるが，最近，小児・成人に発症する症状の軽微な“遅発型"と呼ばれる症例が報告さわし，この臨床病型の差異に関して種々の検討が行なわれている. 本研究では，この糖原病II型ウズラを用い， maltaseの活性測定における基質の相違による特性，感度などの問題点を検討した.また，電気泳動法によるウズラのmaltaseのisozyme分析を行ない，ヒトのmaltaseisozyme分析の結果と比較検討した.更にisozyme分析を中心に，本モデル動物の臨床神経学における意義を考察した. 対象および方法日本生物科学研究所(日生研〉より，発症したウズラと正常ウズラの提供を受けた.発症ウズラは，階、化後6カ月頃から翼の挙上が出来ないことで識別される.脚の機能，体重などは変化なく，正常ウズラとの交配が可能で、あり，受精能力は保たれている.初期には，オスのみに6羽の発症が確認され，日生研でRocked-Wing系(RW系〉と仮称され，継代飼育の努力が払われ，現在までに数十羽の発症が確認されている. 今回の検索には，発見のキヅカケになった6羽のうち 1羽，“NO.9280ウズラ"とその後に作製された発症ウズラ 9羽および正常ウズラ12羽を用いた. 断頭濡血したウズラより，浅胸筋，前広背筋，後広背筋，前腔骨筋を採取し，直ちに， -160o Cイソベンタン液で凍結し，組織化学的検索用とした. 一部小片は電子顕微鏡用にグ、ルタールアルデヒド固定をし，カコジレート緩衝液洗機後

O

S

0

4

で後固定した.組織化学的検索として， hematoxylin and eosin (HE)， modified Gomori trichrome， NADH-TR

，

menadionlinkedα-glycerophos-phate dehydrogenase (MAG)， oil red

0

， PAS， A TP ase， acid phosphatase， acetylcholinester -ase， alkaline phosphate， phosphorylase， phos -phofructokinase染色を行なった. 生化学的検索には，浅胸筋，深胸筋，大腿筋，心筋，肝臓を採取し，直ちに液体窒素中で凍結し，分析時まで-80o Cに保存した.組織中のグリコーゲン含量は， Kepp凶le町r&De白cker戸1り)の方法でた.嫌気性解糖によるinvitroでの乳酸生成能は， Schmid & Mahler2

)の方法に従い検討した.解糖系の主要な酵素として， phosphorylase， phos -phoglucomutase (PGlu-M)， phosphog-lucoisomerase (PGlu-1)， phosphofructokinase， aldolase， pyruvate kinase CPK)， lactate dehy -drogenase (LDH)の活性を測定した3) 酵素活性の測定には， 9倍容のTris-EDTA緩衝液(0.05M Tris， 5mM EDT A， pH 7.5)でホモゲナイズし， 80，000g， 30分間遠心した上清を用いた. また，解糖系に副次的に関与し，ライソゾームに含まれる各種酵素の活性を測定した.maltase (α-glucosidase)

，

β-glucosidase

，

α時 galactosidase，β-galactosidase，β田glucuronidase の活性をSoyamaら4)の方法に従い，合成基質4 -Methylumbelliferyl化合物を用いる方法で測定した.試料は， 9倍容の蒸留水でホモゲナイズし，ライソゾームを破壊するため， freezing & thaw -一1003

(3)

ingを3回おこなった.9， OOOr.p.m.， 20分間遠心し，その上清を分析に用いた.蛍光の測定には， Farrand社のModelA4 Fluorometerを用いた.

maltase Cα-1，4-g1ucosidase)には，ライソゾームに存在し， pH 4.0に至適活性を持つacid maltaseと，主にミグロソームおよび可溶性分画に存在し， pH 6.5に至適活性を持つneutral maltaseの2つが区別されている.このmaltase の活性は， Engel & Gomez5

)の方法に従い， maltaseの水解反応を利用する方法および Soyamaら4)の方法に従い，合成基質 4-Methylum-belliferyl-α-D-glucopyranoside C4-MUG，

Koch-L

i

ght社〉を用いる方法で測定した.

