平成20 年度修士卒業論文
Pseudoalteromonas
のヴィオラセイン合成酵素遺伝子
vioA のクローニングと発現
Cloning and expression of the violacein-synthesizing enzyme gene vioA from Pseudoalteromonas.
高知工科大学大学院
工学研究科 基盤工学専攻
1115002 阿波連 毅成
目次
第一章 はじめに
1-1 要約 ・・・・ 3 1-2 背景 ・・・・3第二章 実験材料および方法
2-1 vioA 塩基配列の検索 ・・・・5 2-2 ゲノム DNA の抽出 ・・・・5 2-3 プライマー設計 ・・・・5 2-4 PCR 反応とゲル電気泳動 ・・・・7 2-5 DNA シーケンス ・・・・9 2-6 組換え発現ベクターの調製 ・・・・ 9 2-7 組換えベクターの確認 ・・・・ 10第三章 結果と考察
3-1 520P1 株 vioA 遺伝子の塩基配列決定 ・・・・ 11 3-2 組換えベクターの確認 ・・・・ 16第四章 総括
・・・・ 18第五章 謝辞・文献
・・・・19付録
・・・・ 20第一章 はじめに
1-1. 要約
青紫色素ヴィオラセイン(violacein)産生に至るまでに酵素 vioA～vioE を必要とする事が 分かっている。そのため、ヴィオラセイン産生細菌であるPseudoalteromonas sp. 520P1 株 vioA のクローニングと発現に取り組んだ。まず、vioA 塩基配列が決定されている violacein 産 生 細 菌 の Chromobacterium violaceum、Janthinobacterium lividum、
Pseudoalteromonas tunicataの遺伝子間の相同性を元にプライマーを設計し、520P1 株の ゲノムを鋳型としてvioA を増幅する PCR を試みたが、目的の遺伝子を得る事が出来なか った。520P1 株の同属であるP. tunicataのvioA 遺伝子を元にプライマーを設計し、PCR を行った。これにより520P1 の vioA 遺伝子の一部が得られたので、この PCR 産物の塩基 配列を決定し、この配列を元に再度プライマーを設計し520P1 vioA の全塩基配列を決定し た。 次に vioA タンパク質の発現を調べるため、ベクターpET28(a)に全塩基配列を決定した 520P1 株 vioA 遺伝子を組み込み、大腸菌 BL21(DE3)を形質転換した。これにより得られ た形質転換体を培養し、イソプロピル 1-チオ-β-D-ガラクトシド (IPTG)による誘導を行い タンパク質の発現をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた。
1-2. 背景
本研究室が室戸海洋深層水から得た青紫色素産生細菌Pseudoalteromonas sp.520P1 株 (1)は青紫色素 violacein を産生する事が分かっている(2)。ヴィオラセインは抗菌作用、抗 腫瘍作用、抗トリパノソーマ作用をもつ事が知られている (3)。ヴィオラセイン合成経路に ついては遺伝子解析や酵素学的研究が行われてきた(4－6)。C. violaceumのヴィオラセイン 合成遺伝子群は、vioA、vioB、vioC、vioD、vioE から構成され、トリプトファンを基質と してvioA、vioB、vioE、vioD、vioC が順次触媒する反応によりヴィオラセインが生合成さ れると推定されている(4)(Fig.1)。violacein
violacein
violacein
Fig.1 ヴィオラセインの合成経路 Fig.1 に見られるとおり、酵素 vioA はトリプトファンを基質とするため、中間体を基質と す る 他 の 酵 素 vioB ～ vioE と 比 べ 酵 素 活 性 の 研 究 が 容 易 で あ る 。 そ の た め 、 ま ず Pseudoalteromonas sp. 520P1 株 vioA のクローニングとタンパク質発現に取り組んだ。Balibar et al. (4)は、C. violaceumの組み換えvioA 酵素を使ってトリプトファンを基質と する反応を試験管内で行い、生産物であるインドール-3-ピルビン酸（IPA）が生じる事を HPLC による分析で示した。しかし、520P1 株とC. violaceumではアミノ酸の相同性がか なり低い事より、酵素の特性が違っていることが予想されるため、520P1 株の vioA のクロ ーニングとタンパク質発現に取り組んだ。
第二章 実験材料および方法
2-1.
vioA 塩基配列の検索まず、violacein 産生細菌の中で vioA 配列が決定されている Chromobacterium violaceum、Janthinobacterium lividum、Pseudoalteromonas tunicataのvioA 遺伝子の 配列をNCBI の DNA データベースである GenBank により調べ、DNA 塩基配列解析ソフ トウェアGENETYX 用いて相同性を調べた。
以下にC. violaceum、J. lividum、P. tunicataのvioA 遺伝子の配列の GenBank 登録番 号を示す。
C.violaceum AB032799 / J.lividum DQ074977 / P.tunicata AAOH01000004
2-2. ゲノム DNA の抽出
PPES-Ⅱ斜面培地にて保存してある青紫色素産生細菌Pseudoalteromonas sp. 520P1 株 から菌体の一部をかきとりPPES-Ⅱ寒天プレート培地に塗布し、20℃で培養した。形成さ れたコロニーを5ml PPES-Ⅱ液体培地に植菌し、2 日間 20℃にて静置培養した。培養物 5ml をQIAamp DNA Mini Kit を用い、このキットのプロトコールに従ってゲノム DNA の抽 出を行った。
2-3. プライマーの設計
C. violaceum、J. lividum、P. tunicataそれぞれのvioA 塩基配列（付録[1]参照）を比較 し、前半と後半部分のこの 3 種の配列に共通する塩基配列を元に Fw1、Rv1、Fw2、Rv2 （Table 1）を設計した。またP. tunicataのvioA 塩基配列（付録[2]参照）の一部を選択し、 Ptu-Fw01、Ptu-Rv01、Ptu-Fw02、Ptu-Rv02 （Table 1）を設計した。
この論文で使用したプライマーをTable 1 に示す。 Table 1 使用したプライマー 名称 配列 備考 Fw1 ＡＴＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＧＧＧＧＣＴＧＧ ＡＧＴＴＴＣＧＧＧＡ P. tunicata vioA の 22-52 塩基目 Fw2 ＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧＡＴＡＣＴＣ ＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧ P. tunicata vioA の 178-208 塩基目 Ptu-Fw01 ＡＴＧＴＣＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴ ＴＡＴＡＴＣＣＡＴＴ P. tunicata vioA の 1-30 塩基目 Ptu-Fw02 ＣＡＣＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＡＡ ＧＧＣＧＧＴＧＴＴＡ P. tunicata vioA の 271-300 塩基目 520P1-Fw03 ＣＧＡＡＴＡＡＣＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＡＴ ＧＡＴＣＧＴＣＡＣＡ 520P1vioA の 691-720 塩基目 Ptu-Fw04 ＡＣＣＧＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＴＴＴＡＣ ＣＣＡＧＣＣＴＣＡＴ P. tunicata vioA の前の-521～-491 塩 基目 EcoRⅠ－Fw05 ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＴＣＡ ＡＧＡＡＡＡＴＡＣＴ 520P1vioA の 1-30 塩基目 名称 配列 備考 Rv1 ＧＣＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＴ Ｇ P. tunicata vioA の 1201-1179 塩基目 Rv2 ＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＣＣ ＡＡＴＡＣＴＴＧＴＧ P. tunicata vioA の 1086-1065 塩基目 Ptu-Rv01 ＴＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧ ＣＣＡＣＡＧＴＧＴＧ P. tunicata vioA の 1208-1178 塩基目 Ptu-Rv02 ＴＣＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＡＡＴＴＧＣ ＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡ P. tunicata vioA の 1037-1007 塩基目 520P1-Rv03 ＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧＴＡＡＧＣＡＡＴＡＴ ＴＧＧＧＧＧＴＧＡＴ 520P1vioA の 691-720 塩基目 Ptu-Rv04 ＴＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＡ ＴＴＴＣＴＧＴＴＴＧ 520P1vioA の配列より後の 132-102 塩基 目 HindⅢ-Rv04 ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡ ＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴ 上記のプライマーにHindⅢ付加 HindⅢ-Rv05 ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＴ ＡＴＣＧＧＴＣＡＴＧ 520P1vioA の 1257-1287 塩基目
2-4. PCR 反応とゲル電気泳動
下記のTable 2 に従い、試薬を 0.2ml PCR チューブに入れ、Table 3 に示す方法で PCR 反応を行った。KOD-Plus DNA ポリメラ－ゼは東洋紡から購入した。 Table 2 KOD・PCR 反応液 ・超純水 39.25μl ・10×PCR Buffer 5μl ・Template DNA ＜1μg ・2mM dNTP mix 4μl ・25mM MgSO4 2μl・Forward Primer (100μM) 0.5μl （final 0.2～1.0μM） ・Reverse Primer (100μM) 0.5μl （final 0.2～1.0μM） ・KOD-Plus 0.25μl （0.1～0.25μl） 計 50μl Table 3 KOD ポリメラーゼによる PCR 反応 ※1 使用するプライマーの Tm に応じて変更した。 （目安はFw, Rv 両プライマーの Tm の平均値より 3℃程度低く設定） ※2 1,500bp 以上の DNA を増幅する場合は 120sec とした。 各プライマーの組み合わせでのアニーリング温度は次の通りであった。 Fw1～Rv1、Fw2～Rv2：47℃ Ptu-Fw01～Ptu-Rv01 と Ptu-Fw02Ptu-Rv02 の組み合わせ：45℃ Ptu-Fw04～520P1-Rv03：51℃ 520P1-Fw03～Ptu-Rv04：49℃ EcoRⅠ-Fw05 ～HindⅢ-Rv04：48.5℃
Step Temperature Time Cycle number
1 94℃ 2min 1 2 94℃ 15sec 3 (※1) 30sec 4 68℃ 90sec (※2) 35 5 72℃ 7min 1 6 4℃ ∞ 1
PCR 反応終了後、アガロース電気泳動により目的の長さの塩基配列が得られているか確 認した。この電気泳動は0.8％のアガロースゲルプレート、TAE 緩衝液を用いた。 アガロースゲルからのDNA の回収は QIAquick Gel Extraction Kit を用い、プロトコー ルに従って行った。
コロニーPCR は Table 4 および Table 5 の方法で行った。 Table 4 コロニーPCR 反応液
・超純水 39.25μl ・10×Ex Taq Buffer 5μl ・Template DNA ※ ・dNTP mix 4μl ・Ptu-Fw01 (100μM) 0.5μl （final 0.2～1.0μM） ・Ptu-Rv01 (100μM) 0.5μl （final 0.2～1.0μM） ・TaKaRa Ex Taq 0.25μl （0.1～0.25μl） 計 50μl ※滅菌済みの楊枝でコロニーを少々かきとりPCR チューブに入れた。 Table 5 コロニーPCR 反応 プライマーPtu-Fw01～Ptu-Rv01 を使用 PCR 反応終了後、アガロース電気泳動により目的の長さの塩基配列が得られているか上 記の方法で確認した。
Step Temperature Time Cycle number
1 95℃ 1min 1 2 95℃ 15sec 3 45℃ 15sec 4 72℃ 30sec 35 5 72℃ 7min 1 6 4℃ ∞ 1
2-5. DNA シーケンス
DNA シーケンスはバイオマトリックス研究所（千葉県流山市）で行った。 シーケンスのための一般的なサンプル調製は、テンプレートとプライマー（3.2pmol）に超 純水を加え、最終容量を14μl とした。テンプレートのサイズが 1000bp 未満の場合は 40ng、 1000bp 以上の場合は 80ng のテンプレート DNA を用いた。プライマーは PCR に用いたプ ライマーを使用した。2-6. 組換え発現ベクターの調製
520P1 vioA 全塩基配列を元に制限酵素を付加したプライマーEcoRⅠ-Fw05、 HindⅢ-Rv05、HindⅢ-Rv04 を設計した（Table 1）。ベクターpET28(a)の制限酵素処理
反応はEcoRⅠ1μl、HindⅢ1μl、1×M Buffer 2μl、pET28(a) 63ng、超純水を加え最 終容量20μl とし、37℃ 1h 行った。
EcoRⅠ-Fw05 とHindⅢ-Rv04 を用いた PCR で得られた vioA 遺伝子を含む PCR 産物の制 限酵素処理
2-4.で示した Table 2 の条件と同様に PCR 反応液を調製し、Table.3 の制限酵素部位を付 加したvioA 遺伝子を得るため PCR を行った(アニーリング温度 48.5℃)。0.8％アガロース 電気泳動後、目的のPCR 産物のバンドをアガロースゲルから DNA を回収し、制限酵素EcoR Ⅰ、HindⅢの二種類で処理した。
反応はEcoRⅠ1μl、HindⅢ1μl、1×M Buffer 2μl、PCR 産物 167ng、超純水を加え最 終容量20μl とし、37℃ 1h 行った。
制限酵素処理したベクター、PCR 産物を TaKaRa DNA Ligation Kit 〈Mighty Mix〉を 用い、プロトコールに従ってライゲーションを行った。
反応はDNA 溶液と Ligation Mix の容量比が 1：1 になるように pET28(a) 1μl、、 PCR 産物 4μl と Ligation Mix 5μl を加え最終容量 10μl とし 16℃ 18h 行った。ベクタ ーとインサートDNA のモル比は 1：7 であった。
次に、反応後のベクターを用いて E.coli BL21(DE3)コンピテントセルを用い Novagen pET System Manual に従い形質転換を行った。詳しい手順は付録〔3〕参照。
2-7. 組換え発現ベクターの確認
