顆粒球コロニー形成刺激因子の白血病性幹細胞の増殖と分化に及ぼす影響

原 著

〔聖女歴1。8七難，墾覇〕

血振球コロニー形成刺激因子の白血病語幹細胞の

増殖と分化に及ぼす影響

東京女子医科大学第一内科学教室（主任：滝沢敬夫教授）

（指導：溝口秀昭教授） フチ ノ ウエ マ スミ

渕 之 上 眞 澄

（受付 平成2年4月5日）

Effect of Granulocyte Colony・Stimulating Factor on the Proliferation and

the Differentiatio箪of Leukemic Progenitor Cells

Masumi FUCHINOUE

Division of Hematology， Department of Medicine I（Director：Prof． Takao TAKIZAWA） （Leader：Prof． Hideaki MIZOGUCHI）

Tokyo Women’s Medical College

The colony−forming activities of recombinant granulocyte colony−stimulating factor（rG−CSF）on

primary and secondary colony formation by blast progenitors from 30 patients with acute myeloblastic

leukemia were examined using blast colony assay and compared to colony formation stimulated by

phytohemagglutinin−stimulated leukocyte−conditioned medium（PHA−LCM）． Recombinant G−CSF

stimulated blast colonies in 70ut of 30 cases，and the magnitude of stimulation in responding cases to rG−CSF was much lower than that of PHA−LCM． Blasts cells of type MI did not form colonies with rG−CSF． The subtypes of 7 responding cases were type M2（3），M3（1）， M4（2）and M5（1）． These results indicate that it is desirable to investigate the responsiveness of blast progenitors to rG−CSF before

rG−CSF is used for the recovery from neutropenia after chemotherapy or bone marrow transplanta−

tion． However， rG−CSF can be safely used for the patients with MI type leukemia． Recombinant G−CSF

increased self−renewal capacity of blast progenitors， when measured by liquid cultur6 systeln、 Previous exposure to rG−CSF did not alter cellular phenotype and morphology of colony cells，

