日本大学大学院松戸歯学研究科歯学専攻

添加物配合飼料が骨粗鬆症モデルラットの大腿骨骨梁構造に与える影響

日本大学大学院松戸歯学研究科歯学専攻 佐藤 佳奈美

（指導：河相 安彦）

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Ⅰ . Abstract

Ⅱ . 緒 言

Ⅲ . 研 究 １ ： フ ラ ク ト オ リ ゴ 糖 ， イ ソ フ ラ ボ ン お よ び ク エ ン 酸 カ ル シ ウ ム 混 合 飼 料 （ AFD) に よ る 骨 粗 鬆 症 ラ ッ ト の 大 腿 骨 骨 質 へ の 効 果

１ ． 材 料 お よ び 方 法 １ ） 飼 料 の 製 作 ２ ） 実 験 動 物 ３ ） 測 定 方 法

（ １ ） 血 液 生 化 学 検 査

（ ２ ） BMD お よ び BMC の 測 定

（ ３ ） 3D-map の 観 察

（ ４ ） 骨 梁 構 造 計 測

（ ５ ） 非 脱 灰 標 本 の 観 察 ４ ） 統 計 解 析

２ ． 結 果 ３ ． 小 活

Ⅳ . 研 究 Ⅱ ：添 加 物 配 合 飼 料（ AFD ）が 卵 巣 摘 出 ラ ッ ト（ OVX) の 大 腿 骨 骨 の 構 造 に お よ ぼ す 効 果

１ ． 材 料 お よ び 方 法 １ ） 飼 料 の 製 作 ２ ） 実 験 動 物 ３ ） 測 定 方 法

（ １ ） BMD お よ び BMC の 測 定

（ ２ ） 3D-map の 観 察

（ ３ ） 骨 梁 構 造 計 測

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（ ４ ） 非 脱 灰 標 本 の 観 察 ４ ） 統 計 解 析

２ ． 結 果 ３ ． 小 活

Ⅴ ． 考 察

Ⅵ ． 結 論

Ⅶ ． 参 考 文 献

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Ⅰ ． Abstract Background

Osteoporosis increases the risk of bone fractures in the elderly, and in consequence leads to the need of nursing care. The fear of slip/falling limits the activities of the elderly decrease their exercise. The decreased exercise leads to sarcopenia. This creates a vicious circle of reduced motor function and further decline of muscle strength.

Additive formula diet (AFD) contains fructo-oligosaccharide (FOS), isoflavone (ISO) and 1 % Ca as a supplement for patients with osteoporosis to supply sufficient calcium intake and absorption.

Objectives

This study aimed to develop and test the effect of AFD to low mineral diet fed and ovariectomized (OVX) osteoporosis rats. The bone volume and bone quality was assessed as the outcome of the study.

Material and Methods Research1

Ten rats were randomly assigned into 2 groups (n=5). The 2 groups were fed a low-mineral diet (LMD; Oriental Koubo Industry Co., Tokyo, Japan) for 189 days. At 190 days, the rats were fed LMD+Normal mineral diet (NMD), and LMD+AFD for 84 days. The mice were euthanized with carbon dioxide after blood collection from the jugular vein. Under anesthesia, the femur was removed after 273 days of intervention.

Research2

Sixteen 20-week old ovariectomized rats were randomly distributed into 2 groups;

one group was fed normal diet (n = 8) and the second group was fed AFD (n = 8). Both

groups were fed for 24 weeks, and body weight was measured at 8 and 24 weeks. After

measuring the weight at 24 weeks, rats were euthanized using carbon dioxide. Lateral

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femur bone was extracted, and Bone Mineral Density (BMD) and Bone Mineral Content (BMC) were measured via micro computed tomography. Non-decalcified ground sections of the femur were examined via polarized-light microscopy.

Results

AFD showed significant improvement of bone volume, BMD and BMC, and bone quality, bone structure; both with LMD and OVX rats compared to NMD fed rats. The supplement also showed no prominent side effect from the blood test and growth.

Conclusion

Based on the results of Study I and Study II, AFD showed significant an effect of

improving BMD, BMC and trabecular structure of osteoporosis rats with malnutrition

and OVX. Therefore, it was suggested that AFD improves trabecular structure for

osteoporosis.

