Key words: adenine nucleotide,ミ トコ ン ド リア 呼 吸 能,ミ トコ ン ドリア ス コ ア, perfluorochemical,同 所 性 心 移 植 緒 言 心 臓 移 植 を行 う 際 に,避 け られ な い 問 題 と し て,心 保 存 の 問 題 が あ る.現 在,臨 床 的 に は, 多 くの 施 設 で 低 温 単 純 浸 漬 法(以 下,浸 漬 法 と す る)が 用 い ら れ て い る が,そ の 安 全 限 界 は, 4∼5時 間 と さ れ て い る.donor心 を,長 距 離 長 時 間 運 搬 す る必 要 が 生 じ る事 も あ り,よ り安 全 に 長 時 間 保 存 で き る方 法 の 確 立 が 望 まれ る. 我 々 は,こ れ ま で,長 時 間 心 保 存 法 と して,灌 流 装 置 を 用 い た低 温 持 続 冠 灌 流 法(以 下,灌 流 法 とす る)に つ い て 検 討 を 加 え て 来 た1).今 回, 24時 間 保 存 心 の,ミ ト コ ン ド リア の 機 能 お よ び 形 態,心 筋 内Adenine Nucleotide量,移 植 後 心 機 能 等 よ り,灌 流 保 存 法 の 有 用 性 に つ い て 検 討 した.ま た,灌 流 液 と して,低 温 に お い て も, 高 い 酸 素 配 送 能 を 有 す る と言 わ れ る,perfluoro chemical(以 下,PFCと す る)を 用 い た24時 間 保 存 心 の,ミ トコ ン ド リア の 状 態,心 筋 エ ネ ル ギ ー レベ ル,移 植 後 心 機 能 等 を測 定 し,PFCの 有 用 性 を検 討 し た.
Table 1 Composition of Solution
材 料 と 方 法
体 重8.5∼15kgの 雑 種 成 犬42頭 をdonorと し て 用 い た.donor犬 は,ketamine hydrochloride
(100mg)を 筋 注 し,pentobarbital sodium(30 mg/kg)に て 静 脈 麻 酔 後,気 管 内 挿 管 し た.従 量 式 人 工 呼 吸 器 に 接 続 し,pancuroniume bromide に て 筋 弛 緩 し,調 節 呼 吸 下 に お い た.下 行 大 動 脈 お よ び下 大 静 脈 に,圧 測 定 用 カ テ ー テ ル を 留 置 した.外 頚 静 脈 よ り肺 動 脈 へ,Swan Ganzカ テ ー テ ル を挿 入 した.右 側 開 胸 後,肺 静 脈 よ り 左 房 お よ び 左 室 圧 測 定 用 の カ テ 先 トラ ン ス デ ュ ー サ ー(Millar社 製model SPC 370)を 挿 入 し た.こ こ で 心 機 能 を 測 定 して,移 植 前 値 と し た.次 い で 両 側 開 胸 と して,腕 頭 動 脈 よ り心 停 止 液(Table 1)を 注 入 し,心 停 止 後donor心 107
を 摘 出 し た.得 ら れ たdonor心 をA, B, Cの 3群 に 分 類 し た(Table 2).A群 は 細 胞 内 液 組
成 のCollins液 に,膜 安 定 化 を 図 る 目 的 で
xylocaine 1mmol/lを 加 え,さ らにglucose 30g/lを 加 え たmodified Collins液(以 下, MC液 とす る)に 浸 漬 し,4℃ 冷 暗 所 で保 存 し た(Table 1).B群 は 臓 器 灌 流 装 置ORPH 3000 C(泉 工 医 科 工 業 社 製)に 接 続 し,MC液 を灌 流 液 と して,灌 流 温4℃,灌 流 圧20mmHg, pH 7.4, PO2 500∼800mmHgに な る よ う に 設 定 し,順 行 性 冠 灌 流 保 存 し た(Fig.1).C群 はMC液 に PFC(ミ ド リ十 字 社 製Fluosol・DA)を400mEq/ l加 え,膠 質 浸 透 圧 を上 げ る た め にalbumine 12.5g/lを 添 加 し た 液(以 下,PFC液 とす る) を用 い て,B群 と 同 じ灌 流 条 件 で,灌 流 保 存 し
