リグニン様酵素重合ポリフェノールの免疫賦活効果と作用メカニズムに関する研究

リグニン様酵素重合ポリフェノール の免疫賦活効果と

作用メカニズムに関する研究

山中 大輔

i 目 次

緒 論 1

実 験 の 部 7

第 一 章 酵 素 重 合 ポ リ フ ェ ノ ー ル (enzymatically polymerized polyphenols : EPP)

の 免 疫 調 整 効 果 と T 細 胞 へ の 影 響 21 第 一 節 マ ウ ス 白 血 球 に 対 す る EPP の 影 響 22 1. EPP の 脾 臓 細 胞 に 対 す る 毒 性 評 価 22 2. EPP の 脾 臓 細 胞 に お け る サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 27 第 二 節 EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 作 用 に お け る T 細 胞 の 関 与 29 1. EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 作 用 と T 細 胞 群 の 影 響 30 2. EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 作 用 に お け る CD4 の 関 与 32 3. EPP と CD4 分 子 の 相 互 作 用 34 第 一 章 考 察 38 第 二 章 EPP の 免 疫 賦 活 活 性 に お け る 異 種 細 胞 間 相 互 作 用 の 影 響 40 第 一 節 種 々 の 白 血 球 に 対 す る EPP の 影 響 41 1. CD4 陽 性 ， CD8 陽 性 T 細 胞 に 対 す る EPP の 影 響 41 2. 各 組 織 由 来 白 血 球 に 対 す る EPP の 影 響 43 3. SCID マ ウ ス 由 来 脾 臓 細 胞 に 対 す る EPP の 影 響 45 第 二 節 EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 作 用 に お け る 抗 原 提 示 細 胞 の 関 与 47 1. EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 作 用 に お け る 抗 原 提 示 細 胞 群 の 影 響 47 2. EPP の BMDC に お け る サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 49 第 三 節 細 胞 間 相 互 作 用 に よ り 制 御 さ れ る EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 51 1. EPP の IFN-γ 産 生 誘 導 作 用 に お け る 抗 原 提 示 細 胞 と T 細 胞 の 関 与 51

2. EPP の IFN-γ 産 生 誘 導 作 用 に お け る IL-12 の 関 与 53

3. EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 に お け る 種 々 の 細 胞 間 接 着 分 子 の 影 響 55

ii 第 三 章 EPP の 経 口 投 与 に よ る 抗 腫 瘍 効 果 お よ び NK 細 胞 活 性 化 作 用 59 第 一 節 酵 素 重 合 前 後 に お け る CA の 物 性 変 化 60 1. CA， pCA の 抗 酸 化 活 性 60 2. CA， pCA の 分 子 量 分 布 62 第 二 節 CA， pCA の 安 全 性 評 価 64 1. 細 菌 を 用 い た CA， pCA の 変 異 原 性 試 験 64 2. 経 口 投 与 に お け る CA， pCA の 摂 取 量 と マ ウ ス の 体 重 変 化 66 第 三 節 CA， pCA の 経 口 投 与 に よ る 抗 腫 瘍 効 果 68

1. in vivo に お け る CA， pCA の 経 口 投 与 に よ る 腫 瘍 増 殖 抑 制 効 果 68 2. in vitro に お け る 腫 瘍 細 胞 増 殖 に 対 す る CA， pCA の 影 響 70

iii 略 語 一 覧

本 論 文 中 に 使 用 し た 略 語 は 以 下 の 通 り で あ る ． Ab : antibody

ABTS : 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline -6-sulphonic acid) diammonium salt APC: allophycocyanin

BM : bone marrow BMC : bone marrow cell

BMDC : bone marrow-derived dendritic cell BRM : biological response modifier

BSA : bovine serum albumin CA : caffeic acid

CD : cluster of differentiation cDNA : complementary DNA CLEC : C-type lectin

CoA : trans-p-coumaric acid ConA : concanavalin A

CTL : cytotoxic T lymphocyte

CTLA-4 : cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 CY : cyclophosphamide

Da : Dalton

DHP : dehydrogenation polymer DIW : deionized water

DMSO : dimethyl sulfoxide

DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EGCG : epigallocatechin-3-gallate

ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay EPP ; enzymatically polymerized polyphenol ESI : electrospray ionization

FA : trans-ferulic acid

FACS : fluorescent-activated cell sorting FBS : fetal bovine serum

FITC : fluorescein isothiocyanate GALT : gut-associated lymphoid tissues

iv HPLC : high performance liquid chromatography HRP : horse raddish peroxidase

HSV : herpes simplex virus i.p. : intraperitoneal

ICAM-1 : intercellular adhesion molecule -1 id : internal diameter

IFN : interferon Ig : immunoglobulin IL : interleukin

LAL : limulus amebocyte lysate

LC/MS : liquid chromatography -mass spectrometry LFA-1 : lymphocyte function -associated antigen-1 mAb : monoclonal antibody

MACS : magnetic activated c ell sorting MAPK : mitogen activated protein kinase MHC : major histocompatibility complex mRNA : messenger RNA

MTT : 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide NF-κB : nuclear factor-κB

NK : natural killer NLR : Nod-like receptor

OTPP : oolong tea polymerized polyphenol

p56Lck : lymphocyte-specific protein tyrosine kinase p56 pAb : polyclonal antibody

PAMP : pathogen-associated molecular pattern PBS : phosphate-buffered saline

PC : peritoneal cavity

pCA : polymerized caffeic acid PCC : peritoneal cavity cell

pCoA : polymerized p-coumaric acid PCR : polymerase chain reaction PE : phyco-erythrin

pFA : polymerized ferulic acid

PMA : phorbol 12-myristate 13-acetate PRR : pattern recognition receptor rpm : round per minutes

v SCID : severe combined immunodeficiency SPF : specific pathogen free

SPL : splenocyte TCR : T cell receptor Th : helper T THY : thymocyte TLR : Toll-like receptor TMB : 3,3`,5,5`-tetramethylbenzidine TNF : tumor necrosis factor

1 緒 論 近 年 ， 先 進 諸 国 に お い て 高 齢 化 は 避 け る こ と の で き な い 問 題 の 一 つ と な っ て お り ， 疾 病 の 治 療 な ら び に 介 護 に 係 る 社 会 的 負 担 を 回 避 す る た め ， 各 国 政 府 は 様 々 な 対 策 を 行 っ て い る ． 我 が 国 で は ， 2000 年 に 発 足 し た 「 健 康 日 本 21」 が 2013 年 現 在 第 2 期 を 迎 え ， 国 民 の 健 康 の 増 進 の 総 合 的 な 推 進 を 図 る た め の 基 本 的 な 方 針 と さ れ て い る (健 康 日 本 21 : http://www.kenkounippon21.gr.jp/‎)． 具 体 的 に ， 壮 年 期 死 亡 の 減 少 ， 健 康 寿 命 の 延 伸 及 び 生 活 の 質 の 向 上 を 実 現 す る こ と を 目 指 し ， 従 来 の 疾 病 対 策 の 中 心 で あ っ た 健 診 に よ る 早 期 発 見 又 は 治 療 に と ど ま る こ と な く ， 健 康 を 増 進 し ， 疾 病 の 発 病 を 予 防 す る 「 一 次 予 防 」 に 一 層 の 重 点 を 置 い た 対 策 が 推 進 さ れ て い る ． 国 民 の 健 康 維 持 へ の 関 心 は 次 第 に 膨 れ 上 が り ， 食 生 活 な ら び に 生 活 習 慣 の 見 直 し が 行 わ れ ， ジ ョ ギ ン グ ， サ イ ク リ ン グ な ど の 運 動 が 積 極 的 に 取 り 入 れ ら れ て い る ． セ ル フ メ デ ィ ケ ー シ ョ ン に よ る 各 個 人 の 健 康 増 進 が 推 奨 さ れ て い る 背 景 を 受 け て ， 人 々 に 有 益 な 薬 理 作 用 を 有 す る 様 々 な 機 能 性 食 品 に 注 目 ・ 期 待 が 集 ま っ て い る ． と り わ け ， 科 学 的 根 拠 に 基 づ き ， そ の 有 効 性 ・ 安 全 性 を 国 に 承 認 さ れ た「 特 定 保 健 用 食 品 」は ，昨 今 の 健 康 意 識 の 強 さ を 象 徴 し た 製 品 で あ る ． 健 康 増 進 法 (栄 養 改 善 法 ) に 基 づ く 保 健 機 能 食 品 の 一 つ と し て ，機 能 性 食 品 市 場 が 拡 大 し つ つ あ っ た 1991 年 に 制 度 が 創 設 さ れ ， 既 に 1000 品 目 を 超 え る 商 品 が 許 可 さ れ て い る ． 現 在 ， こ れ ら 既 存 制 度 の 規 制 緩 和 ， な ら び に 新 た な 食 品 機 能 性 表 示 の 導 入 に 向 け た 動 き が 活 発 化 し て い る ． 機 能 性 食 品 の 普 及 に 伴 い ， 機 能 性 食 品 の 生 体 調 節 作 用 を 担 う 様 々 な 機 能 性 分 子 の 特 定 お よ び 作 用 メ カ ニ ズ ム の 解 析 が 分 子 レ ベ ル で 盛 ん に 行 わ れ て い る ． 代 表 的 な も の に ， 整 腸 作 用 を 有 す る 乳 酸 菌 類 (プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス )， 体 脂 肪 ・ コ レ ス テ ロ ー ル の 低 減 効 果 を 持 つ ポ リ フ ェ ノ ー ル 類 が 挙 げ ら れ ， こ れ ら は 既 に 国 民 の 食 生 活 に 広 く 浸 透 し て い る ． 乳 酸 菌 類 は ， 食 生 活 の 欧 米 化 お よ び ス ト レ ス に よ り 悪 化 し た 腸 内 フ ロ ー ラ (腸 内 細 菌 叢 ) の バ ラ ン ス を 改 善 し ，腹 部 膨 満 感・下 痢 症 状 な ど の 改 善 効 果 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て い る 1 )_{． ま た 近 年 で は ， ポ リ フ ェ ノ ー ル 類 の} 様 々 な 薬 理 効 果 ・ 生 理 機 能 が 次 々 に 解 明 さ れ て い る ． 例 え ば ， エ ピ ガ ロ カ テ キ ン ガ レ ー ト (epigallocatechin gallate : EGCG) を は じ め と す る 緑 茶 葉 由 来 ポ リ フ ェ ノ ー ル 類 は ，抗 肥 満 効 果 2 )_{，抗 ヒ ト 免 疫 不 全 ウ イ ル ス (human immunodeficiency virus :}