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Ⅱ . 緒 言

世 界 の 総 人 口 は 増 加 傾 向 に あ り ，総 人 口 に 占 め る 65 歳 以 上 の 人 口 比 率 は ， 1950 年 の 5.1 ％ か ら 2010 年 の 7.7 ％ へ 上 昇 し て い る 。 世 界 の 高 齢 化 は 今 後 も 急 速 に 進 展 す る

と 言 わ れ て い る な か で ， 日 本 は 既 に 超 高 齢 化 社 会 を 迎 え て い る

。 急 速 な 高 齢 化 に よ り 高 齢 者 の 骨 お よ び 関 節 に 関 連 す る 疾 病 が 増 加 し ， そ の 対 応 は 重 要 な 課 題 と な っ て い る 。ア ジ ア 圏 で は 大 腿 骨 頸 部 骨 折 が こ の 20 年 間 で 3 倍 に 増 加 し ， そ の 8 割 が 閉 経 女 性 で 占 め ら れ て い る

。 日 本 で も 多 く の 骨 粗 鬆 患 者 が 存 在 す る と さ れ て い る が ， 大 多 数 は 病 識 に 乏 し く ， 潜 在 化 し て い る 状 況 で あ る

。 骨 密 度

（ Bone mineral density 以 下 BMD ） の 低 下 を 主 徴 と す る 骨 粗 鬆 症 は ， 高 齢 者 に お け る 骨 折 の 増 加 ， ひ い て は 要 介 護 者 の 増 加 へ 結 び つ く と 考 え ら れ て い る 。 ひ と た び 骨 折 を 経 験 す る と 再 転 倒 の 回 避 か ら 行 動 が 制 限 さ れ ， 運 動 量 と 筋 力 の 減 少 を 伴 う サ ル コ ペ ニ ア が 誘 発 さ れ ，身 体 機 能 の 低 下 に 伴 う ADL （ 日 常 生 活 動 作 ）の 低 下 を 引 き 起 こ す 。施 設 入 居 者 は 転 倒 お よ び 骨 折 の ハ イ リ ス ク 群

で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る の は 施 設 入 居 者 に サ ル コ ペ ニ ア の 状 態 を 呈 す る 者 が 多 い こ と が 関 連 し て い る と 考 え ら れ る 。

歯 科 領 域 お け る 骨 粗 鬆 症 に 関 す る 報 告 と し て ， 骨 粗 鬆 症 と 臼 歯 の 損 失 と の 間 に 有 意 な 相 関 を 認 め た と い う 報 告

， 低 BMD の 骨 粗 鬆 症 患 者 で は 咀 嚼 能 率 が 有 意 に 低 下 し て い る と の 報 告

が あ る 。 ま た ， 骨 粗 鬆 症 に 罹 患 し て い な い 無 歯 顎 者 は 罹 患 し て い る 無 歯 顎 者 と 比 較 し て 有 意 に 咀 嚼 能 率 が 高 い と の 報 告

も あ る 。 従 っ て ，骨 粗 鬆 症 の 予 防 と 改 善 は ，全 身 お よ び 口 腔 領 域 に お け る 高 齢 者 の 自 立 と QOL の 維 持 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る と 考 え ら れ る 。

閉 経 や 加 齢 変 化 に 伴 い 高 齢 者 の 骨 吸 収 量 は 骨 の 形 成 量 を 大 き く 上 回 る た め に ，

骨 量 お よ び 骨 質 の 低 下 を 招 く と さ れ て い る 。 閉 経 以 降 ， 海 綿 骨 は 5 年 間 で 年 間 約

3 % 減 少 す る と さ れ ， 閉 経 後 骨 粗 鬆 症 の 大 き な 要 因 の 一 つ と さ れ て い る 。 ま た ，

高 齢 者 は 加 齢 に 伴 う 生 理 機 能 の 低 下 に よ り ビ タ ミ ン D の 代 謝 が 低 下 し ，カ ル シ ウ

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ム を は じ め と す る ミ ネ ラ ル 群 の 腸 管 に お け る 吸 収 率 が 低 下 す る と さ れ て い る

。 ま た ，厚 生 労 働 省 の 平 成 25 年 国 民 健 康 栄 養 調 査

に よ る と 50 歳 以 上 の 男 女 に お け る カ ル シ ウ ム の 摂 取 量 は 基 準 の 推 定 平 均 必 要 量

に 達 し て い な い と 報 告 さ れ て い る 。

骨 密 度 の 低 下 を 予 防 し ，骨 折 や 転 倒 を 防 止 し 要 介 護 高 齢 者 の QOL 低 下 を 防 ぐ た め に は ， 骨 密 度 の 低 下 予 防 に カ ル シ ウ ム の 摂 取 が 寄 与 し た と い う 複 数 の 臨 床 試 験 の 報 告