た(Table 1, Fig. 1).24時 間 保 存 終 了 後,A, B, C各 群 と も,保 存 心 を7個 ず つ,心 筋 エ ネ ル ギ ー 代 謝 等 の 検 索 に 用 い た 群 と,移 植 し た 群 とに 分 け て 検 討 した. 1. 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア呼 吸 能 の 測 定 採 取 し た 心 筋 よ り,萩 原 らの プ ロ テ ア ー ゼ 法 を 用 い て,ミ トコ ン ド リア を分 離 した2).ミ トコ ン ド リア は,0.25Mシ ョ糖,5mM Tris-HCl 緩 衝 液(pH 7.4)に 浮 遊 させ た.反 応 液 は,0.05 Mシ ョ糖,10mM Tris-HCl緩 衝 液(pH 7.4), 10mM KCl, 2mM MgCl2, 0.1mM EDTAの 組 成 液 を用 い た.RANK社 製 の 酸 素 電 極 を用 い, コハ ク酸 を 基 質 と して,25℃ に お け る呼 吸 調 節 比(以 下,respiratory control index(RCI)と
す る)とADP/O比 を,萩 原 ら の 酸 素 電 極 法 よ り求 め た3)(Fig. 2). 2. Adenine Nucleotideの 測 定 液 体 窒 素 に て 凍 結 した 左 室 心 筋 を,解 凍 し な い よ うに 素 早 く秤 量 した.直 ち に 氷 冷 し た0.5N HClO4を5ml加 え,ホ モ ジ ナ イ ズ(WHEATON 社overhead stirrer使 用)し た.遠 心 分 離(4℃, 3000rpm, 30分)し,上 清 をサ ン プ ル と し て 測 定 した.一 方,沈 渣 は1N NaOHに て 加 温 溶 解 し, ビ ュ ー レ ッ ト法4)に て 蛋 白 質 の 定 量 を 行 い, Adenine Nucleotideの 含 有 量 は,蛋 白 質 重 量 当
た りの モ ル 数 と して 表 した.ATP, ADP, AMP は い ず れ も,酵 素 法 に よ るend point法 の 原 理
で,NADHの 減 少 を,340nmの 吸 光 度 変 化 に
よ り 測 定 し た5)6)(Fig.3).ま た,Atkinson7)の 式 に よ りEnergy Charge(以 下,ECと す る) を 算 出 し,ATP, ADP, AMPの 総 和 をTotal Adenine Nucleotide(以 下,TANと す る)と
し た.
TAN=ATP+ADP+AMP
Table 2 Group
Fig. 1 Perfusion Circuit
In group B and group C the donor hearts were set in the perfusion circuit (ORPH 3000C, Senko Medical Instrument Inc., Japan). They were perfused from the aor tic root for 24 hours with the 4•Ž oxygenated perfusate (PO2: 500 to 800 mmHg) at a pressure of 20mmHg. F: filter, R: roller pump, O: membrane oxygenator, H: heat exchanger, S: sen sor of pressure, temperature and pH
3. ミ トコ ン ド リア ス コ ア の 測 定
左 室 自 由 壁 の 中 間 層 よ り心 筋 を採 取 し た.2.5 %グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド溶 液 で 固 定 し,緩 衝 液 に
ノ ー ル で 脱 水 後,プ ロプ レ オ ン オ キ サ イ ドで 処 理 し,エ ポ ン に 包 埋 した8).超 薄 切 片 を作 成 し, 酢 酸 ウ ラ ニ ル ク エ ン酸 鉛 で 染 色 し,電 子 顕 微 鏡 (明石 製 作 所 製LEM 2000)に て 観 察 した.作 成 し た 電 子 顕 微 鏡 写 真 よ.り,1例 に つ き100個 の ミ トコ ン ドリア を 無 作 為 に選 択 し,Flamengら9) の 変 法 に よ り0か ら4ま で ス コ ア化 した.す べ て の ミ トコ ン ドリ ア が 正 常 で あ っ た 場 合(ス コ ア の 合 計 が400の 場 合)を100%と し た.
