脂質ナノ粒子製剤を用いたがん遺伝子治療法の開発

著者 服部 喜之

雑誌名 星薬科大学紀要

号 52

ページ 1‑8

発行年 2010

URL http://id.nii.ac.jp/1240/00000136/

1. はじめに

近年､ 分子生物学の進歩がめざましく､ 遺伝子操作・

導入が飛躍的に進歩し､ がん治療においても遺伝子治療 の臨床応用が期待されている｡ なかでも､ 抗がん剤によ り治療効果を示さない難治性のがんに対する新たな治療 法として遺伝子治療が期待されている｡ がん遺伝子導入 用の遺伝子ベクターは､ レトロウイルスやアデノウイル スなどのウイルスベクターと､ リポソームやポリマーな どの非ウイルスベクターに大別される｡ ウイルスベクター は遺伝子導入効率が高いものの､ その抗原性や変異ウイ ルスの出現などの問題がある｡ フランスではX連鎖重 症複合免疫不全症における遺伝子治療の臨床応用におい て､ 染色体に挿入されたレトロウイルスベクターにより がん遺伝子であるLMO2遺伝子を活性化させT細胞性 白血病を発症させた報告や¹⁾､ アデノウイルスベクター によりオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子治療を 受けた患者が､ アデノウイルスベクターの肝動脈内投与 後に身体症状が急変し､ 呼吸困難と多臓器不全により死 亡した報告がされている²⁾｡ 一方､ リポソームやエマル ション等の脂質ナノ粒子製剤は､ 生体膜の構成成分であ るリン脂質等を主成分としているため､ 毒性や抗原性が 低いという利点を持っており､ 遺伝子治療における遺伝 子送達用ベクターとしての有用性が期待されている^{3, 4)}｡ しかし､ 脂質ナノ粒子製剤の問題点は､ in vivoでの遺 伝子発現が低いことである｡ そこで筆者らは､ 安全性が 高く､ 導入効率の高い､ 脂質から構成される遺伝子導入 用ナノ粒子製剤の開発を試みた｡

2. プラスミドDNA導入用正電荷脂質ナノ粒子製剤 の開発

リポソームなどの脂質ナノ粒子製剤による一般的な遺 伝子導入方法は､ まず､ 負電荷を有するDNAと正電荷

を有する脂質ナノ粒子製剤を混合し､ 脂質ナノ粒子/DN A複合体 (ナノ粒子複合体) を形成させる｡ このナノ粒 子複合体を細胞あるいは腫瘍組織などに投与すると､ ナ ノ粒子複合体は細胞表面に吸着後､ エンドサイトーシス により細胞内に取り込まれる｡ 続いて､ エンドソームか ら細胞質に放出されたナノ粒子複合体あるいはナノ粒子 複合体から遊離したDNAは核内に移行し､ 目的の遺伝 子を発現する｡ そのため､ 脂質ナノ粒子製剤はDNAと 静電的に結合させるために､ 製剤組成に正電荷脂質を用 いる⁵⁾｡ 筆者らは､ 正電荷脂質として正電荷コレステロー ル誘導体に着目し､ 正電荷コレステロール誘導体を主成 分とした正電荷ナノ粒子製剤の開発を試みた｡

正電荷コレステロール誘導体は､ コレステロール骨格､

正電荷官能基､ これらをつなぐリンカー部で構成される (Fig. 1)｡ 遺伝子導入用の第一世代の正電荷コレステロー ル誘導体として､ 3級アミンとコレステロールがカルバ ミド結合で結合した3ß[N-(N’, N’-Dimetylaminoethan e)-carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) が開発されてい る (Fig. 1)⁶⁾｡ 遺伝子導入効率は､ 正電荷官能基や リンカー部により大きく影響を受けることが知られてい る⁵⁾｡ さらに近年､ ヒドロキシエチル基で修飾されたア ミンを有する正電荷脂質が､ がん細胞に対して高い遺伝 子発現を誘導することが報告されていた^7-11)｡ そこで筆 者らは､ ヒドロキシエチル基で修飾されたアミン基とコ レステロールが生分解性のリンカーで結合した正電荷コ レステロール誘導体を合成した (Fig. 1)^{12, 13)}｡