に あ る よ う に ，カ ル シ ウ ム の 積 極 的 な 摂 取 と カ ル シ ウ ム の 体 内 吸 収 を 改 善 す る こ と が 求 め ら れ て い る 。

こ の よ う な 背 景 の 中 ， カ ル シ ウ ム 摂 取 の 向 上 を 目 的 に 高 齢 者 が 長 期 に わ た り 安

全 に 使 用 で き る サ プ リ メ ン ト の 開 発 と 体 内 吸 収 を 改 善 す る た め に 吸 収 効 率 を 向 上

さ せ る 配 合 の 検 討 が 行 わ れ て き た 。 先 行 研 究 で は カ ル シ ウ ム の 摂 取 お よ び 吸 収 の

効 率 を 目 的 に ， カ ル シ ウ ム を 代 表 と す る ミ ネ ラ ル 成 分 の 吸 収 促 進 お よ び 腸 内 細 菌

叢 を 変 換 す る フ ラ ク ト オ リ ゴ 糖 （ 以 下 FOS ）

， 腸 内 細 菌 に よ っ て エ ク オ ー ル に

変 換 さ れ る こ と で 強 い エ ス ト ロ ゲ ン 作 用 を 有 す る イ ソ フ ラ ボ ン （ 以 下 ISO ）

に 関 す る 研 究 が 行 わ れ て き た 。し か し ，こ れ ら の 検 討 は FOS ま た は ISO の 単 独 成

分 を 摂 取 さ せ た 研 究 で あ り ， カ ル シ ウ ム 摂 取 量 は 改 善 さ れ な い で き た 。 そ こ で

Nakada ら

は カ ル シ ウ ム を 摂 取 し や す く ， 体 内 の カ ル シ ウ ム 吸 収 効 率 を 考 慮

し た FOS ， ISO お よ び リ ン 酸 カ ル シ ウ ム （ 3.0 % カ ル シ ウ ム 含 有 ） の 3 種 混 合 サ

プ リ メ ン ト を 開 発 し ， ラ ッ ト に 飼 料 と し て 摂 取 さ せ た 結 果 ， 骨 粗 鬆 症 の 予 防 お よ

び 大 腿 骨 骨 幹 部 の 破 断 強 度 の 向 上 に よ る 骨 質 の 改 善 に 有 効 で あ る と の 報 告 を し た 。

し か し ， 含 有 さ れ て い る 3.0 ％ カ ル シ ウ ム 濃 度 は 生 体 に と っ て 必 要 摂 取 量 を 超 え

て お り ， 栄 養 の 均 衡 を 崩 す 可 能 性 が あ る と も 報 告 し て い る

。 そ こ で 本 研 究 は

Nakada ら の 3 種 混 合 サ プ リ メ ン ト 飼 料 に お け る カ ル シ ウ ム 濃 度 を 一 般 で 市 販 さ

れ て い る 飼 料 と 同 程 度 の 1.0% カ ル シ ウ ム 濃 度 に 調 整 し ，リ ン 酸 カ ル シ ウ ム と ク エ

ン 酸 カ ル シ ウ ム の 配 合 比 率 を 変 更 し ， ISO お よ び FOS の 濃 度 は 過 去 の 報 告 に 基 づ

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き 同 じ 濃 度 と し た

新 た な 3 種 混 合 飼 料 （ Additive Formula Diet ， 以 下 AFD ） を 製 作 し た 。本 研 究 は ，骨 粗 鬆 症 モ デ ル ラ ッ ト に お け る AFD の 摂 取 が ，骨 梁 構 造 に 与 え る 影 響 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 に ， 低 栄 養 骨 粗 鬆 症 モ デ ル ラ ッ ト と 卵 巣 摘 出 骨 粗 鬆 症 ラ ッ ト （ 以 下 OVX ） に AFD を 経 口 摂 取 さ せ ， 大 腿 骨 骨 幹 端 に お け る 骨 形 成 お よ び 骨 梁 構 造 の 改 善 と 有 効 性 を 検 討 し た 。 ま ず 研 究 Ⅰ と し て １ ） AFD の 安 全 性 の 検 討 を 血 液 生 化 学 検 査 に て 行 い ， ２ ） 低 栄 養 骨 粗 鬆 症 ラ ッ ト の 大 腿 骨 骨 質 に 及 ぼ す 効 果 を 骨 量 お よ び 骨 梁 構 造 ， ３ ） 偏 光 顕 微 鏡 を 用 い て 視 覚 的 に 骨 梁 の 変 化 お よ び 偏 光 特 性 を 検 討 し た 。続 い て 研 究 Ⅱ と し て AFD が 卵 巣 摘 出 ラ ッ ト の 大 腿 骨 骨 構 造 に お よ ぼ す 効 果 を １ ） 骨 量 お よ び 骨 梁 構 造 ， ２ ） 偏 光 顕 微 鏡 を 用 い た 骨 梁 の 変 化 お よ び 偏 光 特 性 を 観 察 し 検 討 を 行 っ た 。

