陸棲ラン藻の環境適応機構

陸棲ラン藻の環境適応機構

著者 吉田 尚之

著者別名 Yoshida, Takayuki

雑誌名 博士学位論文要旨 論文内容の要旨および論文審査

結果の要旨／金沢大学大学院自然科学研究科

巻 平成21年6月

ページ 1‑8

発行年 2009‑06‑01

URL http://hdl.handle.net/2297/26900

氏名 学位の種類 学位記番号 学位授与の日付 学位授与の要件 学位授与の題目 論文審査委員（主査）

論文審査委員（副査）

吉田尚之 博士（理学）

博甲第１０４５号 平成２０年３月３１日

課程博士(学位規則第４条第１項）

陸棲ラン藻の環境適応機構

坂本敏夫（自然科学研究科・准教授）

櫻井勝（自然科学研究科・教授)，東浩（自然科学研究科・准教授)，

山口正晃（自然科学研究科・准教授)，金森正明（自然科学研究科・講師）

Abstract

ThecyanobacteriumNDstoccommuneisadaptedtotheterrestrial enviromnentandhighlytoleranttoultravioletradiation(ＵＶ)and

desiccation・Ｉｔｉｓｓｈｏｗｎｔｈａｔ凡communeaccumulatesscytonemineand

mycospoline-likeaminoacids(MAAs)thatabsorbUV-AandUV-B，

respectivelywhenNbcommuneissubjectedtoUV､Inthisstudy，

localizationofUV-absorbingpigaｍｅｎｔｓｉｎＮｂｃｏｍＩｍｍｅ,ｃｈａｎｇｅｓｏｆ ｔｒｅｈａｌｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｌｅｖｅＩｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｆｔｈｅｇｅｎｅｓｆＯｒtrehalose

methabolizingenzymesrespondingtodesiccationandbiochemical propertiesoftheseenzymeswereinvestigated・Scytoneminelocalizedin

theextracellularmatrixandMAAslocalizedincellsandextracellular

matrix・lMcommunecoloniescontainedscytonemineanditslevelwas

equivalenttochlorophyllcontent・ＩｎｔｈｅＥＰＳ－ｄｅｐｌｅｔｅｄｃｅｌｌｓ，MAAwas

resultssuggestthataccumulationofUV-absorbingpigmentsis

necessaryfDradaptationtoterrestrialenvironｍｅｎｔ.」ＭｃｏｍｍＩｍｅ

ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｔｒｅｈａＩｏｓｅａｓacompatiblesolute・PhotosyntheticactiviIyof

lMcommｍｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｈｅｎＮｃｏｍｍｕｎｅｗａｓｄｅｓｉccated・Levelsof

transcriptsofgenesoftrehalosesynthesis(n.eYanmreZ)andtrehalose hydrolysis(IreH)inlMpImcrifiomIelAMM-ISdecreasedsimultaneously

-1-

after6hofdehydration・Trehalaseactivitydecreasedinthｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ

resultssuggestthattrehaloselevelisregulatedmainlybychangeof

trehalaseactivity．

要旨

陸棲ラン藻ＮＭＤＣＣＯｍｍｍｅ(イシクラゲ)は地球上の陸地に広く分布し、数 珠状に連なった細胞が細胞外多糖類(EPS)に包まれたコロニーを形成している。

ｌＭｃｏｍｍ肌ｅは陸上に生息しているため、紫外線に対する防御機構や強い乾燥 耐性を持っている。凡ｃｏｍｍｍｅは紫外線照射によって、紫外線吸収色素であ

いろ。本研究では、ｌＭｃｏｍｍｍｅが陸上環境に適応した機構を解明するため

したトレハロースの蓄積の機構について調べた。

まず、ｌＭｃｏｍｍｍｅコロニーに含まれる紫外線吸収色素の量とＥＰＳ除去細胞

に含まれる紫外線吸収色素の量を比較した。スキトネミンはＥＰＳと細胞内に、

ＭＡＡｓは細胞内に局在していた(Tableｌ)。細胞内に含まれているＭＡＡｓはク ロロフィルとほぼ同程度で、コロニーに含まれるスキトネミンの量はクロロフィ

線吸収色素の蓄積が陸上への適応に必要であることが考えられる。

凡ｃｏｍｍｍｅの乾燥と水和過程において、含水量に対する光合成活性とトレ

減少するにしたがって光合成活`性が減少し、同時に、トレハロース含有量が増加 した(Fig.１)。水和の過程では、コロニーに含まれている水が増加するにつれて 光合成活性が上昇しトレハロース含有量が減少した。

