コイ Cyprinus carpio カテプシン S 遺伝子のクローニング

43 Mem.  Institute of Advanced Technology,  Kinki  University   No. 10 : 43 〜 52（2005）

コイ Cyprinus carpio カテプシン S 遺伝子のクローニング

常 本 和 伸、長 富   潔、原   研 治

要  約

魚類カテプシン L は比活性の高い single-chain form で存在している事が知られており、海洋生物由来遺 伝子資源として食肉への応用も十分に可能であると思われる。しかしながら、今まで単離精製されてきた 魚類カテプシン L がアイソフォームである可能性は否定できない。そこで本研究ではコイカテプシン L 様 酵素の遺伝子クローニングを試みた。RT-PCR の結果、約半数のクローンはコイカテプシン L であり、そ の他のクローンはカテプシン S 様酵素であった。このことにより、コイカテプシン L にアイソフォームは 存在せず、比活性の高い状態で存在していることがわかった。以上のことにより食肉への添加などによる 熟成度の向上、新規機能性ペプチド産生などの効果が期待できるものと考えられる。

緒  言

細胞内の異物・老廃物の分解の大部分はリソゾームで行われている。タンパク質分解においても、細胞 構成及び外来由来のタンパク質分解にはリソゾームのプロテアーゼが最も重要な役割を果たしている。そ れらリソゾームの主要なプロテアーゼはシステインプロテアーゼに属するカテプシン B,H,L,S 等のカテプ シン群である。またカテプシン自身を含む多くのリソゾーマルシステインプロテアーゼのプロセッシング や代謝にもやはりカテプシン群が関与している。哺乳動物においては、これらリソゾーマルシステインプ ロテアーゼが関与していると思われるタンパク質分解異常に起因する多くの疾病が報告されている。また、

組織の死後はその分解作用が顕著に現れるためタンパク質の自己消化が進行するものと考えられている。

カテプシン群の生合成及び活性化機構に関しては、まずリボソーム上で不活性前駆体酵素として合成さ れ、シグナルペプチド（プレ部）の働きにより小胞体内へ輸送された後、プレ部が切断されプロ型酵素と なり糖鎖が付加される。その後、ゴルジ体へ輸送され、ゴルジ体内で糖鎖内のマンノースの 6 位がリン酸 化されることによって、それが標識となりリソゾームに運ばれる。カテプシン群はリソゾームに運ばれる 過程で活性化され、リソゾーム内の細胞膜及びオルガネラ膜に接する領域に局在し、各種タンパク質の分 解や生理活性ペプチドのプロセッシングに関与している（勝沼．1992）。また、近年抗原提示細胞内にお いて抗原ペプチドのプロセッシングや MHC-class II 分子のインバリアント鎖（Ii）のプロセッシング

（Villadangos et al. 2000）と T 細胞の発達にこれらカテプシン群が深く関与しているという報告（Nakagawa  et al. 1998）がある。

カテプシン群は、至適 pH、阻害剤との相互作用、基質特異性及び分子量の違いから、それぞれ分類さ れている。その中でも強いエンドプロテアーゼ活性を有するのはカテプシン L（EC 3.4.22.15）である（勝 沼 . 1998）。カテプシン L は、細胞内タンパク質分解のイニシエーションとして最も重要な酵素と考えら れている（勝沼．1998, Barrett et al. 1981）。 特に魚類においては、畜肉に比べてかなりの早さで筋タン パクが自己消化することが知られており、これらのリソゾーマルシステインプロテアーゼの働きや発現調 節機構等は哺乳動物と異なっているものと思われる。

カテプシン L に関する研究は、ラット（Bando et al. 1986, Ishidoh et al. 1987）、ヒト（Chauhan et al. 

1993）等の哺乳動物を中心に行なわれており、酵素学的諸性質、一次構造、活性化機構についての報告も

長崎大学大学院生産科学研究科

多く、プレ・プロ部のプロセッシング機構も明らかにされている（Kominami et al. 1988, Hara et al. 