Fig. 2 Schema of Polarography for Mitochondrial O2 Consumption
Smoothed oxygen electrode tracing with succinate as substrate. In State 2, substrate is present without adenosine diphosphate (ADP). State 3 is active state of respiration in presence of ADP. When all the ADP is phosphorylated, respiration returns to a slower rate, i.e., State 4. The reaction medium contained 0.01M KCl, 0.0001M EDTA, 0.002M MgCl2, 0.05M Sucrose and 0.01M Tris - HCl buffer (pH 7.4 at 25•Ž). Fig. 3 ミ トコ ン ド リア ス コ ア 4: ミ トコ ン ドリ ア の 正 常 な微 細 構 造 を保 っ て お り,ク リス タ の 配 列 に 乱 れ が な く ミ トコ ン ド リア 顆 粒 も認 め られ る. 3: ク リ ス タ,基 質 と も構 造 は 保 た れ て い る が, ミ トコ ン ド リア顆 粒 は 消 失 して い る. 2: ミ トコ ン ド リア顆 粒 は 消 失 し,基 質 の 淡 明 化 も認 め ら れ る が,ク リス タ の破 壊 は な い. 1: ミ トコ ン ド リア顆 粒 は 消 失 し,基 質 の 淡 明 化 と局 所 的 な 凝 結(focal condensation)及 び ク リス タ の 破 壊 が 認 め られ る. 0: ミ トコ ン ド リア顆 粒 は 消 失 し,ク リス タ 及
び ミ ト コ ン ド リア 内 外 膜 の 破 壊 が 認 め られ る. 4. 同 所 性 心 移 植 recipient犬 は,右 第4肋 間 開 胸 後,右 大 腿 動 脈 よ り送 血 用 カ ニ ュ ー レ を挿 入 し,奇 静 脈 よ り 上 大 静 脈 へ,右 心 耳 よ り下 大 静 脈 へ 脱 血 用 カ ニ ュ ー レ を挿 入 し,体 外 循 環 を 開 始 し た.体 外 循 環 中 ヘ マ ト ク リ ッ トは25∼30%に 維 持 し,25℃ のcore coolingを 併 用 し た.大 動 脈 遮 断 後 recipient心 を 摘 出 し,donor心 を左 房 → 心 房 中 隔 → 肺 動 脈 → 大 動 脈 の 順 に 吻 合 し,大 動 脈 遮 断 解 除 後 右 房 を吻 合 し た10).体 外 循 環 離 脱 後,血 行 動 態 の 安 定 し た 時 点 で 心 機 能 を測 定 し,移 植 前 値 と比 較 し て,心 機 能 の 回復 率 を%controlと し て 表 し た.心 拍 出 量 測 定 に は,Swan Ganzカ テ ー テ ル 及 び 拍 出 量 測 定 用 コ ン ピ ュ ー タ ー (EDWARD社model 9520A)を 用 い,熱 希 釈 法 に よ り測 定 した.左 房 圧,左 室 圧 及 び 左 室 内 圧 変 化 率(LV dp/dt)は,前 述 の カ テ 先 トラ ン ス デ ュ ー サ ー を 用 い て 測 定 し,ポ リ コー ダ ー(日 本 電 気 三 栄 社 製Polygraph 2318)に 描 記 し た. 左 室 一 回 仕 事 係 数(LVSWI)は 次 式 か ら求 め た. LVSWI=SI×(LVSM-LAP)×0.0136 SI:一 回 拍 出 係 数,LVSM:左 室 中 間 圧, LAP:左 房 圧 5. 統 計 処 理 デ ー タ は,各 々 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で 表 し,stu dent t testを 用 い て 検 定 し,p<0.05を 有 意 差 あ り と し た.
Fig. 4
Mitochondrial
Respiratory
Function
RCI: Respiratory
control
index; state 3
QO2/state 4 QO2
ADP/O: Amount of ADP phospholytated/
amount of oxygen consumed
*p<0.001
vs Group A, **p<0.05
vs
Group B, ***p<0.01
vs Group A
Fig. 5 Myocardial Adenine Nucleotide Content *p<0.005 vs A, **p<0.01 vs A 結 果 1. ミ ト コ ン ド リ ア 呼 吸 能 RCIは,A群3.03±0.33,B群4.30±0.58, C群5.04±0.48で あ っ た.B群 はA群 に 比 べ て 有 意(p<0.001)に 高 値 で あ り,C群 はB群 に 比 べ て 有 意(p<0.05)に 高 値 で あ っ た.ADP/ O比 は,A群0.92±0.23, B群1.32±0.24, C 群1.68±0.22で あ っ た.RCIと 同 様 に,B群 は A群 に 比 べ て 有 意(p<0.01)に 高 値 で あ り,C 群 はB群 に 比 べ て 有 意(p<0.05)に 高 値 で あ っ た(Fig. 4). 2. 心 筋Adenine Nucleotide量 ATP量(μmoles/g protein)は,A群8.29±
2.91, B群17.6±5.37, C群25.2±7.67で あ っ た.B群 はA群 に 比 べ て 有 意(p<0.005)に 高 値 で あ っ た.C群 とB群 間 に は,有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た が,C群 の ほ う が 高 値 の 傾 向 を 示 し た.TAN量(μmoles/g protein)はA群22.9± 3.89, B群31.4±5.67, C群37.8±5.73で あ っ た.B群 はA群 に 比 べ て 有 意(p<0.01)に 高 値 で あ っ た が,C群 とB群 間 に は,ATP量 と 同 様 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た.ECはA群0.54± 0.09, B群0.67±0.09, C群0.77±0.08で あ っ た.B群 はA群 に 比 べ て 有 意(p<0.05)に 高 値 で あ り,C群 はB群 に 比 べ て 有 意(p<0.05)に 高 値 で あ っ た(Fig. 5, Table 3). 3. ミ ト コ ン ド リ ア ス コ ア 電 顕 像 で 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア は,A群 で は 膨 化 ・ ク リ ス タ の 開 大 あ る い は 崩 壊 ・基 質 の 淡 明 化 ・内 外 膜 の 破 綻 な ど 様 々 の 変 化 を 認 め た.B 群 で は,軽 度 膨 化 ・ ク リ ス タ の 開 大 ・基 質 の 淡 明 化 ・ な ど を 認 め る も の が 比 較 的 多 か っ た.C 群 で は,ク リ ス タ,基 質 と も 構 造 が 保 た れ て い る も の が 多 か っ た が,ミ ト コ ン ド リ ア 顆 粒 は 消 失 し て い る も の が 多 か っ た(Fig. 6).ミ ト コ ン ド リ ア ス コ ア(%)はA群34.4±6.22, B群45.8± 7.52, C群58.1±8.85で あ っ た.B群 はA群 に 比 べ て 有 意(p<0.01)に 高 値 で あ り,C群 はB 群 に 比 べ て 有 意(p<0.05)に 高 値 で あ っ た(Table 3).