脂質ナノ粒子製剤の調製は､ 合成した正電荷コレステ ロール誘導体を主成分とし､ 界面活性剤であるTween 80を安定剤として添加した組成を用いて､ 修正エタノー ル注入法で行った (Table I)｡ そして､ 各脂質ナノ粒 子製剤とプラスミドDNA (pDNA) を混合してナノ粒 子複合体を調製したところ､ 粒子径は約200-800 nmと 脂質ナノ粒子製剤により様々であったが､ いずれのナノ

Cationic Cholesterol Derivative-Based Nanoparticles for Cancer Gene Therapy

Yoshiyuki HATTORI

Institute of Medicinal Chemistry, Hoshi University

粒子複合体も表面電位は正電荷であった (Table I)｡

さらに､ ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードした pDNA (pCMV-luc) を用いてナノ粒子複合体を調製し､

ヒト前立腺がんPC-3細胞に対して遺伝子導入効率を評 価したところ､ 正電荷コレステロール誘導体の中でもヒ ドロキシエチル基で修飾された2級アミンとコレステ ロールがアミド結合で結合したcholesteryl-3ß-carboxy amidoethylene-N-hydroxyethylamine(OH-Chol) を主 成分とする脂質ナノ粒子製剤 (NP-OH) が最も高い遺伝 子発現を誘導できることが判った (Fig. 2A)¹³⁾｡

DNAのリン酸基の負電荷 (-) と正電荷脂質の正電荷 (+) の比 (荷電比) は､ 遺伝子導入効率に大きな影響を 与える要因の一つである｡ NP-OHは､ 荷電比 (+/-) が 3/1以上でナノ粒子複合体の表面電位が正電荷となり､

それに伴い遺伝子発現が上昇し､ その遺伝子導入活性は 市販の遺伝子導入試薬 (Lipofectamine 2000, DMRIE- C, Transfectin, Tfx20) と同等であった (Fig. 2B)¹³⁾｡

また､ 一般的に正電荷リポソームを調製する場合､ リポ ソ ー ム 組 成 と し て 膜 融 合 性 を 示 す 中 性 脂 質 で あ る dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) を 組 成 に 添加したものが使用される場合が多いが､ OH-Cholと Tween 80の組成で調製したNP-OH は､ OH-Cholと DOPEの組成で調製された正電荷リポソームよりも高 い遺伝子導入活性を示すことも明らかにしている¹³⁾｡

3. 正電荷脂質ナノ粒子製剤によるin vivoでの 遺伝子導入

in vivoでのNP-OHによる遺伝子発現効率を調べる

ために､ PC-3細胞をヌードマウス皮下に移植した担が んマウスに､ NP-OHを用いて腫瘍内に直接遺伝子導入 を行った｡ その結果､ in vitroの結果 (Fig. 2B) と異な り､ 荷電比 (+/-) が1/1で調製した負電荷のナノ粒子複 合体が､ 荷電比 (+/-) が3/1で調製した正電荷のナノ粒 子複合体よりも高い遺伝子発現を誘導した (Fig. 3A, Figure 1.

The structure of cationic derivatives of cholesterol with an amino head group: OH-Chol; cholesteryl-3ß-carboxya midoethylene-N-hydroxyethylamine, DC-Chol; 3([N-(N’,N

’-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholesterol, HAPC- Chol; N-hydroxyethyl aminopropane carbamoyl choles- terol, MHAPC-Chol; N,N-methyl hydroxyethyl aminopropane carbamoyl cholesterol, DMAPC-Chol; N,N ,N-dimethyl aminopropane carbamoyl cholesterol.

Nanoplexs^a) Table I. Size and ζ-potential of nanoplexes of plasmid DNA at a charge ratios (+/-) of 3/1.