1988）。また、抗原提示細胞内での MHC-class II 分子のインバリアント鎖のプロセッシングに必要な酵素 であることがわかってる（Villadangos et al. 2000）。

コイ肝膵臓より精製したカテプシン L は哺乳類とは異なり比活性の高い 28-29 kDa の single-chain form であるという興味深い結果が得られている（Tsunemoto et al. 2004）。また一次構造レベルでも、コイ、

ニジマス、ゼブラフィッシュ共に、哺乳類における two-chain form になる切断部位の直前のアミノ酸（P1 部位）が親水性アミノ酸である Ser から疎水性アミノ酸である Val になっており、この近傍のアミノ酸配 列の相同性は低く、魚類と哺乳類カテプシン L 間では重鎖・軽鎖の切断部位近傍の配列が保存されていな いことが明らかになった。またシロサケカテプシン L によるウシのインスリン B 鎖の加水分解の結果によ り P1 部位が Val の場合作用しないと報告している（Yamashita et al. 1990）。このことにより、魚類カテ プシン L は two-chain form を取らない可能性が強く示唆された（Tsunemoto et al. 2004）。そのことによ り魚類カテプシン L は食肉の熟成度向上、新規機能性ペプチド産生などの効果が期待できるものと思われ る。しかし、報告されている魚類カテプシン L がアイソフォームである可能性は否定できない。

そこで本研究では、コイカテプシン L にアイソフォームが存在するのか調べるために、カテプシン L 様 酵素並びにカテプシン L に酵素学的、一次構造的に非常に類似で魚類で唯一精製酵素の報告があるカテプ シン S の遺伝子クローニングを行った。

カテプシン S（EC 3.4.22.27）は、中性域に至適 pH を持ち、かつ広い pH 域で活性を有する唯一のエン ド型システインプロテアーゼである（Kirschke et al. 1989）。近年カテプシン S はカテプシン L と同様、

抗原提示細胞内において抗原ペプチドのプロセッシングや MHC-Class II 分子のインバリアント鎖（Ii）の プロセッシングと T 細胞の発達に深く関与しているという報告がある Nakagawa et al. 1999, Riese et al. 

1996）。

一方、魚類では、コイ肝膵臓カテプシン S に関する酵素学的諸性質並びに N 末端アミノ酸配列に関する 知見があるのみである（Pangkey et al. 2000a, 2000b）。カテプシン S は中性域に至適 pH を持つという性 質から、魚筋肉の自己消化に深く関与しているものと考えられている（Pangkey et al. 2000b）。また、精 製酵素での分子量が 37 kDa とウシ（24 kDa）と比べて極端に大きい（Pangkey et al. 2000a）。成熟型酵 素では糖鎖の存在も確認されていないことよりなぜ分子量が極端に大きいのか興味が持たれる。また、魚 類では報告例がほとんど無い事から、カテプシン L のアイソフォームという形で存在している可能性もあ る。

そこで本研究では、コイカテプシン S 遺伝子のクローニングを行い、同時にカテプシン L のアイソ フォームの検出を試みた。

実 験 方 法

１．実験魚

幸田水産（株）より購入した養殖コイ（魚体重約 0.8˜1.0 kg）より肝膵臓を摘出し、ただちに RNA 抽出に使 用した。

２．遺伝子組換え実験試薬及び機器

試薬は特に明記しない限り、和光純薬工業社製の特級試薬を用いた。実験に用いるピペット、ピペット チップ及び試薬ビン等は、オートクレーブ（121℃，20 min）もしくは乾熱滅菌処理（180℃，2 h）した。

泳 動 装 置 に は、 ミ ニ ゲ ル 電 気 泳 動 シ ス テ ム Mupid-2（COSMO  BIO 社 製 ） を 用 い た。PCR に は、

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GeneAmp^TM PCR System 2400（Applied Biosystems 社製）を使用した。逆転写酵素には Super Script II