Fig. 6 Ultrastructural alterations of mitochondria after 24-hour preservation
Table 3 Energy Charge & Mitochondria Score
Values are expressed as mean•}SD. *p<0.05 (A vs B, B vs C) **p<0.01 (A vs B) 4. 同 所 性 移 植 後 心 機 能 donor心 の 移 植 前 と移 植 後 の 心 機 能 を 比 較 し て,移 植 後 の 心 機 能 の 回 復 率 を%controlと し て 表 し た.左 室 収 縮 能 を 示 すLV dp/dt maxは, A群25.4±4.75, B群32.4±7.26, C群51.8± 9.08で,B群 はA群 に 比 べ て 有 意(p<0.05)に 高 値 で あ り,C群 はB群 に 比 べ て 有 意(p<0.001) に 高 値 で あ っ た.拡 張 期 特 性 の 指 標 で あ る-LV dp/dt maxは,A群16,7±3.7, B群22.3±4.33, C群43.5±9.17で,B群 はA群 に 比 べ て 有 意(p< 0.05)に 高 値 で あ り,C群 はB群 に 比 べ て 有 意 (p<0.001)に 高 値 で あ っ た.同 様 に,心 係 数 (CI)及 びLVSWIも 表4に 示 す 如 く,B群 は A群 に 比 べ て 有 意 に 高 値 で あ り,C群 はB群 に 比 べ て 有 意 に 高 値 で あ っ た(Table 4). 考 察 従 来 か ら,心 筋 保 護 あ る い は 心 保 存 の検 討 は, エ ネ ル ギ ー 代 謝 面 か ら よ く な さ れ て き た が,な か で も,心 筋 収 縮 の 直 接 的 な エ ネ ル ギ ー 源 で あ るATPな どの 高 エ ネ ル ギ ー リ ン 酸 化 合 物 の 代
謝 は,心 機 能 を考 え る上 で 重 要 で あ り,高 エ ネ ル ギ ー リ ン 酸 化 合 物 が 温 存 され れ ば,良 好 な 心 機 能 が 得 ら れ る も の と考 え られ る.し か し,心 筋 内ATP含 有 量 の み で はATPの 消 費 と供 給 の 関 係 は 把 握 で き ず,ATP生 成 能 を知 る こ とが 重 要 で あ る と思 わ れ る.ATPは,生 体 酸 化 と共 役 し て い る リン 酸 化 反 応 に よ っ て,ミ トコ ン ド リア 内 で 生 成 さ れ て お り,ミ トコ ン ドリア 呼 吸 能 を測 定 す る こ とに よ り,ATP生 成 能 を推 測 で き る.
Table 4 Cardiac Function
These data were obtained 60 minutes from the termination of CPB (88•}7 minutes after the onset of reperfusion). Ventricular pacing was used to adjust heart rate to control levels.
All values are means•}SD.
