Study of cleanup methods and derivatization methods for trace analysis of antibiotics in foods and biological samples

食品 ・ 生体試料中の微量抗生物質分析のための前 処理法及び誘導体化に関する研究

著者 坂本 泰洋

学位名 博士（薬学）

学位授与機関 星薬科大学

学位授与年度 2013年度

学位授与番号 32676甲第169号

URL http://id.nii.ac.jp/1240/00000675/

食品・生体試料中の微量抗生物質分析のための 前処理法及び誘導体化法に関する研究

Study of cleanup methods and derivatization methods for trace analysis of antibiotics in foods and biological samples

薬品分析化学教室

坂本 泰洋

目次

論文リスト …

1

略語リスト …

2

緒論 …

4

第

1

第

1–1

6

第

1–2

MIP

7

第

1–2–1

MIP

クロラムフェニコールの分析

7

第

1–2–2

8

第

1–2–3

LC/UV

9

第

1–2–4

LC/UV

11

第

1–2–5

LC/MS

13

第

1–2–6

ELISA

15

第

1–3

IAC

17

第

1–3–1

IAC

17

第

1–3–2

IAC

18

第

1–3–3

IAC

19

第

1–4

21

第

2

第

2–1

22

第

2–2

-IAC

23

第

2–2–1

IAC

23

第

2–2–2

25

第

2–3

SPDE

28

第

2–3–1

SPDE

28

第

2–3–2

31

第

2–3–3

SPDE

32

第

2–3–4

SPDE

34

第

2–3–5

36

第

2–3–6

37

第

2–4

38

第

3

LC

第

3–1

39

第

3–2

40

3–3

LC

41

第

3–3–1

LC

コリスチンの分析 …

41

第

3–3–2

LC

43

第

3–3–3

LC

蛍光誘導体化法による

OPA

45

第

3–3–4

47

第

3–3–5

48

第

3–4

49

総括 …

50

謝辞 …

52

実験の部 …

53

参考文献 …

64

論文リスト

本論文は，学術雑誌に掲載された次の報文を基本とするものである．

1)

383–389

2012

（第

1

2) Y. Sakamoto, Y. Iwasaki, R. Ito, K. Saito: Determination of gentamicins in meat by LC/FL accompanied with online immunoaffinity chromatography cleanup system, Nippon Shokuhin Kagaku Gakkaishi (Jpn. J. Food Chem. Safety), 20(3), 170–177 (2013).

（第

1

2

3

3) Y. Sakamoto, Y. Jinno, I. Shinodzuka, Y. Iwasaki, R. Ito, K. Saito: Sample cleanup by

solid-phase dispersive extraction for determination of vancomycin in serum, Anal. Sci., 30(2), 271–275 (2014).

（第

2

4)

オンカラム蛍光誘導体化

LC

209–214

2013

（第

3

略語リスト

BCA Bicinchoninic acid

CAP Chloramphenicol

CL Colistin

CLA Colistin A

A

CLB Colistin B

B

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FL Fluorescence detector

FMOC 9-Fluorenylmethyl chloroformate 9-

FPIA Fluorescence polarization immunoassay

GM Gentamicin

IAC Immunoaffinity chromatography

クロマトグラフィー

LC Liquid chromatograph

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantification

MDL Method detection limit

MDRA Multiple drug-resistant Acinetobacter

ME 2-Mercaptoethanol 2-

MIP Molecularly imprinted polymer

MQL Method quantification limit

MS Mass spectrometer

NIP Non-molecularly imprinted polymer

OPA o-Phthalaldehyde

PBS Phosphate buffered saline pH 7.4

pH 7.4

RSD Relative standard deviation

TCA Trichloroacetic acid

TDM Therapeutic drug monitoring

UV Ultraviolet detector

VCM Vancomycin

緒論

抗生物質は，ヒトや家畜の感染症治療に汎用されている主要な医薬品であるが，抗生物 質の乱用による耐性菌の出現が問題となっている．特に家畜の場合，抗生物質は疾 病治療 のための動物用医薬品のみならず，感染症予防を目的に飼料添加物としても用いられてい る．動物用医薬品及び飼料添加物は，使用できる動物の種類，用法用量及び休薬期間が法 律で規定され ¹⁾，畜産食品中への残留防止が図られている．しかし，法律で定められた用 法用量や休薬期間を遵守しなかった場合，これらの動物用医薬品が畜産食品中に残留する ことが懸念され，耐性菌の出現の原因となる恐れがある．日本では，ポジティブリスト制 度が施行されたことにより ²⁾，食品中での残留基準が設定された動物用医薬品は大幅に増 加し，基準が設定されていないものについても一律基準（