（GIBCO 社製）を、Taq DNA ポリメラーゼには、AmpliTaq Gold^TM（Applied Biosystems 社製）を用いた。

プライマーに使用した合成オリゴヌクレオチドは GIBCO 社に委託合成した。 TA クローニング法には、

pGEM^®-T Easy Vector Systems（Promega 社 製 ） を、 培 地 作 成 用 試 薬 に は BACTO^® Tryptone, BACTO^®  Yeast Extract（DIFCO 社製）を用いた。サイクルシークエンシング反応には GeneAmpTMPCR System  2400（Applied Biosystems 社製）を、試薬には Big Dye^TMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction  Kit（Applied Biosystems 社製）を用いた。塩基配列の決定には DNA Sequencing System ABI PRISMTM377  DNA Sequencer（Applied Biosystems 社製）を用いた。シークエンスデータの解析には遺伝子解析ソフト  GENETYX-MAC Ver 7.3（ソフトウェア開発社製）と DNASIS Mac Ver 3.5（日立ソフトウェアエンジニア リング社製）を用いた。

３．実験方法

（１）全 RNA の抽出

コイ肝膵臓からの全 RNA の抽出は、全 RNA 単離試薬 ISOGEN（NIPPON GENE 社製）を用い、そのプロ トコールに従って行なった。

（２）RT-PCR

一本鎖 cDNA を合成するために、5' 末端にアンカープライマー（APS-BR ;  5'-GGCCACGCGTCGACTAG  TAC -3'）配列をもつ oligo-dT（CDS-BR ;  5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）¹⁷-3'）プライマーを用いて逆 転写反応を行なった。ついで合成した一本鎖 cDNA を用い、

コイカテプシン S の N 末端アミノ酸配列（VPDAMDWRYNKGYVTDVKDQ）（Pangkey et al. 2000a）に 基 づ い て 作 成 し た プ ラ イ マ ー CAS-1（5'-GTT/C/A/GCCT/C/A/GGAT/CGCT/C/A/GATGGAT/CTGGTAT/

C-3'）、CAS-3（5'-GCT/C/A/GATGGAT/CTGGTAT/CAAT/CAAA/GGG-3'）とカテプシン群で特に種間で保存 されている領域（His¹⁵⁸（Papain number）近傍）で作成したプライマー CAL-H（5'-TA（A/C/GT）CC（A/

C/G/T）AC（A/C/G/T）GC（A/C/G/T）A（A/G）（A/C/G/T）AC（A/C/G/T）CC（A/G）TG-3'）を使用し て、合成した一本鎖 cDNA を鋳型にを用いて PCR 反応を行った。また、カテプシン L 様酵素を得る目的で カテプシン群に保存されている活性中心の Cys 近傍（CGSCWAFS）でプライマー CATH-CYS（5'-TGC/

TGGA/C/G/TA/WC/GA/C/G/TGC/TTGGGCA/C/G/TTT-3'）と、同じく Asn 近傍（WLVNSW）でプライマー CAS-W（5'-CCCCAA/C/G/TC/GA/TA/GTTC/TTTA/C/G/TACA/C/G/TAA/GCCA-3'） を 用 い て PCR 反 応 を 行った。合成した一本鎖 cDNA を鋳型に、94℃, 1 min; 55℃, 1 min; 72℃, 2 min: 40 cycles で PCR 反応を 行なった。

（３）TA クローニング法

 pGEM^®-T Easy Vector Systems を用い 4℃でライゲーション反応を行なった。その後、形質転換を行なっ た。

  形質転換後、β-ガラクトシダーゼ（‐）の形質転換株である白色コロニーだけを選んで 5  ml の LB 培 地に植菌し、37℃で一晩振とう（160 rpm/min）した。その後、培養した形質転換菌よりアルカリ - SDS 法でプラスミド DNA を調製しシークエンス反応の試料とした。

（４）塩基配列決定法（シークエンス）

 DNA 塩基配列決定にはダイデオキシ法を改良した、サーマルサイクラーを用いて行なうサイクルシー クエンス法を採用し、蛍光で標識された ddNTP を用いたダイターミネーター法で行なった。アルカリ -SDS 法で調製したプラスミド DNA をテンプレートとして用い、ダイターミネーターサイクルシークエン スを行なった。得られた反応産物は ABI PRISM^TM377 DNA Sequencer にセットし塩基配列を決定した。