*:p<0.05 vs A, **:p<0.005 vs A +:p<0.001 vs B, ++:p<0.05 vs B
Fig. 7 Correlation of Mitochondrial Score, Mitochondrial Respiratory Function and Myocardial ATP Content 酸 素 電 極 法 に よ る ミ ト コ ン ド リア 呼 吸 能 測 定 に お い て,Piを 含 む 反 応 液 に,ミ トコ ン ドリア, コ ハ ク酸 お よ びADPを 加 え る と,コ ハ ク酸+ 2ADP+2Pi+1/2O2→ フ マ ル酸+2ATP+3 H2Oな る 反 応 が 起 き る.こ の場 合,リ ン酸 化 の 効 率 を 示 すP/O比,す な わ ちADP/O比 は2
で あ る.ADP/O比 は,state 3(ATPを 作 り
つ つ あ る と き の 呼 吸 状 態)中 に 消 費 さ れ た 酸 素 の 原 子 数 の 比 と して 計 算 され る.つ ま り,ポ ー
ラ ロ グ ラ フ ィ ー よ りstate 3の 酸 素 消 費 量 が 測
定 さ れ る の で,添 加 したADP量 よ りADP/O
比 が 求 め ら れ る.RCIはstate 3/state 4(ADP が す べ て リン 酸 化 さ れ た と き の 呼 吸 状 態)で 測 定 さ れ る(Fig. 2).い ず れ の 値 も 高 い ほ ど ミ ト コ ン ドリア の 共 役 能 が 強 く,酸 化 的 リ ン酸 化 能 も高 く,ミ トコ ン ド リア のintactnessの 指 標 に な る と考 え られ る. ATPは,ミ トコ ン ドリ ア 内 で,酸 化 的 リ ン酸 化 反 応 に よ って 合 成 され るが,長 時 間 保 存 し た 心 筋 のATPの 減 少 は,ミ トコ ン ド リア の 酸 化 的 リン 酸 化 能 の 低 下 に よ る もの で あ るか,ま た, ミ ト コ ン ド リア 自体 の 形 態 的 な 障 害 に も とず く もの で あ る の か 明 らか で な い.我 々 の検 討 で は, 心 筋ATP量,酸 化 的 リン 酸 化 能(ATP/O比, RCI)お よ びMSの3者 の 間 に は き わ め て 有 意 な 相 関 性 が 認 め ら れ た(Fig. 7).つ ま り長 時 間 保 存 心 筋 の エ ネ ル ギ ー レベ ル の低 下 は,ミ トコ ン ド リア の 障 害 に も とづ く,機 能 的 か つ 形 態 的
漬 法 で は 保 存 時 間 に 限 界 が あ る もの と考 え ら れ る.そ こ で,我 々 は24時 間 よ り安 全 に 心 保 存 す る た め に は,灌 流 法 が 有 用 で あ る と考 え て い る. こ の 点 を,明 らか に す る為 に,MC液 に4℃ で 24時 間 浸 漬 した 群 と,同 じ く4℃ のMC液 で24 時 間 灌 流 保 存 し た 群 と で,心 筋Adenine Nu cleotide,ミ トコ ン ド リア の 機 能 と形 態 及 び 移 植 後 心 機 能 等 に つ い て 比 較 し た. 心 筋 収 縮 力 は,高 エ ネ ル ギ ー リ ン酸 化 合 物 で あ るATP, ADPな ど に 規 定 さ れ,特 に 虚 血 中 の 心 筋 内ATP残 余 量 が,虚 血 解 除 後 の 心 機 能 回 復 と直 接 相 関 す る と言 われ て い る13). Schapar ら14)は,虚 血 後 心 拍 動 を得 る た め に は,心 筋 内 ATPレ ベ ル が0.5∼1.0μmoles/g wet weight 必 要 で あ る と し,Kublerら15)は,3.5μmoles/ g wet weight以 上 必 要 で あ る と して い る.ま た, ATP含 有 量 が2.0μmoles/g wet weight以 下 で 心 筋 の 壊 死 が 起 こ り16),虚血 前 値 の20%以 下 の 低 下 でstone heartが 起 こ る と言 わ れ て い る17). 我 々 の 実 験 で は 浸 漬 法 で は,ATPが8.29±2.91 μmoles/g proteinで,灌 流 法 で は17.6±5.37 μmoles/g proteinで あ っ た.し た が っ て 浸 漬 法 で も 灌 流 法 で も,い ず れ の保 存 心 も虚 血 解 除 後 心 拍 動 は 得 られ た.し か しATP量 は,有 意 に 灌 流 保 存 心 で 高 値 で あ り,MS及 び ミ トコ ン ド リア 呼 吸 能 も,灌 流 法 で 有 意 に す ぐれ て い た. つ ま り灌 流 法 で は,浸 漬 法 に 比 べ て ミ トコ ン ド リア の 保 存 状 態 が 良 く,ミ ト コ ン ド リア の 酸 化 的 リ ン酸 化 が 促 進 さ れ,心 筋ATPの 残 余 量 も 多 く,移 植 後 心 機 能 の 回 復 も良 くな っ た も の と 思 わ れ る. 