Nanoparticles

OH-Chol DC-Chol

Nanoplexs ^a)

22.1 㫧0.6 39.9 㫧1.9 Cationic

lipid

Nanoparticles Nanoparticles

NP-OH NP-DC

224.4 㫧 1.0 373.0 㫧 9.9 Size (nm)

118.0 㫧 3.1 117.1 㫧 11.8

ζ-potential (mV) 40.7 㫧1.0 45.3 㫧1.8

Size (nm) ζ-potential (mV)

HAPC MHAPC DMAPC

39.3 㫧0.6 46.4 㫧1.7 38.5 㫧1.5 Particle size distributions and ζ-potentials were measured at 10-15 min after forming nanoplex.

NP-HAPC NP-MHAPC NP-DMAPC

227.5 㫧 8.0 766.2 㫧 6.9 826.5 㫧11.8 120.0 㫧 2.9

130.2 㫧 0.7 75.3 㫧 1.1

45.1 㫧0.5 54.2 㫧1.4 44.8 㫧1.6

ζp g p

Values represent the means㫧S.D. (n=3). ^a)Nanoplex formed in water.

Figure 2.

Effect of cationic lipid on transfection in human pros- tate tumor PC-3 cells (A). Each nanoplex was prepared by mixing plasmid pCMV-luc encoding luciferase gene under the control of cytomegalovirus (CMV) promoter with nanoparticle at a charge ratio (+/-) of 3/1. Effect of charge ratio (+/-) in forming nanoplex on transfection into PC-3 cells (B). NP-OH nanoplexes were prepared by mixing pCMV-luc with NP-OH nanoparticles at vari- ous ratios (+/-); Lipofectamine 2000, DMRIE-C, Transfectin and Tfx20 according to the manufacturer’s instructions. In A and B, the luciferase assay was car- ried out 24 h after incubation of the nanoplexes.

B)¹³⁾｡ さらに､ 荷電比 (+/-) が1/1で調製したNP-OH のナノ粒子複合体は､ 市販の遺伝子導入試薬であるin vivo jetPEI (PolyPlus-transfection社) よりも高い遺 伝子発現を誘導できた¹³⁾｡ 負電荷の脂質ナノ粒子複合体 が正電荷の脂質ナノ粒子複合体よりも高い遺伝子発現を 示した理由は､ 腫瘍組織中を脂質ナノ粒子複合体が拡散 する際に､ 正電荷のものよりも負電荷のものの方が組織 への吸着が少なく､ 広く腫瘍内を拡散できたからではな いかと考えている｡ そのため､ 培養細胞で得られた最適 な遺伝子導入条件が､ 必ずしもin vivoにおいても同じ ではないということが示唆された｡ 以上の結果から､

NP-OHはin vitro並びにin vivoにおいてpDNAを高 効率に導入できる製剤であることが判った｡

4. 正電荷脂質ナノ粒子による短鎖2本鎖RNAの 導入

RNA干渉は､ 二本鎖RNAと相補的な塩基配列を持 つmRNAが分解される現象で､ この現象を利用して人 工的に合成した二本鎖RNAを細胞内に導入することに より､ 任意の遺伝子の発現を抑制することが出来る^{14, 15)}｡ そのため､ 短鎖2本鎖RNA (small interfering RNA, siRNA) を､ 最小限の副作用で最大限の薬理効果を発揮 する新たな核酸医薬として期待が高まっている｡ siRNA に用いられる核酸は､ 19-27塩基から構成される合成短 鎖2本鎖RNAと､ 短鎖2本鎖RNAを短いヘヤピン配 列 で 結 合 さ せ た 一 本 鎖 RNA (short hairpin RNA,

shRNA) を コ ー ド す る プ ラ ス ミ ド DNA (shRNA pDNA) である｡ RNA干渉は細胞質で起こる現象のた め､ 細胞質にsiRNAを高効率に導入することが出来れ ばその効果は発揮することは出来るが､ shRNA pDNA の場合､ 核にshRNA pDNAを移行させてshRNAを 転写させる必要がある｡