maltaseのisozyme分析を Mehler & DiMauro6 )の方法を一部修正して施行した.セルロース・アセテート膜 CSuperSepraphore， Gel -man Instrument社〉に酵素活性測定に用いた上清をアプリケーターCSepratek-4，Gelman Instru -ment社〉で添付した. 電気泳動には，リン酸カリウム緩衝液CO.04M， pH 6.5)を用い， 6mAで90分間泳動した.泳動終予後直ちに， pH 4.0およびび、pH6.5~.にこ調整した 2mM川fの4 衝液に浸した別のセルロ一ス.アセテート膜を重ね合わせた .3TC， 60分間インキュベート後，更にpH10.7の0.2Mグリシン・炭酸ナトリウム緩衝液で飽和した積紙CWhatmanpaper， Whatman 社〉を重ね，反応を停止させ，直ちに紫外線ランプ下で紫外線フィルターを用い，写真撮影を行なった. 成績 1.組織学的，組織化学的所見最も顕著な変化は，筋線維に最大3μm径の多くの空胞をHE染色でみることであった(図1，D入胸筋は最も強く侵され，多くの筋線維は脂肪組織に置換していたが，残存線維には多くの空胞を認めた.次に前広背筋，後広背筋，前腔骨筋の順に侵され，前腔骨筋では空胞はわずかにしか存在しなかった. 筋線維の大小不同は浅胸筋に強く，前広背筋に軽度存在した.責食反応を伴う壊死線維は見出し得なかった.上記空胞は， PAS染色で強く染め出され(写真1， E)，ジアスターゼ消化試験で消失し，グリコーゲンの著明な増加を示唆した. 次に特異的なことは，酸フォスファターゼ染色で多数の強陽性の部分が全ての筋線維にみられたことであった(写真1，F). 線維内空胞は酸フォスファターゼに軽く陽性であり，強陽性の部分は空胞とは別に存在した .phosphorylaseおよび phosphofructokinase染色では対照筋との聞に染色性の差は認められなかった.

2 .

電子顕微鏡的所見電子顕徴鏡的には，多数のグリコーゲン頼粒を筋原線維聞に認めた(写真

2

).このグリコーゲン穎粒は多くは集塊をなして存在し，膜で被われていないものが多かったが，時に膜に被われているものも存在した. ミトコンドリアなどには変化は少なく，また筋節の配列の乱れもごく少数の筋線維を除いては存在しなかった. 次に特徴的なのは，線維内にミエリン様小体，グリコーゲン頼粒の集塊， autophagic vacuoles が集合した部の存在であった(写真3).このような部は，組織化学的にみた酸フォスファターゼ陽性の部と一致すると思われた. 3.組織グリコーゲン含量(表1，表2) 湿重量当りのグリコーゲン含量は， NO.9280ウズラの大腿筋，浅胸筋，心筋および肝臓のすべてで，著明な増加が認められた.NO.9280ウズラの表l 組織グリコーゲン含量(1) Control NO.9280 大腿筋 0.66 mg/g 11.24 mg/g 浅胸筋 1.85 6.72 d心筋 0.63 13.66 肝臓 0.44 84.33 表 2 組織グリコーゲン含量(2) Control Disease 大腿筋 2.4土0.4mg/g (6) 10.5:t1. 8 mg/g (5) 浅胸筋 4.1:t0.9 (7) 12.3:t2.6 (6) dレ筋 1.6:t0.3 (5) 15.4:t2.6 (6) 肝臓 0.6:t0.3 (7) 43.8:t12.0 (7) mean士S.E.( )は例数 -1004ー

(4)

浅胸筋は，著明な萎縮を示し，脂肪組織による置き換りがみられ正常ウズラの約3.5倍の増加を示すのみであった.しかし，大腿筋や心筋では正常の約20倍，肝臓は約200倍にも達した(表1).その後の多数例での検討においても，発症ウズラでは浅胸筋で正常の約3倍，大腿筋で約4.5倍の増加を示した.また，心筋では約10倍，肝臓では約70 倍の増加を示し，骨格筋より，心筋・肝臓へのグリコーゲンの蓄積が著明であることが確認された (表

2)

.

4 .