Ⅲ . 研 究 Ⅰ ： フ ラ ク ト オ リ ゴ 糖 ， イ ソ フ ラ ボ ン お よ び ク エ ン 酸 カ ル シ ウ ム 混 合 飼 料 （ AFD ） に よ る 骨 粗 鬆 症 ラ ッ ト の 大 腿 骨 骨 質 へ の 効 果 （ 日 本 大 学 松 戸 歯 学 部 動 物 実 験 委 員 会 承 認 （ AP13MD008 ））

１ ． 材 料 お よ び 方 法 １ ） 飼 料 の 製 作

飼 料 は AFD ，低 栄 養 食 お よ び 普 通 食 を 製 作 し た 。 AFD （ オ リ エ ン タ ル 酵 母（ 株 ），

東 京 ，日 本 ）は 標 準 飼 料 で あ る AIN-93M （ オ リ エ ン タ ル 酵 母（ 株 ），東 京 ，日 本 ） に FOS ， ISO ， ク エ ン 酸 カ ル シ ウ ム お よ び リ ン 酸 カ ル シ ウ ム を 配 合 し ， カ ル シ ウ ム 濃 度 を 1.0% に 調 整 し た も の と し た 。低 栄 養 食（ オ リ エ ン タ ル 酵 母（ 株 ），東 京 ， 日 本 ， Low Mineral Diet ，以 下 LMD ）は AIN-93M の カ ル シ ウ ム ，リ ン を そ れ ぞ れ 0.1% お よ び フ ッ 素 0.001% 以 下 に し た も の と し ，普 通 食（ オ リ エ ン タ ル 酵 母（ 株 ），

東 京 ，日 本 ， Normal Mineral Diet ，以 下 NMD ）は AIN-93M の カ ル シ ウ ム 濃 度 を 炭

酸 カ ル シ ウ ム お よ び リ ン 酸 カ ル シ ウ ム に よ っ て 1.0% と し た も の と し た 。 AFD ，

LMD お よ び NMD の 組 成 の 詳 細 を Table 1 に 示 す 。

8 ２ ） 実 験 動 物 (Fig.1)

実 験 動 物 は 19 週 齢 Wistar 雌 性 ラ ッ ト （（ 株 ） 三 協 ラ ボ サ ー ビ ス ， 日 本 ） 20 頭 と し ，室 温 23 ± 1 ℃ 湿 度 お よ び 50 ± 1% で ，飼 料 お よ び 水 を 自 由 に 摂 取 で き る よ う 飼 育 し た 。 1 週 間 の 予 備 飼 育 を 行 い 環 境 変 化 に 順 応 さ せ た 後 ， 20 週 齢 時 に 無 作 為 に 2 群 （ LMD+NMD お よ び LMD+AFD ） に 割 り 付 け た 。 各 群 は 20 週 齢 時 か ら 189 日 間 LMD を 摂 取 し ，骨 粗 鬆 症 モ デ ル ラ ッ ト

，と し た 後 ， 190 日 目 か ら 83 日 間 AFD ま た は NMD を 摂 取 さ せ た 。 各 群 は ， 介 入 273 日 後 に 炭 酸 ガ ス に て 安 楽 死 さ せ ， 大 腿 骨 の 摘 出 を 行 い ， 以 下 の 方 法 に よ り 測 定 を 行 っ た 。 な お ，ラ ッ ト の 健 康 状 態 お よ び 成 長 を 確 認 す る 目 的 で 、 20 週 齢 ，介 入 189 日 後 お よ び 介 入 273 日 後 の 体 重 を 測 定 し た 。

３ ） 測 定 方 法

（ １ ） 血 液 生 化 学 検 査

安 楽 死 の 前 に 頚 静 脈 よ り 採 血 を 行 い ， 遠 心 分 離 器 で 3000 回 転 / 分 ， 5 分 間 遠 心 分 離 を 行 っ た 後 ， 血 液 生 化 学 検 査 を 依 頼 （（ 株 ） モ ノ リ ス ， 日 本 ） し た 。