さらに、ｌＭｃｏｍｍｍＩｅに近縁で実験室で培養可能なＮｐｍｃＩｉｉｉｍｎｅｌＡＭ

－２－

トレハロース量が増加し、風乾した試料ではSJumol/召乾重量以上のトレハロー

る。トレハロース合成酵素遺伝子(【reYZ)，分解酵素遺伝子(【reH)の転写産物量は 乾燥処理６～１２時間で減少した。凡plmctｽﾞfiDrmelAMM-I5粗抽出液中のト

レハロース合成活性は０．５Ｕ/gprotein、分解活性は５０Ｕ/gproteinであっ た。トレハロース合成活性はＳ０ｍＭＮａＣｌを加えても影響されなかったが、分

解活性は約２０％まで活性が減少した(Fig.２)。Ｔｒｉｓ(hydroxymethyl）

aminomethane(略称：ＴＩis)はトレハロース合成酵素の活性に影響を与えな かったが，分解活性を強く阻害した(Table２)。大腸菌で大量発現したトレハ ロース分解酵素の活性は、NaCIおよびＴＩｉｓで阻害されることから、非ストレス 条件下でトレハロース分解酵素の活性が高く保たれており、乾燥または塩ストレ ス条件下でトレハロース分解酵素の活性が阻害をうけることによって合成と分解

のバランスが合成へと大きく傾くことにより、トレハロースの蓄積を行う機構が あることが考えられる。今後は、トレハロース分解酵素の阻害剤についての研究 ス分解酵素の阻害剤についての研究 を行っていく必要がある。

－３－

Tableｌ陸棲ラン藻NDstoccommuneにおける色素およびウロン酸の

含有量

ＮＬｃｏｎｍｍｎｅｃｅｌｌｓ凡ｃｏｍｍＩｍｅｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈＥＰＳ ｗｉｔｈｏｕｔＥＰＳ

Chloropllyll

(ｍg/gdryweight）

Carotenoids

(Ing/gdryweight） ^{０６±０．２ ２．６±０．ｓ}

ＭＡＡｓ

(、g/gdryweight）

Scytonelnine

(Ing/gdryweight） ^{1.0±１．２ 1.0±０．７}

Uronicacid

(Ing/gdryweight）

EPSはコロニーを機械的に破砕した後紙フィルターでろ過することにより除去し

た。クロロフィルとカロテノイドはメタノールで抽出し、分光学的に定量した。

ＭＡＡｓとスキトネミンはメタノール抽出物をＨＰＬＣを用いて定量した。硫酸加

水分解物中に含まれるウロン酸をカルバゾール法により比色定量した。

－４－

Table2トレハロース代謝系酵素に対する緩衝液の影響

ＭﾌﾞTreHactivity (×103Ｕ/gprotein）

Trehalaseactivity

（U/gprotein）

Ｍｔｓ＋Mthactivity

（ｍＵ/gprotein）

25ｍＭＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ

（ｐＨ7.5） ^{2９．６ 2４．９ ４７７}

25ｍＭＴＥＳ－ＮａＯＨ

（ｐＨ7.5） ^{５４．０ 2５．８ 4４６}

25ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣＩ

（ｐＨ7.5） ^{8.8 ０}

25ｍＭＴｒｉｓ－ＨＳＯ

２４

（ｐＨ7.5）） Notmeasured ^０ Notmeasured

25ｍＭＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ

＋５ｍＭＴＩｉｓ－ＨＣｌ

（ｐＨ7.5）

０ ９

Notmeasured

ラン藻lMplmclifiDmelAMM-15株の無細胞抽出液および大腸菌で大量発現 し精製したトレハロース分解酵素ＭﾌﾞTreHを用いて酵素反応溶液に含まれてい る緩衝液の影響を調べた。デンプンを基質とし２段階の反応の結果生じたトレハ