indicating that rG−CSF did not induce differentiation of blast progenitor cells．

緒 言

最近，正常の造血前駆細胞の増殖，分化を促す

コロニー形成刺激因子（colony−stimulating

facter， CSF）とよぼれる物質が数種類分離同定さ

れた1）2）．このうち顯粒球コロニー形成刺激因子

（granulocyte colony−stirnulating factor， G・

CSF）は頼粒球系に方向づけられた正常穎粒球系

前駆細胞の増殖を促進し，また成熟白血球の貧食

能，superoxideの放出， antibody−dependent cel・

lular cytotoxity（ADCC）等の機i能を高めること

が知られている2）3）．G−CSFは最近，骨髄移植後の

正常造血回復促進や，骨髄異形成症候群の治療に

使用されはじめている4）5）．急性骨髄性白血病に対

する化学療法後にもG−CSFを正常造血回復の目

的で使用することが期待されるが，臨床使用の前

に，白血病細胞の増殖を刺激するか否かを明らか

にする必要があると考える．近年ヒト白血病細胞

を伽碗πoで培養し，白血病芽球コロニー形成を

みる方法が確立された6）7）．このコロニーは白血病

性幹細胞に由来し，生体内に形成されたコロニー

一603一

数を算定することで白」血病性幹細胞を定量的に測

定でぎる，そこで著者は，白血病芽球コロニー法

を用い，G−CSFが白血病性前細胞の増殖能と分化

能にどのような影響を及ぼすかについて検討し

た，

方 法

1．症例

急性骨髄性白血病患者30例について検討した．

白血病細胞は，初発時または再発時の末梢．血また

は骨髄血より採取した．骨髄細胞を用いた場合，

骨髄血中の芽球は全例80％以上であった．白血病

の病型分類は，FABの基準に従った8）．

2．白血病細胞の分離

ヘパリン採血した末梢血または骨髄血をフィ

コールコンレイ（比重1．077）に重層し，比重遠沈

法（1，500rpm，30分）で，単核細胞を分離した．

この細胞浮遊液にヒツジ赤血球を加え，ロゼット

を形成させ，再度フィコールコンレイに重層させ

ることにより混在するT一リンパ球を除去し

た6）7）．このようにして分離した白血球細胞を，

α一modi五cation of Eagle’s medium（α一MEM，

GIBCO， Grand Island NY）に浮遊させ，ただち

に用いるか，または，10％ dimethyl sulfoxide

（DMSO）と50％ウシ胎児血清（FCS）を含むα一

MEMに浮遊させ，液体窒素中に凍結保存した．

3．白血病芽球コロニー法

白血病芽球コロニーの培養はMindenらの方法

の変法によって行った6）7）9）．つまり，上記のごとく

分離しα一MEM中に浮遊した白血病細胞4×105

個を20％FCSを含む0．8％メチルセルロースに混

和し，プラスチック培養皿（35×101nm，』Lux社，

Lux tissue culture dish；Lab−Tek， Division， Miles Laboratories， Naperville lll）に入れて炭