実 験 結 果

１．コイカテプシン S 遺伝子のクローニング

プライマー CAS-1 及び CAL-H を用いて PCR を行ったところ、600 bp 以下にスメアーなバンドしか見ら れなかったため、プライマー CAS-3 及び CAL-H を用いて semi-nested PCR を行ったところ約 840 bp に特 異的バンドが検出されたため、この増幅断片をクローニングし、塩基配列の決定しアミノ酸配列を決定し た（Fig. 1）。その結果、 で囲んだアミノ酸配列が Pangkey らが決定したコイカテプシン S の N 末端アミノ酸配列（Pangkey et al. 2000a）が確認された。ウシではこの領域では約 540 bp になることよ り、分子量の問題も解決されると考えたが、配列の途中に終始コドンが見られたことにより、PCR 段階で の合成のミスではないかと考え、この解析結果に基に CAS-3 より 3' 側にプライマー RT-1（5'-ACTGATGTT AAAGACCAGAAGGAT-3'）及び RT-2（5'-GCCTTCAGTGCAGTAAGACCCACA-3'）を設計し、再び RT-PCR を 試みた。

プライマー RT-1 と CAL-H を用い次いで RT-2 と CAL-H で semi-nested PCR を行ったところ、約 820 bp に特異的バンドが検出されたため、この増幅断片をクローニングしスクリーニングを行ったところ、4 種 類の異なる増幅断片（約 500 bp、620 bp、720 bp、830 bp）があることがわかった。そこでそれらを順 に Type I、II、III、IV とし遺伝子解析した（Fig. 2）。ブロック①、②、③、④の各領域は全 Type に含ま れていた。しかし挿入配列 a、b、c の有無によって各 Type に分かれることがわかった。これらを模式化 したものを Fig. 3 に示した。更にその境界付近を解析してみるとエクソン - イントロン間の保存領域とほ ぼ一致し、挿入配列 a、b、c の両端には GT/AG が確認されたことにより挿入配列はイントロンであるこ とが確認された。

Fig. 1

XXXX1XXGCCATGGATTGGTACAACAAGGGCTACGTGACTGATGTTAAAGACCAGAAGGATTGTGGAxx60 XXXXXXXAXXMXXDXXWXXYXXNXXKXXGXXYXXVXXTXXDXXVXXKXXDXXQXXKXXDXXCXXGXX RT-1

XXX61XXTCATGCTGGGCCTTCAGTGCAGTAAGACCCACATTTTGACATTTACAAAGAGGTCTTATAXX120 XXXXXXXSXXCXXWXXAXXFXXSXXAXXVXXRXXPXXTXXFXX*

RT-1

XX121XXTGGCAATTTTATAGAGTCCATATAGCCCAGGTCAGCATTCTTAACCTTTTTGCATTTATTXX180 xx181xxCATCCCTCTTTTGTCTTTCAGACTGGTTCCCTGGAGGGTCAGACATTCAAGAAGACAGGAxx240 xx241xxAAACTGGTGTCTCTGAGTGAACAGCAGCTGGTGGACTGCTCTGGTTCTTATGGGAACATGxx300 xx301xxGGCTGTGGTGGAGGACTAATGGACCAGGCCTTCCAGTACATTGAAGCCAATGGGGGTCTGxx360 xx361xxGATACAGAGGAGTCCTACCCATATGAGGCCACTGTGAGTCTTTATAATGTTTGATTCTTAxx420 xx421xxCCGTAATGCTTCAGCTTGTTGTTGTTTAAATGATTTTAATCATTTTTGCTCATCAATTTTxx480 xx481xxTTCCCATGCAGGATGGCAAGTGCCGTTTTAACCCGAGCACTGTAGGTGCCACCTGCACAGxx540 xx541xxGATATGTTGATGTCAGCAGTGGGGATGAAAGTGCACTACAGGAGGCTGTTGCCACAATCGxx600 xx601xxGCCCTGTATCTGTTGCCATCGATGCTGGACACAGCAGCTTCCAGCTCTATGAATCAGGTAxx660 xx661xxAATGCTATCGCTTGTTTTTTAGGTGTTAGGTTTTACATGTGAAATTTTATCCATTAATTAxx720 xx721xxTTCAGGTTTGAATGAGATATTTGTTGTCTAATGTAATAAATAATGTTTCTAGGTATCTACxx780 xx781xxAATGAACCTGAGTGCAGCAGCTCTGACTTAGATCATGGCGTCTTGGCGGTGGGATAxxxxxx836

Fig. 1． Nucleotide and deduced amino acid sequences（partial）of RT-PCR product （836 bp）and design of primer for RT-PCR. The stop codon is indicated by gray box and asterisk. N-terminal amino acid sequences of purified carp cathepsin S are boxed. New designed primer sequences are underlined.