0.01 ppm

食品に残留する抗生物質を測定するために，高感度且つ精度の高い分析法が要求されてい る．食品中に残留する抗生物質の分析法の一つに微生物学的試験法がある．微生物学的試 験法とは，抗生物質が有する微生物の増殖抑制作用を利用した分析法であり，抗生物質の 残留の有無をスクリーニングする手法として有用である ^3–5)．しかし，選択性に欠ける面 があり，極微量に存在する抗生物質を検出・同定することは困難である．

他方，ヒトの疾病治療において，有効治療域の狭い抗生物質 では副作用が 生じ やす く，

適切な治療効果が得られないこともあり，このような場合，治療薬物モニタリング（

TDM

TDM

TDM

ELISA

FPIA

FPIA

TDM

食品及び生体試料中の微量な抗生物質を正確に測定する方法として，従来，機器分析に よる理化学的試験法が用いられている．近年では，高速液体クロマトグラフ

/

る食品や生体試料中に存在する夾雑物の影響を受けて，微量な抗生物質の分析に支障をも たらすことがある．試料中に含まれる夾雑物を取り除くために，液液分配抽出法や固相抽 出法（

SPE

UV

FL

また，

MS

他方，測定感度の向上もしくは選択性や分離能を改善する目的で，誘導体化操作を行う ことがある．例えば，極性が高く逆相系クロマトグラフィーでは分離が困難な物質を誘導 体化によってその極性を下げて分離能を改善することができる．更に，紫外部吸収や発蛍 光作用を持たない物質を

UV

FL

MS

第

1

MIP

IAC

SPE

第

2

SPDE

第

3

LC

LC

第

1

第

1–1

従来，クリーンアップ法には

SPE

MIP

IAC

SPE

MIP

CAP

MIP

MIP

他方，

MIP

IAC

IAC

IAC

GMs

SPE

第

1–2

MIP

第

1–2–1

MIP

ェニコールの分析

CAP

Figure 1

物質であり，畜産動物などの疾病治療や予防を目的とした動物用医薬品として用いられて いる．我が国のポジティブリスト制度において，

CAP

23)である可能性が高いことから，食品への残留について「不検出」基準が設定され ²⁴⁾，家 畜等への使用も禁止されている．しかし，

CAP

26

3

CAP

中国産のハチミツやローヤルゼリーなどからも

CAP

27)．したがって，ハチミツ及びローヤルゼリー中

CAP

LC/UV

LC/MS

SPE

MIP

CAP

MIP

LC/UV

LC/MS

ELISA

HN

Cl

Cl O

OH OH

N

- O O

Figure 1 Chemical structure of CAP.

第

1–2–2

従来，

MIP

MIP

MIP

また，検出器に

MS

LC/UV

本法で用いた

SupelMIP

SPE-Chloramphenicol

CAP

MIP

MIP

LC/MS

LC/UV

CAP

MIP

第

1–2–3

LC/UV

CAP

CAP

Oasis

HLB

SupelMIP

SPE-Chloramphenicol

アップ効果を比較検討した．その結果，夾雑物の少ないアカシア蜜では，

Oasis

HLB

MIP

夾雑物の多いソバ蜜やローヤルゼリーを試料とした場合，

Oasis

HLB

CAP

MIP

（

Figure 2

本法で用いた

SupelMIP

SPE-Chloramphenicol

MIP

MIP

非分子インプリントポリマー（

NIP

SupelMIP

SPE-Chloramphenicol

NIP

CAP

保持すると報告されている ⁴²⁾．このような特徴を有していることから，当該

MIP

MIP

Oasis

HLB

Time (min) ^{10 15}

5 0

（ a ）

6 5 4 3 2 1 0

mV

Time (min) ^{10 15}

0 5

（ b ）

CAP

6 5 4 3 2 1 0

mV

Figure 2 LC/UV chromatograms of royal jelly spiked with CAP at 1.0 μg/g and purified with

(a) Oasis

HLB and (b) MIP.