筆者らは､ 様々な正電荷コレステロール誘導体から調 製した脂質ナノ粒子製剤を用いて､ ルシフェラーゼ安定 発 現 株PC-3細 胞 に ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 に 対 す る siRNA (Luciferase siRNA) あるいはshRNA pDNA (Luciferase shRNA pDNA) を導入し､ ルシフェラー ゼ発現抑制効率を比較した (Fig. 4A, B)｡ siRNAを用 いた遺伝子発現抑制効果においては､ ヒドロキシエチル 基で修飾された2級アミンを有する正電荷コレステロー ル誘導体 (OH-Chol, HAPC-Chol) で調製されたNP- OHとNP-HAPCが､ 最も高い遺伝子発現抑制効果を 誘導した (Fig. 4A)^{16, 17)}｡ また､ ヒドロキシエチル基で 修飾された3級アミンを有する正電荷コレステロール 誘導体 (MHAPC-Chol) で調製されたNP-MHAPCに おいても高い遺伝子発現抑制効果を誘導したが､ コント ロール配列のsiRNA (Control siRNA) においても遺 伝子発現抑制効果が観察されており､ 非特異的な遺伝子 発現抑制現象 (オフターゲット現象) が誘導されたので はないかと推察された (Fig. 4A)｡ さらに､ NP-OHに よる遺伝子発現抑制効率は､ NP-OHとsiRNAの荷電 比 (+/-) の上昇と共に上昇し､ 正電荷を有する脂質ナノ 粒子複合体を調製した際に最も高い遺伝子発現抑制効果 を示した (Fig. 5A)¹⁷⁾｡ Luciferase shRNA pDNAに よる遺伝子発現抑制効果においては､ NP-OHを用いた 場合において最も高い遺伝子発現抑制効果を示した (Fig. 4B) ｡ ま た ､ 市 販 の 遺 伝 子 導 入 試 薬 で あ る Figure 3.

Tumor transfection in vivo. Xenografts of PC-3 tumor cells were directly injected with NP-OH nanoplex formed at a charge ratio (+/-) of 1/1 or 3/1; in vivo jetPEI according to the manufacturer’s instructions; and naked plasmid DNA. Twenty-four hours after i.t. injec- tions, mice were imaged and bioluminescence was quan- tified. In A, pseudocolor images representing light emit- ted from tumors superimposed over grayscale reference images of representative mice from each group of three.

In B, Quantification of emitted photons from each tumor. Each column represents the mean ±S.D. (n=3).

Statistical significance was evaluated by Student’s t test. *P<0.05.

Figure 4.

Suppression of gene expression by siRNA (A) or shRNA pDNA (B) transfection with nanoparticles in luciferase stably expressing PC-3 cells. In A, each nanoplex of luciferase or control siRNA was prepared at a charge ratio (+/-) of 3/1. In B, nanoplexes of luciferase or con- trol shRNA pDNA were prepared at a charge ratio (+/-) of 3/1. In A and B, the luciferase assay was carried out 48 h after incubation of the nanoplexes. The values are expressed as the mean±S.D. (n=3). Statistical signifi- cance was evaluated by Student’s t test. **P<0.01.

Lipofectamine 2000を用いた場合は､ siRNAにおいて は高い遺伝子抑制効率を誘導できたが､ shRNA pDNA においては遺伝子発現抑制効率が不十分であった (Fig.