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そこでイントロンの無い Type I の解析をしたところ、ストップコドンの無い ORF であることがわかっ たため、Type I の配列と初めに RT-PCR にて増幅した断片の 5' 末端領域を加えた Type I の全塩基配列を 決定し、アミノ酸配列を推定した（Fig. 4）。全長は 503 bp からなり 167 アミノ酸配列をコードしていた。

また、コイカテプシン S の N 末端アミノ酸配列を持っていたことにより、Type I がコイカテプシン S 遺伝 子の一部であると推定した。また以前決定したコイカテプシン L と比較すると、活性中心である Cys と His は保存されていたが、カテプシン L に見られる糖鎖結合部位の Asn は見られなかった。このことによ りカテプシン L とは別のカテプシンであることがわかった。  次に哺乳類のカテプシン S（マウス（Gen  Bank accession no. AJ002386）、ラット（Patanceska et al. 1992）、ヒト（Wiederanders et al 1992）、ウ シ（Ritonja et at. 1991, Wiederanders et al. 1991）、コイカテプシン L（Tsunemoto et al. 2004）と比較 した結果、カテプシン L とは明らかに異なるカテプシン S 様のシステインプロテアーゼである事が示唆さ れた（Fig. 5）。

Fig. 3． Scheme  of  four  different  types  of  RT-PCR  products.  Boxes  indicate  putative exon of carp cathepsin S. Dot boxes indicate intron.

Fig. 2． Nucleotide  sequence  and  separation  of  RT-PCR  product（836  bp）. 

Boxes indicate putative exon of carp cathepsin S. Bold letters indicate  exon-intron boundary sequences. Dot lines indicate intron.

xxxxxx1xxGCCATGGATTGGTACAACAAGGGCTACGTGACTGATGTTAAAGACCAGAAGGATTGTGGAxx60 xxxxxx1xxAxxMxxDxxWxxYxxNxxKxxGxxYxxVxxTxxDxxVxxKxxDxxQxxKxxDxxCxxGxxxx20

xxxxx61xxTCATGCTGGGCCTTCAGTGCAACTGGTTCCCTGGAGGGTCAGACATTCAAGAAGACAGGAxx120 xxxxx21xxSxxCxxWxxAxxFxxSxxAxxTxxGxxSxxLxxExxGxxQxxTxxFxxKxxKxxTxxGxxxx40

xxxx121xxAAACTGGTGTCTCTGAGTGAACAGCAGCTGGTGGACTGCTCTGGTTCTTATGGGAACATGxx180 xxxxx41xxKxxLxxVxxSxxLxxSxxExxQxxQxxLxxVxxDxxCxxSxxGxxSxxYxxGxxNxxMxxxx60

xxxx181xxGGCTGTGGTGGAGGACTAATGGACCAGGCCTTCCAGTACATTGAAGCCAATGGGGGTCTGxx240 xxxxx61xxGxxCxxGxxGxxGxxLxxMxxDxxQxxAxxFxxQxxYxxIxxExxAxxNxxGxxGxxLxxxx80

xxxx241xxGATACAGAGGAGTCCTACCCATATGAGGCCACTGATGGCAAGTGCCGTTTTAACCCGAGCxx300 xxxxx81xxDxxTxxExxExxSxxYxxPxxYxxExxAxxTxxDxxGxxKxxCxxRxxFxxNxxPxxSxxxx100