第

1–2–4

LC/UV

ハチミツ（アカシア蜜，レンゲ蜜，オレンジ蜜，サクラ蜜，ビワ蜜，ローズマリー蜜，

ラベンダー蜜及びソバ蜜）に

CAP

0.2 μg/g

A–E

CAP

1.0 μg/g

MIP

LC/UV

Table 1

Table 2

回収率が

64.5%

75.5–81.8%

標準偏差（

RSD

5.6%

76.4–83.2%

RSD

8.2%

AOAC

1 μg/g

75–120%

RSD 10%

なお，ソバ蜜において回収率が低くなった原因として，ソバ蜜は他のハチミツに比べて，

夾雑物が多く，その夾雑物が

MIP

CAP

CAP

MIP

π-π

Table 1 Recoveries of CAP in honey samples purified with MIP.

Flower species

Amount spiked (μg/g)

Recovery (%) Average RSD

Acasis 0.2 77.9 3.1

Astragalus 0.2 81.8 3.7

Orange 0.2 76.7 5.6

Cherry 0.2 77.7 2.8

Medlar 0.2 75.5 2.8

Rosemary 0.2 81.0 3.7

Lavender 0.2 80.8 3.0

Buckwheat 0.2 64.5 2.7

(n = 5)

Table 2 Recoveries of CAP in royal jelly samples purified with MIP.

Royal jelly Amount spiked (μg/g)

Recovery (%) Average RSD

A 1.0 83.2 3.7

B 1.0 79.4 8.2

C 1.0 79.8 8.2

D 1.0 78.0 5.8

E 1.0 76.4 5.9

(n = 5)

第

1–2–5

LC/MS

LC/UV

Oasis

HLB

LC

らの

CAP

A

B

MIP

Oasis

HLB

CAP

10

50

100

250

500 ng/mL

れ

LC/MS

Oasis

HLB

はマトリックス検量線の傾きが小さくなり，イオンサプレッションを受けていることが分

かった（

Figure 3–a

レッションの度合いが顕著であった（

Figure 3–b

MIP

CAP

Figure 3–c

Oasis

HLB

Figure 3–d

ローヤルゼリーにおいては，

Oasis

HLB

A

B

MIP

A

B

CAP

ハチミツの主な組成は糖であり，ローヤルゼリーには糖の他にタンパク質が含まれる．

このように組成の異なる試料においても，

MIP

とから，

LC/UV

LC/MS

CAP

る

MIP

18

12

6

0

Pe ak ar ea ( × ) 10

400 500 200 300

100

0 Concentration (ng/mL)

(a) Acasia ¹⁸

12

6

0

Pe ak ar ea ( × ) 10

400 500 200 300

100

0 Concentration (ng/mL) (b) Buckwheat

18

＜ Oasis

HLB ＞

18

12

6

0

Pe ak ar ea ( × ) 10

500 400

300 200

100

0 Concentration (ng/mL) (c) Acasia

12

6

0

Pe ak ar ea ( × ) 10

400 500 200 300

100

0 Concentration (ng/mL) (d) Buckwheat

＜ MIP ＞

Figure 3 Comparison of slopes of calibration curves of CAP for standard and sample spiked after extraction with Oasis

HLB and MIP.

○ : Standard solution ; a,

: Acacia (Oasis

HLB); b, ▲: Buckwheat (Oasis

HLB); c, ●: Acacia (MIP); d, ■: Buckwheat (MIP).

第

1–2–6

ELISA

これまでの機器分析による測定結果から，

Oasis

HLB

A

液を，

MIP

Oasis

HLB

CAP

0.05

0.1

1.0 ng/mL

ELISA

CAP

溶液による検量線を作成して

IC50

結果，

Figure 4

CAP

IC50

1.11 ng/mL

たが，

Oasis

HLB

A

IC50

0.20

ng/mL

0.18 ng/mL

4.4–9.3

正確な濃度を算出することは困難であった．他方，

MIP

A

IC50

0.66 ng/mL

0.71 ng/mL

Oasis

HLB

CAP

CAP

1.4–2.0

MIP

ELISA

100

0.01 80

60 40

20 0

R el at iv e ab so rb an ce (% )

0.1 1 10

Concentration (ng/mL)

100 80 60

40 20 0

R el at iv e ab so rb an ce (% )

0.01 0.1 1 10

Concentration (ng/mL) (a)

(b)

Figure 4 Matrix calibration curves of CAP in (a) buckwheat and (b) royal jelly A purified with Oasis

HLB and MIP by ELISA.