HIV) 効 果 3 , 4 )，抗 酸 化 効 果 5 )，抗 腫 瘍 効 果 6 )，抗 変 異 原 性 効 果 7 )，抗 高 コ レ ス テ ロ ー ル 効 果 8 )

な ど の 様 々 な 有 益 な 生 体 機 能 を 有 し て い る ． 一 方 ， カ テ キ ン 類 の ポ リ マ ー で あ る 烏 龍 茶 重 合 ポ リ フ ェ ノ ー ル (oolong tea polymerized polyphenols : OTPP) は 膵 リ パ ー ゼ の 阻 害 活 性 を 持 ち ， 食 後 の 高 ト リ グ リ セ リ ド 血 症 を 抑 制 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 9 , 1 0 )_{．機 能 性 食 品 な ら び に 食 品 由 来 の 機 能 性 分 子 の 生 物 活 性 お よ び}

2 利 用 者 に 合 わ せ た セ ル フ メ デ ィ ケ ー シ ョ ン を 科 学 的 根 拠 に 基 づ い て 実 践 で き る よ う に な っ た ． 一 方 で ， こ れ ら プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス な ら び に ポ リ フ ェ ノ ー ル 類 に 共 通 し た 生 体 調 整 活 性 と し て ， 免 疫 機 能 調 整 作 用 が 着 目 さ れ て い る ． 食 品 と 免 疫 系 の 関 係 性 は 古 く か ら 指 摘 さ れ て き た が ， 近 年 ， 腸 管 免 疫 研 究 が 発 展 し た こ と で 新 た な 展 開 を 迎 え て い る ． 自 然 免 疫 機 構 が 分 子 レ ベ ル で 詳 細 に 解 析 さ れ る よ う に な り ， こ の 過 程 で 多 く の 受 容 体 が 発 見 さ れ た ．Toll-like receptor (TLR)，Nod-like receptor，C-type lectin (CLEC) な ど の pattern recognition receptor (PRR) の 存 在 が 明 ら か と な り ， 自 然 免 疫 研 究 は 著 し い 発 展 を 遂 げ た 11 ) ． PRR を 介 し て 産 生 さ れ た サ イ ト カ イ ン な ら び に ケ モ カ イ ン は ， そ の 他 の 免 疫 細 胞 を 活 性 化 さ せ ， 病 原 体 の 排 除 を 促 す 1 2 )_{． ま} た ， 自 然 免 疫 に 関 連 す る 受 容 体 は 重 篤 な 感 染 症 に お い て 機 能 す る だ け で な く ， 免 疫 機 構 の 発 達 ， 促 進 ， 維 持 に も 密 接 に 関 わ っ て お り ， さ ら に 粘 膜 免 疫 に お い て も 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る ． 腸 管 は 多 数 の 免 疫 細 胞 が 集 ま る 人 体 最 大 の 免 疫 組 織 で あ り ， 免 疫 応 答 の 主 要 な 調 節 器 官 と し て 注 目 を 集 め て い る ． 腸 管 に 存 在 す る 腸 内 細 菌 は 絶 え ず 免 疫 細 胞 と 接 触 し て お り ， 免 疫 系 の 発 達 と 制 御 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る ． 無 菌 マ ウ ス は ， 感 染 防 御 あ る い は 抗 炎 症 と い っ た 免 疫 応 答 能 力 が 著 し く 低 い こ と か ら ， 腸 内 菌 叢 が 全 身 の 免 疫 応 答 に 対 し て 大 き な 影 響 を 与 え て い る と 考 え ら れ る 1 3 , 1 4 ) ． 腸 内 細 菌 叢 に よ る 消 化 管 免 疫 組 織 (gut-associated lymphoid tissues : GALT) の 活 性 化 を 目 的 と し て 発 展 を 遂 げ た も の が ， 乳 酸 菌 な ど の プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス で あ る ．さ ら に ，自 然 免 疫 の 認 識 機 構 が 急 速 に 解 明 さ れ る に つ れ て ， マ ク ロ フ ァ ー ジ ・ 樹 状 細 胞 を 免 疫 修 飾 す る 物 質 が 微 生 物 の 有 す る 核 酸 な ら び に 多 糖 類 な ど に 広 く 分 布 し て い た こ と か ら ， こ れ ら の 分 子 を 病 原 体 関 連 分 子 パ タ ー ン (pathogen-associated molecular patterns : PAMPs) と 称 す る よ う に な っ た 1 5 )． こ の よ う に 分 子 レ ベ ル で の 解 明 が 進 ん だ こ と に よ り ， 腸 内 に 生 息 す る 菌 叢 の み な ら ず ， 死 菌 体 お よ び そ の 成 分 ， さ ら に は 食 品 中 に 含 ま れ る PAMPs に よ っ て も GALT は 活 性 化 さ れ る と い う 考 え 方 が 普 及 し た ． プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス と し て 利 用 さ れ る 一 部 の 乳 酸 菌 は ，interferon (IFN)-γ 産 生 誘 導 活 性 な ど の 強 力 な 免 疫 賦 活 効 果 を 有 し て お り 1 6 )_{， 腫 瘍 免 疫 な ら び に 感 染 時 に 働 く ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー (natural killer : NK) 細 胞} な ど を 意 図 し て 活 性 化 す る こ と を 目 標 と し た 研 究 が 進 め ら れ て い る 1 7 , 1 8 )_{． ま た ，}

Singh と Aggarwal は タ ー メ リ ッ ク に 含 ま れ る curcumin が 転 写 因 子 nuclear factor-κB (NF-κB) を 抑 制 す る こ と を 明 ら か に し た こ と に 端 を 発 し 1 9 )， 緑 茶 2 0 )， グ レ ー プ シ ー ド 2 1 )_{， ザ ク ロ} 2 2 )

3

の 症 状 軽 減 を 目 的 と し て 研 究 が 進 め ら れ て い る 2 6 , 2 7 )

．

免 疫 賦 活 作 用 を 有 す る 食 品 は 一 般 的 に biological response modifier (BRM) と 称 さ れ ， 我 が 国 で は 古 く か ら 茸 な ど の 食 用 真 菌 が 使 用 さ れ て き た ． 病 原 真 菌 に 類 似 し た 細 胞 壁 構 造 を 持 つ 食 用 真 菌 を 経 口 摂 取 す る こ と で ，GALT の 活 性 化 を 介 し て 全 身 性 の 免 疫 シ ス テ ム を 上 昇 さ せ る こ と が 可 能 で あ る ． 著 者 は こ れ ま で に ブ ラ ジ ル 原 産 の 薬 用 茸 で あ る ア ガ リ ク ス (Agaricus brasiliensis : A. brasiliensis) の 自 然 免 疫 調 節 作 用 に つ い て の 研 究 を 行 っ て き た ． A. brasiliensis の 主 な 薬 理 作 用 と し て ， 糖 尿 病 抑 制 効 果 2 8 )_{，抗 メ タ ボ リ ッ ク 症 候 群 効 果} 2 9 )_{，肝 保 護 作 用} 3 0 , 3 1 )_{，な ど が 報 告 さ れ} て い る ． ま た ， そ の 乾 燥 子 実 体 に は 主 要 な 真 菌 細 胞 壁 構 成 成 分 で あ る 「β-glucan」 が 約 12.4% (日 本 食 品 分 析 セ ン タ ー 調 べ ： 酵 素 法 ) と 豊 富 に 含 ま れ て お り ， 主 に β-glucan に よ る 抗 腫 瘍 効 果 3 2 - 3 5 ) が こ れ ま で に 複 数 報 告 さ れ て い る ．さ ら に ，helper T (Th) 1 細 胞 応 答 誘 導 3 6 )，サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 3 7 , 3 8 )，抗 ア レ ル ギ ー 効 果 3 9 )， ア ナ フ ィ ラ キ シ ー 様 反 応 抑 制 作 用 4 0 ) ， NK 細 胞 活 性 化 作 用 4 1 , 4 2 ) な ど の 報 告 が ， A. brasiliensis の 免 疫 調 節 作 用 を 裏 付 け て い る ． 著 者 は 研 究 の 過 程 で ， A. brasiliensis の 冷 水 抽 出 物 が TLR2 を 介 し て 白 血 球 を 活 性 化 さ せ ， 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る interleukin (IL)-6 の 産 生 を 誘 導 す る こ と を 報 告 し た 4 3 )．さ ら に ，A. brasiliensis か ら 抽 出 さ れ た 分 岐 1,3-β-glucan 鎖 を 少 量 含 む 可 溶 性 1,6-β-glucan が ， β-glucan 受 容 体 で あ る dectin-1 に 認 識 さ れ ， tumor necrosis factor (TNF)-α な ど の サ イ ト カ イ ン を 誘 導 す る こ と ，granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) と 抗 原 提 示 細 胞 の 存 在 下 で ，IFN-γ の 産 生 を 強 力 に 誘 導 す る こ と を 明 ら か と し4 4 ) ，A. brasiliensis に よ る 免 疫 修 飾 メ カ ニ ズ ム の 一 部 が 解 明 さ れ た ． II 型 IFN と し て 知 ら れ る IFN-γ は ， ウ イ ル ス 感 染 時 な ど に ， 主 に Th1 細 胞 か ら 産 生 さ れ る サ イ ト カ イ ン の 1 種 で あ り ，NK 細 胞 な ら び に キ ラ ー T 細 胞 (cytotoxic T lymphocyte : CTL) の 活 性 化 作 用 を 有 し て い る 4 5 , 4 6 ) ．従 っ て 機 能 性 食 品 に よ る IFN-γ の 産 生 制 御 に よ り ，NK 細 胞 お よ び CTL の 活 性 化 を 介 し ， 腫 瘍 免 疫 な ら び に 感 染 免 疫 に お け る 生 体 応 答 を 人 為 的 に コ ン ト ロ ー ル す る こ と が 可 能 と な る ． 我 が 国 で は こ れ ま で ， 食 用 真 菌 で あ る シ イ タ ケ (Lentinus edodes) な ら び に ス エ ヒ ロ タ ケ (Schizophyllum commune) 由 来 の β-glucan で あ る レ ン チ ナ ン ，シ ゾ フ ィ ラ ン と い っ た 医 薬 品 が ，臨 床 に お い て そ の 抗 腫 瘍 効 果 が 認 め ら れ ， 癌 患 者 に 対 し て 使 用 さ れ て き た 経 緯 が あ る 4 7 - 5 0 )_{． 従 っ て ，}

各 種 機 能 性 食 品 に 含 ま れ る β-glucan に も 同 様 な 活 性 を 期 待 し ， BRM と し て 利 用 さ れ て い る ． 1,6-β-glucan 分 岐 鎖 を 持 つ 1,3-β-glucan に は 強 い IFN-γ 産 生 誘 導 作 用 が あ り ，多 く の 食 用 真 菌 に お い て 経 口 摂 取 に よ る NK 細 胞 活 性 化 作 用 が 報 告 さ れ て い る ．受 容 体 の 特 定 を 含 め た 分 子 メ カ ニ ズ ム の 解 明 に よ り ，β-glucan は 機 能 性 食 品 に お け る 主 要 な 免 疫 調 整 因 子 と し て 位 置 付 け ら れ た ．

5

検 討 す る た め に は ， タ ン パ ク 質 な ら び に 多 糖 類 ， さ ら に は エ ン ド ト キ シ ン な ど の 微 生 物 由 来 PAMPs の 混 入 の 無 い ， 純 度 の 高 い 試 験 検 体 を 用 い て 検 討 を 行 う 必 要 が あ る ．

Figure 1. The proposed major structure of natural lignin.