酸ガス培養器（炭酸ガス濃度5％）中で7日間培

養した．

基準となるCSFとしてはPHA刺激白血球培

養上清（phytohemagglutinin−stimulated

leukocyte−conditioned medium， PHA−LCM）を

用い，rG−CSFのCSF活性と比較した． PHA−

LCMは正常ヒト末梢血を0．5％メチルセルロー

スに重層し，上清中の白血球を1％PHAととも

に7日間培養し得た上清である．

用いたG−CSFはヒト遺伝子組み換え型G−CSF

（rG−CSF：Kirin−Amgen社， Thousand Oaks

CA，比活性9．8×107U／mg）を用いた3）． rG−CSF

の添加濃度はコロニー形成を最大に刺激する最低

の濃度（100U／ml）とした．一部の実験では，種々

の濃度のrG−CSFを添加しその作用程度を検討

した．

培養の7日目に20個以上の細胞よりなる集魂を

コロニーとしてその数を算定した．すべての実験

で3または4枚の培養皿を用い平均コロニー数を

算出した．添加したCSFに対する反応性の有無

は次のように判定した．CSF無添加にてコロニー

形成がみられない場合は，培養皿あたり10個以上

のコロニー形成を陽性とし，CSF無添加でコロ

ニー

`成がみられた場合には，CSF添加により有

意のコロニー数の増加が認められた場合を陽性と

した（Student’s t−test）．

4．コロニー構成細胞の表面形質および形態

コロニー構成細胞を02％NaN3を含むリン酸

緩衝液（PBS）に浮遊させ，間接蛍光抗体法を用

いて細胞の表面形質を調べた9）．1次抗体として

My4， My7（Coulter Immunology Hialeak， FL），

OKIa！；OKMI（Ortho Pharmaceutical Corpora−

tion， Raritan， NJ）を5∼10μ1ずつ加え，4℃

で30分間浮聴しPBSで洗浄後，2次抗体として

Huorescein isothiocyanateで標識したヒツジ抗

マウス抗体（GAM−FITC；Coulter Imlnunology）

を加え，4℃30分間定置後，How−cytometerにて

陽性細胞を算定した．同時にcytospinを用いて塗

沫標本を作製し，May−Giemsa染色， peroxidase

染色，naphthol AS−D chloroacetate esteraseお

よびα一naphthyl butyrate esterase二重染色を行

い，形態および組織化学的検討を行った．

5．液体培養法による自己再生能の測定

上記のごとく分離した白血病細胞（1×106個／

ml）を20％FCSを含む3mlのα一MEM中に浮遊

させ，rG−CSFまたはPHA−LCMを添加しプラス

チック培養皿（35×10mm）の中で培養し，1週間

ごとに，培養液を同じ組成の培養液と交換した．

同時に培養した白血病細胞の一部をメチルセル

ロースでPHA−LCMをCSFとして培養し，2次

コロニー形成能をしらべた．液体培養7日後の細

胞数に2次コロニーの数を乗じた値を自己再生能

（secondary plating e飴ciency：PE2）の指標とし

た1D），

6．液体培養後の白血病細胞のNBT還元能

上記のごとくrG−CSFあるいはPHA−LCMと

ともに液体培養した細胞についてNBT還元能を

測定した．2×106個／mlの細胞浮遊液と0．2％

NBT 200mgを含んだPBSを等量ずつ加え，37℃

で20分間浮置したのち，塗沫標本を作製し陽性細

胞を算出し，培養前の白血病細胞の陽性率と比較

した11）．

結 果

1．rG−CSFの白血病芽球コロニー形成能に及

ぼす影響

3Q症例について，rG−CSFまたはPHA−LCMを

添加した場合のコロニー数とその白血病病型を表

1に示す．白血病足型はM1（末分化型）5例，

M2（分化型）10例， M3（前骨髄球型）2例， M4（骨

髄単球型）6例，M5a（未熟単球型）4例， M5b

（成熟単球型）3例であった．CSF無添加の場合，

M1ではほとんどコロニーを形成しなかったが，他

の病型では大多数の症例において，コロニーの形

成が認められた．CSFとしてPHA↓CMを添加

した場合のコロニー数は，白血病細胞4×10‘個あ

たり，59∼8，300個と症例により著しい差を認め

た．rG−CSF添加群では，30症例中7例（27％）で

有意のコロニー形成を認めた．その内訳はM210

例中3例，M32例中1例， M46例中2例， M5a

4例中1例であった．M1の5例では，全例コロ

．ニー

`成が認められなかった．コロニーを形成し

た7例についてコロニー数をPHA−LCM添加に

よる場合と比較すると，PHA−LCMにより形成さ

れたコロニー数を100％とした場合，rG−CSFによ

るコロニー形成の程度は1∼28％と明らかに低値

であった．全例についてrG−CSFによるコロニー

数をPHA−LCM群と比較すると，rG−CSF群で明

らかに低値を示した．（paired Student’s t−test p＜

0．05）．種々の濃度のrG−CSFを添加した場合の

コロニー

狽 表2に示す．検討した6例中2例で

表1 rG−CSFによる白血病芽球コロニー数 症例 病型 CSF無添加 rσCSF

PHA−LCM

1 0 0 _2400±140＊ 2 0 0 _5800±750＊

M1

0 0 _1200±83＊ 3±3 4±1 100±8＊ 5 _{8±1 6±2} 110±：8＊ 6 _{41±2 62±22 150±13＊} 7 0 0 _140±13＊ 8 0 0 _85土18＊ 9 0 0 _1500±130＊ 10 _{180±56 170±63} 1600±370＊

M2

170±11 200±31＊ 8300±1000＊ 2±0 68±8＊ 6200±230＊ 13 _{17±6 14±4} 59±3＊ 11±2 0 _2100±0＊ 13±3 70±9 1300±15⑪＊ 16

M3

120±6 94±19 740±42＊ ！7 _13±3 62±9＊ 570±8＊ 18 _{28±3 31±6 68±12＊} 51±3 66±6 97±61＊

M4

100±10 130±12＊＊ 520±15＊ 21 _39±6 83±4＊ 300±20＊ 22 _{110±26 120±6 2900±100＊} 350±60 340±22 660±48＊ 43±2 33±6 420土25＊

M5a

100±5 200±10＊ 1200±14⑪累 130±7 82±5 420±17＊ 27 _11±0 o _5200±240＊ 0 _{4±2 240±22＊}