カナマイシン(30μg/ml)を含む 5ml の LB 培地で 2-6.で得られた BL21(DE3)の形質転換 体を一晩培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit を用いキットのプロトコールに従い、vioA 遺伝子を含む 520P1vioA/pET28(a)プラスミドを抽出し、このプラスミドを鋳型として 520P1-Fw03 または 520P1-Rv03 をプライマーとしてシーケンスを行った。
第三章 結果と考察
3-1. 520P1 株 vioA 遺伝子の塩基配列決定
C. violaceum、J. lividum、P. tunicataのvioA 塩基配列の相同性を調べたが高い相同性は 見られなかった。これより、3 種のアミノ酸配列を比較し比較的相同性の高い配列を元に Fw1、Rv1、Fw2、Rv2 を設計した。
上記のプライマーを用い Fw1～Rv1、Fw2～Rv2 の組み合わせで、520P1 のゲノム DNA を用いPCR を行ったが、目的の遺伝子産物を得る事が出来なかった。
これより、同属である P. tunicata vioA 配列のみを用い新たにプライマー設計を試み、 Ptu-Fw01(vioA の 1-30 塩基目)、Ptu-Fw02(vioA の 271-300 塩基目)、Ptu-Rv01(vioA の 1208-1178 塩基目)、Ptu-Rv02(vioA の 1037-1007 塩基目)を作成した。 520P1 株ゲノム DNA をテンプレートとし、プライマーPtu-Fw01～Ptu-Rv01、 Ptu-Fw02～Ptu-Rv02、Ptu-Fw01～Ptu-Rv02、Ptu-Fw02～Ptu-Rv01 の組み合わせで、 2-4 で述べた方法に従い PCR を行った。今回確認のため、4 つの組み合わせ同時に PCR を 行ったのでアニーリング温度は低めの45℃に設定した。 その結果、目的付近に(Ptu-Fw01～Ptu-Rv01 約 1200bp、Ptu-Fw02～Ptu-Rv02 約 800bp、 Ptu-Fw01～Ptu-Rv02 約 1000bp、Ptu-Fw02～Ptu-Rv01 約 1000bp)バンドを確認する事が 出来たので、2-4.の方法にて目的のバンドをゲル抽出し精製した。 これよりゲル精製したPtu-Fw01～Ptu-Rv01 のサンプルのシーケンスを行い、520P1 株 中程の塩基配列(54-878 塩基目)を決定した。次に決定した 520P1 株 vioA 塩基配列を元に vioA の 前 半 、 後 半 の 塩 基 配 列 を 決 定 す る た め に 、 塩 基 配 列 の 中 か ら 新 た に 520P1-Fw03(vioA の 691-720 塩基目)、520P1-Rv03(vioA の 691-720 塩基目)を設計した。 （付録〔4〕参照）
さらに、P. tunicata vioA 配列の外側の塩基配列を元に Ptu-Fw04(vioA の前の－521～－
491 塩基目)、Ptu-Rv04(vioA の配列より後の 132－102 塩基目)を設計した(Fig.2)。 新たに設計したプライマーを用いPtu-Fw04～520P1-Rv03、520P1-Fw03～Ptu-Rv04 の組 み合わせでPCR を行った。Fig.2 の①、②の目的産物(それぞれ、約 1000bp、約 700bp) のバンドが得られた。これより目的のバンドをゲル抽出し精製した。
Fig.2 プライマー520P1-Fw03、520P1-Rv03、Ptu-Fw04、Ptu-Rv04 の設計
ゲル精製したサンプルのシーケンスを行い520P1 株 vioA の塩基配列全長を決定した。 以下に示すのは今までに決定している塩基配列と今回のシーケンスにより決定した 520P1 株vioA の塩基配列全長とP. tunicataのvioA 塩基配列全長を比較したものである(Fig.3)。
Fig.3 vioA 塩基配列全長
520P1 vioA 1:ATGTCGAATCAAGAAAATACTATATCCATTGTAGGGGCTGGAGTTTCAGGGATTATGTGC 60 P.tunicata vioA 1:ATGTCGAATCAAGAAAATATTATATCCATTGTAGGGGCTGGAGTTTCGGGAATTATATGT 60 ******************* *************************** ** ***** ** EcoRⅠ-Fw05
520P1 vioA 61:GCGCTTACGCTCGCTAATTTCCATCTAGGTAGCAAAAAAGTAATTAAAGTTTTTGAACAT 120 P.tunicata vioA 61:GCACTCACGCTCGCTAATTTTCATTTAGGTAGCAAAAAGACAATTCGTGTTTTTGAACAT 120 ** ** ************** *** ************* **** ************
520P1 vioA 121:AAAAAACGTGTCGGCGGCAGAGCGCATGCAATTAAAGTTCAAGAACAGTTTATTGATCTT 180 P.tunicata vioA 121:AAAAGGCGTGTTGGTGGTAGAGCCCATGCAATAAAAATTCAAGAACAATTTATCGATCTT 180 **** ***** ** ** ***** ******** *** ********** ***** ******
520P1 vioA 181:GGGGCTGGTCGATTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAATTGATAGCACATTTT 240 P.tunicata vioA 181:GGGGCAGGTCGGTTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAACTAGTTGCACATTTT 240 ***** ***** ********************************* * * *********
520P1 vioA 241:AATATTGAACATGAAAGTTTTCCTTTTACACAATTAACACGACCACAAGAACTTCATAGT 300 P.tunicata vioA 241:AATATTGAAAATGAAAGCTTTCCTTTTACGCAATTAACCAGACCACAAGAGCTACATAGT 300 ********* ******* *********** ******** ********** ** ****** 520P1 vioA 301:GAATTAAAGGAGATTTTAAACAAATTAAAGCCTTTGTGTGCTGAACACAAAGATGAATCC 360 vioB vioA 520P1-Rv03 520P1-Fw03 Ptu-Fw04 Ptu-Rv04
①
②
P.tunicata vioA 301:CAATTAAAAGAAATTTTAAACAAATTAAAGCCCATGTGTGACGAACATAAAGATGACTCA 360 ******* ** ******************** ****** ***** ******** **
520P1 vioA 361:TTTTTGGATTTTTTAACCTCTTATTTAGGTGAAGAACAAAGTAAAGATATTATCAATGCG 420 P.tunicata vioA 361:TTCATCAACTTTTTAACGGCTTATTTAGGTGAAGATCAAAGTAAAGACATCATTAACGCG 420 ** * * ******** **************** *********** ** ** ** ***
520P1 vioA 421:CTTGGATATGATTCTTTATCCTTGCCATTTATCACCCCCAATATTGCTTACGATATTATT 480 P.tunicata vioA 421:CTTGGATATGATTCTTTAGCCCTGCCCTTTATAACCCCTAATATTGCATACGACATAATA 480 ****************** ** **** ***** ***** ******** ***** ** **