嫌気性解糖(表

3

，表的このグリコーゲン含量会増加の原因を追求するために，骨格筋の解糖系の異常の有無を検討した. Schmid

&

Mahlerの方法に従い，大腿筋を用いて in vitroで嫌気性解糖による乳酸生成を検討した.グリコーゲンを加えない条件での乳酸生成は，正常ウズラ1.6μmolelactate produced/ g/30 min.， N o. 9280では， 4.7μmolelactate produced/ g/30min.とNo. 9280ウズラで高値を示した.反応系にグりコーゲンを加えた条件で、は正常ウズラ 9.0に対して， No.9280ウズラは6.4であった(表 3 ). 嫌気性解糖に関与する主要な酵素の活性を測定した(表4入正常ウズラ， NO.9280ウズラ，両者の比活性にほとんど差は認められなかった.これらの事実より，解糖系の主経路にはほぼ問題がな表3 嫌気性解糖による乳酸生成Cinvitro) no addition with glycogen (J1mole lactate/ g/30min.) Control N o. 9280 1.6 9.0 4.7 6.4 表4 解糖系の主要な酵素の比活性(大腿筋〕 Contrnl No.9280 Phosphorylase 0.11 U/mg prot 0.17 U/mg PGlu.M 2.59 2.07 PGlu.I 3.88 4.10 PFK 0.32 0.28 A!dolase 0.30 0.15 PK 0.23 0.18 LDH (0.21)* 0.54 *(深胸筋〉いと考えられる. 5.ライソゾーム酵素活性(表5) 合成基質を用いたライソゾーム酵素活性の測定法では， p H 4.0における α-glucosidase活性が正常ウズラ1，114士147nmole 4.MU/g/hに対し，発症ウズラでは102

:

t

25と約1/10に低下していた.一方， p H 6.5における活性は，正常798

:

t

168に対して，発症ウズラでは1，166士265とほとんど差は認められなかった. その他， β-glucosidase，α-galactosidase，β即 galactosidase，β-glucuronidaseの活性は正常ウ表5 ライソゾム酵素活性 (nmole 4MU/g/h) Control Disease α.glucosidase 1114:t147 102:t25 (n = 12， 776-2688) (n二8. 52-206) (pH4.0) (pH6.5) 798士168 1166:t265 (n = 12， 340-2530)(n=8， 660-2450) β.glucosidase ₍_n_二₄7_，土₀_-₂6₄₎ _(n=45_，土₀_-₁4₆₎ α.ga!actosidase _(n=4106_，5₃土₆₀3_-8₂8₀₀₀₎₍_n₌1₄02_，3₆士₁₀2_-1₁7₅₂₀₎ β.galactosidase _(n=425_，65₁:₈t₃4₀_-64₂₈₆₀₎_(n=431_，18₂₀士₈7₀0_-3₅₁₉₀₎ β-glucuronidase _(n=4190_，5₇土₃₀6_-6₃4₂₆₀₎_(n=4152_，5₃士₂₀5_-9₃5₁₃₀₎ mean:tS.E.( )は例数及び範囲表6 maltoseを基質としたacid maltase活性 Control 〔浅胸筋〉 227 263 〔μmolemaltose/g/minJ No.9280 (大腿筋〉 0 12

表7 4 -MUGを基質としたacid& neutral mal-tase活性

(n mole 4-MU produced/mg prot.!h) pH 4.0 pH 6.5 Control NO.9280 Control No.9280 大腿筋 24.4 3.3 17 .2 22.8 浅胸筋 44.8 3.5 38.9 31.3 '1..) 筋 4.3 1.5 4.5 17.3 肝臓 50.0t 13.8 50.0t 50.0↑ ー」 ↑: scale overしたことを示す.