（ ２ ） BMD お よ び BMC の 測 定

摘 出 し た 大 腿 骨 を Nakada ら

の 方 法 に 従 い ， Micro Computer Tomography

（ R_mCT 2

，（ 株 ） リ ガ ク ， 日 本 ， 以 下 CT ） を 用 い て 撮 像 を 行 っ た 。 CT の 撮 像 条 件 は ，管 電 流 160 μ A ，管 電 圧 90 kV ， FOV10 mm ，撮 影 時 間 26 秒 ，ボ ク セ ル サ イ ズ 20 μ m × 20 μ m × 20 μ m と し た 。撮 像 範 囲 は 大 腿 骨 遠 位 骨 幹 端（ 6.0mm

× 5.0mm × 3.0mm ）と し ， BMD お よ び BMC の 測 定 を 行 っ た (Fig.2) 。骨 塩 定 量 フ

ァ ン ト ム（ hydroxyapatite 含 有 量 : 200mg/cm

， 300mg/cm

, 400mg/cm

， 500 mg/cm

，

600mg/cm

， 700mg/cm

， 800mg/cm

， お よ び 1,550mg/cm

） を CT 撮 像 し ，

TRI/3D-BON BMD （（ 株 ） Ratoc System Engineering ， 日 本 , 以 下 TRI/3D-BON ）

に て フ ァ ン ト ム の CT 値 を 校 正 お よ び 検 量 線 を 作 成 し た 。 BMD お よ び BMC は

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撮 像 し た 海 綿 骨 の CT 値 か ら TRI/3D-BON に て 作 成 し た 検 量 線 よ り 算 出 し た 。

（ ３ ） 3D-map に よ る BMD の 観 察

撮 像 し た デ ー タ を TRI/3D-BON に て 3Dimensional- map （ 以 下 3D-map ） に て カ ラ ー マ ッ ピ ン グ を 行 い ， 大 腿 骨 遠 位 骨 幹 端 断 面 の BMD の 観 察 を 行 っ た 。

（ ４ ） 骨 梁 構 造 計 測

CT よ り 得 ら れ た 海 綿 骨 の 断 層 画 像 を 用 い て ， TRI/3D-BON に て 骨 梁 構 造 計 測 を 行 っ た 。 計 測 項 目 は Trabecular Thickness （ 骨 梁 幅 ， 以 下 Tb.Th ）， Trabecular Number （ 骨 梁 数 ，以 下 Tb.N ）， Trabecular Separation （ 骨 梁 間 距 離 ，以 下 Tb.Sp ），

Trabecular Spacing （ 骨 梁 中 心 間 距 離 ，以 下 Tb.Spac ）， Trabecular Bone Pattern factor

（ 骨 梁 の 連 結 性 ， 以 下 TBPf ）， Structure Model Index （ 骨 梁 の 形 態 ， 以 下 SMI ） と し た 。 な お ， TBPf は 骨 梁 に 凹 面 構 造 の 多 い 場 合 は 負 の 値 と な り 骨 梁 の 連 結 は 良 好 で ， 凸 面 構 造 の 多 い 場 合 は 正 の 値 と な り 骨 梁 の 連 結 は 不 良 と な る 。 SMI は ， 0-4 に 算 出 さ れ 示 さ れ る 。 骨 梁 の 形 態 が 球 状 の 場 合 は「 4 」，棒 状 の 場 合 は

「 3 」，板 状 の 場 合 は「 0 」，と な り 骨 梁 が 混 合 状 態 の と き は 各 値 の 中 間 値 と な る 。

（ ５ ） 非 脱 灰 研 磨 標 本 の 観 察

摘 出 し た 大 腿 骨 骨 幹 端 部 の 非 脱 灰 研 磨 標 本 を 作 製 し ， 海 綿 骨 骨 梁 構 造 の 観 察 を 行 っ た 。 標 本 の 作 製 は ， 大 腿 骨 を ア ル コ ー ル に 浸 漬 固 定 後 ， 脱 水 を 行 い ， キ シ レ ン を 用 い て 脱 脂 を 行 っ た 。 そ の 後 ， Methyl Methacrylate 樹 脂 （ オ ス テ オ レ ジ ン TM 包 埋 キ ッ ト （ 株 ） 和 光 純 薬 工 業 ， 日 本 ） を 使 用 し ， 通 法 に し た が い 樹 脂 包 埋 を 行 っ た 。 包 埋 さ れ た 骨 は 自 動 精 密 切 断 機 （ ISOMET, BUEHLER, USA ） に て 大 腿 骨 の 長 軸 に 対 し て 矢 状 方 向 に 薄 切 ，お よ び 研 磨 を 行 い ，厚 さ 100μm と し た 。 作 製 し た 標 本 は 偏 光 顕 微 鏡 （ LEICA M60 ， Leica Microsystems GmbH ， Germany ） を 用 い て 検 板 法 に て 骨 梁 構 造 お よ び 偏 光 特 性 の 観 察 を 行 っ た 。

