脱灰による軟骨組織の染色性への影響
－ Safranine0-First Green
染色、Truidine Blue
染色を用いての検討－小岸久美子、 松下隆寿
京都大学再生医科学研究所技術部
目的
再生医科学研究所技術部では、骨組織や細胞 、種々の基質上での軟骨の再生実験をおこなったものの標本作製が依頼 される。
軟骨の染色にはSafranine0-First Green染色、Truidine Blue染色、alcian blue染色がある。
これまで酢酸浸漬時間、脱灰操作によってSafranine0-First Green染色で染色すると、染色態度が異なることがわかった。
今回、脱灰液の種類、脱灰条件の違いによる軟骨染色への影響を、Safranine0-First Green染色、Truidine Blue染色を用い て検討をおこなった。
材料と方法
１、７週齢Balb/c♀マウスの膝関節部を含む長骨の皮膚、筋肉を取り除く ２、10％緩衝ホルマリンで２週間常温固定
３、水洗後、脱灰操作をおこなう ４、定法にてパラフィン切片作製
５、safranine0-First Green染色、Truidine Blue染色を行ない、脱灰液及び脱灰条件の違いによる 影響を検討する
検討条件
以下の異なった脱灰条件で検討する。
①Plank-Rychlo法（酸脱灰）：室温 18時間
②10％EDTA：室温 ２、３、６週間
③10％EDTA：37℃（恒温器） １、２、３、６週間
④10％EDTA：4℃（冷蔵庫） ２、３、６、８週間、３カ月
検討方法
Safranine0-First Green染色とTruidine Blue（大野法）染色とを用いて脱灰の影響を検討する。
＜Safranine0-First Green染色＞
以下の方法でSafranine0-First Green染色をおこなった。
１、脱パラ
２、水 洗： 流水 10分 ３、核 染： Hematoxylin(Mayer)染色 5分 ４、水 洗： 流水 10分
５、Fast Green染色： 5分 ６、１％酢酸水浸漬： 1分
７、Safranine 0染色： 10分
８、脱 水 100%エタノールで手早く3回洗い、100%エタノールで30秒、1分、３分と３回脱水 ９、透徹、封入
＜Truidine Blue染色：大野法＞
酸性ムコ多糖は赤紫に染まりメタクロマジ－陽性をしめす。核やその他の組織成分は青色を示す。
メタクロマジ－においてｐHは重要な因子であり、ｐHを変化させることにより酸性ムコ多糖の識別にも 利用される。今回、この大野法を用いて染色性の検討をおこなった。
表１ 大野法による酸性ムコ多糖の染色結果
ヒアルロン酸 コンドロイチン硫酸 ムコイチン硫酸
ｐH２．５
－
＋
ｐH４．１、７．０
＋
＋
表２ 大野法における緩衝液の調整方法
pH
A液(ml) B液(ml)２．５ １９．０ １．０
４．１ １２．０ ８．０
７．０ ３．５ １６．５
A液：1/10M クエン酸
クエン酸(C6H8O7・H2O＝210.14) 2.1gを蒸留水にて全量100mlにする B液：1/5M リン酸水素二ナトリウム
リン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4・12H2O) 7.16gを蒸留水にて全量100mlにする
以下の方法でTruidine Blue染色を行った。
１、脱バラ
２、D.W. 30秒ｘ３
３、0.05%トルイジンブルー（大野法pH7.0 or pH2.5） 30分 ４、D.W. ｘ５ さっと
５、100％EtOH ｘ３ さっと脱水後、透徹、封入
結果
再生医科学研究所技術部では、通常Plank-Rychlo法での酸脱灰をおこなっており、今回の実験でも室温で18時間と短 時間で脱灰効果があり使いやすい方法である。しかし、パラフィンブロックの薄切後、免疫染色等に使用する場合、酸脱 灰では困ることもあり、EDTAを用いた中性脱灰の必要性がある。
Plank-Rychlo法（酸脱灰）の染色結果は、Safranine0-First Green染色は骨端軟骨板部分(a)の赤色は濃く、骨端部分(b) はそれよりは薄い赤色です。ｐH7でのTruidine Blue染色は(a)メタクロマジーが強く出ている。それに比べると(b)はメタ
クロマジーがやや弱い。ｐH2.5では(a)部分の色調がやや薄い。(b)は染まっていない。この染色性の差は各部位の成分の 量の差なのだろうか。
室温での10％EDTA脱灰では、２週間ではSafranine0-First Green染色では、(a)は濃く染まっている。(b)はやや薄い赤。