(5)

ズラと発症ウズラの間で差異が認められなかった 6. maltase(α・1

，

4・glucosidase)活性 (表6

，

表7) pH 4.0における maltoseを基質とする測定法では，正常ウズラ浅胸筋と NO.9280ウズラ大腿筋を用いたが， No.9280ウズラ大腿筋は2回の測定で， 0および12μmolemaltose/g/min.と著明な低値を示した (表6). また，合成基質である4.MUGを用いる方法で，大腿筋，浅胸筋，心筋および肝臓のmaltaseの活性をpH4.0とpH6.5で測定した.acidmaltase の活性は，臓器による差はあるが， NO.9280ウズラで対照の1/3ないし1/20に低下していた.一方， neutral maltaseの活性は， No. 9280ウズラ心筋で対照筋の約 4倍に増加していたが，その他の臓器では両者に差は見られなかった.acidmaltaseおよびneutralmaltaseは，正常およびNo.9280ウズラのいずれにおいても，その活性は心筋で低く，肝臓で最高値を示した (表7). 7. maltaseのpH依存性 (図1，図2) 正常ウズラおよび発症ウズラのmaltaseのpH

+

依存性を検討した.maltoseを基質とすると正常ウズラではpH6.5にピークを示し， pH 4.0で平坦な単峰性の曲線が得られた.発症ウズラも同様にpH6.5~こピークを示すが，， pH 4.0では検出感度ぎりぎりの低値を示した (図1).合成基質4・ MUGを基質とすると，正常ではpH4.5にピークを持ち， pH 6-7.5の間でほぼ平坦な単峰性の曲線が得られた.発症ウズラではpH5.5-7.5の間 μmole glucose/g/hr 60 トーー。Control

.

-

.

，

.

Disease Maltose 40 20

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- ー・回ーー←ー-・--4 5 8 pH 図 maltoseを基質としたmaltaseのpH曲線 μmole 4 MU/g/hr 1.0

r-i.M!lQ 0.6 / 〆〆〆

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Disease 0.2 l..-ーーー一ーーーー-' 4 5 6 」ーー一一一ー」7 8 pn 図2 4.MUGを基質としたmaltaseのpH曲線で平坦なピークを示し， pH 4.0では正常の約1/10 の活性を示した.pH 5.5-7.5の間では両者の活性はほぼ一致した (図2). この両基質とも，発症ウズラにおける acid maltaseの低下を示したが， 4・MUGの方がacid maltaseに対して感受性が高く acidmaltaseの検索には有用と考えられる. 8.電気泳動による acid maltaseおよびneu -tral maltaseのisozyme分析 (写真4)

Con

t

.

pH6.5

9280

C

o

n

t

.

pH4.0

9280

ー

!

一

小

•••••••••

写真4電気泳動法によるmaltaseのEnzymogram (基質は4・MUG) -1006

(6)

-表8 血清maltase活性 (n mole4MU/ml/h) Control Disease acid maltase I 43.2::1:8.6(10) I 4.1:t2.2(9) 口四回1malU田 I 38.5:t13.7(10) I 56凶 0.1(7) mean:tS.D.C)は例数セルロース・アセテート膜を用いた電気泳動で、は，正常ウズラではpH6.5の反応液で3つの is悶 ozymeが分離された.発症ウズラでは，この 3つのうち最も陽極側のbandが消失し，最も陰極側のbandが減少を示した.pH 4.0の反応液では，正常ウズラは2つの isozymeを認め，泳動度はそれぞれpH6.5における最も陽極側および陰極側のbandに一致した.発症ウズラでは，最も陰極側のbandがごくわずかに認められるだけであった. 9.血清maltase活性(表8) このウズラの継代飼育を行なう段階で血清 acid maltaseを測定したところ，発症ウズラで著明な低下が認められた.発見の契機となったNo. 9280ウズラは， 19.6nmole 4-MU/ml/hであった (正常ウズラ82.0nmole4-MU/ml/h).その後の検索で発症ウズラでは，正常ウズラの約1/10の活性しか認められなかった.neutral maltase活性は異常なかった考察 1.組織学的検討 1979年，松井ら7)，黒田ら8)は同種のウズラを組織学的に検索し，報告した. 今回，著者が組織学的に検索したウズラの骨格筋は多くの空胞を有し，空胞内に

PAS

陽性物質の増加が著明であり，これがジアスターゼ消化試験で消化されたことから，グリコーゲンの蓄積をきたしていると考えられた.また， acid phos -phatase染色で強く陽性であり， phosphofructo -kinaseおよびphosphorylase染色で対照筋と差が認められなかった. これらは，ヒトの糖原病II 型にみられる vacuolarmyopathyの組織学的所見に似ている9)川 . 電子顕微鏡的には，多数のmyelin figuresや autophagic vacuolesが存在し， Engelら9)， Garancisl!)， Pellegriniら12)によって報告されているヒトの糖原病II型の所見と類似している.