４ ） 統 計

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2 群 間 の 体 重 ， 血 液 生 化 学 検 査 結 果 ， BMD, BMC お よ び 骨 梁 構 造 計 測 の 比 較 を Mann-Whitney U 検 定 を 行 っ た （ 有 意 確 率 5 ％ ）。

２ ． 結 果 １ ） 体 重 測 定

NMD 群 は AFD 群 と 比 較 し て 介 入 189 目 お よ び 介 入 273 日 後 に お い て 有 意 に 高 い 値 を 示 し た (Table 2) 。

２ ） 血 液 生 化 学 検 査

LMD+AFD の 中 性 脂 肪 は LMD+NMD と 比 較 し て 有 意 に 低 い 値 を 示 し た (Table (p<0.05) 。

３ ） BMD お よ び BMC

BMD お よ び BMC と も に LMD + AFD が LMD + NMD と 比 較 し て 有 意 に 高 い 値 を 示 し た (p<0.05) (Table 4) 。

４ ） 3D-map に よ る BMD の 観 察

カ ラ ー ス ケ ー ル は ，赤 色 が 高 い BMD を 示 し ，青 色 に 移 行 す る に 従 い 低 い BMD を 示 す 。 LMD+AFD の 海 綿 骨 は LMD+NMD と 比 較 し BMD が 高 い こ と が 観 察 さ れ た (Fig.3) 。

５ ） 骨 梁 構 造 計 測

骨 梁 構 造 計 測 の 結 果 を Table 5 に 示 す 。 骨 梁 構 造 計 測 に よ り 海 綿 骨 骨 梁 の 密 度 や 連 結 の 状 態 の 評 価 。

（ １ ） Tb.Th

骨 梁 幅 を 示 す Tb.Th は ， LMD+AFD が LMD+NMD と 比 較 し て 有 意 に 高 い 値

を 示 し （ p<0.05 ） AFD 摂 取 群 が NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 太 い 骨 梁 幅 で あ る こ と

11 が 示 さ れ た 。

（ ２ ） Tb.N

骨 梁 数 を 示 す Tb.N は ， LMD+AFD が LMD+NMD と 比 較 し て 有 意 に 高 い 値 を 示 し （ p<0.05 ） AFD 摂 取 群 が NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 骨 梁 の 緻 密 性 が 示 唆 さ れ た 。

（ ３ ） Tb.Sp

骨 梁 間 距 離 を 示 す Tb.Sp は ， LMD+AFD が LMD+NMD と 比 較 し て 有 意 に 低 い 値 を 認 め （ p<0.05 ） AFD 摂 取 群 が NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 骨 間 距 離 が 短 く 骨 梁 間 の 近 接 に 伴 い 骨 密 度 の 増 加 が 示 唆 さ れ た 。

（ ４ ） Tb.Spac

骨 梁 中 心 間 距 離 を 示 す Tb.Spac は ， LMD+AFD が LMD+NMD と 比 較 し て 有 意 に の 差 を 認 め た 。（ p<0.05 ）。 こ れ よ り ， AFD 摂 取 群 は NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 骨 梁 間 の 近 接 を 認 め 骨 密 度 の 増 加 が 示 唆 さ れ た 。

（ ５ ） TBPf

骨 梁 の 連 結 性 を 示 す TBPf は ， 正 の 値 を 示 し ， 両 群 と も に 凸 面 の 多 い 骨 梁 で あ る こ と が 示 さ れ た 。

（ ６ ） SMI

骨 梁 の 形 態 を 示 す SMI は ，両 群 と も に 混 合 状 態 を 呈 し て い る こ と が 示 さ れ た 。

６ ） 非 脱 灰 研 磨 標 本 の 観 察

LMD+AFD の 海 綿 骨 は LMD+NMD と 比 較 し て 海 綿 骨 骨 梁 同 士 の 連 結 が 多 く ，骨 梁 幅 が 大 き い 。し た が っ て AFD 摂 取 群 は 海 綿 骨 骨 梁 の 密 度 が 高 い こ と が 観 察 さ れ た (Fig.4) 。さ ら に AFD 摂 取 群 か ら は 強 い 偏 光 特 性 が 観 察 さ れ た こ と か ら NMD 摂 取 群 と コ ラ ー ゲ ン 線 維 の 走 行 が 違 う こ と が 示 唆 さ れ た 。