6

7 実 験 の 部

1) 実 験 材 料

1-1) 試 薬

[フ ェ ニ ル プ ロ パ ノ イ ド 類 ]

・ 3,4-dihydroxycinnamic acid (caffeic acid : CA)

・ trans-4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid (trans-ferulic acid : FA) ・ trans-4-hydroxycinnamic acid (trans-p-coumaric acid : CoA)

東 京 化 成 工 業 株 式 会 社 [培 地 お よ び 添 加 物 ]

・ RPMI 1640 medium Invitrogen 社

・ Gentamycin sulfate Sigma 社

・ Fetal Bovin Serum (FBS) Equitech-Bio 社

・ HygroGold (Hygromycin B) InvivoGen 社

・ 5-azacytidine 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社

[各 種 溶 液 ]

・非 働 化 FBS : FBS を 56°C の 水 浴 中 で 30 分 間 加 温 し ，非 働 化 後 ，-20°C に て 保 存 ， 用 時 解 凍 し て 用 い た ．

・ リ ン 酸 緩 衝 食 塩 液 (phosphate-buffered saline : PBS) : NaCl (8 g)， KCl (0.2 g)， KH2PO4 (0.2 g)，Na2HPO4-12H2O (2.9 g) を 脱 イ オ ン 水 (deionized water : DIW) に 溶

解 し て 1,000 mL (pH 7.4) と し た ．

・ ACK-lysing buffer : NH4Cl (8.29 g)， KHCO2 (1 g)， EDTA/2Na (37.2 mg) を DIW に

溶 解 し ， 1,000 mL と し ， フ ィ ル タ ー 滅 菌 し た も の を 実 験 に 使 用 し た ．

・AC buffer : NH4Cl (8.29 g) を Tris-HCl buffer (pH 7.5) に 溶 解 し て 1,000 mL と し ，

フ ィ ル タ ー 滅 菌 し た も の を 実 験 に 使 用 し た ．

・MTT 溶 液 : 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT; 株 式 会 社 同 人 化 学 研 究 所 ) 25 mg を PBS 5 mL に 溶 解 し ， フ ィ ル タ ー 滅 菌 し た も の を 実 験 に 使 用 し た ．

・ 0.1M sodium carbonate buffer (pH 9.5) : NaHCO3 (7.13 g)， Na2CO3 (1.59 g) を DIW

に 溶 解 し て 1,000 mL と し ， NaOH で pH9.5 に 調 整 し た ．

・FACS 染 色 Buffer : 非 働 化 FBS を 1%と な る よ う に PBS に 加 え ，さ ら に 0.09% (w/v) の ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム を 加 え た も の を フ ィ ル タ ー 濾 過 し ， 実 験 に 使 用 し た ．

8

・ TMB microwell peroxidase substrate system KPL Inc.

・ 生 理 食 塩 液 (生 理 食 塩 水 ) 大 塚 製 薬 株 式 会 社

・ Dimethyl sulfoxide (DMSO)

・ Folin-Ciocalteu 試 薬 Sigma 社

・ 10%中 性 緩 衝 ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液 (pH 7.4) ・ 過 酸 化 水 素 (H2O2)

・ Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween 20) 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 [リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク 質 ]

・ Recombinant mouse GM-CSF

・ Recombinant mouse IL-4 BD Biosciences 社

・ Recombinant mouse CTLA-4-Fc chimera protein R&D Systems 社 ・ His-tagged recombinant mouse CD4 protein

・ His-tagged recombinant mouse CD8a protein Sino Biological Inc. [細 胞 刺 激 剤 ]

・ Pam3Cys-SKKKKx3HCl (Pam3CSK4) InvivoGen 社

・ Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)

・ Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus (ionomycin) Sigma 社 [抗 体 各 種 ]

・ anti-mouse CD4 (GK1.5) (rat IgG2b) ・ anti-mouse CD8a (53-6.7) (rat IgG2a)

・ anti-mouse CD11a (LFA-1) (M17/4) (rat IgG2a) ・ anti-mouse IL-12 (p40/p70) (C17.8) (rat IgG2a) ・ anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) (Fc Block) ・ rat IgG2a isotype control

・ Allophycocyanin (APC)-conjugated anti-mouse CD4 (RM4-5) (rat IgG2a) ・ APC-conjugated rat IgG2a isotype control

9

・ FITC-conjugated anti-mouse CD11c (HL3) (armenian hamster IgG1) ・ FITC-conjugated rat IgG2a isotype control

・Phyco-erythrin (PE)-conjugated anti-mouse CD3e (145-2C11) (armenian hamster IgG1) ・ PE-conjugated hamster IgG1 isotype control BD Biosciences 社 ・ anti-mouse CD54 (ICAM-1) (YN1/1.7.4) (rat IgG2b)

・ rat IgG2b isotype control

・ APC-conjugated anti-mouse CD3e (17A2) (rat IgG2b)

・ PE-conjugated anti-mouse CD8a (53-6.7) (rat IgG2a) eBioscience 社 ・ FITC-conjugated anti-mouse CD11b (M1/70.15) (rat IgG2b)

・ FITC-conjugated hamster IgG1 isotype control ・ FITC-conjugated rat IgG2b isotype control

・ PE-conjugated anti-mouse CD80 (RMMP-1) (rat IgG2a) Caltag Laboratories 社 ・ APC-conjugated rat IgG2b isotype control

・ PE-conjugated anti-mouse NKp46 (29A1.4) (rat IgG2a)

・ PE-conjugated rat IgG2a isotype control BioLegend 社 ・ Peroxidase-conjugated anti-6-His antibody R&D Systems 社 ・ Peroxidase-conjugated anti-Rat IgG (H+L) goat pAb 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 [そ の 他 ]

・ Type II horse raddish peroxidase (HRP) ・ PKH-26

・ Bovine serum albumin (BSA) Sigma 社

・ 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical 東 京 化 成 工 業 株 式 会 社 ・ 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox)

Calbiochem Inc. ・ 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt (ABTS)

和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社

・ TO-PRO-3 (TP3) Molecular Probes 社

10 [細 胞 株 ]

・ YAC-1 (RCB1165) (マ ウ ス リ ン パ 腫 )

・ RAW264 (RCB0535) (BALB/c 由 来 マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 細 胞 株 )

・ P815 cells (RCB1167) (DBA/2 由 来 肥 満 細 胞 腫 ) RIKEN Cell Bank [実 験 動 物 ]

・ 雄 性 C57BL/6 マ ウ ス ・ 雌 性 DBA/2 マ ウ ス

・ 雄 性 C3H/HeN マ ウ ス 日 本 エ ス エ ル シ ー 株 式 会 社

11

2) 実 験 方 法

2-1) 第 一 章 の 実 験 方 法

2-1-1) 酵 素 重 合 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 作 製

リ グ ニ ン 様 高 分 子 ポ リ フ ェ ノ ー ル の 酵 素 合 成 は ， HRP (Sigma) と ， precursor と し て 3 種 類 の フ ェ ニ ル プ ロ パ ノ イ ド 類 (CA， FA， CoA) を そ れ ぞ れ 用 い て ， 既 報 の 基 本 的 な 合 成 方 法 を 参 考 に 行 っ た 6 6 ) ．全 量 10mL の PBS に precursor 200 mg を 溶 解 し ，precursor と 等 モ ル の NaOH で 中 和 後 ，HRP 1 mg を 添 加 し た ．H2O2溶 液 (30%) を PBS で 0.1%と な る よ う に 希 釈 し ，precursor の 1.5 mol 等 量 分 の H2O2を 遮 光・室 温 条 件 下 1 時 間 か け て 滴 下 し た ． 滴 下 終 了 後 ， 引 き 続 き 室 温 に て 2 時 間 撹 拌 を 続 け ，沸 騰 水 浴 中 で 20 分 間 加 温 し て HRP を 失 活 さ せ た ．遠 心 後 ，上 清 を 分 子 量 50,000 Da の 透 析 膜 に 移 し ，十 分 量 の DIW で 2 日 間 透 析 を 行 っ た ．透 析 後 ，得 ら れ た 反 応 溶 液 を 凍 結 乾 燥 し ， EPP [CA， FA， CoA の 重 合 体 を そ れ ぞ れ polymerized (p) CA， pFA， pCoA と す る ] の 粉 末 を 得 た ． EPP な ら び に precursor は フ ィ ル タ ー 滅 菌 さ れ た DMSO (Sigma 社 ) に 溶 解 し (20 mg/mL)，生 理 食 塩 水 で 適 度 に 希 釈 後 ，細 胞 培 養 に 用 い た ．

2-1-2) 構 成 元 素 分 析

EPP な ら び に precursor 中 の 炭 素 (carbon)， 水 素 (hydrogen)， 窒 素 (nitrogen) 含 量 の 測 定 は 東 京 薬 科 大 学 中 央 分 析 セ ン タ ー に お い て 実 施 し た ．

