妊娠時における尿中のN-acetyl-β-D-glucosaminidase 活性

(1)

55 ( 東女医大誌第55巻第1

号

〕

頁 55-63 昭和60年1月

妊娠時における尿中の

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活性

東京女子医科大学生化学教室 ( 主任 : 降矢焚教授〕フリヤケイヨシダマサミ降矢焚・吉田真美産科婦人科学教室(指導:吉田茂子教授) 授コ子謝料聡叫ノ野畑行磯 1 -任コ子生学戊室教ダ田学計吉岡第ナガノ

永野

子

利貞生化学セミナー学生カクタユミシオザキミオコタケウチミキ 3学年角田裕美・塩崎美織子・竹内三紀ミズマユミヤマギシアキ

森川￨

みき・ 2学年清水真由美・山岸亜紀 (受付昭和59年10月29日〉

Urinary N・.Acetyl-s.・D-GlucosaminidaseActivity during Pregnancy

Kei FURIY A and Masami YOSHIDA Department of Biochemistry(Director: Prof. Kei FURIY A)

Shigeko YOSHIDA and Satoko ISONO

Department of Obstetrics and Gynecology (Director: Prof. Shigeko YOSHIDA) Teiko NAGANO

Department of Anatomy (Director: Prof. Tsuyuka KUSHIDA)

Yumi KAKUTA， Mioko SHIOZAKI， Miki TAKEUCHI， Miki MORIKAWA (III grade) Mayumi SHIMIZU and Aki YAMAGISHI (II gtade)

Seminar Students of Biochemistry Tokyo Women's Medical College

As a clue to find effects of development of pregnancy on renal function concerning tubular lysosomal enzymes， urinary N-acetyl-β-D-glucosaminidase (EC 3.2.1.30) activities were determined for 122 cases of pregnant women of various week's gestation and 50 cases of control nonpregnant women. The values obtained were 59.9:t21.0， 105.7:t45 14，. 98.2:t98.1， 195.0:t119.0 nmol/h/mg creatinine for controls，

pregnant women less than 16 weeks' gestation， pregnant women between 16.1 and 36.6 weeks' gestation and pregnant women over 37.0 weeks' gestation respectively. The elevation of N-acetyl-s-D -glucosaminidase activity in pregnant women tended to be accompanied by a change in the SDS-polyacrylamide gel pattern of urinary proteins.

In pregnant urine with high N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity the B-form of the enzyme was detected on Cellogel， while it was not detectable in urine samples from normal controls under the same experimental condition. It seems that subclinical impaired renal function could occurred temporarily during development of pregnancy.

(2)

N-acetyl-β心嗣glucosaminidase，EC 3， 2， 1， 30 (以下NAGと省略〉は腎尿細管上皮細胞に存在するライソゾーム酵素の

1

つであり . 尿中の総 NAG活性の上昇は腎尿細管障害の存在を示唆する.妊娠時に尿中への本酵素の排出については， Ellisら1) Saiferら2)が腎疾患あるいは Tay-Sachs病の患者の体液中のNAGについて研究する間に部分的に記述されているが，詳細については報告されていない.一方，妊娠時には腎血流量，糸球体積過値の増加があり，腎尿細管再吸収も増加した糸球体j慮過値を代償するといわれているが，妊娠末期にみられるいわゆる妊娠腎，妊娠中毒症の病因本体は不詳とされている.これらの点を明らかにするてがかりとして，122例の妊婦尿について妊娠の進行に伴う尿中の総NAG活性の変動を調べ，部分的にNAGアイソザイムパタン， SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク像を調べ，興味ある知見を得たので，報告する. 実験方法 1.試料種々の妊娠週数の妊婦122例，対照として健康非妊女子(18-53歳)50例，産後1カ月の女子3例について，早朝尿を採取，直ちに凍結して-20.C に保存し，使用直前に融解し試料とした.妊婦尿は主として本学産婦人科教室外来に提出されたものである. 2. NAG活性の測定 4-methylumbelliferyl-2-acetamide-2・deoxy-β -D-glucoside (Koch-

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ght社製，以下4-MUGと省略〉を基質としてLeabackらの蛍光測定法3)により実施した.4・MUGを0.15Mリン酸ナトリウムークエン酸緩衝液， pH 4_5に溶解して0.4mMに調整して基質液とし，この1mlを3TC，5分間プレインキュベーションを行ない， 20倍希釈した試料l mlを加え混和後，3TC，30分間インキュベートし，この聞に基質から生成される4-methylumbel -liferone (以下4MUと省略〉量を，励起波長364nm 蛍光波長448nmの条件下で，日立MPF-2型分光蛍光光度計を用いて測定した.NAGの反応停止による.NAG活性を，クレアチニン1mgを含む尿により 1時間当り基質から生成される4-MU量〔句nmo叶1/泊h/mgクレアチニン〉として表わした幻制叫) 蛍光測定の標準として4mg/L硫酸キニ一ネ(仰0.1 N硫酸に溶解)を用い， 4・M Uを用いて標準曲線を作製した.