浸 漬 法 で は,保 存 時 間 の 延 長 に と も な っ て 心 保 存 後 も,ミ ト コ ン ド リア の 障 害 は 浸 漬 法 に 比 べ て 少 な く,機 能 的 に も形 態 的 に も良 好 に 保 存 され,心 筋 の エ ネ ル ギ ー レ ベ ル を 高 値 に 保 つ こ とが で き る もの と考 え られ る.以 上 よ り,長 時 間 心 保 存 に お い て は,灌 流 法 が 浸 漬 法 に 比 べ て, よ り安 全 な 保 存 法 で あ る と考 え ら れ た. 次 に 虚 血 組 織 に 対 して,酸 素 の 供 給 を 有 利 に す る と い わ れ る,人 工 血 液(PFC)に つ い て 検 討 を加 え た.用 い た 人 工 血 液 の 素 材 は,フ ル オ ロ カー ボ ン(FC)で あ る.FCは,ふ っ素 と炭 素 の 化 合 物 で,化 学 的 に は 過 ふ っ 化 炭 素(per fluoro carbon)で あ る.我 々 が 用 い た フ ル オ ゾ ー ルDA(以 下,FDAと す る)は,パ ー フ ル オ ロ デ カ リ ン(FDC)と パ ー フ ル オ ロ トリプ ロ ピル ア ミン(FTPA)を7対3の 割 合 で 混 合 し, プ ル ロ ニ ッ クF68と レ シ チ ン で乳 化 した もの で あ る.こ れ は,乳 剤 で は あ る が,臓 器 蓄 積 が 少 な く,粒 子 径 の安 定 性 も よ い と さ れ,臨 床 的 に 使 用 して も さ しつ か え な い と され て い る18)19).FC 乳 剤 に 関 して,酸 素 の 取 り込 み や,そ の 解 離 機 構 に つ い て,詳 細 は 明 らか に され て い な い が, 酸 素 はFC粒 子 の 表 面 に つ け られ る もの で は な く,酸 素 分 圧 に 応 じてFC粒 子 の 内 部 構 造 に 取 り込 ま れ,ま た そ こ か ら離 さ れ る と い わ れ て い る.そ の 酸 素 の授 受 速 度 は,ヘ モ グ ロ ビ ン の 数 分 の1の 速 さ で あ り,ま た,低 温 に お い て も, 酸 素 配 送 能 は 変 化 しな い と され る20)21).この 点 に お い て,PFC液 は,低 温 灌 流 保 存 法 に と っ て 有 益 で あ る と考 え られ る. 我 々 は,灌 流 保 存 中 に 冠 静 脈 洞 よ り流 出 す る, 嫌 気 性 代 謝 産 物 で あ る乳 酸 量 を測 定 して,PFC 液 を用 い る と,そ の 排 泄 量 が 有 意 に 低 値 と な る
事 を報 告 し た1).つ ま り,灌 流 液 にFDAを 添 加 す る と,低 温 条 件 に お い て も,心 筋 細 胞 に 多 く の 酸 素 が 供 給 さ れ,嫌 気 性 代 謝 が 抑 制 さ れ る と と もに,残 存 す る好 気 的 代 謝 に 対 して エ ネ ル ギ ー 源 も供 給 さ れ,そ の 結 果,乳 酸 の 排 泄 量 が 減 少 す る もの と考 え られ た.十 分 な 冷 却 に よ っ て, 代 謝 の 抑 制 さ れ た 保 存 心 に お け る酸 素 需 要 量 は, 極 め て 微 量 で あ り,灌 流 液 に よ る酸 素 供 給 の 必 要 性 に つ い て は 疑 問 も あ る.し か し,長 時 間 心 臓 を保 存 す る 際 に は,微 細 な 嫌 気 性 代 謝 とい え ど も無 視 す る こ と は で きず,灌 流 液 と してFDA を 用 い る事 は よ り安 全 性 の 高 い 心 保 存 法 と考 え られ た. Kanterら は,FC添 加cardioplegiaとblood 及 びcrystalloid cardioplegiaを 比 較 し て,FC 添 加cardioplegiaは,心 筋 組 織 内 酸 素 分 圧 を 高 め,心 筋 酸 素 消 費 量 を増 大 させ,心 筋 の 好 気 的 代 謝 を促 し,心 機 能 回復 に 有 用 で あ っ た と報 告 し た22). Flahertyら は,虚 血 心 筋 に 対 す るFC 添 加cardioplegiaの 有 効 性 を31PNMRを 用 い て 検 討 し た 結 果 ① 細 胞 内pH低 下 の 抑 制,② 心 筋 内ATP, phosphocreatineの 維 持,③Piの 蓄 積 抑 制 等 に 有 用 性 を認 め た と報 告 して い る23). ま た,Novickら は,心 機 能 面 お よ び 心 筋 の 電 顕 像 よ り,FC添 加cardioplegiaの 有 用 性 を述 べ て い る24).我 々 の 灌 流 保 存 法 に お い て もPFC液 を 使 用 す る と,心 筋 ミ ト コ ン ド リア は 形 態 的 に も機 能 的 に も よ く保 存 さ れ,心 筋 のAdenine Nucleotideが 高 値 に 保 た れ,移 植 後 心 機 能 の 回 復 が 速 や か に な っ た.以 上 よ り,PFC液 は,長 時 間 灌 流 心 保 存 に と っ て,有 用 な灌 流 液 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た.