4B)｡

さらに､ in vivoでのNP-OHによるsiRNAの遺伝 子導入効果を調べるために､ ルシフェラーゼ発現安定株 ヒト大腸がんHT-29細胞をヌードマウス皮下に移植し た担がんマウスの腫瘍に､ NP-OHを用いて直接siRNA の導入を行った｡ その結果､ pDNAと同様に負電荷を 有する脂質ナノ粒子複合体を調製した際に､ 高い遺伝子 発現抑制効果を誘導できることが判った (Fig. 5B)｡

この結果から､ NP-OHはpDNAのみならずsiRNAも in vitro並びにin vivoにおいて高効率に導入できる製 剤であることが明らかとなった｡

5. 葉酸受容体標的脂質ナノ粒子製剤の開発

葉酸は､ 全ての細胞がDNA合成に必要とするビタミ ンである｡ とりわけがん細胞は､ 平均的な量より多くの ビタミンを必要とする｡ 多くのがん細胞においては､ 葉 酸受容体が過剰発現し､ 葉酸の取り込みが高いことが報 告されていたことから､ 葉酸修飾した脂質ナノ粒子製剤 は､ がん標的製剤として望ましいと考えられた｡ 葉酸を がん標的リガンドとして使用することの利点として､ 1) 葉酸の分子量が小さい､ 2) 安価である､ 3) 葉酸修飾脂 質の合成が容易である､ 4) 葉酸と葉酸受容体の複合体 がエンドサイトーシスにて細胞内に取り込まれる､ こと などが挙げられる｡ 現在までに､ 葉酸受容体を標的とし

た製剤として､ 抗がん剤を封入した葉酸修飾リポソーム 等は報告されていたが､ 遺伝子送達用ベクターとしての 報告､ 特にin vivoでの報告が少なかったことから､ 筆 者は､ 葉酸修飾脂質ナノ粒子製剤 (NP-F) を開発し､ が ん細胞に高効率に遺伝子導入が可能かどうか検討した｡

まず､ NP-Fの調製のために葉酸とポリエチレングリ コール (PEG､ 分子量2000) 脂質を結合させた葉酸修 飾PEG脂質を合成し､ NP-OHの組成に葉酸修飾PEG 脂質を加えてNP-Fを調製した (Fig. 6A)^{18, 19)}｡ そして､

NP-OHあるいはNP-Fを用いて葉酸受容体を過剰発現 している扁平上皮がんKB細胞に遺伝子導入を行ったと ころ､ NP-OHによる遺伝子導入と同時に葉酸を添加し た場合は遺伝子の細胞内取り込み量に変化は観察されな かったが､ NP-Fによる遺伝子導入と同時に葉酸を添加 した場合は細胞内取り込み量の低下が観察された (Fig.

6B, C)｡ この結果は､ NP-Fが葉酸受容体を介して選 択的にがん細胞内に遺伝子導入されていることを示唆し ている｡ さらに､ KB細胞担がんマウスに対しNP-Fを 用いて負電荷の脂質ナノ粒子複合体を調製し腫瘍内投与 したところ､ 高い遺伝子発現を誘導できた^{19, 20)}｡ 以上の 結果より､ 筆者らが開発したNP-Fはがん細胞に発現す る葉酸受容体を介して選択的に遺伝子導入できる製剤で あることが判った｡

Figure 5.

Effect of charge ratios (+/-) in forming nanoplex of siRNA on in vitro (A) and in vivo transfections (B). In A, NP-OH nanoplexes were prepared by mixing siRNA with NP-OH nanoparticles at various ratios (+/-) and transfected into luciferase stably expressing PC-3 cells.

The luciferase assay was carried out 48 h after incuba- tion of the nanoplexes. In B, human colon tumor HT-29 tumor xenografts which stably expressed luciferase were directly injected with nanoplex of 10μg siRNA.

Seventy-two hours after i.t. injections, mice were im- aged by an NightOWL LB981 NC100 system and biolu- minescence was quantified. Each column represents the mean ± S.D. (n=3). N.D., not done. Statistical signifi- cance was evaluated by Student’s t test. *P<0.05, **P

<0.01.

Figure 6.