○

Standard solution (y = -10.76 ln(x) + 51.118)

▲

Buckwheat (Oasis

HLB

y

= -11.08 ln(x) + 32.289)

■

Buckwheat (MIP

y = -10.85 ln(x) + 45.474)

Royal

jelly A (Oasis

HLB

y = -9.227 ln(x) + 34.247)

□

Royal jelly A (MIP

y = -10.70

ln(x) + 46.285).

第

1–3

IAC

第

1–3–1

GMs

IAC

IAC

IAC

MIP

IAC

GMs

アミノグリコシド系抗生物質である

GMs

Figure 5

GMs

イオン交換系の

SPE

LC/FL

LC/MS

難となることがあった．そこで，クリーンアップ効果が高い

IAC

GMs

IAC

GMs

9-

FMOC

LC/FL

SPE

C O

NH

O

NH

NH

HO O O OH

CH

OH NHCH

R

R

H Gentamicin C

R

= NHCH

R

= CH

Gentamicin C

R

= NH

R

= H Gentamicin C

R

= NH

R

= CH

Gentamicin C

R

= CH

R

= NH

Figure 5 Chemical structures of GMs.

第

1–3–2

IAC

HiTrap

NHS-activated column

GMs

500 ng/mL

1 mL

回収率は

43.3%

GMs

とから，回収率が低かった理由は，カラムから

GMs

0.5 M

GMs

HiTrap

NHS-activated column

で，より高濃度の

1.0 M

2.0 M

GMs

HiTrap

NHS-activated

column

GMs

こで，通常の

ELISA

99.8–101.3%

IAC

GMs

IAC

10 mM

50 mM

及び

100 mM

そこで，抗体への負担が少ないと考えられる低濃度の

10 mM

第

1–3–3

IAC

従来の食肉中

GMs

SPE

Oasis

MCX

IAC

Oasis

MCX

試料には，食肉の中でも夾雑物が多く試料精製が困難である豚腎臓の抽出液を選択し，

GMs

IAC

Oasis

MCX

LC/FL

その結果，

Oasis

MCX

GMs

IAC

Figure 6

0 500 1000

0 5 10 15 20

mV

Time (min) (A)

0 5 10 15 20

Time (min)

0 500 1000

mV

(B)

C

C

C

C

C

C

C

Figure 6 LC/FL chromatograms of pork kidney extract spiked with GMs at 500 ng/g and

purified with (A) Oasis

MCX and (B) IAC.

第

1–4

本章では，従来汎用されている逆相系やイオン交換系の固 相ゲルより効果的に夾雑物を 除去できる

MIP

IAC

MIP

LC/UV

LC/MS

MIP

ELISA

しかし，

MIP

MIP

IAC

IAC

GMs

IAC

SPE

以上の結果から，前処理法としての

IAC

MIP

SPE

第

2

第

2–1

夾雑物除去のために行う選択性の高い前処理法は煩雑なことが多く，実験者の手技技術 の差により，測定結果にバラツキが生じることがあった．そこで，本章では前処理法の操 作性を改善することに主眼を置いた前処理法を検討した．

IAC

IAC

-IAC

他方，前処理法の操作性を改善した方法として，試料液中で逆相系固相ゲルを分散させ ることによって迅速な抽出及びクリーンアップが可能な

SPDE

SPE

SPE

SPDE

多数検体の処理も遠心分離で行うため，カートリッジ式

SPE

SPE

SPDE

VCM

SPDE

第

2–2

-IAC

第

2–2–1

IAC

IAC

IAC

-IAC

Figure 7

コンディショニング，洗浄及び溶出時の流速は，今回使用したリガンド固 定化用カップ リングカラム

HiTrap

NHS-activated column

1.0 mL/min

1.0 mL/min

80.4%

GMs

0.5

mL/min

102.3%

Table 3

オンライン

-IAC

1 mL

20

-IAC

良好な再現性が得られた．

Configuration A

Immunoaffinity column

Fraction collector UV

Drain

10 mM Citric acid aq.

Pump-1

PBS

Pump-2

Configuration B

Immunoaffinity column

Fraction collector UV

Drain

10 mM Citric acid aq.

Pump-1

PBS

Pump-2

Figure 7 Flow diagrams of configuration A (load and wash) and configuration B (elution).

Table 3 Recoveries of GMs standards from an immunoaffinity column.