2 .

生化学的検討生化学的分析では，著明な組織グリコーゲンの増加が認められ，組織学的所見を裏づけた.骨格筋におけるグリコーゲン利用の主経路は， Emb-den-Meyerhofの解糖系である.この経路の異常に関し， in vitroでの嫌気性解糖能を検討したが，発症ウズラに異常はみられなかった.グリコーゲンを加えない条件で，発症ウズラの方が乳酸生成の多いことは，組織内にグリコーゲン含量が多い事実を反映する所見と考えられる.解糖系に関与する主要な酵素の活性も，発症ウズラで異常はみられなかった.このようなことから，発症ウズラにおいては， Embden-Meyerhofの解糖系はほぼ正常に機能しているものと考えられる. 発症ウズラのmaltase活性は， maltoseを基質とする測定法では，ほぼOに等しい.4-MUGを基質とする測定法でも， acid maltaseは対照の1/ 3~ 1/20 に低下していた.一方， neutral maltase は，すべての臓器で活性の低下はみられなかった. β-glucosidase

，

α-galactosidase

，

β-galactosidase，β-glucuronidaseなど他のライソゾーム酵素の活性は，合成基質methylumbellifer -yl化合物を用いた測定法では，発症ウズラにおいて正常ウズラとの差異は認められなかった. 以上のことより，この発症ウズラは， pH 4.0におけるα血1，4-g1ucosidase活性，いわゆる acid maltaseの欠損により，グリコーゲンの著明な蓄積をきたしたものと結論された.

3 .

臨床神経学的考察 a)ヒト糖原病

1

型とウズラについて糖原病は，全身諸臓器に異常なグリコーゲンの蓄積をきたす遺伝性疾患で，臨床症状および生化学的に証明された酵素異常に従って， 6 ~ 7型に分類されている.そのうち，糖原病II型は，乳児期に著明な筋力低下，筋緊張低下を示し，心肥大が特徴的であり，呼吸不全や心不全により死亡する致命的な疾患である.これは，報告者の名にちなんでPompe病とも呼ばれている13) Hersl4)が

(7)