Schematic structure of the folate-linked nanoparticles composed of folate-PEG2000-DSPE, OH-Chol and Tween 80 (NP-F) (A). Association of FITC-labeled nanoplex with human nasopharyngeal tumor KB cells 3 h after transfection in the absence or presence of free folic acid (B, C). The association was determined based on FITC- fluorescence by flow cytometry. Flow cytometry of cells exposed to the nanoplex (continuous line). Dotted line, plus 1 mM folic acid; bold line, autofluorescence of the cells.

6. 脂質ナノ粒子製剤を用いたがん遺伝子治療

筆者らが開発した脂質ナノ粒子が､ がん遺伝子治療に おいて有効な製剤であることを確認するには､ in vivo で治療用遺伝子導入により腫瘍増殖抑制効果を誘導でき るかどうか検討する必要がある｡ 治療用遺伝子を使って がん細胞を直接殺傷する方法の一つとして､ ヒト単純ヘ ルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子 (HSV- tk) を使った自殺遺伝子療法があり､ これは標的がん細 胞にHSV-tk遺伝子を導入後､ プロドラッグであるガン シクロビル (GCV) を投与することでHSV-tk遺伝子を 発現したがん細胞を殺す方法である｡ KB細胞をヌード マウス皮下に移植した担がんマウスに､ NP-Fを用いて HSV-tk発現プラスミドDNA (pCMV-tk) を局所投与 後､ GCVを腹腔内投与により自殺遺伝子治療を行った ところ､ pCMV-tk投与群はコントロールpDNA投与群 と比較し､ 有意ながんのサイズの縮小並びに重量の減少 を観察することができた (Fig. 7A, B)^{19, 21)}｡ NP-Fに より腫瘍組織へ高効率に導入されたHSV-tk遺伝子によ り､ 高い抗腫瘍効果を得ることが出来たのではないかと 考えている²⁰⁾｡

コネキシン43 (Cx43) は､ ギャップ結合を構成する タンパク質の一つであるが､ がん細胞でのCx43の強制 発現はがん細胞の増殖を抑制することから､ Cx43はが ん増殖抑制タンパク質であることが報告されている²²⁾｡

また､ 腫瘍におけるCx43遺伝子発現誘導は､ 抗アポトー シス蛋白質であるBcl-2の発現を低下させ､ 抗がん剤の 感受性を高めることも知られている²³⁾｡ そこで筆者らは､

ホルモン抵抗性前立腺がんであるPC-3細胞担がんマウ ス に ､ NP-OH に よ る Cx43 発 現 プ ラ ス ミ ド DNA (Cx43 pDNA) の腫瘍内投与と抗がん剤ドセタキセル (DTX) の静脈内投与の併用療法を行った (Fig. 8A, B)｡

その結果､ Cx43 pDNAとDTXの併用投与群は､ Cx43 pDNA単独投与群あるいはDTX単独投与群と比較し､

有意に高い治療効果を示すことが明らかとなった²⁴⁾｡ こ の様な遺伝子治療と化学療法の併用治療法は､ 抗がん剤 抵抗性腫瘍に対し抗がん剤感受性を回復させる有効な治 療法となりうるものと期待できる｡

HER-2は乳がん等多くのがん細胞にて過剰発現が観 察されており､ 腫瘍の分化､ 増殖に関与している｡ 現在､

HER-2を過剰発現している乳がんに対してHER-2を 標的としたヒト化モノクローナル抗体であるハーセプチ ン (一般名：トラスツズマブ) が適用されているが､ 臨 床においては抗がん剤パクリタキセル (PTX) との併用 で用いられることが多い^25-27)｡ しかし､ HER-2陽性腫瘍 であってもハーセプチン抵抗性の腫瘍も存在し､ 奏功率 は高くない^{28, 29)}｡ そこで筆者らは､ HER-2陽性KB細 胞 に 対 し ､ HER-2 を 標 的 と し た siRNA (HER-2 siRNA) あるいはshRNA pDNA (HER-2 shRNA pD NA)を投与することで､ PTXの効果を高めることが出 来るか検討を行った｡ NP-OHを用いてHER-2 siRNA あるいはHER-2 shRNA pDNAを腫瘍内投与後､ PTX を尾静脈内投与したところ､ HER-2 siRNAとPTXの 併用投与群あるいはHER-2 shRNA pDNAとPTXの Figure 7.