長 時 間 心 保 存 法 と して,PFC 液 を用 い た 灌 流 保 存 が 勝 れ て い る こ とは,今 回 の わ れ わ れ の実 験 で も示 さ れ た が,臨 床 応 用 す る た め の 問 題 点 と し て,灌 流 す る た め の 装 置 や 保 存 中 の モ ニ ター 装 置 が 必 要 で あ る こ と,複 雑 な 操 作 に と もな う感 染 の 危 険 性 な どが あ る.特 に 今 後 の 課 題 と して,グ ラ フ ト輸 送 の た め に は, 装 置 の ポー タ ブ ル 化 が 是 非 必 要 に な っ て 来 る. Cooperら は,ポ ー タ ブ ル 灌 流 装 置 を 臨 床 に 用 い て,4例 に 対 し て7∼17時 間 灌 流 保 存 し た 後 に 心 移 植 を行 っ て,良 好 な 結 果 をお さめ た25).今 後 わ れ わ れ も,灌 流 装 置 の 種 々 の 問 題 点 を 克 服 し, 安 全 な 灌 流 保 存 法 を確 立 し,臨 床 応 用 した い も の で あ る. 結 論 1. 24時 間 心 保 存 法 と し て,低 温 持 続 冠 灌 流 法 の 有 用 性 を評 価 す る た め に,低 温 単 純 浸 漬 法 を 対 照 と して,ミ トコ ン ド リア 呼 吸 能,ミ トコ ン ド リア ス コ ア,心 筋Adenine Nucleotide量, 同 所 性 移 植 後 心 機 能 を 測 定 し,比 較 検 討 し た. また,灌 流 保 存 液 と し てperfluorochemicalの 有 用 性 を評 価 す る た め に,modified Collins液 を対 照 と し て,同 様 のparameterを 用 い て,比 較 検 討 し た. 2. 灌 流 法 で は,浸 漬 法 に 比 べ て,ミ トコ ン ド リア 呼 吸 能,ミ ト コ ン ド リア ス コ ア,心 筋 Adenine Nucleotide量 が 高 値 に 保 た れ,移 植 後 心 機 能 回復 率 も有 意 に 良 好 な 値 を示 し た.し た が っ て,24時 間 心 保 存 法 と し て,灌 流 保 存 法 の 有 用 性 が 示 唆 され た. 3. PFC液 を 用 い た 灌 流 保 存 で は,MC液 に 比 べ て,ミ トコ ン ド リア 呼 吸 能,ミ ト コ ン ド リ ア ス コ ア,心 筋Adenine Nucleotide量,移 植 後 心 機 能 回 復 率 の値 が 有 意 に 高 値 とな り,PFC 液 の 灌 流 保 存 液 と し て の 有 用 性 が 示 唆 さ れ た. 4. 心 筋 ミ ト コン ドリ ア 呼 吸 能(ADP/O比, RCI),ミ トコ ン ド リア ス コ ア,及 び 心 筋ATP 量 の 間 に は,き わ め て 有 意 な 相 関 性 を示 し,こ れ らは,心 拍 再 開 後 の 心 機 能 を 予 想 す る 上 で, 有 用 な指 標 とな る も の と考 え られ た. 稿 を終 え るに臨 み,御 指 導,御 校 閲 を賜 っ た,寺 本 滋 教 授 に 深甚 な る感 謝 の意 を捧 げ る とと もに, 直 接御 指 導 頂 きま した,妹 尾 嘉 昌助教 授 並 び に第2 外 科 の諸 学 兄 に深 謝 す る. 本論 文 の 要 旨 は,第88回 日本 外科 学 会 総会,第18 回 日本 心 臓 外科 学 会 お よび第8回 国 際 心 臓移 植 学会 に お い て発 表 した.
6) Jaworek D, Gruber W and Bergmeyer HV: Adenosin-53 diphosphate and Adenosin-53 monophos phate; in Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer HV ed., 2nd ed. (Transl from 3rd German ed.), Verlag Chemic Weineim and Academic Press, New York and London (1974) pp 2127-2131. 7) Atkinson DE: The energy charge of the adenylate pool as a regulatory parameter. Interaction with
feedback modifiers. Biochemistry (1968) 7, 4030-4134.
8) 永 野 俊 雄,村 上 悟,大 隅 正 子,小 沢 英 浩,野 々 村 禎 昭:電 子 顕 微 鏡 生 物 試 料 作 成 法.日 本 電 子 顕 微 鏡 学 会 関 東 支 部 編,丸 善,東 京 (1975) pp 17-21.
9) Flameng W, Borgers M, Daenen W and Stalpaert G: Ultrastructual and cytochemical correlates of myocardial protection by cardiac hypothermia in man. J Thorac Cardiovasc Surg (1980) 79,
413-424.