520P1 vioA 481:GAAAAGCACCCTGAGATCCAAGGGTTCTCTGATAACGCGGGATATACATGGCGAAACCTT 540 P.tunicata vioA 481:GAAAAACATCCAGAGATCCAAGGGTTTTCTGATAATGCAGGCTATACCTGGCGAAACCTT 540 ***** ** ** ************** ******** ** ** ***** ************
520P1 vioA 541:AAGGCCGGATTTTGCACTTTACCTCAAATCTTATATAAAAAAGCAGTTGAATTAGGTGTT 600 P.tunicata vioA 541:AAAGAAGGGTTTTGTACTCTTCCACAAATATTGTATGACCGCGCAGTCGAATTAGGCGTT 600 ** * ** ***** *** * ** ***** ** *** * ***** ******** ***
520P1 vioA 601:GAGTTTCATTTTGATTATGAGCTTATTACAATTGATACCCATATAAAAAAACCGGCTTTA 660 P.tunicata vioA 601:GAATTCCATTTTGATTATGAACTCATCACTATCGATAACCATGAAAAAACGCCCGCTTTA 660 ** ** ************** ** ** ** ** **** **** ***** ** ******
520P1 vioA 661:ACTTTAAAAAATAGTGATGATGAGATTATTCGAATAACCCAAGGGGATATGATCGTCACA 720 P.tunicata vioA 661:ACTTTAAAAACCAGTAATGATGATATTGTACGCATCACTCAAGGTGACATGATAGTCACA 720 ********** *** ******* *** * ** ** ** ***** ** ***** ******
520P1 vioA 721:TTGCCACCAACAGCAATGAGCAGGCTCAATTGTAACTTTCCGCAAGATTGGACCCATTAT 780 P.tunicata vioA 721:TTACCTCCTACAGCCATGAGCAGGCTTAATTGTAATTTCCCACAAGATTGGACCCACTAC 780 ** ** ** ***** *********** ******** ** ** ************** **
520P1 vioA 781:ACTTATGGTTCTATTCCTCTCTTCAAAGGTTTTCTTTTCTACGATACATCATGGTGGCAA 840 P.tunicata vioA 781:ACATATGGCTCAATTCCACTTTTTAAAGGCTTTCTTTTTTATGAAAAGCCTTGGTGGCAA 840 ** ***** ** ***** ** ** ***** ******** ** ** * * *********
P.tunicata vioA 841:GATTTATCTTTAACAGATCATGTGATTATTACCAATAACCCAATCAGAAAACTCTACTTT 900 ** ***** ************** ** ** ************** **** ** ******
520P1 vioA 901:AAAGATAATAGATACATCTTTTTTTACACTGATAGTGAATACGCTAATTTCTGGCAAGAA 960 P.tunicata vioA 901:AAAGATAATCGATATATCTTTTTTTACACAGATAGTGATTTCGCTAATTACTGGCAAGAA 960 ********* **** ************** ******** * ******** **********
520P1 vioA 961:ACCAGTCAACATGGCGAAGAACATTACTTAAAAACAGTAAAAGAATTGATGGCTGAAGCA 1020 P.tunicata vioA 961:ACGAGTCAACATGGCGAAGCCCATTATTTAAAAACAATAAAAGAATTTATGGCTGATGCA 1020 ** **************** ***** ********* ********** ******** ***
520P1 vioA 1021:ATTCAGTGCCACATAGATCAAATTCCAGATCCAATTGAACAGACTCATAAATATTGGATA 1080 P.tunicata vioA 1021:ATTCAATGCGATGTTGATCACATACCCGACCCGATAGAGCATACACATAAATATTGGATA 1080 ***** *** * * ***** ** ** ** ** ** ** ** ** ***************
520P1 vioA 1081:CATGGTGTTGAATTTTCCAAAGAGTGTAGTCCAACCCACCCTCTGAGTTTTGTACACAAA 1140 P.tunicata vioA 1081:CATGGCGTTGAGTTTTCTAAAGAGTGTAGCCCTACTCACCCACTAAGTTTTGTCCATAAG 1140 ***** ***** ***** *********** ** ** ***** ** ******** ** **
520P1 vioA 1141:AAAAGTAAAATAATTTCCGCTTCTGATGCTTATACACCCCACTGTGGTTGGATGGAAGGA 1200 P.tunicata vioA 1141:AAAAGTAAAATCATCTCTGCTTCAGATGCTTATACACCACACTGTGGCTGGATGGAAGGC 1200 *********** ** ** ***** ************** ******** ***********
520P1 vioA 1201:GGCATTATGGCTGGTAAAAGTGCGGCCTTAAAACTTCTAAAACGGATTGAAGCTGAAGAA 1260 P.tunicata vioA 1201:GGTGTTATGGCAGGAAAGAGTGCAGCGTTAAAGTTACTCAAACGTCTTGAGGCTGAAGAA 1260 ** ******* ** ** ***** ** ***** * ** ***** **** *********
520P1 vioA 1261:GAAAGCATGACCGATAGTCATGAATAA 1287 P.tunicata vioA 1261:GAAAGCCAAACAGATAATCACAAATAA 1287 ****** ** **** *** ***** HindⅢ-Rv05
Fig.3 に示すように 520P1vioA 配列はP. tunicata vioA 配列とかなりの相同性があった。 P. tunicata、J. lividum、C. violaceumと520P1 の塩基配列、アミノ酸配列の相同性を以 下に示す(Table 6)。
Table 6 P. tunicata、J. lividum、C. violaceumと520P1 の塩基配列、アミノ酸配列の相 同性比較
J. lividum
P. tunicata
C. violaceum
520P1 vioA 塩基 520P1 vioA アミノ酸83％
90％
48％
30％
43％
31％
3-2. 組換えベクターの確認
520P1vioA 塩基配列の全長が決定出来たので、pET28(a)ベクターに組み込むため 520P1 vioA を元に制限酵素を付加した新たなプライマーを設計した(Fig.4)。
制限酵素EcoRⅠを付加したEcoRⅠ-Fw05(vioA の 1-30 塩基目)、制限酵素HindⅢを付加 したHindⅢ-Rv05(vioA の 1257-1287 塩基目)を設計した。