ハロースを基質とし加水分解により生じたグルコースを定量してトレハロース分 解活性とした。

－５－

シ重扇助苦汁共齢言渕汁零ｓｚ》三三冨三①ｅデマンローメ叫珂剛ｅ腸｛氏・識藏眺向汁凹口椰１行堂Ｆ八識脚剛獣計ごｌ削剛ｅ景齢當抑パ美雪で計醗Ｓｚ印Ｓ三富三①Ｓテマンローメ叫動剛酢ｕｐｍ１－ｎ⑩州昔パ百が呉琲剛一、堂Ｆパ刈口ご〒Ｆ汁・】Ⅱ①・三ｍ①い①禺園‐◎・凹巴①寅十］・凸］い“託Ⅱ①．①。⑫“頁。．。①二・回識燕耽内汁覇Ｓｚ》Ｓ冨冨三①ｅデマンローメ叫動剛Ｓ臘一氏・削昨－，昊曽肌内汁ｚ』三三冨三①ｅｕｐｍｉ齢弧廷可Ｉ、１国団認議肌内“テマフローメ叫珂剛齢薑柵Ｆ“ｕｐｍｉ－ｎ琲淵昔へ言が呉津繊一、堂Ｆハ、口ご〒Ｆ汁・］Ⅱ①．◎凶ｓｏ］乱‐①．⑱ヨニ爵＋】・三⑭扉飛Ⅱ◎・ゴミ“｛ＸＣ・ＣＣＣ］・Ｐ童憲眺苦汁呉齢言抑汁覇ｅｚ》ｓ皀冨三①ｅま酢焉煎』扉ｅ濃言・樹藏肌岸誌ロロ卯１ｓ識慨剛一川彗Ｆパー柵剛ｅ景齢當渕八昊雪Ｆ汁醗“ま助葛前一博帥麓一冊Ｐ誌・菫柵顧“ｕロ卯Ｉ齢削吟行美雪

Trehaloselevel＞

(｣umol/gdryweight）

ロｍＤＱＤ一ｍ･フ

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Relativeactivity(%）

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’ Trehaloselevel用

(ｕｍｏｌ/９．Ⅳweight）

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させて得た光合成活性を100％とした。ｙ=-Oo1S573x2+10.644x+19.211, 12=0.599、ｐ<OoOOO1oD,乾燥させた時のｌＭｃｏｍｍｕｎｅの光合成活性の変化。

完全に水和させたコロニーをデシケーター内で乾燥させて、光合成活』性を測定し

た。測定後、コロニーを完全に水和させて得た光合15

0.4272x2＋IOo73x＋３２．３８４，１２＝０．６１３，ｐ<0.0001。

0.9 6０ 0.8

5０ 0.7

〈目自①』。■ａ切目曰）閉渭彦已Ｑ呵昌］］国十巴】国

0.6 ^{４玉呵りワ】１１ 、）ｎＵｎＵｎＵ} 崗渭彦邑Ｑ⑤①⑰甸曰甸呂①当日 （■『①］①出皀切｛、〉

0.ｓ 0.4 0.3

0２ ０．１

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トレハロース代謝系酵素の活性に対するNaC1の影響

lVOstocpⅢctirilmleM-15株の無細胞抽出液を用いて、デンプンを基質として

を測定した。酵素反応溶液中にNaC1を加えて活`性を測定し、ＮａＣｌの影響を調

べた。

－７－

学位論文審査結果の要旨

本脇文は､陸棲ラン藻叱stocc…ｕｎｅ(イシクラゲ)が陸上潔境に適応した機槻を解明することを目的とし、

ストレス防御物夜として働くと考えられる紫外線吸収色素の局在とI乾燥ストレスに応答して適合溶質である トレハロースが瀞\１Ｍする概柵について、生理生化学的手法により＃１１１析した研究成果を記戦している。

野外に生育する本生物のコロニーには光合成色紫に匹敵する戯の紫外線吸収色素が含まれており、高濃度

の紫外線吸収色素を鱗鏑することが陸上への適応に必要であることが灘察されたら乾燥ストレス処理によっ て、コロニーに含まれている水が減少するに従って光合成活性が減少し〈同時に、トレハロース含有fitが増 加した。この結果は、コロニーに含まれる水の量に応響して光合成活性とトレハロース含有溌を変化させる 適応現象であると考察された。卜以ハロース合成酵素活性は酵素反応液中に含まれている塩濃度に影鞭され ないが、トレハロース分解酵素活性は反応液中に含まれている塩により強く阻害される現象がｉｎｖｉｔｒｏの 実験により見いだされた。この結果は、非ストレス条件下ではトレハロース分解酵素の活性が商く保たれて

以上の研究成果は当該学問分野における新知見を含むものであり，審査委員会として博士（理学）に値す

ろと判断した。

－８－