2-1-3) エ ン ド ト キ シ ン の 定 量

12

ス メ ッ シ ュ (線 径 0.12 mm， MESH 80) を 用 い て 単 一 細 胞 化 し ， 1200 rpm × 5 min， 4°C で 遠 心 分 離 し た ． 得 ら れ た 細 胞 は ACK-lysing buffer に よ り 混 在 す る 赤 血 球 を 溶 解 し ， RPMI 1640 medium で 2 回 洗 浄 し た ． 顕 微 鏡 下 で 細 胞 数 を 計 測 し ， 細 胞 濃 度 を 調 整 し ， Gentamycin sulfate (50‎ μg/mL) と 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium 中 に 懸 濁 し た ． 2-1-5) MTT 法 に よ る 細 胞 毒 性 の 測 定 EPP な ら び に precursor の マ ウ ス 脾 臓 細 胞 に 対 す る 細 胞 毒 性 に つ い て は ， 既 報 の 基 本 的 な 方 法 の 細 部 に 変 更 を 加 え て 実 行 し た 6 7 ) ． 細 胞 毒 性 の 検 討 に は C57BL/6 マ ウ ス の 脾 臓 細 胞 を 使 用 し ， 前 述 の 方 法 に よ り マ ウ ス 脾 臓 細 胞 を 調 整 し た ． 4 × 105 cells/100 μL の 脾 臓 細 胞 を 96 well 平 底 プ レ ー ト (住 友 ベ ー ク ラ イ ト 株 式 会 社 ) に 播 種 し ， EPP な ら び に precursor (0–100‎μg/mL) で 刺 激 し ， 37°C・ 5% CO2環 境 下 に て 培 養 し た ． 44 時 間 後 に 上 清 を 除 去 し ， 37°C で 加 温 し た RPMI 1640 medium で 1 回 洗 浄 後 ， MTT 溶 液 (0.5 mg/mL)， Gentamycin sulfate (50‎ μg/mL)， 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium に 培 地 交 換 し ， 37°C・ 5% CO2環 境 下 に て 4 時 間 培 養 し た ． 上 清 を 除 去 し ， DMSO 100 μL で 細 胞 を 溶 解 さ せ ， 550 nm に お け る 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (MTP450; コ ロ ナ 電 気 株 式 会 社 ) を 用 い て 測 定 し た ． 無 刺 激 の コ ン ト ロ ー ル 細 胞 が 示 す 吸 光 度 を 100%と し て ，各 細 胞 増 殖 率 を 縦 軸 に 示 し た ． 2-1-6) 細 胞 培 養 前 述 の 方 法 に よ り C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 を 調 整 し た ．4 × 105 cells/500 μL の 脾 臓 細 胞 を 48 well 平 底 プ レ ー ト (住 友 ベ ー ク ラ イ ト 株 式 会 社 ) に 播 種 し ， EPP な ら び に precursor (0–100‎μg/mL) で 刺 激 し ，37°C・5% CO2環 境 下 に て 培 養 し た ．48 時 間 後 に 1200 rpm × 5 min， 4°C で 遠 心 分 離 後 ， 培 養 上 清 を 回 収 し た ． 2-1-7) 細 胞 分 離 C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 を 前 述 の 方 法 に よ り 調 整 し ， magnetic-activated cell sorting (MACS) に よ り T 細 胞 の 分 離 を 行 っ た ． 脾 臓 細 胞 を anti-CD3e microbeads (Miltenyi Biotec 社 ) で 処 理 し ，MACS LD カ ラ ム (Miltenyi Biotec 社 ) を 用 い て CD3e 陽 性 細 胞 を 除 去 し た ．

2-1-8) フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析

13

収 し ， FACSDiva (BD Biosciences 社 ) と FlowJo ソ フ ト ウ ェ ア (Tree Star Inc.) を 用 い て デ ー タ を 解 析 し た ．

2-1-9) サ イ ト カ イ ン 測 定

細 胞 培 養 上 清 中 の IL-1β， IL-4， IL-6， IFN-γ， GM-CSF 濃 度 は OptEIA kit (BD Biosciences 社 ) を 用 い て sandwich ELISA 法 に よ り 測 定 し た ．

2-1-10) 可 溶 性 CD4 結 合 実 験

EPP と マ ウ ス CD4 の 直 接 的 な 結 合 性 は ELISA 様 試 験 に よ り 評 価 し た ． 96 well ELISA プ レ ー ト (Greiner Bio-one社 ) を 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.5) に 溶 解 し た EPPな ら び に precursor (0–25 μg/mL) で コ ー テ ィ ン グ し ， 4ºCに て 一 晩 放 置 し た ． 0.05% Tween 20 を 含 む PBS (PBST) で 洗 浄 し ， 1% (w/v) BSA を 含 む PBST (BPBST) に よ り 室 温 に て 1時 間 ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た ．PBSTで プ レ ー ト を 洗 浄 後 ， His タ グ 標 識 さ れ た リ コ ン ビ ナ ン ト マ ウ ス CD4 ま た は CD8a タ ン パ ク 質 (Sino Biological‎ Inc.)‎ (2‎ μg/mL) を 加 え 37ºCに て 1時 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た ． 再 度 PBSTで プ レ ー ト を 洗 浄 後 ，ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 anti-6-His antibody (R&D Systems 社 ) を 加 え イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し ，十 分 に 洗 浄 を 行 っ た ．固 相 化 し た EPPな ら び に precursor へ の 可 溶 性 CD4 ま た は CD8a タ ン パ ク 質 の 結 合 性 は ， ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 基 質 (TMB microwell peroxidase substrate system) (KPL Inc.)を 用 い て 観 測 し た ． 1Nの リ ン 酸 で 反 応 を 停 止 し た 後 ， 450 nmに お け る 吸 光 度 を 測 定 し た ．

ま た ，得 ら れ た 結 果 が EPPな ら び に precursorの ELISA プ レ ー ト へ の 固 層 化 効 率 の 違 い に 影 響 さ れ て い な い こ と を 確 認 す る た め ，可 溶 性 CD4タ ン パ ク 質 を プ レ ー ト に 固 層 化 し ，anti-mouse CD4 mAbと 各 試 験 検 体 を 共 存 さ せ る こ と で ，競 合 的 ELISA様 試 験 を 実 施 し た ．ELISAプ レ ー ト を 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.5) に 溶 解 し た Hisタ グ 標 識 リ コ ン ビ ナ ン ト マ ウ ス CD4ま た は CD8aタ ン パ ク 質 (5 μg/mL) で 固 層 化 し た ． PBSTで の 洗 浄 後 ， BPBSTで ブ ロ ッ キ ン グ し ， 再 度 洗 浄 し た ． プ レ ー ト に BPBSTに 溶 解 し た EPPな ら び に precursor (0–250 μg/mL) を 加 え 30分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し ， 洗 浄 後 に BPBST に 溶 解 し た anti-mouse CD4 mAb (GK1.5) ま た は anti-mouse CD8a mAb (53 -6.7) (0.5‎ μg/mL) を 加 え て 室 温 に て 1時 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た ．PBSTで 洗 浄 後 ，ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 anti-Rat IgG (H+L) goat pAb (和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ) を 加 え イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し ， 十 分 に 洗 浄 を 行 っ た ． 各 mAb の 固 層 化 CD4 ま た は CD8a へ の 結 合 は ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 基 質 (TMB microwell peroxidase substrate system) を 用 い て 観 測 し た ． 1Nの リ ン 酸 で 反 応 を 停 止 し た 後 ， 450 nmに お け る 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (MTP450; コ ロ ナ 電 気 株 式 会 社 ) を 用 い て 測 定 し た ．

14 C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 (4 × 106

cells/mL) を 前 述 の 方 法 に よ り 調 整 し ， Gentamycin sulfate (50‎μg/mL) と 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium 中 に 懸 濁 し た ． EPP な ら び に precursor (100 μg/mL) を 加 え 37ºC に て 1 時 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後 ， FACS 染 色 Buffer で 洗 浄 後 ， Fc Block を 含 む FACS 染 色 Buffer に 懸 濁 し ， 氷 上 で 20 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た ． 細 胞 染 色 の た め ， PE 標 識 anti-mouse CD3e (145-2C11) ， FITC 標 識 anti-mouse CD8a (53-6.7) ， APC 標 識 anti-mouse CD4 (RM4-5) ま た は 対 応 す る ア イ ソ タ イ プ IgG を 加 え ， 遮 光 し 氷 上 で さ ら に 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た ．細 胞 は 洗 浄 後 に 10%中 性 緩 衝 ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液 (pH 7.4) で 固 定 後 ，FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences 社 ) を 用 い て デ ー タ を 回 収 し ，FACSDiva (BD Biosciences 社 ) と FlowJo ソ フ ト ウ ェ ア (Tree Star Inc.) を 用 い て デ ー タ を 解 析 し た ． 2-2) 第 二 章 の 実 験 方 法 2-2-1) マ ウ ス 腹 腔 常 在 性 細 胞 ， 脾 臓 細 胞 ， 胸 腺 細 胞 ， 骨 髄 細 胞 の 調 整 C57BL/6 マ ウ ス ま た は SCID マ ウ ス を CO2に よ り 屠 殺 し ， 腹 腔 を 5 mL の 生 理 食 塩 水 で 2 回 洗 浄 し ，洗 浄 液 を 回 収 し た ．1200 rpm × 5 min，4°C で 遠 心 分 離 し た 後 ， 細 胞 数 を 顕 微 鏡 下 で 計 測 し た ．細 胞 濃 度 を 調 整 し ，Gentamycin sulfate (50‎μg/mL) と 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium 中 に 懸 濁 し ， 腹 腔 常 在 性 細 胞 と し た ． 脾 臓 な ら び に 胸 腺 を 摘 出 し ， RPMI 1640 medium 中 で ス テ ン レ ス メ ッ シ ュ を 用 い て 単 一 細 胞 化 し ，1200 rpm × 5 min，4°C で 遠 心 分 離 し た ．得 ら れ た 細 胞 は ACK-lysing buffer に よ り 混 在 す る 赤 血 球 を 溶 解 し ， RPMI 1640 medium で 2 回 洗 浄 し た ． 顕 微 鏡 下 で 細 胞 数 を 計 測 し ， 細 胞 濃 度 を 調 整 し ， Gentamycin sulfate (50‎μg/mL) と 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium 中 に 懸 濁 し ， そ れ ぞ れ 脾 臓 細 胞 ， 胸 腺 細 胞 と し た ．

15 37°C・ 5% CO2環 境 下 に て 培 養 し た ． 48 時 間 後 に 1200 rpm × 5 min， 4°C で 遠 心 分 離 後 ， 培 養 上 清 を 回 収 し た ． 2-2-3) マ ウ ス BMDC の 調 整 な ら び に 細 胞 培 養 BMDC は ， 既 報 を 参 考 に 誘 導 し た 6 8 ) ． 前 述 の 方 法 に よ り 調 整 し た C57BL/6 マ ウ ス 骨 髄 細 胞 に GM-CSF (10 ng/mL) と IL-4 (10 ng/mL) を 加 え ， 96 well 平 底 プ レ ー ト に 250‎ μL ず つ 播 種 し (5 × 105 cells/well)， 37°C・ 5% CO2環 境 下 に て 培 養 し た ． 3 日 目 に ピ ペ ッ テ ィ ン グ に よ り 非 付 着 性 細 胞 を 取 り 除 き ，GM-CSF と IL-4 を 含 む 新 た な 培 地 に 交 換 後 ， さ ら に 培 養 を 続 け た ． 5 日 目 に EPP (100‎ μg/mL) ま た は Pam3CSK4 (0.02 μg/mL) で 刺 激 し ， 7 日 目 に 培 養 上 清 を 回 収 し た ． 2-2-4) 細 胞 分 離 C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 を 前 述 の 方 法 に よ り 調 整 し ， MACS に よ り CD4 陽 性 T 細 胞 な ら び に CD8 陽 性 T 細 胞 の 分 離 を 行 っ た ．脾 臓 細 胞 は CD4+