M5b

120±18 150±17 280±12＊ 30 _{45±3 42±3 265±42＊} ＊p＜0．01にて有意差あり，＊＊p＜0．051こて有意差あり，

高濃：度のrG−CSF（104∼105U／ml）を添加すると有

意のコロニー数の増加を認めたが，他の4例では，

高濃：度のrG−CSFを添加してもコロニー数の有

意の増加がみられなかった．

2．コロニー構成細胞の表面形質および形態

表3は培養前およびrG−CSFまたはPHA−

LCMで形成されたコロニー構成細胞の各モノク

一605一

表2 種々の濃度におけるrG−CSFのコロニー形成に対する作用 コロニー 煤^dish rG−CSF（U／lnD 症例 病型 CSF無添加

PHA・LCM

_{1 10 102 103 104 105} 3

M1

0 1200 @±83 0 0 0 5±2 5±2 6±／ 5

M1

_8±1 46

}5

0 0 0 2±2 4±2 7±2 9

M2

0 1500 @±130 0 0 28＊

}3

460＊

}77

340＊

}62

440＊

}93

11

M2

170

}11

8300@±！000 0 0 0 7±5 6±3 9±2 12

M2

_2±0 6200 @±230 4±1 ₀ 5±3 8±2 0 0 22

M4

100

}2

1600_@±130 2±6 78}／1 150

}11

110

}13

200＊

}10

220寧

}19

＊p＜0．05有意差あり 表3 コロこ一構成細胞の表面形質

M4（％） MY7（％） OKM1（％） OKIa1（％）

症 例

培養前

_bSF

rG− PHA−LCM 培養前

_bSF

rG−

_￨LCM

PHA

培養前

_bSF

rG．

_DLCM

PHA

培養前 rG−CSF PHA−LCM

5 15 7 9 64 47 49

ND

ND

ND

70 79 84 10 20 ユ8 15 27 25 39 8 9 10 96 67 78 11 3 4 11 91 62． 59 5 3 7 92 77 76 12 22 14 45 90 99 90 8 14 23 87 83 99 21 24 25 39 61 80 89 34 10 18 12 23 30 24 32 15 11 72 66 62 16 28 14 94 72 74 26 40 13 21 82 64 58 44 13 20 70 78 80 ND：not done．

ロナール抗体に対して反応する細胞の割合を示

す．培養前の各抗体と反応する細胞の割合とrG・

CSFまたはPHA−LCMで形成されたコロニー構

成細胞における反応する細胞の割合との間に明ら

かな差異を認めなかった．またコロニー構成細胞

の形態はいずれも芽球様で培養前の形態と比較し

て変化を認めず，組織化学的染色性にも変化を認、

めなかった．

3．液体培養法における自己再生能（表4）

培養7日目のPE2は4例中4例でPHA・LCM

群に比しrG−CSF群で高値を示した．培養14日後

でも評価できた3例全例でrG−CSF群で高値を

示した．

4．液体培養後のNBT還元能（表5）

表4 rG−CSF添加によるPE2の変動

症 例 rG−CSF PE2×102

day O day 7 day 14

2 rG−CSF 7．0 160．0 4．1

PHA−LCM

7．0 31．0 0．4 11 rG−CSF 4．8 8．1 6．1

PHA−LCM

4．8 6．0 0 rG−CSF 1．0 1．8 0 24

PHA−LCM

1．0 1．1 0 rG−CSF 0．6 1．2 1．4 16

PHA−LCM

0．6 0．2 0．1

3症例について種々のrG−CSF濃度について

NBT還元能を調べた．3例中2例では，添加する

表5 rG−CSFによる白血病細胞のNBT還元能

症 例 培養前

_PHA・LCM

rG−CSF（U／ml） 0 10 103 104 5 3 3 6 3 6 8 22 4 8 20 24 20 24 3 5 70 3 1 8 9 （陽性率：％）