上記のプライマーを用いEcoRⅠ-Fw05～HindⅢ-Rv05 の組み合わせで PCR を行ったが 目的の遺伝子を得る事が出来なかった。しかし、EcoRⅠ-Fw05 ～Ptu-Rv04 の組み合わせ では目的の遺伝子の長さ 1400bp 付近にバンドを確認する事が出来たので先に設計したプ ライマーPtu-Rv04 に制限酵素 HindⅢを付加したプライマーHindⅢ-Rv04 を設計した (Fig.4)。
Fig.4 プライマーEcoRⅠ-Fw05、HindⅢ-Rv05、HindⅢ-Rv04 の設計
EcoRⅠ-Fw05 ～HindⅢ-Rv04 の組み合わせで 520P1 株ゲノム DNA をテンプレートと し2-4 に述べた方法で PCR を行った結果、目的産物約 1400bp のバンドが得られた。これ より、目的のバンドをゲル抽出し精製した。
pET28(a)ベクターとプライマーEcoRⅠ-Fw05～HindⅢ-Rv04 で得られた PCR 産物を別々 に制限酵素EcoRⅠ、HindⅢで処理した。このベクターとインサートDNA をライゲーショ
ンし、E.coli BL21(DE3)のコンピテントセルを形質転換を行った結果 150 個程のコロニー
を得た。このコロニーの中にインサートDNA が入っているコロニーを選択するために、プ ライマーPtu-Fw01～Ptu-Rv01 の組み合わせで TaKaRa Ex TaqTMを用いコロニーPCRを行 った。 上記のとおりPCR を行った後 0.8％のアガロース電気泳動により 1200bp 付近にバンド が確認できるコロニーを選択した。約150 個のコロニーのうち 70 個のコロニーを PCR で 確認したが、形質転換効率は良い方ではなく、インサートDNA が入っている可能性がある コロニーは70 個中 3 個であった。 HinⅢ-Rv04Ⅲ HindⅢ-Rv05 vioB 520P1 vioA EcoRⅠ-Fw05
○
pET28(a) ベ ク タ ー に 520P1 vioA が 組 み 込 ま れ て い る か 確 認 す る た め に E.coli BL21(DE3)の形質転換体から抽出したプラスミドを用いシーケンスを行った。今回のシー ケンスでは520P1vioA の前半部と後半部がベクターに完璧に組み込まれているか確認した。 そのため、プライマーはPtu-Fw03、520P1-Rv03 を用いシーケンスを行った(Fig.5)。 Fig.5 Ptu-Fw03、520P1-Rv03 によるシーケンス 前半部のシーケンス、後半部のシーケンスの結果より520P1vioA 塩基配列を確認する事が 出来たが、pET28(a)ベクターとのつなぎ目部分のシーケンスが予想と一致せず、ベクター に正常に組み込まれているとの確証は得られなかった。
vioA
520P1-Rv03 520P1-Fw03第四章 総括
Pseudoalteromonas sp. 520P1 の産生する青紫色素 violacein の合成遺伝子 vioA 塩基配
列を、P. tunicataのvioA 配列を元にプライマー設計し、その全長を決定する事が出来た。 しかし、制限酵素処理したpET28(a)ベクターに組み込む事が出来なかったことより、今回 調べた形質転換体における発言を確かめることは出来なかった。今後、正常に組み込まれ たプラスミドを得るために他の形質転換体を調べる必要がある。 vioA 塩基配列の全長からタンパク質は 49kDa 程度の大きさと推定出来ることより、 SDS-PAGE によりタンパク質発現を調べることができる。仮にタンパク質の発現量が少な い場合は、520P1 と大腸菌のコドン使用頻度の違いで発現が弱い可能性があるので、大腸 菌で使用頻度の低いコドンを認識するt-RNA を持つロゼッタなどの大腸菌株を用いてタン パク質発現を確認する必要がある。
第五章 謝辞・文献
＜謝辞＞
本研究を進めるにあたり御指導、助言を下さった榎本恵一教授、細川覚司さん、森本浩行 さんに、心より感謝の気持ちを申し上げます。＜参考文献＞
(1)矢田修一，大場雅行，榎本恵一（2003）「室戸海洋深層水」中の細菌種の分析， 海洋深層水研究 4，47-56(2)S. Yada, Y. Wang, Y. Zou, K. Nagasaki, K. Hosokawa, I. Osaka, R. Arakawa and K. Enomoto（2007）“Isolation and characterization of two groups of novel marine bacteria producing violacein”Mar. Biotechnol. 10, 128-132
(3)N. Duran and C. F. Menck (2001）“Chromobacterium violaceum: A review of pharmacological and industrial perspectives”Crit. Rev. Microbiol. 27, 201-222
(4)C. J. Balibar and C. T. Walsh（2006）“In Vitro Biosynthesis of Violacein from L-Tryptophan by the Enzymes VioA-E from Chromobacterium violaceum ” Biochemistry,45,15444-15457
(5)R. V. Antonio and T. B. Creczynski-Pasa (2004) “Genetic analysis of violacein biosynthesis by Chromobacterium violaceum”Genet. Mol. Res. 3 , 85-91
(6) P. R. August, T. H Grossman, C. Minor, M. P. Draper, I. A. MacNeil, J. M. Pemberton, K. M. Call, D . Holt, M. S. Osburne（2000) “Sequence analysis and functional characterization of the violacein biosynthetic pathway from Chromobacterium violaceum”J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 513-9
＜参考
Web＞
(1)NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
(2)GenBank
付録
[1] C. violaceum、J. lividum、P. tunicataのvioA 配列比較
C.violaceum VioA 1:---ATGAAGCATTCTTCCGATATCTGCATTGTCGGCGCCGGCATCAGCGGCCTGACCTGC 57
J.lividum VioA 1:---ATGAGTACGTATTCTGACATTTGCATCGTTGGCGCCGGCATCGGAGGCTTGATTTGC 57
P.tunicata VioA 1:ATGTCGAATCAAATATCCATTGTAGGGGCTGGAGTTTCGGGAGAAAATATTATTATATGT 60 ..**.... ...** *.***.** **.**.**..*. . **. *.*. **. Fw1
C.violaceum VioA 58:GCCAGCCATCTGCTCGACTCGCCCGCTTGCCGCGGCCTGTCGCTGCGCATCTTCGACATG 117
J.lividum VioA 58:GCCAACCGCCTGATCGACGCCGCCGCCAACAGGAACCTGCGCATCCGGGTATTCGACCTG 117
P.tunicata VioA 61:GCACTCACGCTCGCTAATTTTCATTTAGGTAGCAAAAAGACAATTCGTGTTTTTGAACAT 120 **.. *. **. ...*... ... ...*...* . .* ** .* **.**....