T Cell Isolation Kit II ま た は CD8+ T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec 社 ) で 処 理 し ， MACS LS カ ラ ム (Miltenyi Biotec 社 ) を 用 い て CD4 陽 性 T 細 胞 な ら び に CD8 陽 性 T 細 胞 を 精 製 し た ．

C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 を 前 述 の 方 法 に よ り 調 整 し ， MACS に よ り CD11b 陽 性 細 胞 な ら び に CD11c 陽 性 細 胞 の 分 離 を 行 っ た ． 脾 臓 細 胞 は anti-CD11b ま た は anti-CD11c microbeads (Miltenyi Biotec 社 ) で 処 理 し ， MACS LD カ ラ ム (Miltenyi Biotec 社 ) を 用 い て CD11b 陽 性 細 胞 な ら び に CD11c 陽 性 細 胞 を 除 去 し た ．

C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 を 前 述 の 方 法 に よ り 調 整 し ， mouse T cell enrichment columns (R&D Systems 社 ) を 用 い て T 細 胞 を 濃 縮 し た ．

2-2-5) フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析

C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 な ら び に 細 胞 分 離 後 に 得 ら れ た 細 胞 は ， FACS 染 色 Buffer に 懸 濁 し ，Fc Block 処 理 後 に 各 種 蛍 光 標 識 抗 体 あ る い は 対 応 す る ア イ ソ タ イ プ IgG で 染 色 し た ．ま た ，マ ウ ス 腹 腔 常 在 性 細 胞 も 同 様 に 染 色 し た ．10%中 性 緩 衝 ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液 (pH 7.4) で 固 定 後 ， FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences 社 ) を 用 い て デ ー タ を 回 収 し ，FACSDiva (BD Biosciences 社 ) と FlowJo ソ フ ト ウ ェ ア (Tree Star Inc.) を 用 い て デ ー タ を 解 析 し た ．

T 細 胞 の 精 製 後 ， 細 胞 分 離 前 後 の 各 細 胞 は APC 標 識 anti-mouse CD4 (RM4-5) ま た は FITC 標 識 anti-mouse CD8a (53-6.7) で 染 色 し ， FACS 解 析 し た ．

CD11b 陽 性 細 胞 な ら び に CD11c 陽 性 細 胞 の 除 去 後 ， 細 胞 分 離 前 後 の 各 細 胞 は FITC 標 識 anti-mouse CD11b (M1/70.15) ま た は FITC 標 識 anti-mouse CD11c (HL3) で 染 色 し ， FACS 解 析 し た ．

16

anti-mouse CD3e mAb (17A2) で 染 色 し ， FACS 解 析 し た ．

2-2-6) サ イ ト カ イ ン 測 定

細 胞 培 養 上 清 中 の GM-CSF 濃 度 は OptEIA kit (BD Biosciences 社 ) を 用 い て sandwich ELISA 法 に よ り 測 定 し た ．

IL-12p70 な ら び に TNF-α 濃 度 は ELISA MAX set (BioLegend 社 ) を 用 い て 測 定 し た ．

IFN-γ 濃 度 は OptEIA kit な ら び に ELISA MAX set を 用 い て 測 定 し た ． 2-3) 第 三 章 の 実 験 方 法 2-3-1) ゲ ル 濾 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー CAま た は pCAを 尿 素 ア セ ト ン 溶 液 に 溶 解 し (5 mg/mL)， 200‎ μLを 尿 素 ア セ ト ン 溶 液 で 平 衡 化 し た Toyopearl HW-60F column (東 ソ ー 株 式 会 社 ) (1 × 45 cm) に ア プ ラ イ 後 ， 同 溶 液 を 溶 出 液 と し て オ ー プ ン カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 行 っ た ． 溶 出 画 分 (500‎μL/tube) を 回 収 し ， Folin-Ciocalteu試 薬6 9 ) を 用 い て フ ェ ノ ー ル 性 水 酸 基 を 検 出 し た ．具 体 的 に ，等 量 の 溶 出 画 分 と Folin-Ciocalteu試 薬 を 室 温 で 3分 間 混 合 し た 後 ，等 量 の 10% (w/v) 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム を 加 え た ．60分 間 室 温 で イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後 ， マ イ ク ロ プ レ ー ト に 移 し ， 700 nmに お け る 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (Safire; TECAN社 ) を 用 い て 測 定 し た ． 2-3-2) 変 異 原 性 試 験 細 菌 に 対 す る CA お よ び pCA の 変 異 原 活 性 は ，ウ ム ラ ッ ク AT キ ッ ト (株 式 会 社 蛋 白 精 製 工 業 ) を 用 い て umu 試 験 に よ り 測 定 し た ． CA お よ び pCA は 15 ng/mL か ら 1 mg/mL の 濃 度 ま で は 水 に 溶 解 さ せ ， 2 mg/mL を 超 え る 濃 度 で は 10% DMSO に 溶 解 ・ 懸 濁 さ せ た ． ま た バ ッ ク グ ラ ウ ン ド 用 の コ ン ト ロ ー ル と し て 10% DMSO を 使 用 し た ．こ れ ら の 試 験 検 体 10 μL と サ ル モ ネ ラ 菌 NM2009 株 100 μL を S9 Mix の 存 在 ・ 非 存 在 下 に て 混 合 し た ． 37°C に 設 定 し た 振 盪 培 養 器 に て 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト 後 ，100‎μL の X-gal を 加 え ， DNA の 損 傷 に 応 答 し て 誘 導 さ れ た umu 遺 伝 子 の レ ベ ル を β-galactosidase 活 性 と し て 観 察 し た ． 発 色 後 ， 100‎ μL の 反 応 停 止 液 を 加 え ， 630 nm に お け る 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (MTP450; コ ロ ナ 電 気 株 式 会 社 ) を 用 い て 測 定 し た ． β-galactosidase 活 性 が バ ッ ク グ ラ ウ ン ド の 2 倍 を 超 え る 場 合 を 陽 性 結 果 と し て 判 定 し た ．ま た EPP な ら び に precursor 自 身 が 吸 光 度 に 及 ぼ す 影 響 は ， ブ ラ ン ク テ ス ト を 行 い 補 正 し た ． 2-3-3) 腫 瘍 細 胞 株 の 調 整

17 1640 medium を 用 い て 継 代 培 養 し た ． CD80 低 発 現 P815 細 胞 株 (B7-P815) は ，既 報 7 0 ) に 従 い 作 成 し た ．CD80 の cDNA は マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 細 胞 株 で あ る RAW264 か ら 精 製 し た mRNA よ り PCR に て ク ロ ー ニ ン グ し た ． CD80 遺 伝 子 フ ラ グ メ ン ト は pcDNA3.1/Hygro (+) プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー (Invitrogen 社 ) に 挿 入 し ， 15 μg の 直 鎖 状 プ ラ ス ミ ド を P815 細 胞 株 (1 × 106

cells) に Gene Pulser II (Bio-Rad 社 ) を 用 い て 250 V の 条 件 で エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン し た ．mock-P815 細 胞 は コ ン ト ロ ー ル プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を 同 条 件 に て 導 入 し ， コ ン ト ロ ー ル 細 胞 株 と し て 作 成 し た ． 遺 伝 子 導 入 後 の P815 細 胞 は Gentamycin sulfate (50‎ μg/mL)， Hygromycin B (50‎ μg/mL) な ら び に 5-azacytidine‎ (10‎ μM) と 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium を 用 い て 継 代 培 養 し た ． 2-3-4) フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 遺 伝 子 導 入 後 の P815 細 胞 な ら び に C3H/HeN マ ウ ス 脾 臓 細 胞 は ， FACS 染 色 Buffer に 懸 濁 し ，Fc Block 処 理 後 に 各 種 蛍 光 標 識 抗 体 あ る い は 対 応 す る ア イ ソ タ イ プ IgG で 染 色 し た ．ま た ，マ ウ ス 腹 腔 常 在 性 細 胞 も 同 様 に 染 色 後 ，10%中 性 緩 衝 ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液 (pH 7.4) で 固 定 し た ． NK 細 胞 活 性 の 測 定 の 際 に は ， 染 色 後 に 固 定 せ ず フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー に ア プ ラ イ し た ． FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences 社 ) を 用 い て デ ー タ を 回 収 し ，FACSDiva (BD Biosciences 社 ) と FlowJo ソ フ ト ウ ェ ア (Tree Star Inc.) を 用 い て デ ー タ を 解 析 し た ．

mock-P815 細 胞 ， B7-P815 細 胞 は PE 標 識 anti-mouse CD80 (RMMP-1) で 染 色 し ， FACS 解 析 し た ．

T 細 胞 群 の 割 合 を 確 認 す る た め ， マ ウ ス 脾 臓 細 胞 は APC 標 識 anti-mouse CD3e (17A2)，FITC 標 識 anti-mouse CD4 (RM4-5)，PE 標 識 anti-mouse CD8a (53-6.7) で 染 色 し ， FACS 解 析 し た ． NK 細 胞 数 の 変 化 を 確 認 す る た め ， マ ウ ス 脾 臓 細 胞 は PE 標 識 anti-mouse NKp46 (29A1.4) で 染 色 し ， FACS 解 析 し た ． 2-3-5 腫 瘍 移 植 マ ウ ス を 用 い た 腫 瘍 細 胞 増 殖 抑 制 試 験 腫 瘍 接 種 9 日 前 よ り ，DBA/2 マ ウ ス に 自 由 飲 水 の 形 式 で 連 日 500‎μg/mL の CA な ら び に pCA を 経 口 投 与 し た ．継 代 培 養 を 続 け た B7-P815 細 胞 は PBS で 2 回 洗 浄 し ， 細 胞 懸 濁 液 50 μL‎(5‎×‎105

18

2-3-5) MTT 法 に よ る 直 接 的 な 腫 瘍 細 胞 増 殖 抑 制 試 験

EPP な ら び に precursor の B7-P815 肥 満 細 胞 腫 に 対 す る 細 胞 毒 性 は ， 既 報 6 7 )