rG−CSFの濃度を変化させても陽性率は，無添加

および培養前の値と比較し有意の変化を認めな：

かった．しかし，1例（症例3）では高濃度のrG−

CSFを添加すると陽性率が高くなる傾向を認め

た．なおこの症例ではPHA−LCM添加により陽

性率は著明に増加した．

考 察

今回の実験で，rG−CSFは白血病芽球コロニー

を一部の症例で形成させることが判明した．しか

しその頻度は30例中7例でありその程度も

PHA−LCMに比べるとごく軽度であった．このよ

うな点はG−CSFを白血病の化学療法あるいは骨

髄移植後の好中球の回復の促進のために使っても

安全に用いることのできる例が多いことを示して

いる．白血病病型についてみるとrG−CSFはM1

の細胞ではコロニー形成を刺激せず，コロニーを

形成した7例のうち3例がM2，2例がM4であっ

た．G−CSFの白血病芽球コロニーに対する作用に

ついては，短篇の報告があるが，いずれも，G−CSF

は白血病芽球コロニー形成刺激作用をもつと述べ

ている9＞12）∼14）．コロニー形成刺激作用の頻度は本

実験の結果よりも多いことが報告されており，

Vellengaら12）は59％， Begleyら13＞は16例中13例

でコロニー形成を認めたと述べている．しかし，

Vellengaら12）は軟寒天培地を用いた二層法を用

いており，Begleyら13）は，骨髄血を用いた軟寒天

法を用いている点など方法が異なるためとも考え

られる．Naraら15）の報告では，添加するG−CSF

の濃度が本法よりはるかに高いのでそれらの結果

を同等に比較することは難しいと思われる．また

Naraら15）はG−CSFのコロニー形成刺激作用は，

添加するG−CSFの濃度依存性に増加すると述べ

ている．我々の結果でも，6例中2例では同様の結

果を認めたものの残る4例では，濃度依存性の増

加ば認められなかった．

白血病病型とG−CSFに対する反応性について

はBegleyら13）は， G−CSFの作用は白血病病型に

より差がないと報告している．しかし，今回の結

果ではM1の細胞に対しコロニー形成を刺激しな

かった．M1の形態を有する白血病芽球は非常に未

熟な多能性幹細胞と同様の細胞表面形質をもつ傾

向があることが報告されているので16）17），G−CSF

は未熟な白血病細胞に対してはコロニー形成刺激

作用を示さないと考えられる．

液体培養を用いた自己再生能の測定は，従来の

メチルセルロースを用いた場合に比して自己再生

能をより正確に反映しているという報告がみられ

る10）．今回の結果ぱ4例中全例でG−CSFで培養し

た後のPE2はPHA−LCMのそれより高値を示

し，G−CSFは自己再生能を促進するように作用す

ることを示唆している．McCullochらは， G−CSF

は自己再生能を低下させより分化の：方向へ誘導す

ると報告しており18），我々の結果とは異なってい

る．G−CSFはまた白血病細胞を形態的に骨髄球，

分葉核球にまで分化させるとの報告がある

が3）19），本実験では，白血病細胞の分化を誘導しな

かった．またNBT還元能についての結果からも

白血病細胞がNTB還元能をもつように分化させ

る作用はないと思われた．

以上の結果より，G−CSFは白血病性幹細胞の増

殖を弱いながらも刺激すること，反応の程度には

三型による差を認め，M1細胞に対しては増殖作用

を有さないことが明らかになった．また，コロニー

を形成させた場合は自己再生能を増加させる傾向

を示した．したがって臨床的に急性白血病患者に

G−CSFを使用する際， M1の症例には使用しうる

と考えられるが，それ以外の病型については事前

に白血病芽球コロニー法を行い，コロニー形成の

みられない限り使用を考慮するなど，慎重に対象

例を選択することが必要と思われる．

結 語

急性骨髄性白血病患者の末梢血および骨髄血か

ら採取した白血病細胞について白血病芽球コロ

ニー

@を用い，ヒト遺伝子組み換え型G−CSFの

白血病性幹細胞に対する増殖能および分化能に及

ぼす影響を検討した．

1．G−CSFは30例の白血病細胞のうち7例

（28％）で有意のコロニー形成をさせたが，それら

のコロニー数はPHA−LCMによって形成された

コロニー

狽ﾆ比較すると明らかに低値であった．

白血病山型についてみるとM1ではコ・ニーの形

成がみられなかった．

2．G−CSFによるPE2はPHA−LCMによる値

より高値を示し，G−CSFは白血病性幹細胞の自己

再生能を高めることが考えられた．

3．G−CSFで形成されたコロニー構成細胞の芽

球の形態，表面形質は培養土と同様で変化を認め

ず分化を誘導しなかった．

稿を終えるに当り，御指導，御校閲を賜りました滝沢

敬夫教授，溝口秀昭教授に深謝申し上げます．また直

接御教示いただぎました泉二登志子講師に心より感

謝し，御礼申し上げます． 文 献

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