C.violaceum VioA 118:CAGCAGGAGGCGGGCGGCCGCATCCGCTCGAAGATGCTGGATGGCAAGGCGTCGATAGAG 177
J.lividum VioA 118:AATGCCAGCGTAGGCGGCCGCATCCAGTCGCGGAAAATAGATGGAGAGGAAATCGCCGAA 177
P.tunicata VioA 121:AAAAGGCGTGTTGGTGGTAGAGCCCATGCAATAAAAAT---TCAAGAACAATTTATCGAT 177 .* . . *. **.**..*...**. .*.. .*...* ..*....*... ...**
C.violaceum VioA 178:CTGGGCGCGGGGCGATACTCCCCGCAGCTGCACCCGCAT-TTCCAGAGCGCGATGCAGCA 236
J.lividum VioA 178:CTCGGCGCCGCCCGCTACTCGCCGCAGCTGCATCCGCAT-TTCCAGCAACTCATGCAGGG 236
P.tunicata VioA 178:CTTGGGGCAGGTCGGTTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAACTAGTTGCACAT 237 ** **.** *. ** *..** **.**.**.**...** **...*... ..****. Fw2
C.violaceum VioA 237:TTACAGCCAGAAGAGCGAGGTGTATCCGTTCACCCAGCTGA-AATTCAAGAGCCATGTCC 295
J.lividum VioA 237:CAGCGGACTGCCGCATGCGGTCTACCCCTTCACCGAGGTCG-TCTCCCACGATAGCGCGC 295
P.tunicata VioA 238:TTTAATATTGAA-AATGAAAGCTTTCCTTTTACGCAATTAACCAGACCACAAGAGC-TAC 295 .. ...*...*...*..** **.**..*. * . .. *.*... ... *
C.violaceum VioA 296:AGCAGAAGCTGAAGCGGGCGATGAACGAGTTGTCGCCCAGGCTGAAAGAGCATGGCAAGG 355
J.lividum VioA 296:TGGAAGAGCTGAAGGCAACGCTGGATGAGCTGAGTCCGATGGTGAAAGAGCATCCGCAAG 355
P.tunicata VioA 296:ATAGTCAATTAAAAGAAATTTTAAACAAATTAAAGCCCATGTGTGACGAACATAAAGATG 355 .. . *..*.**.. .... *..*..*..*.. .**.*.* ...*.**.*** * *
C.violaceum VioA 356:AATCCTTTCTCCAGTTCGTCAGCCGCTACCAGGGCCATGACAGCGCGGTGGGCATGATCC 415
J.lividum VioA 356:ACTCCTTCCTCGAGTTCTTCAGCCATTACCTGGGCGCCACCAAGGCCACCCACATCATCA 415
P.tunicata VioA 356:ACTCATTCATCAACTTTTTAACGGCTTATTTAGGTGAAGATCAAAGTAAAGACATCATTA 415 *.**.**..** *.**..*.*... .**....**... ... .. . ..***.**..
C.violaceum VioA 416:GCTCCATGGGCTACGACGCGCTGTTCCTGCCCGACATCTCGGCCGAGATGGCCTACGACA 475
J.lividum VioA 416:AGGCGACCGGCTATGACGCCTTGATGCTGCCGATGGTGTCGGCGGCCATGGCCTACGACA 475
P.tunicata VioA 416:ACGCGCTTGGATATGATTCTTTAGCCCTGCCCTTTATAACCCCTAATATTGCATACGACA 475 ...*... **.**.**..* .*. ..*****. . .* .*..* .. **.**.*******
C.violaceum VioA 476:TCGTCGGCAAGCACCCGGAAATCCAGAGCGTGACCGATAACGACGCCAACCAGTGGTTCG 535
J.lividum VioA 476:TCATCAAGAAGCATCCGGAAACGCAGCACTTTACGGAAAACGCCGCCAACCAGTGGCGCT 535
P.tunicata VioA 476:TAATAGAAAAACATCCAGAGATCCAAGGGTTTTCTGATAATGCAGGCTATACCTGGCGAA 535 *..*... **.**.**.**.*..**. ...*..* **.**.*..*.*.*....***...
C.violaceum VioA 536:CGGCGGAAACGGGCTTTGCGGGCCTGATCCAGGGCATCAAGGCCAAGGTCAAGGCTGCCG 595
J.lividum VioA 536:ATGCCACCGACGGCTACCACGAATTGCTAAGCCAGTTGCAGCACAAGGCCCAGGCCGCCG 595
P.tunicata VioA 536:ACCTTAAAGAAGGGTTTTGTACTCTTCCACAAATATTGTATGACCGCGCAGTCGAATTAG 595 . .. ... **.*.. . .*... .*. *...*...*.. ..*. ...*
C.violaceum VioA 596:GCGCGCGCTTCAGCCTGGGTTACCGGCTGCTGTCGGTGAGGACGGACGGCGACGGCTACC 655
J.lividum VioA 596:GGGTGGAATTCCAGCTTGAACATCGTTTGCTGTCCGTTGAAAAATCCGGCGCAGACCATG 655
P.tunicata VioA 596:GCGTTGAATTCCATTTTGATTATGAACTCATCACTATCGATAA--CCATGAAAAAACGCC 653 *.*...***.. .*.*...*... .*..*..* .* .. *. .*...
C.violaceum VioA 656:TGCTGCAAC-TGGCCGGCGACGACGGCTGGAAGCTGGAACACCGGAC-CCGCCATCTGAT 713
J.lividum VioA 656:TGCT-CGCC-T--TCAGCCACCATGGCGACACGCAGATGCACCGCAC-ACGCCATCTGGT 710
P.tunicata VioA 654:CGCTTTAACTTTAAAAACCAGTAATGATGATATTGTACGCATCACTCAAGGTGACATGAT 713 .*** ...* * ...*.*. * .*... .... .. .**.*...* ..*..*..**.*
C.violaceum VioA 714:CCTGGCCATTCCTCCGTCGGCGATGGCCGGGCTCAATGTCGACTTCCCCGAGGCGTGGAG 773
J.lividum VioA 711:GATGACCATCCCGCCGTCCGCCATGCCGCGCCTGAACCTGGATTTCCCGAATGCCTGGAG 770
P.tunicata VioA 714:AGTCACATTACCTCCTACAGCCATGAGCAGGCTTAATTGTAATTTCCCACAAGATTGGAC 773 *..*..* **.**..* **.*** .. *.** **. . .*.***** * *. ****.