10) Lower RR and Shumway NE: Studies on the orthotopic homotransplantation of the canine heart. Surg Forum (1960) 11, 18-19.
11) Reitz BA, Brody WR, Hickey PR and Michaelis LL: Protection of the heart for 24hr with intracellular (high k+) solution and hypothermia. Surg Forum (1974) 25, 149-151.
12) 西 元 寺 秀 明:長 時 間 浸 漬 保 存 心 の 移 植-実 験 的 研 究-.移 植 (1984) 19, 314-321.
13) Hearse DJ, Stewart DA and Cain EB: Recovery from cardiac bypass and elective cardiac arrest. The metabolic consequences of various cardiaoplegic procedures in the isolated rat heart. Circ Res
(1974) 35, 448-457.
14) Schaper J, Winkler JMB and Schaper W: Ultrastractural, functional and biochemical criteria for estimation of reversible myocardial ischemic injury: a study on the effects of global ischemia on the
isolated dog heart. J Mol Cell Cardiol (1979) 11, 521-541.
15) Kiibler W and Spiekermann PG: Regulation of glycolysis in the ischemic and the anoxic myocar dium. J Mol Cell Cardiol (1970) 1, 351-377.
16) Gudbjarnason S: Acute alterations in energetics of ischemic heart muscle. Cardiology (1971) 56, 231-244.
17) Hearse DJ, Garlick PB and Humphrey MS: Ischemic contracture of the myocardium, Mechanisms and prevention. Am J Cardiol (1977) 39, 986-993.
18) 光 野 孝 雄,大 柳 治 正:人 工 血 液-血 液 ガ ス 運 搬 体 と し て のPEC乳 剤-.医 学 の あ ゆ み (1980) 105, 553 -561 . 19) 光 野 孝 雄:人 工 血 液 と し て のPFC乳 剤,Fluosol-DA.外 科 (1985) 47, 1510-1516. 20) 光 野 孝 雄,大 柳 治 正:血 液 ガ ス 運 搬 体 と し て の フ ル オ ロ カ ー ボ ン 乳 剤(人 工 血 液).救 急 医 学 (1980) 4, 57-64.
21) Magovern GJ Jr,
Flaherty
JT,
Gott VL,
Bulkley BH and Gardner TJ: Optimal myocardial
protection with fluosol cardioplegia.
Ann Thorac Surg (1982) 34, 249-256.
22) Kanter KR, Jaffin JH, Ehrlichman RJ, Flaherty JT, Gott VL and Gardner TJ: Superiority of
perfluorocarbon
cardioplegia
over blood or crystalloid cardioplegia.
Circulation (1981) 64, Suppl
2, 75-80.
23) Flaherty JT, Jaffin JH, Magovern GJ Jr, Kanter KR, Gardner TJ, Miceli MV and Jacobus WE:
Maintenance
of aerobic metabolism
during global ischemia with perfluorocarbon
cardioplegia
improves myocardial preservation.
Circulation (1984) 69, 585-592.
24) Novick RJ, Stefaniszyn HJ, Michel RP, Burdon FD and Salerno TA: Protection of the hypertro
phied pig myocardium,
A comparison of crystalloid,
blood, and fluosol-DA
cardioplegia during
prolonged aortic clamping.
J Thorac Cardiovasc Surg (1985) 89, 547-566.
25) Cooper DKC, Wicomb WN and Barnard CN: Storage of the donor heart by a portable hypothermic
perfusion system, experimental development and clinical experience.
J Heart Transplant
(1983) 2,
(Director: Prof. S. Teramoto)
To assess the viability of canine hearts after prolonged ex-vivo heart preservation, we evaluated the myocardial metabolism by determining the high energy phosphate(HEP) levels and respiratory function of isolated mitochondria(MRF). Furthermore, we calculated the mitochondrial score(MS) for semi-quantitative analysis of ultrastructural changes. These three indicators were compared with the left ventricular functioin (LVF) following orthotopic heart transplantation (H-TX). Forty two hearts, harvested from mongrel dogs, each weighing 8.5kg•`15kg, were divided into 3 groups: 24-hour immersion in modified Collins solusion(MC) (group A), 24-hour perfusion with MC(group B) and 24-hour perfusion with MC containing perfluorochemicals(PFC)(group C). After the 24-hour preservation, biopsies were obtained from 7 hearts in each group and HEP levels, MRF and MS were determined. The HEP levels, MRF and MS were significantly higher in group C than in group B and significantly higher in group B than group A. The cardiac function after H-TX revealed a similar tendency. These findings indicate that continuous hypothermic perfusion provides better protection than simple hypothermic immersion and that perfusion with an intracellular solution containing PFC preserves and protects an organ sufficiently before clinical heart transplantation.