３ ． 小 括

12 以 上 の 結 果 か ら 以 下 の こ と が 小 括 さ れ た 。

１ ）低 栄 養 骨 粗 鬆 症 状 態 ラ ッ ト に AFD を 摂 取 さ せ た 場 合 NMD を 摂 取 さ せ た ラ ッ ト と 比 較 し て 有 意 に 高 い 骨 密 度 お よ び 骨 塩 量 が 得 ら れ た 。

２ ） 低 栄 養 骨 粗 鬆 症 状 態 ラ ッ ト に AFD を 摂 取 さ せ た 場 合 ， NMD 摂 取 さ せ た ラ ッ ト と 比 較 し て 有 意 に 密 度 の 高 い 海 綿 骨 骨 梁 構 造 が 得 ら れ た 。

以 上 よ り ， AFD を 摂 取 さ せ た 低 栄 養 骨 粗 鬆 症 状 態 ラ ッ ト は NMD を 摂 取 し た ラ ッ ト と 比 較 し て 骨 量 お よ び 骨 質 の 改 善 に 有 意 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

Ⅳ . 研 究 Ⅱ : 添 加 物 配 合 飼 料 （ AFD ） が 卵 巣 摘 出 ラ ッ ト （ OVX ） の 大 腿 骨 骨 の 構 造 に お よ ぼ す 効 果 （ 日 本 大 学 松 戸 歯 学 部 動 物 実 験 委 員 会 承 認

（ AP13MD013 ））

１ ． 材 料 お よ び 方 法 １ ） 飼 料 の 製 作

飼 料 は 研 究 Ⅰ で 用 い た AFD お よ び NMD を 使 用 し た (Table 1) 。

２ ） 実 験 動 物

実 験 動 物 は 両 側 卵 巣 摘 出 手 術 を 行 っ た 19 週 齢 の 骨 粗 鬆 症 モ デ ル

（ Ovariectomized rat, 以 下 OVX ） Wistar 雌 性 ラ ッ ト（（ 株 ）三 協 ラ ボ サ ー ビ ス ，日

本 ） 16 頭 と し た 。 ラ ッ ト の 飼 育 は 室 温 23±1 ℃ お よ び 湿 度 50±1% と し ， 餌 お よ び

水 は 自 由 に 摂 取 で き る も の と し た 。 1 週 間 の 予 備 飼 育 を 行 い 環 境 変 化 に 順 応 さ せ

た 後 ， 20 週 齢 時 に 無 作 為 に 2 群（ OVX+NMD お よ び OVX+AFD ）に 割 付 け 介 入 を

開 始 し た 。各 群 は ，介 入 24 週 後 に 炭 酸 ガ ス に て 安 楽 死 さ せ ，大 腿 骨 の 摘 出 を 行 っ

た (Fig.5) 。な お ，ラ ッ ト の 健 康 状 態 お よ び 成 長 を 確 認 す る た め ，介 入 8 週 後 ， 24

週 後 に 体 重 を 測 定 し た 。

13 ３ ） 測 定 方 法

（ １ ） BMD お よ び BMC の 測 定

摘 出 し た 大 腿 骨 を Nakada ら

の 方 法 に 従 い CT 撮 像 を 行 っ た 。 CT の 撮 像 条 件 は ， 研 究 Ⅰ と 同 様 で あ る (Fig.2) 。 研 究 Ⅰ と 同 様 に 骨 塩 定 量 フ ァ ン ト ム を CT で 撮 像 し ， TRI/3D-BON に て フ ァ ン ト ム の CT 値 を 校 正 し ， 検 量 線 を 作 成 し た 。 BMD お よ び BMC は 撮 像 し た 海 綿 骨 の CT 値 か ら 作 成 し た 検 量 線 を 用 い て 算 出 し た 。

（ ２ ） 3D-map の 観 察

研 究 Ⅰ と 同 様 に 撮 像 し た デ ー タ を TRI/3D-BON に て 3Dimensional-map （ 以 下 3D-map ） に て カ ラ ー マ ッ ピ ン グ を 行 い ， 大 腿 骨 遠 位 骨 幹 端 断 面 の BMD を 観 察 し た 。

（ ３ ） 骨 梁 構 造 計 測

研 究 Ⅰ と 同 様 に CT よ り 得 ら れ た 海 綿 骨 の 断 層 画 像 を 用 い て ， TRI/3D-BON に て 骨 梁 構 造 計 測 を 行 っ た 。