C.violaceum VioA 774:CGGCGCGCGCTACGGCTCGCTGCCGCTGTTCAAGGGTTTCCTCACCTACGGCGAGCCATG 833
J.lividum VioA 771:TCCGTTCCAGTACGACTCGCTGCCCCTGTTCAAGGGATTCCTCACGTTCGACACGGCCTG 830
P.tunicata VioA 774:CCACTACACATATGGCTCAATTCCACTTTTTAAAGGCTTTCTTTTTTATGAAAAGCCTTG 833 .. .. .. **.*.***..*.** **.**.**.** **.**... *..*....*.* **
C.violaceum VioA 834:GTGGCTGGACTACAAGCTGGACGACCAGGTGCTGATCGTCGACAACCCGCTGCGCAAGAT 893
J.lividum VioA 831:GTGGGATGCGCTCGGGCTGACCGACAAGGTGCTGATGGCTGCCAATCCCCTGCGCAAGAT 890
P.tunicata VioA 834:GTGGCAAGATTTATCTTTAACAGATCATGTGATTATTACCAATAACCCAATCAGAAAACT 893 ****.. *. ... ..*....**..*.***.*.** ...**.** .*..*.**..*
C.violaceum VioA 894:CTACTTCAAGGGCGACAAGTACCTGTTCTTCTACACCGACAGCGAGATGGCCAATTACTG 953
J.lividum VioA 891:CTACTTCAAGAGCGACAAGTATGTGCTGTTCTACACCGACAGCAAAAGTGCCACCTACTG 950
C.violaceum VioA 954:GCGCGGCTGCGTGGCCGAAGGAGAGGACGGCTACCTGGAGCAGATCCGCACCCATCTGGC 1013
J.lividum VioA 951:GCGGGACAGCCTGGAACTCGGTGAAGACGTGTACCTGGAGCGTGTCCGCAGCCACCTGGA 1010
P.tunicata VioA 954:GCAAGAAACGAGTCAACATGGCGAAGCCCATTATTTAAAAACAATAAAAGAATTTATGGC 1013 **. *... ... ** **.*.*. **..*..*.. .*... ...***.
C.violaceum VioA 1014:CAGCGCGCTGGGCATCGTTCGCGAGCGCATTCCCCAGCCCCTCGCCCATGTGCACAAGTA 1073
J.lividum VioA 1011:AGAAGTCCTGCCGCTCGATGGCCAGCCGCTGCCGCAGATCAAGGCGCACTTCCACAAGTT 1070
P.tunicata VioA 1014:TGATGCAATTCAATGCGATGTTGATCACATACCCGACCCGATAGAGCATACACATAAATA 1073 .. *. .*.. .**.*....*.* ..* **..*... *..**. . **.**.*.
C.violaceum VioA 1074:TTGGGCGCATGGCGTGGAGTTCTGCCGCGACAGCGATATCGACCATCCGTCCGCGCTCAG 1133
J.lividum VioA 1071:CTGGCCGCATGGCGTCGAGTTTTGCGTGGAGCCGGAAGCCGAGCACCCGGCCGTCCTGCT 1130
P.tunicata VioA 1074:TTGGATACATGGCGTTGAGTTTTCTAAAGAGTGTAGCCCTACTCACCCACTAAGTTTTGT 1133 .*** ..******** *****.*.. **. . .. .... **.**. ... .* . Rv2
C.violaceum VioA 1134:CCACCGCGACAGCGGCATCATCGCCTGTTCGGACGCCTACACCGAGCACTGCGGCTGGAT 1193
J.lividum VioA 1131:GCACCGGGA---CGGCATCATTTCCTGCTCGGATGCCTATACCGCGCATTGCGGCTGGAT 1187
P.tunicata VioA 1134:CCATAAGAAAAGTAAAATCATCTCTGCTTCAGATGCTTATACACCACACTGTGGCTGGAT 1193 .**...* ...*****..*....**.**.**.**.**....**.**.********
C.violaceum VioA 1194:GGAGGGCGGCCTGCTCAGCGCCCGCGAAGCCAGCCGT-CTGCTGCTGCAGCGCATCGCCG 1252
J.lividum VioA 1188:GGAAGGCAGCCTGATCAGCGCCCAGCAAGCCAGCGGC-CTGTTGCTGCAACGGCTAGATC 1246
P.tunicata VioA 1194:GGAAGGCGGTGTTAT-GGCAGGAAAGAGTGCAGCGTTAAAGTTACTCAAACGTCTTGAGG 1252 ***.***.*..*..*..**... .*...****... ..*.*.**..*.** .* *. . Rv1
C.violaceum VioA 1253:CGTGA--- 1257
J.lividum VioA 1247:AACGGGAGGACGTCGCCGCCGCGAACGATACATTCATCACTTCCTCGACCGAGCGCGCAT 1306
P.tunicata VioA 1253:CTGAAGAAGAAAGCCAAACAGATAATCACAAATAA--- 1287 . .... .. . . . .. . . ..
C.violaceum VioA 1257:--
J.lividum VioA 1307:GA
[2] P.tunicata vioA全塩基配列
1 atgtcgaatc aagaaaatat tatatccatt gtaggggctg gagtttcggg aattatatgt 60 Ptu-Fw01
61 gcactcacgc tcgctaattt tcatttaggt agcaaaaaga caattcgtgt ttttgaacat 120
121 aaaaggcgtg ttggtggtag agcccatgca ataaaaattc aagaacaatt tatcgatctt 180
181 ggggcaggtc ggttttcacc acaacttcat aaaaatatta atgaactagt tgcacatttt 240
241 aatattgaaa atgaaagctt tccttttacg caattaacca gaccacaaga gctacatagt 300
Ptu-Fw02
301 caattaaaag aaattttaaa caaattaaag cccatgtgtg acgaacataa agatgactca 360
361 ttcatcaact ttttaacggc ttatttaggt gaagatcaaa gtaaagacat cattaacgcg 420
421 cttggatatg attctttagc cctgcccttt ataaccccta atattgcata cgacataata 480
481 gaaaaacatc cagagatcca agggttttct gataatgcag gctatacctg gcgaaacctt 540
541 aaagaagggt tttgtactct tccacaaata ttgtatgacc gcgcagtcga attaggcgtt 600
601 gaattccatt ttgattatga actcatcact atcgataacc atgaaaaaac gcccgcttta 660
661 actttaaaaa ccagtaatga tgatattgta cgcatcactc aaggtgacat gatagtcaca 720
721 ttacctccta cagccatgag caggcttaat tgtaatttcc cacaagattg gacccactac 780
781 acatatggct caattccact ttttaaaggc tttctttttt atgaaaagcc ttggtggcaa 840
841 gatttatctt taacagatca tgtgattatt accaataacc caatcagaaa actctacttt 900
901 aaagataatc gatatatctt tttttacaca gatagtgatt tcgctaatta ctggcaagaa 960
1021 attcaatgcg atgttgatca catacccgac ccgatagagc atacacataa atattggata 1080
Ptu-Rv02