を 参 考 に 解 析 し た ． 試 験 開 始 2 日 前 ， 継 代 培 養 を 続 け た B7-P815 細 胞 は RPMI 1640 medium で 2 度 洗 浄 し ，Gentamycin sulfate (50‎μg/mL) と 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium 中 に 懸 濁 し ， 引 き 続 き 維 持 培 養 を 続 け た ． 1 × 104 cells/100 μLの B7-P815細 胞 を 96 well 平 底 プ レ ー ト (住 友 ベ ー ク ラ イ ト 株 式 会 社 ) に 播 種 し ， CAな ら び に pCA (0–100‎ μg/mL) で 刺 激 し ， 37°C・ 5% CO2環 境 下 に て 培 養 し た ．24時 間 後 に 上 清 を 除 去 し ，37°Cで 加 温 し た RPMI 1640 mediumで 2 回 洗 浄 後 ，MTT溶 液 (0.5 mg/mL)，Gentamycin sulfate (50‎μg/mL)，非 働 化 FBSを 10% 含 む RPMI 1640 mediumに 培 地 交 換 し ， 37°C・ 5% CO2環 境 下 に て 1時 間 培 養 し た ． 上 清 を 除 去 し ， DMSO 100 μLで 細 胞 を 溶 解 さ せ ， 550 nmに お け る 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (MTP450; コ ロ ナ 電 気 株 式 会 社 ) を 用 い て 測 定 し た ． 無 刺 激 の コ ン ト ロ ー ル 細 胞 が 示 す 吸 光 度 を 100%と し て ， 各 細 胞 増 殖 率 を 縦 軸 に 示 し た ． 2-3-6) マ ウ ス 脾 臓 細 胞 の 調 整 C3H/HeN マ ウ ス に 自 由 飲 水 の 形 式 で 10 日 間 あ る い は 14 日 間 ，500‎μg/mL の CA な ら び に pCA を 経 口 投 与 し た ．マ ウ ス は CO2に よ り 屠 殺 し ，脾 臓 を 摘 出 し た ．RPMI 1640 medium 中 で ス テ ン レ ス メ ッ シ ュ を 用 い て 単 一 細 胞 化 し ，1200 rpm × 5 min，4°C で 遠 心 分 離 し た ． 得 ら れ た 細 胞 は ACK-lysing buffer に よ り 混 在 す る 赤 血 球 を 溶 解 し ，RPMI 1640 medium で 2 回 洗 浄 し た ．NK 細 胞 活 性 を 測 定 す る 際 は ，ACK-lysing buffer の 代 わ り に AC buffer を 使 用 し た ．顕 微 鏡 下 で 細 胞 数 を 計 測 し ，細 胞 濃 度 を 調 整 し ，Gentamycin sulfate (50‎μg/mL) と 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium 中 に 懸 濁 し た ．

2-3-7) マ ウ ス 脾 臓 細 胞 の 培 養 と サ イ ト カ イ ン 測 定

500‎μg/mL の CA な ら び に pCA を 10 日 間 経 口 投 与 し た C3H/HeN マ ウ ス 脾 臓 細 胞 (4 × 106 cells/mL) を 前 述 の 方 法 に よ り 調 整 し ， Gentamycin sulfate (50‎μg/mL) と 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium 中 に 懸 濁 し た ．脾 臓 細 胞 を 96 well 平 底 プ レ ー ト (住 友 ベ ー ク ラ イ ト 株 式 会 社 ) に 播 種 し (250‎μL/well)，生 理 食 塩 水 (コ ン ト ロ ー ル )， あ る い は PMA (20 ng/mL) と ionomycin (1‎μM) で 刺 激 し ， 37°C・ 5% CO2

環 境 下 に て 培 養 し た ． 48 時 間 後 に 1200 rpm × 5 min， 4°C で 遠 心 分 離 後 ， 培 養 上 清 を 回 収 し た ． 細 胞 培 養 上 清 中 の IL-6 濃 度 は OptEIA kit (BD Biosciences 社 ) を 用 い て sandwich ELISA 法 に よ り 測 定 し た ．IFN-γ な ら び に TNF-α 濃 度 は ELISA MAX set (BioLegend 社 ) を 用 い て 測 定 し た ．IL-17A 濃 度 は ELISA Ready-SET-Go! reagent set (eBioscience 社 ) を 用 い て 測 定 し た ．

19 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い た NK 細 胞 活 性 の 測 定 は 既 報 7 1 ) を 参 考 に 行 っ た ． YAC-1 細 胞 は PKH-26 (Sigma 社 ) で 染 色 し ， NK 細 胞 特 異 的 タ ー ゲ ッ ト 細 胞 と し て 用 い た ．500‎μg/mL の CA な ら び に pCA を 14 日 間 経 口 投 与 し た C3H/HeN マ ウ ス 脾 臓 細 胞 を 前 述 の 方 法 に よ り 調 整 し ，Gentamycin sulfate (50‎μg/mL) と 非 働 化 FBS を 10%含 む RPMI 1640 medium 中 に 懸 濁 し た ． 脾 臓 細 胞 (2 or 4 × 106 cells/mL) と PKH-26 標 識 YAC-1 細 胞 (4 × 104 cells/mL) を 24 well 平 底 プ レ ー ト (住 友 ベ ー ク ラ イ ト 株 式 会 社 ) に 播 種 し ， 37°C ・ 5% CO2 環 境 下 に て 共 培 養 し た ． 24 時 間 後 ，

TO-PRO-3 (TP3) (Molecular Probes 社 )を 加 え て 室 温 で 1 時 間 放 置 し ， 死 細 胞 を 染 色 し た ． フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ る 生 細 胞 な ら び に 死 細 胞 の 解 析 は ， 上 述 の 方 法 に よ り 行 っ た ．細 胞 傷 害 性 は PKH-26 陽 性 細 胞 中 の 死 細 胞 の 割 合 と し て %で 示 し た [(タ ー ゲ ッ ト 死 細 胞 /タ ー ゲ ッ ト 死 細 胞 + タ ー ゲ ッ ト 生 細 胞 ) × 100]．YAC-1 の 死 細 胞 は ，PKH-26 標 識 YAC-1 細 胞 の み を 培 養 し た 際 に 得 ら れ る 恒 常 的 な 細 胞 死 (バ ッ ク グ ラ ウ ン ド ) の レ ベ ル で 補 正 し た ． 2-3-9) 抗 酸 化 活 性 測 定 CA な ら び に pCA の 抗 酸 化 活 性 は ， 一 般 的 な 手 法 で あ る DPPH 法 7 2 ) な ら び に ABTS 法 7 3 ) に 基 づ き 評 価 し た ． DPPH 法 : 50%の ethanol に 溶 解 し た 各 試 験 検 体 お よ び 陽 性 コ ン ト ロ ー ル で あ る trolox 20 μL (0–500‎μg/mL) に 対 し て 200 μL の DPPH 150 μmol/L (50% ethanol 溶 液 ) 200 μL を 加 え ，遮 光 し て 室 温 で 30 分 反 応 さ せ た 後 ，517 nm に お け る 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (Safire; TECAN 社 ) を 用 い て 測 定 し た ．

20

ム を 加 え た ．60分 間 室 温 で イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後 ，マ イ ク ロ プ レ ー ト に 移 し ， 700 nmに お け る 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (Safire; TECAN社 ) を 用 い て 測 定 し た ．ま た EPPな ら び に precursor自 身 が 吸 光 度 に 及 ぼ す 影 響 は ，ブ ラ ン ク テ ス ト を 行 い 補 正 し た ．

尿 中 に 排 泄 さ れ た 単 量 体 CA の 検 出 は liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS) を 用 い て ， 既 報 7 5 ) を 参 考 に 実 行 し た ． 尿 検 体 は 必 要 に 応 じ て 希 釈 し ， HPLC シ ス テ ム (Waters Alliance 2695 separations module; Waters 社 ) と 28ºC に 維 持 し た Inertsil ODS-3 column (150‎mm‎×‎1.5‎mm‎id,‎5‎μm) (ジ ー エ ル サ イ エ ン ス 株 式 会 社 ) を 用 い て 解 析 し た ． 10‎ μL の 尿 検 体 な ら び に CA 標 準 品 (0.5‎ μg/mL) を オ ー ト サ ン プ ラ ー よ り イ ン ジ ェ ク シ ョ ン し ， 流 速 0.1 mL/min に て 0.1%の 蟻 酸 存 在 下 acetonitrile 10–40%の グ ラ ジ エ ン ト 条 件 (60 分 間 ) で 溶 出 し た ．カ ラ ム 溶 出 液 は ESI 法 を 用 い て イ オ ン 化 し ， ネ ガ テ ィ ブ イ オ ン 化 モ ー ド に 設 定 し た Micromass LCT time-of-flight mass spectrometer (Micromass 社 ) を 用 い て 観 測 し た ．ま た チ ュ ー ニ ン グ に は Leucine-Enkephalin 標 準 品 を 用 い た ． デ ー タ は MassLynx software program version 4.0 (Micromass 社 ) を 用 い て m/z 50 か ら 1000 ま で を ス キ ャ ン し ，m/z 179.035 (CA = m/z: 179.0345) に 設 定 し て タ ー ゲ ッ ト イ オ ン を モ ニ タ ー し た ．

2-4) 動 物 倫 理

本 研 究 の 動 物 実 験 プ ロ ト コ ー ル は 東 京 薬 科 大 学 動 物 実 験 委 員 会 の 承 認 を 受 け (P11-49， P12-42， P13-45， P13-46)， す べ て の 動 物 実 験 は 「 東 京 薬 科 大 学 動 物 実 験 規 程 」 に 則 り 行 わ れ た ． ま た ，す べ て の 動 物 は Specific pathogen free (SPF) 環 境 下 で 飼 育 し ， 4–10 週 齢 で 実 験 に 使 用 し た ．

2-5) 有 意 差 検 定

21

第 一 章 酵 素 重 合 ポ リ フ ェ ノ ー ル (enzymatically polymerized polyphenols : EPP) の 免 疫 調 整 効 果 と T 細 胞 へ の 影 響

リ グ ニ ン 類 は 特 殊 な 機 能 性 食 品 に 限 ら ず ， 一 般 的 に 流 通 し て い る 食 品 に も 含 有 さ れ て お り 5 1 )_{，我 々 の 生 活 に お い て 日 常 的 に 食 事 と し て 体 内 に 取 り 込 ま れ て い る ．}