In vivo suicide gene therapy for KB tumor xenografts with GCV in mice. Mice were divided into two groups:

group I, control pDNA (10μg); group II, pCMV-tk (10 μg). The NP-F nanoplexes of the pDNAs were injected directly into the tumor four times (day 0, 2, 4, and 6).

GCV (25 mg/kg) was administered i.p. at 24 and 36 h after the injections. Tumor volume (A) was measured over time. On day 14, all mice were killed, and tumor weight (B) was measured. The results in A and B indi- cate the mean volume and weight ± S.E. or S.D., re- spectively (n=5). *P<0.05 and **P<0.01, compared with control.

Figure 8.

In vivo combination therapy of PC-3 tumor xenografts with Cx43 pDNA and docetaxel in mice. When the aver- age volume of PC-3 xenograft tumors reached 200 mm³ (day 0), these mice were selected for treatment with docetaxel (DTX) alone, control pDNA, connexin 43 (Cx43) pDNA, control pDNA plus DTX and Cx43 pDNA plus DTX. Nanoplexes of 10μg pDNA per tumor were directly injected into xenografts on days 0 and 1. DTX at a dose of 15 mg/kg was injected i.v. on days 0.

Tumor volume (A) was measured on days 0, 3, 6, 9, 11, 13, 15. On day 15, all mice were killed, and macro- scopic tumor appearance (B) was evaluated. Data are shown as the mean ± S.E. (A). n=4 for each group. *, p < 0.05.

併用投与群は､ PTX単独投与群に比べ高い抗腫瘍効果 が得られた (Fig. 9A, B)³⁰⁾｡ 特に､ HER-2 shRNA pDNAとPTXの併用投与群で著しい延命率の増加が観 察された(Fig. 9B)｡ HER-2 shRNA pDNAは､ 細胞 内に導入後､ 核に移行しHER-2 shRNAを転写させる 必要があるが､ HER-2 siRNAを細胞内に投与した場合 と比べて持続的にHER-2 shRNAが細胞内で合成され ることから､ HER-2発現抑制が長期間持続し､ PTXと の相乗効果が高まり､ 高い抗腫瘍効果が得られたのでは ないかと考えられた｡

さらに近年､ 内分泌腫瘍の一つである甲状腺髄様がん の原因遺伝子であるRearranged during transfection (RET) と い う チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 型 受 容 体 に 対 す る siRNA (RET siRNA) を用いて甲状腺髄様がんに対す る抗腫瘍効果の評価も行っている｡ 甲状腺髄様がんTT 担がんマウスにNP-OHを用いてRET siRNAを腫瘍 内に直接投与しても､ RET siRNA単独投与では高い抗 腫瘍効果は観察されなかったが､ 抗がん剤のイリノテカ ン (CPT-11) と併用することにより高い抗腫瘍効果を 誘導できることも明らかにしている³¹⁾｡ 以上の結果より､