本症における acidmaltaseの欠損を証明して以来，乳児例と発症時期を異にする，臨床症状やグリコーゲン蓄積の軽徴な小児例15)1ベ成人例9)17)-20)が報告されるようになっている. 現在，糖原病II型は発症年齢の違L、によって， ①“infantile type"(乳児型)，②“childhoodtype" (小児型)，③“adulttype"(成人型〉の3型に分類されている.また，②および③を一括して“late -onset type"(遅発型〉と呼ぶこともある.この3 型における臨床症状やグリコーゲン含量の差の発現機序に関しては，種々の考え方が提唱されている.遺伝学的な面からの検討では，典型的な“ 10-fantile type"は常染色体劣性遺伝により遺伝することが確認されている.Hudgsonら21)は，“in -fantile type"のheterozygoteが“adulttype"に進展する可能性を示唆した.一方， Engelら病型患者の両親の骨格筋のacidmaltaseの活性を測定し，これが正常者と患者の活性の中間値をとることを示した.このことから，彼らは“in -fantile type"と“late-onsettype"は異なる遺伝子による疾病で，発症者はhomozygoteであると考えた. また，“infantiletype"と“late-onsettype" が同一家系に発症することがないことも，この考え方を支持するものとした.しかし，最近，Koster ら22)は，“infantiletype"と“late-onsettype"が同一家系にみられたと報告し，この問題は依然，未解決である，近年，合成基質4-MUGを用いる maltase活性の鋭敏な測定法が開発され，この酵素を種々の側面から検討する手掛りが与えられた.Mehlerら6) は，この方法によって“late-onsettype"で、も acid maltase活性が正常者の 2-12%残存していることを示した.しかし，この残余活性と糖原病II型の臨床症状および組織学的所見の差異に相関はみられなかった.また，“late-onsettype"で、は， neu -tral maltase活性は，ほぼ正常に保たれることから，neutral maltaseがグリコーゲン蓄積を減少させる作用を有する可能性も考えられている.一方， “infantile type"では， neutral maltaseの活性は著明に低下しているが，臨床症状およびグリコーゲン含量との相関はみられなかったと報告されている5)19) 今回検察した発症ウズラにおいても， maltose を基質とする測定法ではacidmaltase活性がみられなかったが， 4-MUGを基質とする測定法ではacidmaltaseの活性が正常ウズラの約10%残存していた.これは， Mehlerら6)がヒトの“late -onset type"で期，症状が軽度である点も合わせ考えると，発症ウズラはヒトの“late田onsettype"に似ているものと考えられる.しかし，ヒトの“late-onsettype" では，グリコーゲンの蓄積は骨格筋に限られており，心筋および肝臓では通常認められない19)2ベ発症ウズラでは，心筋および肝臓に骨格筋と同様に著明なグリコーゲンの蓄積を認める点でユニークである. b) maltase活性測定法の検討ウズラの maltaseのpH依存性の分析では， maltoseを基質として活性測定を行なった場合， “late-onset type"と考えられる発症ウズラでpH 4_0で活性はほぼOに等しい.かつ， pH 5_5から徐々に減少を示し，感受性の点からも，わずかな残余活性を問題にする場合には， maltoseを基質とする方法は不適当と考えられる.合成基質4 -MUGを基質とした場合にはpH4_0で約1/10の活性を示し， pH 5_5から急激な減少を示し， neu -tral maltase活性を測定している可能性も否定される.“lase-onsettype"における残余活性の測定やisozymeの分析，酵素の精製など詳細なacid maltaseの研究に，4 有力な方法になるものと考えられる. c) maltaseの酵素学的検討近年，電気泳動法や免疫学的方法により，この酵素の分子レベルでの検討がさかんに行なわれている.Dreyfusら加は，電気泳動法により，骨格筋のacidmaltaseはただ 1つのisozymebandを示すが， neutral maltaseでは 2つのisozyme bandを示し，かっ両者は移動度に若干の差が認められ， acid maltaseおよびneutralmaltase活性には分子レベルで、の相違があると述べている.また，腎臓には骨格筋などにはみられない移動度の少ないもう一つのbandが存在することをも示し 1008ー

(8)

村上論文付図

I

写真l 正常ウズラ CA-C)と発症ウズラ CD-F)の前広背筋_A，D:HE染色， B，E:

PAS染色，C， F:酸フォスファターゼ染色 Cx 300)

(9)

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1

etype"と“late-onsettype"の骨格筋のacidmaltaseは，正常と若干異なる移動度を示し，この“aberrantisozyme"が臨床症状などの差をきたす原因になっていると述べている. これに反し， Mehlerら6)は，同様な方法で骨格筋，心筋，肝臓ではpH6.5の反応液で3つのbandが認められ，脳ではそのうちのlつが欠除することを示した.pH 4.0の反応液では，すべての組織でただ

1

つのbandを示し， pH 6.5の最も陰極側の bandと移動度が一致した.また， 1 例の“infantile type"で、は， acid maltaseのbandが消失し， 3例の“late-onsettype"では，わずかであるが明らかにbandの残存が認められ，かつ，この両者で正常者との移動度に差はみられなかったとしている. この両者は， “infantile type"における acid maltaseのbandの欠除で区別されると述べている.Dreyfusら23)とMehlerら6)の結果の相違は，前者がpH4.0およびpH6.5の反応を別々の泳動膜を用いて行なったのに対して，後者が一枚の泳動膜で泳動後，半分ずつ反応させたことによるものと考えられる. 今回検索したウズラでは， maltaseの3つのis -ozymeが確認された.そのうち，最陽極側および最陰極側の2つがacidmaltaseのisozyme，中央の

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つがneutralmaltaseのisozymeと考えられた.ウズラの acidmaltaseが2つのbandを形成した点は， Dreyfusら23)，Mehlerら6)がヒトの acid maltaseが1つのbandを示したとの報告と異なっており，種特異性の可能性が高いが詳細は不明である.しかし， neutral maltaseのisozyme 活性は発症ウズラにおいても残存していたが， acid maltaseのisozymeは， 1つが全く消失し，他の