こ れ ま で の 研 究 で リ グ ニ ン に よ る 抗 ウ イ ル ス 効 果 が 報 告 さ れ て お り 6 5 )_{， ウ イ ル ス}

感 染 に 対 す る 機 能 性 分 子 と し て リ グ ニ ン は 認 識 さ れ て い た ． 合 成 リ グ ニ ン 類 に よ る 抗 HIV 効 果 は ， HIV と 感 染 タ ー ゲ ッ ト 細 胞 と の 結 合 を 抑 制 す る 効 果 と ， HIV プ ロ テ ア ー ゼ の 阻 害 効 果 と の 2 種 類 の 作 用 機 序 に よ っ て 成 り 立 っ て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 6 4 , 7 6 ) ． HIV は 主 に CD4 を 高 発 現 し て い る ヘ ル パ ー T 細 胞 に 感 染 す る こ と が 知 ら れ て お り 7 7 ) ， リ グ ニ ン 類 に は T 細 胞 を は じ め と す る 免 疫 担 当 細 胞 に 対 し て 何 ら か の 干 渉 作 用 が あ る こ と が 予 想 さ れ る ．ま た ，Kurakata ら に よ っ て リ グ ニ ン 類 に よ る マ ウ ス リ ン パ 球 に 対 す る DNA 合 成 促 進 活 性 が 報 告 さ れ て い る が ，そ の 中 で モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と ウ サ ギ 補 体 を 用 い て T 細 胞 群 を 破 壊 す る こ と で ， リ グ ニ ン 類 の 白 血 球 の DNA 合 成 促 進 活 性 が 減 少 す る と い う 実 験 結 果 が 示 さ れ て い る 6 2 )_． こ れ ら の 報 告 は ， リ グ ニ ン 類 が T 細 胞 に 何 ら か の 影 響 を 与 え て い る 可 能 性 を 強 く 示 唆 し て い る ． し か し な が ら ， 現 在 に 至 る ま で リ グ ニ ン 類 の 免 疫 系 へ の 作 用 に つ い て は ほ と ん ど 解 明 さ れ て い な い ． ま た 少 数 報 告 が あ る に も か か わ ら ず 7 8 , 7 9 )_{， そ} の ほ と ん ど が 純 粋 な リ グ ニ ン 類 に よ る も の で は な く ， リ グ ニ ン 多 糖 複 合 体 お よ び 天 然 リ グ ニ ン を 用 い た 研 究 で あ り ， い ず れ も 活 性 中 心 を 断 定 す る こ と は 困 難 で あ る ．

22 第 一 節 マ ウ ス 白 血 球 に 対 す る EPP の 影 響 食 品 に 含 ま れ る 機 能 性 分 子 は ， 腸 管 粘 膜 に 存 在 す る 様 々 な 免 疫 担 当 細 胞 と 接 触 す る ． 免 疫 調 整 作 用 を 持 つ 様 々 な 機 能 性 食 品 は ， 経 口 摂 取 に よ る 疾 病 の 予 防 な ら び に 治 療 へ の 効 果 を 期 待 し て 積 極 的 に 利 用 さ れ て い る ． 例 え ば ， 免 疫 賦 活 作 用 を 持 つ 高 分 子 多 糖 類 で あ る 1,3-/1,6-β-glucan は ，経 口 摂 取 に よ り 全 身 性 の NK 細 胞 活 性 を 上 昇 さ せ る 効 果 を 示 す こ と で 知 ら れ て お り 4 2 )_{，こ れ ら の β-glucan は in vitro に} お い て も 免 疫 担 当 細 胞 を 活 性 化 し ， 様 々 な サ イ ト カ イ ン 産 生 を 誘 導 す る こ と で ， NK 細 胞 活 性 化 を 含 め た 免 疫 賦 活 効 果 を 示 す 4 1 )． 一 方 ， 積 極 的 な in vitro 研 究 に よ っ て ， 多 く の 低 分 子 ポ リ フ ェ ノ ー ル 類 ， と り わ け EGCG，な ら び に curcumin に は ，MAPKs お よ び NF-κB に 対 す る 強 力 な 活 性 化 抑 制 作 用 が あ る こ と が 報 告 さ れ ， 多 く の 研 究 者 が そ の 考 え 方 を 支 持 し て い る 2 3 , 8 0 )_． こ れ ら の 特 徴 は ， 経 口 摂 取 に よ る 効 果 発 現 に 応 用 さ れ て お り ， 食 事 な ら び に サ プ リ メ ン ト に よ る こ れ ら の 機 能 性 分 子 の 取 り 込 み に よ っ て ， 炎 症 性 疾 患 の 抑 制 効 果 が 期 待 さ れ る 8 0 ) ． 免 疫 調 節 作 用 を 持 つ 多 く の 機 能 性 分 子 に お い て ，in vitro 研 究 で 得 ら れ た 特 徴 と ， in vivo 研 究 で 得 ら れ る 結 果 に 関 連 性 を 示 す ケ ー ス が 認 め ら れ る ．そ こ で 本 節 で は ， リ グ ニ ン 様 EPP が 十 分 な 免 疫 調 整 作 用 を 持 つ 機 能 性 分 子 と な り 得 る か ど う か ， 純 度 評 価 お よ び 正 常 白 血 球 へ の 細 胞 毒 性 の 有 無 を 検 討 し た 後 ， in vitro 刺 激 に よ っ て 誘 導 さ れ る サ イ ト カ イ ン 産 生 量 を 指 標 と し て マ ウ ス 脾 臓 由 来 白 血 球 に 対 す る 免 疫 学 的 活 性 を 評 価 し た ． 1. EPP の 脾 臓 細 胞 に 対 す る 毒 性 評 価

EPP は ，precursor と し て CA，FA，あ る い は CoA を 用 い て ，H2O2の 存 在 下 ，HRP

23 の 混 入 が ほ と ん ど な い こ と が 確 認 さ れ た ． さ ら に ， リ ム ル ス C 因 子 応 答 性 を 利 用 し て 測 定 し た エ ン ド ト キ シ ン 含 量 は ，3 種 類 の EPP 間 で 差 が 見 ら れ た も の の ，い ず れ の EPP に お い て も 極 め て 微 量 で あ っ た ． グ ラ ム 陰 性 菌 細 胞 壁 を 構 成 す る エ ン ド ト キ シ ン は ， し ば し ば 天 然 物 中 に 混 在 し ， 動 物 細 胞 を 用 い た 生 物 学 的 活 性 評 価 の 際 に ， 抗 原 提 示 細 胞 に 発 現 す る TLR4/MD2 を 介 し て 細 胞 を 活 性 化 さ せ ， 様 々 な サ イ ト カ イ ン 産 生 を 誘 導 す る 8 2 ) ． EPP 中 の エ ン ド ト キ シ ン 含 量 が 極 め て 低 値 で あ っ た こ と か ら ，作 製 し た 3 種 類 の EPP が in vitro に お け る 免 疫 評 価 実 験 に 適 し た リ グ ニ ン ポ リ マ ー で あ る こ と が 確 認 さ れ た ．

24

Figure 3. The structure of precursors and the proposed major structure of EPPs.

R can be either H or OH.

Table 1. Yield, elemental analysis, and endotoxin content of samples.

Elemental analysis (%) Endotoxin Yield (%) Carbon Hydrogen Nitrogen (pg/mg)

CA - 59.91 4.59 0.01 - FA - 61.80 5.20 0.01 - CoA - 65.91 4.91 0.01 - pCA 40.0 46.45 4.15 0.02 231.5 pFA 35.2 53.75 5.01 0.00 93.7 pCoA 40.0 57.62 4.67 0.00 N.D. - ; not done N.D. ; not detected

26

Figure 4. Effect of various polyphenols on cell viability in murine splenocytes.

27 2. EPP の 脾 臓 細 胞 に お け る サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 EPP の 免 疫 学 的 活 性 に つ い て ，C57BL/6 マ ウ ス 由 来 脾 臓 細 胞 か ら 誘 導 さ れ る 種 々 の サ イ ト カ イ ン 産 生 量 を 指 標 と し て 評 価 し た ． ま た ， precursor で あ る フ ェ ニ ル プ ロ パ ノ イ ド 類 を ， 比 較 対 象 と し て 用 い た ． 脾 臓 白 血 球 は EPP お よ び そ の precursor と 共 に 48 時 間 培 養 し た 後 ， 遠 心 分 離 後 に 上 清 を 回 収 し た ． 評 価 項 目 と し て ， 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る IL-1β な ら び に IL-6，ヘ ル パ ー T 細 胞 の 分 化 に 関 与 す る IL-4 お よ び IFN-γ，さ ら に 抗 原 提 示 細 胞 の 活 性 化 に 関 与 す る GM-CSF を 選 択 し ，そ れ ぞ れ ELISA 法 に て 定 量 し た ．

Precursor で あ る CA， FA， CoA は 脾 臓 細 胞 か ら の サ イ ト カ イ ン 産 生 を 誘 導 し な か っ た が ， 各 々 が 酵 素 重 合 し た EPP は 添 加 濃 度 依 存 的 に IL-1β， IL-6， IFN-γ な ら び に GM-CSF 産 生 を 誘 導 し た (Figure 5)．こ の 傾 向 は 脾 臓 細 胞 増 殖 促 進 作 用 の 場 合 と 類 似 し て お り ， 免 疫 担 当 細 胞 か ら の サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 が 発 揮 さ れ る た め に は ， フ ェ ニ ル プ ロ パ ノ イ ド 類 の 高 分 子 化 が 重 要 で あ る と 考 え ら れ る ． ま た ， IFN-γ， GM-CSF の 産 生 は 高 度 に 誘 導 さ れ た が ， IL-1β お よ び IL-6 の 産 生 は 低 か っ た ．

28

Figure 5. Effect of various polyphenols on cytokine production in murine splenocytes.