3 .

クレアチニン測定前述の20倍希釈した試料について Folin法の変法により測定した5) 4. Cellogel電気泳動6) 12X12cmサイズのCellogelを支持体として 0.04Mリン酸カリウム，pH6.5を用いて 4.Cで電気泳動を行なった.試料をマイクロダイアフローシステム(アミコン社〉により

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2

膜を用いて約 50倍に濃縮後，陰極端近くの部位に塗布し， 3mA/ 試料， 200V，約2時間通電した. 泳動終了後， 500μM 4-MUG， pH 4.4を用いて NAG活性帯を染色， 1Mグリシン， pH 10により反応停止後，直ちに暗室で、365nmUV照射により蛍光性スポットを確認した. 5. SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 約50倍に濃縮した試料を1%SDS， 2・メルカプトエタノールを含む

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.

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リン酸ナトリウム， pH 7.0で処理したものを泳動用試料として Weberの方法7)により電気泳動を行った.泳動終了後，アミドブラック10Bを用いて染色，酢酸: メタノール:水 (7:10: 100， V/V/V)により脱染，東洋デンシトメータ DMU-2型を用いてデンシトグラムを描き Boeskenらに9)10)より提唱された半定量的なタンパク組成の解析を行なった. 6. スJラブ型SDSポリアクりルアミドゲル電気泳動 3 -15%のゲル濃度の濃度勾配ゲルを調製し Weberらの方法に準じて電気泳動を行なし、市}，グマシーブリリアントブルーRを用いて染色，型の如く脱染を行なった9) 結果 1.原中 NAG活性対照非妊女子50例についての結果をFig.Hこ - 56ー

(3)

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Fig. 1 Urinary NAG excretion of normal non pregnants. Enzyme activities are expressed as nmol 4.methylumbel1iferone released per hour

45

1

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較するために，妊娠

16.1-36.6

週群を

16.1-20.0

週群と

20.1-36.6

遇群に

2

分してそれぞれの群の平均値を求め，対照群および妊娠豆

1

6 .

0

週群のそれらを合わせて図示した

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F

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4

にみられるように，妊娠壬

1

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0

週群と妊娠

16.1-20.0

週群との間には

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で有意の差が認められた(平均値は前者で

1

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クレアチニンであった). 官壬娠

16.1-20.0

週と

20.1-36.6

週群の聞にはかなりの差異が期待されたが，帰無仮説の検定により，

p<0.02

で有意差を示すに止まった.なお，産後

2

週

-4

週の女子

3

例についての尿中

NAG

活性は，それぞれ

5

7 .

5

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1

7 .

1

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2

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l/

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クレアチニンであった.妊婦l例について妊娠の経過を伴う尿中

NAG

活性の変動を

F

i

g

.5

に図示する.妊娠週数の増加に伴う尿中

NAG

排出の上昇がみられ，産後の尿では

NAG

活性が急激に低下示す.平均値は

5

9 .

9 :

t

2 1nmo

l/

h/mg

クレアチニンであった.

F

i

g

.

2

は妊婦

1

2

例についての結果を図示したものであり，妊娠の進行に伴う尿中

NAG

活性の上昇傾向がみられた.定性反応によるタンパク陽性の妊婦尿が数例認められたが，必ずしも高い

NAG

活性を示したわけではなく，高い

NAG

活性を示した試料が総てタンパク陽性であるとは限らなかった.次に

F

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.2

に示した結果

(

8

4

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9

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h/mg

クレアチニンを除く〉を妊娠

1

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0

週までの群

(n=30)

，

16.1-36.6

週群

(n=

7

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，

3

7 .

0

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p<O.OOl

で有意の差が認められたが，後者と妊娠孟

3

7 .

0

週群間の有意差は認められなかっした.

2 .

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電気泳動による

NAG

アイソザイム像 57 -た. 胎盤の形成は妊娠

16-20

週の聞に完了するとされており，胎盤形成の完了の前後の群について比

(4)

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.

型に加えて p.型アイソザイムが出現すること，妊婦 5例につき尿中 NAGを測定し総 NAG 活性の上昇をみたが， p.型アイソザイムは検出されなかったという1)今回，著者らは122例の妊婦尿につき，妊娠週数別に NAG活性を測定した結

(7)

A θ G (a) pregnant woman with high NAG activity (b) pregnant woman with high NAG activity

(c) non -pregnant woman with nonmaJ NAG act1vlty ④ ⑦ (d) patient with impaired renal function with high NAG activity (e) patient with impail'ed l 'enal functIon with high NAG activity 61 ⑥ Fig. 8 Densitometric sketches of scans for various SDS.PAGE patterns of urinary proteins. The ratio of A : B depicts the glomerular tubular protein ratio according to Lubega'). Hatched area represents albumin band. 果を，対照群から得られた結果と比較した.対照群の値は

5

9 .