ｐH7のTruidine Blue染色では、(a)はメタクロマジーが強く(b)はメタクロマジーそれよりやや弱い。ｐH2.5では(a)部分 の色調が薄くなってきている。(b)は染まっていない。３週間でもSafranine0-First Green染色ではまだ(a) (b)ともに染まっ ているが、ｐH7のTruidine Blue染色では、(a)はメタクロマジーが強く(b)は濃紺に染まってきている。ｐH2.5では(a)部 分の色調がかなり薄くなり (b)は染まっていない。６週間になるとSafranine0-First Green染色でも赤色がかなり薄い。
ｐH7のTruidine Blue染色では、(a)はほとんど色が抜け細胞だけが見えている。 (b)は濃紺に染まっている。ｐH2.5では
(a) (b)ともに全く染まっていない。
37℃の恒温器での10％EDTA脱灰は、１週間ではSafranine0-First Green染色では、(a)は室温脱灰の1/4程に赤色が薄く なっている。(b)も薄くなっている。ｐH7のTruidine Blue染色では、(a)はメタクロマジーが出ているが、色がかなり薄く なっている。 (b)は色調もメタクロマジーもかなり薄い。ｐH2.5では(a) (b)ともに染まっていない。２週間になると Safranine0-First Green染色では、(a)はわずかに赤色が感じられるほどで、(b)はまったく染まっていない。ｐH7のTruidine Blue染色では、(a)はわずかに薄紫で (b)はそれより弱い薄紫。ｐH2.5では(a) (b)ともに染まっていない。３週間なると Safranine0-First Green染色では、(a) (b)ともにほとんど染まっていない。ｐH7のTruidine Blue染色では、(a)は染まってい ず (b)はほんのわずかメタクロマジーが感じられる程度。ｐH2.5では(a) (b)ともに染まっていない。６週目Safranine0-First
Green染色、Truidine Blue染色（ｐH7、ｐH2.5）いずれでも染まっていない。しかし、骨端軟骨内二次骨化中心部(c)が、
薄い赤紫に染まっていた。
4℃（冷蔵庫）での10％EDTA脱灰は、脱灰に時間がかかり２週目では少し薄切しにくかった。Safranine0-First Green 染色では、(a) (b)ともに鮮やかに染まっている。ｐH7のTruidine Blue染色でも、(a) (b)ともに非常に濃く染まっている。
ｐH2.5では(a)は室温の2週目より濃く染まっている。 (b)もうっすら染まっている。３週目でもSafranine0-First Green染 色では(a)は２週目とほぼ同じくらい染まっており (b)はわずかに薄くなっているようだ。ｐH7のTruidine Blue染色では、
(a) (b)ともに２週目よりはやや薄くなっているが、はっきりしている。ｐH2.5は２週目と同じ。６週目になると
Safranine0-First Green染色では(a)の端の方がはっきりと薄くなってきており、中心部もわずかに薄くなっている。ｐH7
のTruidine Blue染色では、３週目より薄くなってきているが、室温の２週目よりは濃く染まっている。ｐH2.5では(a) は
やや薄くなっており、端はかなり薄くなっている。(b)は３週目と同じ。８週目ではSafranine0-First Green染色、ｐH7、 ｐH2.5 Truidine Blue染色は６週目とほぼ同じくらい。３ヶ月目ではSafranine0-First Green染色は８週目とほとんど同じく
らい。ｐH7、ｐH2.5 Truidine Blue染色は(a) (b)ともに８週目より薄くなってきているが、室温の２週目よりは濃く染まっ
ている。
考察
今回の実験の結果、染色性のことを考えると、4℃（冷蔵庫）での脱灰が好ましいが、組織が大きくなった場合、所要 時間がかなり長くなるという難がある。最初に組織を薄く切るか、脱灰しながら薄くしていく等の工夫がいる。また、37℃ の恒温器での10％EDTA脱灰は、脱灰作用は速いが染色性が急激に落ちることがわかった。このことより軟骨の再生実 験を行なった試料の染色の場合、事前に試料の大きさ、種類に合せた脱灰条件の検討が必要となる。
大野法によるｐHを変えたTruidine Blue染色での染め分けで、EDTA脱灰の場合、特に37℃や室温での長期の脱灰操 作では染色性の消失が見られるので、酸性ムコ多糖部分の流出など何らかの変化が考えられる。今後、免疫染色等を用い て変化の内容を確認する実験をおこなう必要がある。
当研究所技術部では、さまざまな条件で実験された軟骨組織や細胞の標本作製依頼があり、今回の結果をもとに、依頼 される研究者と検討しながら染色条件を決めていく。