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つもわずかな活性しか認められなかったことは， Mehlerら6)の報告に合致する所見と考えられる.このウズラにおいても， isozymeの異常によって症状の軽度な“late-onsettype"の糖原病II 型を発症したものと考えられる. d) 動物モデルとしての臨床上の有用性についてこのウズラの継代飼育に関しては，血清acid maltaseの測定が有用なスクリーニング法となった.すなわち，血清acidmaltase活性の測定により，症状発現前の鮮化後1-2カ月の段階で6カ月後の発症が予測可能であった.また，血清acid maltase値の低値な雌雄を交配することによって，発症ウズラを増加，維持することが可能であった.この点からもウズラの糖原病II型が遺伝子の異常による発症であることが推定される. ヒトにおいては， Soyamaら4)が尿中の acidmaltaseおよびneutral maltaseの測定を行ないpH 4.0/ pH 6.5の比を求め，これがスクリーニングに有用であることを報告しているが，血清acidmaltase の測定によるスクリーニングは報告されていない. ヒトにおける血清acid maltase測定による “late-onset type"のスクリーニングは今後研究の価値があると考える. 以上，今回検索したウズラは，発症時期，症状の程度，組織学的および生化学的所見， acid maltaseのisozyme分析結果などから，糖原病II 型の“adulttype"又は“late-onsettype"の自然発症モデルと考えられる.このウズラの胸筋では，筋径の大小不同や著明な脂肪細胞の浸潤など一部 “dystrophic"な変化を呈した.この種の変化は，ヒトの成人型の場合にも強調されている点である24) 糖原病のうちで最もグリコーゲンの蓄積の著明なものは，解糖系の主要な代謝経路に異常のないこのII型であり，なぜ糖原病II型でこの様なことが認められるかを含め生化学的に未解決な点が多い. この糖原病II型“late-onsettype"の自然発症ウズラは，本症における臨床病型の差異の検討や酵素投与など実験的治療に際して，貴重なモデルとなり得ると考える. 総括および結論翼の機能障害を主徴とする日本ウズラの突然変異種の骨格筋や肝臓を，組織学的および生化学的に検索した.maltaseの酵素学的研究を行ない，臨床神経学における意義を論じた. 1)組織学的には，グリコーゲンを含む多数の空胞を認め，多くのmye

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n figuresやautophagic vacuolesが存在し，ヒトの糖原病II型にみられる所見とほぼ同じであった.

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2)生化学的分析では，骨格筋，心筋および肝臓に著明なグリコーゲンの増加が認められた.しかし，嫌気性解糖能および解糖系の主要な酵素の活性に異常はなかった. 3)acid maltase活性が著明に減少していたが， neutral maltase活性はほぼ正常に保たれていた 4)maltaseの活性測定法に関し検討を加え， acid maltasの詳細な研究には，合成基質

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を用いる測定法が有用であることを示した.

5)電気泳動法による isozyme分析で， maltase の 3つの isozymeが認められ，うち 2つが acid maltaseの isozymeと考えられた.このウズラは acid maltaseの isozyme活性が著明に減少して L 、ナこ 6)このウズラ突然変異種は，ヒトの糖原病II型 “adult type"の疾患モテ、ルと考えられる.本モデルの臨床神経学的意義について考察した. 本稿を終るに臨み，御懇篤なる御指導，御校聞を賜りました，東京女子医科大学脳神経センター・神経内科学教室，丸山勝一教授，竹宮敏子助教授，小林逸郎劫教授に深甚の謝意を表します. 終始かわらぬ御指導，御校関を賜りました国立武蔵療養所神経センター・疾病研究第I部，杉田秀夫部長，高木昭夫室長，埜中征哉室長(現・微細構造研究部部長)，石浦章一博士に深謝いたします. 貴重なウズラの提供を戴き，種々の御指導を戴きました実験動物中央研究所，野村達次所長，ウズラの育種などで御協力戴きました，日本生物科学研究所，水谷誠博士に感謝いたします. 文献

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日本ウズラに発見された糖原病II型（成人型）に関する研究 ： 組織学的，生化学的， 酵素学的研究および臨床神経学的検討

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