9

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2

1

nmol/h/mgクレアチニンであり， Tuckerらの報告4)とほぼ同じであった.妊娠初期より妊娠

3

6 .

6

週までは妊娠経過に伴う尿中 NAG活性の有意な上昇がみられたが， 37.0週以降はほとんど変化せず，出産後は急激に下降して対照群とほぼ同じ値

(

5

7 .

5

，

1

7 .

1

，

2

6 .

8

nmol/h/ mgクレアチニン〉を示した.妊娠時には腎血流量，糸球体積過値の増加(妊娠末期には40%にもおよぶ〉があり，腎尿細管再吸収も増加した糸球

(8)

61-、1誕輸時 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

+

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Fig.9 Various patterns ofproteins in human urine usingslab gradient gel electrophoresis.A andT bandsshow albumin and transferrinre -spectively.(a) 1-4， nonnal non-pregnantsub -jects;5-8， pregnantsubjects withhigh NAG activity;9， trans-ferrin; 10， human serum;11， 12， bovineserumalbumin.(b) 1-4， pregnant sub -jectswithhighNAG activity;5-8， pati巴ntswith impaired renal functionwithhighNAG activity; 9， transferrin; 10， human serum;11， 12， bovine serum albumin 体積過値を代償するといわれているが，今回得られた妊娠中期，後期の尿中の NAG活性値は対照、群の

2 -3

倍強を示しているので，何らかの原因による尿細管上皮細胞の障害が考えられる. 一方，ポリアクリノレアミドゲルを支持体として

2

種類の電気泳動を行なったところ，妊婦尿では，アルブミン(分子量66，000)よりも低分子のタンパク帯が陽極側に多数出現し，陰極側にはトランスフェリン，アルブミン2量体などもみられた CFig_ 7，9).これらは Lubegaら8)のL、う糸球体性思わせるが，糸球体性タンパク/尿細管性タンパク比を求めると， 0.18， 0.19となり，尿細管性タンパク尿型を示し CFig.8)，尿細管の再吸収の低下ないしは機能障害を示唆する結果が得られた. さらに，対照

5

例，妊婦13例について尿中の α1 -ミクログロフリンおよび sz-ミクログロプリンを酵素免疫法により測定したところ妊娠の進行に伴う増加がみられたが，このような分子量

4

万以下の低分子のタンパクの排出の増加は尿細管の再吸収能の低下を反映するものであり，現在検討中である. 尿中の NAG~こは A 型と B 型の主なアイソザイムが存在し，正常尿では総 NAG活性の約90%が A型

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型をも含めて〉であり B型は極く僅かであり， B型アイソザイムの増加は腎障害を反映するという1)12) pIが5.4であるA型と 7.9であるB 型の両アイソサ'イムの分画はDEAE-支持体を用いて 0-0.5MNaclの濃度勾配による溶出を行なえば比較的容易に実施できるが1) 今回は定性的に Cel10gel電気泳動により妊婦では対照に比し， B型アイソザイムの尿中への排出の増加がみられた以上の結果から，妊娠時には一過性の準臨床的 CsubclinicaJ)な腎尿細管上皮細胞障害が起こるものと考えられる.妊娠時にはプロゲステロン，エストリオールなど種々のホルモンの産生分掛が急増することから，原因の lつとなる可能性もありうるだろう. なお，今回の実験に供した 122例の妊婦尿のうちで NAG活性が300nmo1/h/mgクレアチニン以上の値を示した例は16例であり，うち 2例は軽症の糖尿病で330.9，418. 2nmo1/h/mgクレアチニンであった.後者の例では5.068gの児を分娩している.その他

et al.: Presence of serum and tissue forms of N -acetyl.β-glucosaminidase in urine from patients with renal disease. Clin Chim Acta 64 195-202 (1975) 2) Saifer

，

A.

，

et al.: Identification of Tay.sachs genotypes by hexaminidase analysis of urine and tear samples. Adv Exp Med Biol 68 339-366 (1976)

3) Leadback

，

D.H. and Walker

，

P.G.: Studies on glucosaminidase. Biochem J 78 151-156 (1961)

4) Tucker， S.M.， et al.: Automated assay of N-acetyl-β.glucosaminidase in normal and path ological human urine. Clin Chim Acta 62 333-339 (1975)

5) 降矢告さ:クレアチン・クレアチニン測定法.臨

床病理 22 32-52 (1975)

6) Poenal， L. and Dreyfus， J.D.: El巴ctrophor etic study of hexaminidase. Clin Chim Acta 43 439-442 (1973)

妊娠時における尿中のN-acetyl-β-D-glucosaminidase 活性

号

〕

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