xxxx301xxACTGTAGGTGCCACCTGCACAGGATATGTTGATGTCAGCAGTGGGGATGAAAGTGCACTAxx360 xxxx101xxTxxVxxGxxAxxTxxCxxTxxGxxYxxVxxDxxVxxSxxSxxGxxDxxExxSxxAxxLxxxx120

xxxx361xxCAGGAGGCTGTTGCCACAATCGGCCCTGTATCTGTTGCCATCGATGCTGGACACAGCAGCxx420 xxxx121xxQxxExxAxxVxxAxxTxxIxxGxxPxxVxxSxxVxxAxxIxxDxxAxxGxxHxxSxxSxxxx140

xxxx421xxTTCCAGCTCTATGAATCAGGTATCTACAATGAACCTGAGTGCAGCAGCTCTGAATTAGATxx480 xxxx141xxFxxQxxLxxYxxExxSxxGxxIxxYxxNxxExxPxxExxCxxSxxSxxSxxExxLxxDxxxx160

xxxx481xxCATGGTGTGTTGGCGGTAGGATAxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx503 xxxx161xxHxxGxxVxxLxxAxxVxxGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx167

Fig. 4． Partial and deduced amino acid sequences from the RT-PCR product  Type  I  of  carp  cathepsin  S?.  N-terminal  amino  acid  sequences  of  purified carp cathepsin S are boxed.

Type Ixxxxxxx1xAMDWYNKGYVTDVKDQKDCGSCWAFSATGSLEGQTFKKTGKLVSLSEQQLVDCS--GSYG 58 Mousexxxxxx116xTV..RE..C..E..Y.GS..A...V.A....LKL...I...A.N...NEEK.. 175 Ratxxxxxxxx116xSV..RE..C..N..Y.GS...E.A....LKL...A.N...TEEK.. 175 Humanxxxxxx118xSV..RE..C..E..Y.GS..A...V.A..A.LKL...A.N...T-EK.. 176 Bovinexxxxxxx4xSM..RE..C..E..-.GA...V.A..A.VKL...A.N...T-AK.. 61 Carp(Cat.L)119xSL..RE...P....GE...T..AM...M.R...N...--RPE. 179 xxxxxxxxxxxxxxxxx**xx**x**x**x*xx**x*****xx*xx*x*xxx*****x***x*x*****xxxxx*

Type Ixxxxxx59xNMGCGGGLMDQAFQYIEANGGLDTEESYPYEATDGK-CRFNPSTVGATCTGYVDVSSGDE 117 Mousexxxxxx176x.K...Y.TE...ID...IEADA....K.M.E.-.HY.SKNRA...SR.IQLPF... 235 Ratxxxxxxxx176x.K...F.TE...ID-TSI.S.A....K.M.E.-.LYDPKNRA...SR.IELPF... 234 Humanxxxxxx177x.K..N..F.TT...ID.K.I.SDA....K.M.L.-.QYDSKYRA...SK.TELPY.R. 236 Bovinexxxxxx62x.K..N..F.TE...ID.N.I.S.A....K.M...-.QYDVKNRA...SR.IELPF.S. 121 Carp(Cat.L)180x.E..N...KDQN...S...VG..DQP.HYD.KYSA.ND..F..IP..K. 238 xxxxxxxxxxxxxxx*x**x**x*xx*****xxxxxxxxxx****xxx*xxx*xxxxxxxx*xxxxxxxxxx*x*

Type Ixxxxx118xSALQEAVATIGPVSVAI-DAGHSSFQLYESGIYNEPECSSSELDHGVLAVGxxxxxxxx 167 Mousexxxxxx236xD..K....TK...G.-..S....FF.K..V.DDPS.-TGNVN....V..xxxxxxxx 283 Ratxxxxxxxx235xE..K....TK...G.D..S....F..Q..V.DDPS.-TENMN....V..xxxxxxxx 283 Humanxxxxxx237xDV.K....NK...GV-..R.P..F..R..V.Y.PS.-TQNVN....V..xxxxxxxx 284 Bovinexxxxx122xE..K....NK...G.-..S....F..KT.V.YDPS.-TQNVN....V..xxxxxxxx 169 Carp(Cat.L)239xH..MK.I.AV...-....E...F.Q....Y.K....E...xxxxxxxx 286

* * * ***** ** * ** * * * * **** **

Fig. 5． Comparison of partial amino acid sequences of Type I, mammalian cathepsin Ss,  and carp cathepsin L. Type I; carp cathepsin S?, Carp（Cat.L）; carp cathepsin L. 

