氏 名 Fei WEI
学 位 （専 攻 分 野） 博士（理学）
学 位 記 番 号 総研大甲第 1730 号
学位授与の日付 平成２６年９月２９日
学位授与の要件 生命科学研究科 生理科学専攻
学位規則第６条第１項該当
学 位 論 文 題 目 The Chinese herb, Danshen (Radix Salviae Miltiorrhizae), induces salivary fluid secretion
論 文 審 査 委 員 主 査 教授 富永 真琴 教授 箕越 靖彦 教授 吉村 由美子 教授 村上 政隆
教授 杉谷 博士 日本大学
(Separate Form 2)
論 文 内 容 の 要 旨
Summary of thesis contents
[INTRODUCTION] Xerostomia is mainly caused by salivary gland hypofunction.
The incidence of salivary gland hypofunction in the population over 65 years old is 30-40%. However, the common current treatments for salivary gland hypofunction by parasympathomimetic drugs are accompanied by systemic side effects . Danshen has been clinically used to relieve dry mouth in Chinese medicine. However, only a few reports addressed the direct effect of Danshen on the salivary glands . Murakami et al.
(2009), examined 20 Chinese herbs, focusing on their capability to promote salivary fluid secretion in the submandibular glands of rats. The results of that study showed that Danshen not only promotes during muscarinic stimulation with carb amylcholine, but it also induces salivary fluid secretion without the addition of any other
stimulants.
[PURPOSE] In this study, Danshen was chosen as a candidate for the relief of xerostomia, and the capability of Danshen to induce salivary fluid secreti on and its mechanism were examined.
[METHODS] The submandibular gland was isolated from the rat and vascularly
perfused, and also acinar cells were isolated to measure the Ca2+ influx. The excretory duct was cannulated and the secreted volume was measured by electronic balance.
Arterio-venous difference of partial oxygen pressure was measured as an indicator of oxygen consumption. Arterio-venous pressure difference was also measured as
indicator of increase in microcirculation.
[RESULTS & DISCUSSION] Although Danshen induced salivary fluid secretion in the submandibular glands, the time course of that secretion differed from fluid
secretion induced by carbamylcholine. There was a latency associated with the fluid secretion induced by Danshen, followed by gradual increase in the secretion until it reached its highest value, and thereafter there was a slow decline to a near zero level.
These characteristics suggested that the mechanism for Danshen -induced salivary fluid secretion could be different from that induced by carbamylcholine.
Carbamylcholine activates the M3 receptor to release IP3 and quickly releases Ca2+
from the intracellular calcium stores. The elevation of intracellular Ca2+ level induces chloride release and quick osmosis, resulting in an ons et of fluid secretion.
Furthermore, the 1 adrenergic and neurokinin A receptors use the same signalling
(Separate Form 2)
sequence after binding the individual receptors. Therefore, IP3-store Ca2+ release signalling may not be involved in secretion induced by Danshen, but rather, there may be a distinct signalling process. During Danshen stimulation, the additional
application of either ouabain (inhibitor of Na+/K+ ATPase) or bumetanide (inhibitor of NKCC1), inhibited the oxygen consumption and suppressed the fluid secretio n by more than 90%. These results indicated that Danshen activates Na+/K+ ATPase and NKCC1 to maintain Cl- release and K+ release for fluid secretion. Next, we examined the involvement of the main membrane receptors, M3 muscarinic and 1 adrenergic receptors. Neither atropine nor phentolamine inhibited the fluid secretion induced by Danshen. Accordingly, Danshen does not bind with M3 nor 1 receptors. An increase in [Ca2+ ]i is essential for the activation of the luminal Cl- and basolateral K+ channels.
The nominal removal of extracellular Ca2+ and chelating of intracellular Ca2+ by BAPTA-AM totally abolished the fluid secretion induced by Danshen, suggesting the involvement of Ca2+ in the activation of these channels. However the fluorescent Ca2+
indicators could not show the changes in the [Ca2+] i due to the dark color of Danshen and its extract, Salvianolic acid B. The quick drop seen in the arterio-venous pressure difference suggests an increase in the microcirculation due to Danshen. However, the paracellular fluid secretion indicated by the fluorescent dye was smaller than that induced by carbamylcholine, suggesting that the transcellular fluid secretion was dominant in the whole fluid secretion during Danshen stimulation.