29 第 二 節 EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 作 用 に お け る T 細 胞 の 関 与 前 節 の 検 討 に よ り ，3 種 類 の EPP が 脾 臓 細 胞 活 性 化 作 用 を 有 し ，GM-CSF お よ び IFN-γ の 産 生 を 強 く 誘 導 す る こ と が 明 ら か と な っ た ．し か し ，脾 臓 に は 様 々 な 免 疫 担 当 細 胞 が 存 在 し て お り ，EPP が 作 用 し た 細 胞 種 ，な ら び に そ の メ カ ニ ズ ム に つ い て は 不 明 で あ る ． 免 疫 賦 活 作 用 を 持 つ 機 能 性 分 子 は 多 数 存 在 し ， サ イ ト カ イ ン の 産 生 誘 導 メ カ ニ ズ ム も 様 々 で あ る ． 例 え ば ， 前 述 し た エ ン ド ト キ シ ン は ， マ ク ロ フ ァ ー ジ な ど の 抗 原 提 示 細 胞 を TLR4 シ グ ナ ル 経 由 で 活 性 化 さ せ ， IL-6 な ら び に TNF-α な ど の サ イ ト カ イ ン 産 生 を 促 す 8 3 )． ま た ， エ ン ド ト キ シ ン は 古 く か ら B 細 胞 マ イ ト ジ ェ ン と し て も 知 ら れ て お り ， B 細 胞 表 面 に 存 在 す る TLR4/MD-2 な ら び に RP105/MD-1 複 合 体 を 介 し て ，B 細 胞 分 裂 を 誘 導 す る 8 4 )_{．ま た ，免 疫 担 当 細 胞 の}

30 1. EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 作 用 と T 細 胞 群 の 影 響 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 に は 様 々 な 細 胞 種 が 混 在 し て い る が ， 著 者 は ま ず ， 脾 臓 細 胞 に お け る EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 と T 細 胞 群 の 関 係 に つ い て 明 ら か に す る た め ， マ ウ ス 脾 臓 細 胞 か ら T 細 胞 を 除 去 し ， EPP に よ り 誘 導 さ れ る IFN-γ お よ び GM-CSF の 産 生 量 を 指 標 に 検 討 し た ．

31

Figure 6. Contribution of T cell population to the EPP-induced cytokine production from murine splenocytes.

32 2. EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 作 用 に お け る CD4 の 関 与 EPP に よ る マ ウ ス 脾 臓 細 胞 か ら の サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 に CD3e 陽 性 細 胞 が 密 接 に 関 係 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た が ， CD3e は ヘ ル パ ー T 細 胞 お よ び CTL の い ず れ の T 細 胞 種 に も 高 度 に 発 現 し て い る 9 1 ) ．リ グ ニ ン 類 に よ る 抗 HIV 効 果 が 多 数 報 告 さ れ て い る こ と ， HIV の 主 要 な タ ー ゲ ッ ト 細 胞 が CD4 陽 性 T 細 胞 で あ る こ と か ら 7 7 ) ， EPP の マ ウ ス 脾 臓 細 胞 か ら の サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 に ， と り わ け ヘ ル パ ー T 細 胞 が 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性 が 予 想 さ れ た ．そ こ で 著 者 は T 細 胞 表 面 上 の 主 要 な 受 容 体 で あ る CD4 な ら び に CD8 に 着 目 し ，こ れ ら の 受 容 体 が EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 能 に ど の よ う な 影 響 を 及 ぼ し て い る か 確 認 す る た め ， そ れ ぞ れ の 受 容 体 に 対 す る 中 和 抗 体 を 用 い て 解 析 し た ．

C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 を anti-CD4 mAb，ま た は anti-CD8a mAb で 処 理 し ，EPP に よ り 脾 臓 細 胞 か ら 誘 導 さ れ る IFN-γ な ら び に GM-CSF の 産 生 量 を ELISA 法 に て 測 定 し た ． ま た コ ン ト ロ ー ル と し て ， そ れ ぞ れ の 中 和 抗 体 に 対 応 す る ア イ ソ タ イ プ IgG を 添 加 し ， 抗 体 の 特 異 的 な 作 用 に つ い て 観 察 し た ．

33

Figure 7. Involvement of CD4 in cytokine production induced by EPP from splenocytes.

34 3. EPP と CD4 分 子 の 相 互 作 用

35

Figure 8. Binding capacity of the EPPs to CD4 molecules.

36

ELISA プ レ ー ト 上 で の 結 果 を 踏 ま え て ， 正 常 細 胞 表 面 に 発 現 す る CD4 受 容 体 に 対 す る EPP の 影 響 に 着 目 し た ．C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 を 3 種 類 の EPP で 処 理 し ， 洗 浄 後 に APC 標 識 anti-CD4 mAb と 脾 臓 細 胞 と の 結 合 性 を FACS に よ り 解 析 し ，細 胞 表 面 上 で の EPP の 作 用 に つ い て 検 討 し た ． ま た ， EPP と 細 胞 膜 上 CD4 と の 結 合 の 特 異 性 を 評 価 す る た め ， 比 較 対 象 と し て PE 標 識 anti-CD3e mAb な ら び に FITC 標 識 anti-CD8a mAb， さ ら に 重 合 前 の precursor を 用 い て 実 験 を 行 っ た ．

37

Figure 9. The competitive binding of polyphenols and anti -CD4 antibody to cell-surface CD4.

38 第 一 章 考 察

40 第 二 章 EPP の 免 疫 賦 活 活 性 に お け る 異 種 細 胞 間 相 互 作 用 の 影 響 リ グ ニ ン 類 を 免 疫 賦 活 性 機 能 性 分 子 と し て 安 全 に 食 品 応 用 す る た め に は ， EPP の 免 疫 賦 活 メ カ ニ ズ ム を さ ら に 明 確 に す る 必 要 が あ る ． 前 章 で は ， MACS に よ る CD3e 陽 性 細 胞 の 除 去 に よ り サ イ ト カ イ ン 産 生 量 が 減 少 し た が ，完 全 に は 抑 制 さ れ な か っ た ．従 っ て ，EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 が ，T 細 胞 依 存 性 の 経 路 な ら び に 非 依 存 性 の 経 路 に よ る 制 御 を 受 け て い た 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ． ま た ， EPP が CD4 へ の 結 合 能 を 有 す る こ と ， EPP の 免 疫 賦 活 作 用 に お い て CD4 分 子 が 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と を 明 ら か に し た ．し か し ，CD4 は 抗 原 提 示 細 胞 膜 上 の MHC-classII と 結 合 し ，抗 原 提 示 細 胞 か ら ヘ ル パ ー T 細 胞 へ の 情 報 伝 達 に 関 わ る 補 助 受 容 体 と し て 知 ら れ て い る た め 1 0 9 )

41 第 一 節 種 々 の 白 血 球 に 対 す る EPP の 影 響 本 節 で は ， EPP の サ イ ト カ イ ン 産 生 誘 導 作 用 に お け る T 細 胞 依 存 性 経 路 ， な ら び に 非 依 存 性 経 路 に つ い て 解 析 す る た め ，(i) 脾 臓 に 存 在 す る CD4 陽 性 細 胞 を 精 製 後 ，EPP が 直 接 T 細 胞 に 与 え る 影 響 に つ い て 検 討 し ，(ii) 腹 腔 内 ，胸 腺 ，骨 髄 な ど 種 々 の 組 織 に 由 来 す る 白 血 球 の EPP 応 答 性 に つ い て 比 較 を 行 い ， (iii) さ ら に 機 能 性 T 細 胞 お よ び B 細 胞 が 欠 損 し た C.B-17/Icr-scid/scid (SCID) マ ウ ス の 脾 臓 細 胞 と 正 常 マ ウ ス の 脾 臓 細 胞 を 用 い て ， EPP に 対 す る 免 疫 応 答 性 を 比 較 検 討 し た 1. CD4 陽 性 ， CD8 陽 性 T 細 胞 に 対 す る EPP の 影 響 EPP の T 細 胞 に 対 す る 直 接 的 な 作 用 に つ い て 解 析 す る た め ， マ ウ ス 脾 臓 細 胞 か ら T 細 胞 群 を 精 製 し ， EPP に よ っ て 誘 導 さ れ る サ イ ト カ イ ン 濃 度 を 指 標 に 検 討 し た ． C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 か ら ，CD4 陽 性 T 細 胞 あ る い は CD8 陽 性 T 細 胞 を MACS に よ り 精 製 し ， 3 種 類 の EPP で 刺 激 し た 後 に 産 生 さ れ る IFN-γ， GM-CSF な ら び に TNF-α の 産 生 量 を ELISA に よ り 測 定 し た ．MACS 処 理 前 の 脾 臓 細 胞 ，な ら び に CD8 陽 性 T 細 胞 は ，CD4 陽 性 T 細 胞 と の 比 較 対 象 と し て 実 験 に 用 い た ．FACS 解 析 に よ り ，MACS 処 理 前 の 脾 臓 細 胞 中 の CD4 陽 性 T 細 胞 群 ,CD8 陽 性 T 細 胞 群 の 割 合 が そ れ ぞ れ 26.9%， 17.1%で あ っ た の に 対 し ， MACS 処 理 後 の CD4 陽 性 T 細 胞 群 ,CD8 陽 性 T 細 胞 群 の 割 合 は そ れ ぞ れ 90%以 上 で あ る こ と を 確 認 し た ．

42

Figure 10. Effects of EPPs on purified CD4+ or CD8+ T cells isolated from splenocytes.

44

Figure 11. Different reactivity of leukocytes derived from various organs of C57BL/6 mice to EPPs on cytokine production.

45 3. SCID マ ウ ス 由 来 脾 臓 細 胞 に 対 す る EPP の 影 響 C.B-17 系 統 マ ウ ス で 発 見 さ れ た SCID マ ウ ス は ， DNA 修 復 機 構 の 欠 損 に よ り 機 能 性 T 細 胞 お よ び B 細 胞 が 欠 損 し て お り ， 重 度 の 免 疫 不 全 状 態 に 陥 る 11 2 , 11 3 )_{． 主} に 移 植 研 究 の た め に 利 用 さ れ て き た が ， T 細 胞 お よ び B 細 胞 が 存 在 し な い こ と か ら ， 獲 得 免 疫 系 が 発 展 し な い た め ， 異 種 組 織 ・ 異 種 細 胞 に 対 す る 強 い 拒 絶 を 示 さ な い ．一 方 で ，NK 細 胞 お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ な ど の 自 然 免 疫 系 に 関 わ る 機 能 は 正 常 に 残 さ れ て い る こ と が 知 ら れ て い る 11 4 - 11 7 ) ．EPP に よ る 免 疫 調 節 作 用 に ，マ ク ロ フ ァ ー ジ あ る い は B 細 胞 が 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た た め ， 著 者 は 続 い て ，B 細 胞 の 欠 損 し た SCID マ ウ ス を 用 い て ，EPP の 免 疫 賦 活 作 用 の 評 価 を 試 み た ．

SCID マ ウ ス 由 来 脾 臓 細 胞 を 3 種 類 の EPP で 刺 激 し ，上 清 中 に 放 出 さ れ る IFN-γ， GM-CSF， な ら び に TNF-α 量 を ELISA 法 に て 測 定 し た ． Pam3CSK4 は 陽 性 コ ン ト ロ ー ル と し て ， ま た C57BL/6 マ ウ ス 脾 臓 細 胞 は 各 サ イ ト カ イ ン の 産 生 レ ベ ル 比 較 の た め ， 実 験 に 使 用 し た ．

46

Figure 12. Cytokine induction by EPPs from C.B-17 SCID mice-derived splenocytes.