Dots mean identical with Type I. Generally conserved sequences within Type I  are  indicated  by  asterisks.  Actives（Cys,  and  His）are  bold  and  underlined. 

N-glycosylation site (Asn) is underlined.

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２．コイカテプシン L 様酵素遺伝子のクローニング

RT-PCR を試みたところ約 500 bp の特異的断片が得られ、クローニング後、塩基配列を決定し解析し た結果、約半数のクローンはカテプシン L であった。残りのクローンは先ほどのカテプシン S 様酵素 Type I（以下 CSCCP1）（Fig. 6A）と、CSCCP1 とは違うカテプシン S 様酵素（CSCCP2）（Fig. 6B）であっ た。しかし、CSCCP2 にはカテプシン L 及びカテプシン S に構造的に非常に類似のカテプシン K に見ら れる糖鎖結合部位が同じ場所に見られた。

(A)

xxxx1xxTGTGGATCATGCTGGGCCTTCAGTGCAACTGGTTCCCTGGAGGGTCAGACATTCAAGAAGxx60 xxxx1xxCxxGxxSxxCxxWxxAxxFxxSxxAxxTxxGxxSxxLxxExxGxxQxxTxxFxxKxxKxxxx20 xxx61xxACAGGAAAACTGGTGTCTCTGAGTGAACAGCAGCTGGTGGACTGCTCTGGTTCTTATGGGxx120 xxx21xxTxxGxxKxxLxxVxxSxxLxxSxxExxQxxQxxLxxVxxDxxCxxSxxGxxSxxYxxGxxxx40 xx121xxAACATGGGCTGTGGTGGAGGACTAATGGACCAGGCCTTCCAGTACATTGAAGCCAATGGGxx180 xxx41xxNxxMxxGxxCxxGxxGxxGxxLxxMxxDxxQxxAxxFxxQxxYxxIxxExxAxxNxxGxxxx60 xx181xxGGTCTGGATACAGAGGAGTCCTACCCATATGAGGCCACTGATGGCAAGTGCCGTTTTAACxx240 xxx61xxGxxLxxDxxTxxExxExxSxxYxxPxxYxxExxAxxTxxDxxGxxKxxCxxRxxFxxNxxxx80 xx241xxCCGAGCACTGTAGGTGCCACCTGCACAGGATATGTTGATGTCAGCAGTGGGGATGAAAGTxx300 xxx81xxPxxSxxTxxVxxGxxAxxTxxCxxTxxGxxYxxVxxDxxVxxSxxSxxGxxDxxExxSxxxx100 xx301xxGCACTACAGGAGGCTGTTGCCACAATCGGCCCTGTATCTGTTGCCATCGATGCTGGACACxx360 xx101xxAxxLxxQxxExxAxxVxxAxxTxxIxxGxxPxxVxxSxxVxxAxxIxxDxxAxxGxxHxxxx120 xx361xxAGCAGCTTCCAGCTCTATGAATCAGGTATCTACAATGAACCTGAGTGCAGCAGCTCTGACxx420 xx121xxSxxSxxFxxQxxLxxYxxExxSxxGxxIxxYxxNxxExxPxxExxCxxSxxSxxSxxDxxxx140 xx421xxTTAGATCATGGTGTCCTGGCTGTCGGATATGGAAGTTCAAGTGGAGAGGACTATTGGCTCxx480 xx141xxLxxDxxHxxGxxVxxLxxAxxVxxGxxYxxGxxSxxSxxSxxGxxExxDxxYxxWxxLxxxx160 xx481xxGTGAAGAACTGGTGGGGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx497 xx161xxVxxKxxNxxWxxWxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx165

(B)

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Fig. 6． Nucleotide  and  deduced  amino  acid  sequences  of  Type  I  and  CSCCP from RT-PCR（about 500 bp）. （A）, Type I. （B）, CSCCP. 