Concentration (ng/mL)

Recovery (%) Average RSD

GM C

160 101.0 1.6

GM C

120 104.2 1.8

GM C

160 105.3 3.3

GM C

60 92.0 4.0

(Total GMs) (500) (102.3) (7.6)

第

2–2–2

IAC

GMs

GMs

1 mL

500 ng

-IAC

Table 4–A

Table 5–A

また，抽出操作を含めた全操作過程での

GMs

に

GMs

1 g

500 ng

求めた結果を，

Table 4–B

Table 5–B

（

B

IAC

GMs

-IAC

MDL

S/N = 3

MQL

S/N > 10

GMs

MDL

30 ng/g

MQL

100 ng/g

GMs

GMs

量として定められており，肉で

0.1 μg/g

2.0 μg/g

5.0 μg/g

以上の結果から，

IAC

GMs

Table 4 Recoveries of GMs in extract of chicken meat purified with an immunoaffinity column.

Amount spiked (ng/g)

Recovery (%) Breast fillet Thigh Average RSD Average RSD

GM C

160 110.9 3.3 104.1 7.6

GM C

120 105.6 6.3 112.9 4.1

GM C

160 102.8 2.6 102.1 7.6

GM C

60 89.6 4.5 83.9 6.5

(Total GMs) (500) (104.2) (3.6) (104.3) (4.5) (n = 5)

Amount spiked (ng/g)

Recovery (%) Breast fillet Thigh Average RSD Average RSD

GM C

160 109.2 1.9 75.9 7.1

GM C

120 84.1 4.1 83.7 7.9

GM C

160 82.3 8.1 73.4 6.3

GM C

60 70.7 14.7 75.9 10.5

(Total GMs) (500) (89.0) (4.8) (77.5) (7.0) (n = 5)

(A) GMs were added to a blank extract of chicken meat immediately before IAC operation.

(B) GMs were added to blank chicken meat before extraction and homogenization.

(A)

(B)

Table 5 Recoveries of GMs in extract of pork meat purified with an immunoaffinity column.

Amount spiked (ng/g)

Recovery (%)

Thigh Liver Kidney

Average RSD Average RSD Average RSD

GM C

160 97.2 4.4 100.0 7.9 93.0 3.4

GM C

120 92.4 8.6 103.7 8.3 94.6 4.2

GM C

160 95.1 7.0 99.9 11.7 90.6 7.0

GM C

60 87.3 14.8 84.4 9.7 84.7 9.5

(Total GMs) (500) (94.0) (5.0) (100.1) (6.1) (92.1) (2.5) (n = 5)

Amount spiked (ng/g)

Recovery (%)

Thigh Liver Kidney

Average RSD Average RSD Average RSD

GM C

160 79.3 8.6 87.2 8.5 85.2 5.6

GM C

120 79.2 9.1 93.2 7.5 87.9 5.0

GM C

160 71.5 8.7 85.4 9.8 80.1 7.1

GM C

60 67.2 7.8 75.6 10.7 75.3 10.1

(Total GMs) (500) (75.6) (6.4) (87.7) (3.9) (83.7) (3.4) (n = 5)

(A) GMs were added to a blank extract of pork meat immediately before IAC operation.

(B) GMs were added to blank pork meat before extraction and homogenization.

(A)

(B)

第

2–3

SPDE

第

2–3–1

SPDE

従来のカートリッジ式

SPE

SPDE

VCM

VCM

Figure 8

Amycolatopsis orientalis

VCM

10–20 μg/mL

20 μg/mL

VCM

VCM

TDM

TDM

FPIA

TDM

血清中

VCM

SPE

SPE

逆相系の

SPE

Oasis

HLB

VCM

VCM

SPE

SPDE

Figure 9

SPDE

化学物質による実験者への曝露の危険性を低減する． また，

SPDE

SPDE

TCA

BCA

57)で測定した．更に，

SPDE

VCM

LC/MS

SPDE

SPE

H O OHHOH

OH NH2

CH3

HO

O

OH OH

OH

O O

O O

O O

O O O

O

O H H

H H H

H

H H

H

H

H

H

H H

H CH3

CH3

CH3

NH2

HN NH

N N N N

NH

H

H

H

H

HO

HO Cl Cl H3C

CO2H

Figure 8 Chemical structure of VCM.

2500 × g centrifuge 15 s

Solid-phase gel

Filtrate Captube

Centrifugation filter

Micro test tube

Figure 9 Scheme of SPDE using a centrifugation filter.