[CONCLUSION] The present findings support the use of Danshen in the treatment of xerostomia, and we consider that Danshen is a promising secretagogue which could avoid the systemic side effects induced by the recent muscarinic drugs such as
cevimeline, pilocarpine and so on.
(Separate Form 3)
博 士 論 文 の 審 査 結 果 の 要 旨
Summary of the results of the doctoral thesis screening
本 論 文 は 、漢 方 薬 丹 参 (Radix Salviae miltiorrhizae)が 、唾 液 腺 を 刺 激 し て 大 量 の 唾 液 を 分 泌 す る こ と 、丹 参 刺 激 は ム ス カ リ ンM3受 容 体 、ア ド レ ナ リ ン1受 容 体 を 介 さ ず に 既 知 の 唾 液 分 泌 機 構 を 活 性 化 し て 水 分 分 泌 を 誘 発 す る こ と を 明 ら か に し た 。 従 来 副 作 用 の 多 か っ た ム ス カ リ ン 受 容 体 刺 激 剤 に 代 る 新 し い 治 療 薬 と し て の 可 能 性 が あ る 。
唾 液 分 泌 は 支 配 す る 神 経 の 活 動 に よ り 誘 発 さ れ る 。 臨 床 的 に ド ラ イ マ ウ ス の 治 療 に 用 い ら れ て い る20種 類 の 漢 方 薬 に つ い て 直 接 唾 液 腺 の 唾 液 分 泌 に 増 強 効 果 が あ る か ど う か を 生 理 研 と 南 京 医 科 大 学 の 共 同 で ス ク リ ー ニ ン グ し た 結 果 、15種 類 が 、carbamylcholine (CCh) 誘 発 の 唾 液 分 泌 を 増 強 し た 。 出 願 者 は 、 こ の 中 か ら 丹 参 (Danshen、DS)が 単 独 投 与 で 唾 液 分 泌 を 誘 発 す る こ と を 見 い だ し 、 そ の 分 泌 機 序 を 明 ら か に す る 実 験 計 画 を 実 施 し た 。 顕 微 鏡 下 で 雄 性 ラ ッ ト か ら 顎 下 腺 を 摘 出 し 、 動 脈 か ら 灌 流 液 を 一 定 流 量 で 灌 流 し た 。 導 管 に 挿 入 し た チ ュ ー ブ の 尖 端 を 電 子 天 秤 上 の カ ッ プ に 導 き 、 唾 液 の 累 積 重 量 を 測 定 し た 。CChは 急 速 に 分 泌 を 誘 発 し て1分 以 内 に ピ ー ク を 示 し 、一 旦 、低 下 し た 後 に 再 び 増 加 し て プ ラ ト ー 値 と な る 。DSは 投 与 後 数 分 間 、分 泌 が 誘 発 さ れ な い 潜 時 を 示 し た 。し か し 、分 泌 が 誘 発 さ れ る と 増 加 し て20分 後 に 最 大 分 泌 速 度 を 示 し 、そ の 後 、40分 か け て 低 下 し た 。こ れ は 、DSが IP3依 存Ca2+ storeか ら のCa2+放 出 を 起 こ さ な い 可 能 性 を 示 し た 。こ れ を 発 端 にDSが ど の 作 用 点 に 働 き 、 最 終 的 な 水 分 分 泌 を も た ら す か を 系 統 的 に 検 討 し た 。
唾 液 水 分 分 泌 経 路 に は 唾 液 腺 細 胞 を 通 過 す る 経 細 胞 経 路 と 唾 液 腺 細 胞 間 隙 を 用 い る 傍 細 胞 経 路 が あ る 。CChに よ る 分 泌 刺 激 開 始 時 の 最 初 の ピ ー ク は 経 細 胞 輸 送 に よ る も の で 、 続 い て 増 加 す る 水 分 分 泌 の2/3は 傍 細 胞 輸 送 に よ る も の と 推 定 さ れ る 。傍 細 胞 輸 送 の 駆 動 力 は 主 と し てmicrocirculationの 静 水 圧 に よ る 。 動 静 脈 灌 流 系 に 三 方 活 栓 を 置 い て 動 静 脈 静 水 圧 差 を 測 定 し た 。DS投 与 直 後 に 静 水 圧 差 は 急 速 に 低 下 し 、microcirculationに 灌 流 液 が 流 入 す る こ と が 示 さ れ た 。 細 胞 内 に 進 入 し な い 蛍 光 色 素Lucifer Yellow (LY)を 灌 流 液 に 加 え 、DS に よ るLY分 泌 を 測 定 し た 。DSに よ るLY分 泌 はCCh刺 激 に 比 べ て 低 値 で あ り 、 大 量 の 水 分 分 泌 増 加 は 傍 細 胞 輸 送 で は 説 明 で き な い た め 、DSは 主 に 経 細 胞 分 泌 を 誘 発 す る と 結 論 づ け た 。