脂質ナノ粒子製剤を用いた遺伝子治療と化学療法の併用 療法も今後の有用ながん治療法の一つではないかと考え

ている｡

以上の結果より､ 筆者らが開発した脂質ナノ粒子製剤 は､ がん遺伝子治療に有用な遺伝子導入用ベクターとし て使用できる可能性が示唆された｡

7. おわりに

筆者らは､ 正電荷コレステロール誘導体から構成され る遺伝子導入用の脂質ナノ粒子製剤を開発した｡ この脂 質ナノ粒子製剤は､ 培養細胞だけではなく､ in vivoに おいても腫瘍内投与により高い遺伝子発現を誘導できる ことを明らかにしている｡ さらに､ がん特異的に遺伝子 導入するために､ がん特異的リガンドである葉酸で修飾 した葉酸修飾ナノ粒子 (NP-F) も開発した｡ そして､ こ れら脂質ナノ粒子製剤を用いて治療用pDNAあるいは siRNAによるがん遺伝子治療あるいは抗がん剤との併 用療法を行った結果､ 高い抗腫瘍効果を得ることに成功 した｡ 現在､ 静脈内投与により腫瘍へ集積し高効率に遺 伝子発現を誘導できるナノ粒子製剤の開発は成功されて いないことから､ 今後は､ 臨床で使用できる静脈内投与 可能ながん遺伝子治療用脂質ナノ粒子の開発を目指して 研究を進めたいと考えている｡

A B

10μg shRNA pDNA 5 mg/kg PTX

%) 5000

volume (%)

3500

2500 3000

10 μg shRNA pDNA 5 mg/kg PTX

r volume (%

4000 5000

10 μg siRNA 5 mg/kg PTX

se in tumor v

1500 2000

ease in tumor 1000 2000 3000

Fold increas

00 3 6 9 12 15 18 21

500 1000

* * *

Fold incre

0

0 3 6 9 12 15 18 21

1000

* *

*

Days

0 3 6 9 12 15 18 21

Median survival days Days

0 3 6 9 12 15 18 21

Median survival

Saline

Control shRNA pDNA HER-2 shRNA pDNA PTX

28.5 27.0 32.0 35 0 y Saline

Control siRNA HER-2 siRNA PTX

24.5 26.0 28.5

30.0 PTX

Control shRNA pDNA plus PTX HER-2 shRNA pDNA plus PTX

35.0 30.5 42.5 Control siRNA plus PTX

HER-2 siRNA plus PTX 28.5 31.5

Figure 9.

In vivo combination therapy of HER-2 siRNA and paclitaxel for KB tumor xenografts (A). When the average volume of KB tumor xenografts reached at 100 mm³ (day 0), HER-2 or Control siRNA were directly injected into tumor on days 0, 3, 6 and 9. Paclitaxel (PTX) at a dose of 5 mg/kg was injected i.v. on days 1, 4, 7 and 10. In vivo combination therapy of HER-2 shRNA pDNA and PTX for KB tumor xenografts (B). HER-2 or Control shRNA pDNA were directly injected into tumor on days 0, 3, 6 and 9. PTX at a dose of 5 mg/kg was injected i.v. on days 1, 4, 7 and 10. In A and B, data are shown as the mean ± S.E. n=3 for each group. *p<0.05; compared with the mice injected PTX.

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Cationic Cholesterol Derivative-Based Nanoparticles for Cancer Gene Therapy Yoshiyuki HATTORI

Institute of Medicinal Chemistry, Hoshi University

Cancer gene therapy has been intensively developed using non-viral vectors, among which cationic liposomes and nanoparticles are the most investigated. Optimal gene therapy for tumors must deliver plasmid DNA (pDNA) or syn- thetic small interfering RNA (siRNA) to tumor cells with high efficiency and minimal toxicity. We developed new cationic nanoparticles (NP) composed of cholesteryl-3ß-carboxyamidoethylene-N-hydroxyethylamine (OH-Chol) and Tween 80, and evaluated the transfection efficiencies of pDNA and siRNA into human prostate tumor PC-3 xenografts. NP showed effective transfection of pDNA and siRNA when directly injected into the xenografts. For tar- geted delivery to tumors, vitamin folic acid has been utilized for folate receptor (FR)-mediated drug delivery since FR is frequently overexpressed on many types of human tumors. We developed folate-linked nanoparticles (NP-F) com- posed of OH-Chol, Tween 80 and folate-poly(ethylene glycol)-distearoylphosphatidylethanolamine conjugate. Tumor growth of FR-positive human nasopharyngeal tumor KB xenografts was significantly inhibited when a complex of NP-F and a therapeutic gene was intratumorally injected. These findings suggested that cationic cholesterol-based nanoparticles were potential non-viral pDNA and siRNA vectors for local tumor treatment.