1081 catggcgttg agttttctaa agagtgtagc cctactcacc cactaagttt tgtccataag 1140
1141 aaaagtaaaa tcatctctgc ttcagatgct tatacaccac actgtggctg gatggaaggc 1200
1201 ggtgttatgg caggaaagag tgcagcgtta aagttactca aacgtcttga ggctgaagaa 1260 Ptu-Rv01
〔3〕形質転換
¾ E.coli BL21(DE3)のコンピテントセル 20μl を氷中で 2～5min 静置し、融解した。
¾ 上記の懸濁液にライゲーション液を1μl 加えた。 ¾ チューブを氷中で5min 静置した。 ¾ チューブを42℃の水槽に浸し 30sec 熱処理した。(振盪厳禁) ¾ チューブを氷中に2min 置いた。 ¾ 室温のSOC 培地 80μl を添加した。 ¾ 37℃、250rpm、1h 振盪培養した。 ¾ LB 培地カナマイシン (30μg/ml)入りに塗布した。 ¾ 37℃ 終夜培養 〔4〕決定した520P1 株 vioA 塩基配列 520P1 vioA 1:---TATGTGC 7
P.tunicata vioA 1:ATGTCGAATCAAGAAAATATTATATCCATTGTAGGGGCTGGAGTTTCGGGAATTATATGT 60 *** **
520P1 vioA 8:GCGCTTACGCTCGCTAATTTCCATCTAGGTAGCAAAAAAGTAATTAAAGTTTTTGAACAT 67
P.tunicata vioA 61:GCACTCACGCTCGCTAATTTTCATTTAGGTAGCAAAAAGACAATTCGTGTTTTTGAACAT 120 ** ** ************** *** ************* **** ************
520P1 vioA 68:AAAAAACGTGTCGGCGGCAGAGCGCATGCAATTAAAGTTCAAGAACAGTTTATTGATCTT 127
P.tunicata vioA 121:AAAAGGCGTGTTGGTGGTAGAGCCCATGCAATAAAAATTCAAGAACAATTTATCGATCTT 180 **** ***** ** ** ***** ******** *** ********** ***** ******
520P1 vioA 128:GGGGCTGGTCGATTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAATTGATAGCACATTTT 187
P.tunicata vioA 181:GGGGCAGGTCGGTTTTCACCACAACTTCATAAAAATATTAATGAACTAGTTGCACATTTT 240 ***** ***** ********************************* * * *********
520P1 vioA 188:AATATTGAACATGAAAGTTTTCCTTTTACACAATTAACACGACCACAAGAACTTCATAGT 247
P.tunicata vioA 241:AATATTGAAAATGAAAGCTTTCCTTTTACGCAATTAACCAGACCACAAGAGCTACATAGT 300 ********* ******* *********** ******** ********** ** ******
520P1 vioA 248:GAATTAAAGGAGATTTTAAACAAATTAAAGCCTTTGTGTGCTGAACACAAAGATGAATCC 307
P.tunicata vioA 301:CAATTAAAAGAAATTTTAAACAAATTAAAGCCCATGTGTGACGAACATAAAGATGACTCA 360 ******* ** ******************** ****** ***** ******** **
520P1 vioA 308:TTTTTGGATTTTTTAACCTCTTATTTAGGTGAAGAACAAAGTAAAGATATTATCAATGCG 367
P.tunicata vioA 361:TTCATCAACTTTTTAACGGCTTATTTAGGTGAAGATCAAAGTAAAGACATCATTAACGCG 420 ** * * ******** **************** *********** ** ** ** ***
520P1 vioA 368:CTTGGATATGATTCTTTATCCTTGCCATTTATCACCCCCAATATTGCTTACGATATTATT 427
P.tunicata vioA 421:CTTGGATATGATTCTTTAGCCCTGCCCTTTATAACCCCTAATATTGCATACGACATAATA 480 ****************** ** **** ***** ***** ******** ***** ** **
520P1-Rv03
520P1 vioA 428:GAAAAGCACCCTGAGATCCAAGGGTTCTCTGATAACGCGGGATATACATGGCGAAACCTT 487
P.tunicata vioA 481:GAAAAACATCCAGAGATCCAAGGGTTTTCTGATAATGCAGGCTATACCTGGCGAAACCTT 540 ***** ** ** ************** ******** ** ** ***** ************
520P1 vioA 488:AAGGCCGGATTTTGCACTTTACCTCAAATCTTATATAAAAAAGCAGTTGAATTAGGTGTT 547
P.tunicata vioA 541:AAAGAAGGGTTTTGTACTCTTCCACAAATATTGTATGACCGCGCAGTCGAATTAGGCGTT 600 ** * ** ***** *** * ** ***** ** *** * ***** ******** ***
520P1 vioA 548:GAGTTTCATTTTGATTATGAGCTTATTACAATTGATACCCATATAAAAAAACCGGCTTTA 607
P.tunicata vioA 601:GAATTCCATTTTGATTATGAACTCATCACTATCGATAACCATGAAAAAACGCCCGCTTTA 660 ** ** ************** ** ** ** ** **** **** ***** ** ******
520P1 vioA 608:ACTTTAAAAAATAGTGATGATGAGATTATTCGAATAACCCAAGGGGATATGATCGTCACA 667
P.tunicata vioA 661:ACTTTAAAAACCAGTAATGATGATATTGTACGCATCACTCAAGGTGACATGATAGTCACA 720 ********** *** ******* *** * ** ** ** ***** ** ***** ******
520P1-Fw03
520P1 vioA 668:TTGCCACCAACAGCAATGAGCAGGCTCAATTGTAACTTTCCGCAAGANTNGGACCCATTA 727
P.tunicata vioA 721:TTACCTCCTACAGCCATGAGCAGGCTTAATTGTAATTTCCCACAAGA-TTGGACCCACTA 779 ** ** ** ***** *********** ******** ** ** ***** * ******* **
520P1 vioA 728:TACTTATGGTTCTATTCCTCTCTTCAAAGGTTTTCNTTTCTACGATACATCNTGGTGGNN 787
P.tunicata vioA 780:CACATATGGCTCAATTCCACTTTTTAAAGGCTTTCTTTTTTATGAAAAGCCTTGGTGGCA 839 ** ***** ** ***** ** ** ***** **** *** ** ** * * ******
520P1 vioA 788:AGAATTATCATTTANCAGATCATGTCNTCNTCNCCNATAACCCANTACNAAAGNNGNACT 847
P.tunicata vioA 840:AGATTTATC-TTTAACAGATCATGTGATTATTACCAATAACCCAATCAGAAAACTCTACT 898 *** ***** **** ********** * * ** ******** * *** ***
520P1 vioA 848:TTNAAANATAATANATACATCNTTTTTTACA--- 878
P.tunicata vioA 899:TT-AAAGATAATCGATATATCTTTTTTTACACAGATAGTGATTTCGCTAATTACTGGCAA 957 ** *** ***** *** *** *********