N-glycosylation sites（Asn）are underlined.

考   察

本研究ではカテプシン L のアイソフォームの有無を確認するために、カテプシン L 様酵素並びに酵素学 的にも一次構造レベルでも非常に類似のカテプシン S の遺伝子クローニングを行った。

 Pangkey ら（2000a）の報告では、精製酵素での分子量は約 37 kDa で、ウシの精製酵素での分子量（約 24 kDa）と比較してかなり大きいと報告している。RT-PCR では精製酵素の分子量が哺乳類のものと比べ て大きいということを裏付けるようなクローン（Type IV）が得られたが、この配列のには 3 つのイント ロンが含まれており（Fig. 2）、完全な mRNA では無くスプライシングされる前の heterogeneous nuclear

（hn）RNA であることがわかった。更に面白いことにスプライシング段階の hnRNA（Type II, Type III）も 確認された（Fig. 4）。通常スプライシングは速やかに行われ hnRNA 由来の mRNA が得られることはほと んど無い。また、カテプシン L ではこの様なクローンは得られいない。なぜこの様なスプライシング段階 のクローンが存在するのか明らかとするためには、EST クローンを作成し解析するしかないが、本研究の 本筋から外れるため、行っていない。

CSCCP1 はカテプシン L の特徴の一つである成熟型酵素内の糖鎖結合部位が無かったため、更に今度は 活性中心間でのプライマーを作成し RT-PCR 法を行い解析を進めた（Fig.  6）。その結果、カテプシン L 様 酵素は得られず、約半数のクローンはカテプシン L で CSCCP1 とは異なるが、カテプシン S と割と相同性 の高いクローン CSCCP2 も得られた。CSCCP2 はデータベース上にあるコイ卵巣よりクローニングした Cysteine proteinase（CCP）（GenBank accession no. L30111）と非常に高い相同性を示した。そこで、

RACE 法にて両クローンの全塩基配列の決定を試みた。

CSCCP1 においては、約 1200 bp の全長クローンが得られたが、N 末端アミノ酸配列の前半部分に精製 酵素とは違うアミノ酸で構成されていた。また CSCCP2 では 5'RACE 法ではクローンが得られず、いまだ 解析中である。いずれにしても、CSCCP1 は成熟型酵素のアミノ酸配列と違いが見られ、CSCCP2 におい てはカテプシン L 及びカテプシン K に保存されている糖鎖結合部位が見られたことにより、両クローンと もにコイカテプシン L ではなくカテプシン S 様酵素であると結論付けた。本研究ではカテプシン S 様酵素 は得られたが、カテプシン L 様酵素は得られず、コイカテプシン L にアイソフォームは存在しない事が確 認された。つまり、コイカテプシン L 遺伝子はシングルコピー遺伝子である可能性が高い。また、魚類カ テプシン L は比活性の高い single-chain form を取る事が分かっており（Tsunemoto et al. 2000, Yamashita  et al. 1990）畜肉の熟成に十分に有用な海洋生物由来遺伝子資源であると思われる。

参 考 文 献

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英 文 要 旨

Molecular cloning of cathepsins S and L-like  from hepatopancreas of the carp Cyprinus carpio.

Kazunobu  Tsunemoto,  Kiyoshi  Osatomi,  Kenji  Hara

Abstract

Fish cathepsin L is consisted of the single-chain form, the specific activity is stronger than the two- chain  from  (mammalian  cathepsin  Ls).  So  fish  cathepsin  L  may  be  harnessed  to  the  improvement  of  meat. But purified fish cathepsin Ls cannot be denied that there is isoform. So in this stydy, we cloned  cathepsins S and L-like from carp hepatopancreas. In the result of RT-PCR, three cloned were obtained. 

One of them was carp cathepsin L, and the rest of them were cathepsin S-like cysteine proteinases. 

From  these  result,  carp  cathepsin  L  never  have  a  place  in  isoform,  carp  cathepsin  L  is  consisted  of   single-chain  form.  Thus  it  is  contemplated  that  carp  cathepsin  L  is  useful  in  maturation  of  meat  and  production of a new functional peptide.