ム ス カ リ ンM3受 容 体 と ア ド レ ナ リ ン1受 容 体 は 唾 液 腺 水 分 分 泌 の た め の 基 本 受 容 体 で あ る 。 阻 害 剤 の 投 与 実 験 を 行 う と 、DSに よ る 分 泌 は ム ス カ リ ンM3受 容 体 、 ア ド レ ナ リ ン
1受 容 体 い ず れ を 阻 害 し て も 抑 制 さ れ ず 、 こ れ ら の 受 容 体 の 関 与 は 否 定 さ れ た 。 経 細 胞 水 分 分 泌 は 、 管 腔 側 膜 のCa2+依 存 性Cl-チ ャ ネ ル に よ っ てCl-が 流 出 し 、 こ れ にNa+イ オ ン が 電 気 的 に 追 随 し て 浸 透 圧 勾 配 が 生 じ る こ と に よ っ て 細 胞 か ら 水 がaquaporin5を 通 過 し て 流 出 す る こ と に よ っ て お こ る と 考 え ら れ て い る 。DS刺 激 中 にNKCC1及 びNa+/K+ ATPaseの 阻 害 剤 のbumetanide及 びouabainを 投 与 し てCl-流 出 を 示 す 水 分 泌 、エ ネ ル ギ ー 代 謝 の 活 性 化 を 示 す 酸 素 消 費 を 測 定 し 、NKCC1及 びNa+/K+ ATPaseが 通 常 の ム ス カ リ ン 受 容 体 刺 激 同 様 にDS 刺 激 で も 大 き く 関 与 し て い る こ と が 示 さ れ た 。
こ う し た 結 果 か ら 出 願 者 は 、DSは 未 知 の 経 路 に よ り 細 胞 内Ca2+濃 度 を 上 昇 さ せ 、こ れ に よ りCa2+活 性 化Cl-チ ャ ネ ル が 活 性 化 し 、 水 分 分 泌 を 起 こ す と 考 え た 。 灌 流 液Ca2+除 去 、 BAPTA-AM に よ る 細 胞 内Ca2+キ レ ー ト に よ りDSに よ る 分 泌 は 誘 発 さ れ ず 、 細 胞 内 外Ca2+
の 必 要 性 が 示 さ れ た 。 次 に 、 単 離 し た 顎 下 腺 細 胞 を 用 い て 細 胞 内Ca2+の 測 定 を 試 み た 。 予 備 実 験 でDSはCa2+指 示 薬 の 蛍 光 を マ ス ク しCa2+濃 度 測 定 は 不 調 に 終 わ っ た の で 、 刺 激 に は DSの 抽 出 物 Salvianolic Acidを 用 い た 。し か し 、同 様 にCa2+指 示 薬 の 蛍 光 を マ ス ク し た た め 、 Ca2+指 示 薬 に よ る 細 胞 内Ca2+濃 度 は 確 認 で き な か っ た 。
以 上 の よ う に 、 出 願 者 は 漢 方 薬 丹 参 の 唾 液 腺 に よ る 分 泌 誘 発 現 象 を 、 水 分 分 泌 、 酸 素 消 費 、 傍 細 胞 輸 送 、microcirculationな ど 種 々 の 臓 器 機 能 を 経 時 的 に 測 定 す る こ と に よ っ て 初 め て 客 観 的 な 記 述 を 行 っ た 。 本 研 究 は 、 漢 方 薬 等 客 観 的 記 載 の な い 薬 物 機 能 に つ い て 、 系
(Separate Form 3)
統 的 に 臓 器 生 理 機 能 を 測 定 し て そ の 機 構 を 議 論 し た 優 れ た 研 究 で あ り 、 臓 器 生 理 学 と し て の 方 法 論 を 含 め 、 今 後 の 当 該 分 野 の 発 展 に 資 す る も の と 考 え ら れ る 。 従 っ て 、 本 論 文 は 学 位 論 文 と し て 十 分 な 内 容 を 有 し て い る も の と 審 査 委 員 会 に お い て 全 会 一 致 で 判 定 さ れ た 。