（ ４ ） 非 脱 灰 研 磨 標 本 の 観 察

研 究 Ⅰ と 同 様 に 大 腿 骨 骨 幹 端 部 の 非 脱 灰 研 磨 標 本 を 作 製 し ， 海 綿 骨 骨 梁 構 造 の 観 察 を 行 っ た 。 標 本 は 偏 光 顕 微 鏡 を 用 い て 検 板 法 に て 骨 梁 構 造 お よ び 偏 光 特 性 の 観 察 を 行 っ た 。

４ ） 統 計 解 析

体 重 ， BMD, BMC お よ び 骨 梁 構 造 計 測 の 2 群 間 の 比 較 は Student’s t-test に て 行 っ た （ 有 意 確 率 5 ％ ）。

２ ． 結 果 １ ） 体 重

NMD 群 は AFD 群 と 比 較 し て 介 入 8 週 後 お よ び 24 週 後 に お い て NMD 群 が 有

14 意 に 高 い 値 を 示 し た (Table 6) 。

２ ） BMD お よ び BMC

BMD お よ び BMC と も に OVX+AFD が OVX+NMD と 比 較 し て 有 意 に 高 い 値 を 示 し た (p<0.05) (Table 7) 。

３ ） 3D-map の 観 察

研 究 １ 同 様 の カ ラ ー ス ケ ー ル で 観 察 し た 結 果 OVX+AFD の 海 綿 骨 は OVX+

NMD と 比 較 し BMD が 高 い こ と が 観 察 さ れ た (Fig.6) 。

４ ） 骨 梁 構 造 計 測

骨 梁 構 造 計 測 の 結 果 を Table 8 に 示 す 。 骨 梁 構 造 計 測 に よ り 海 綿 骨 骨 梁 の 密 度 や 連 結 の 状 態 が 観 察 さ れ た 。

（ １ ） Tb.Th

骨 梁 幅 を 示 す Tb.Th は ， AFD 摂 取 群 は NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 い 値 を 示 し た（ p<0.05 ）。こ れ よ り ， AFD 摂 取 群 は NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 骨 梁 数 は 有 意 多 い こ と が 示 さ れ た 。

（ ２ ） Tb.N

骨 梁 数 を 示 す Tb.N は ， AFD 摂 取 群 は NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 い 値 を 示 し た （ p<0.05 ）。

（ ３ ） Tb.Sp

骨 梁 間 距 離 を 示 す Tb.Sp は ， AFD 摂 取 群 は NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 い 値 を 示 し た こ と か ら （ p<0.05 ）， AFD は 骨 梁 同 士 の 距 離 が 短 い ま た は 骨 梁 幅 の 増 加 が 示 さ れ た 。

（ ４ ） Tb.Spac

骨 梁 中 心 間 距 離 を 示 す Tb.Spac は ， AFD 摂 取 群 は NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 有

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意 に 低 い 値 を 示 し た こ と か ら （ p<0.05 ）， AFD は 骨 梁 同 士 の 距 離 が 短 い こ と が 示 さ れ た 。

（ ５ ） TBPf

骨 梁 の 連 結 性 を 示 す TBPf は ， AFD 摂 取 群 お よ び NMD 摂 取 群 は 正 の 値 を 示 し た こ と か ら 両 群 と も に 骨 梁 同 士 間 の 空 間 が 多 く ， 連 結 性 が 不 良 で あ る こ と が 示 さ れ た 。

（ ６ ） SMI

骨 梁 の 形 態 を 示 す SMI は ， AFD 群 が 3.0 ， NMD 摂 取 群 が 3.1 で あ っ た 。 ５ ） 非 脱 灰 研 磨 標 本 の 観 察

大 腿 骨 遠 位 骨 幹 端 に お い て ， AFD 摂 取 群 は NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 密 な 骨 梁 の 網 目 状 構 造 が 観 察 さ れ ， AFD 群 に 強 い 偏 光 特 性 が 観 察 さ れ た (Fig.7) 。

３ . 小 括

１ ）卵 巣 摘 出 骨 粗 鬆 症 ラ ッ ト に AFD を 摂 取 さ せ た 場 合 NMD を 摂 取 さ せ た ラ ッ ト と 比 較 し て 有 意 に 高 い 骨 密 度 お よ び 骨 塩 量 が 得 ら れ た 。

２ ） 卵 巣 摘 出 骨 粗 鬆 症 ラ ッ ト に AFD を 摂 取 さ せ た 場 合 ， NMD 摂 取 さ せ た ラ ッ ト と 比 較 し て 有 意 に 密 度 の 高 い 海 綿 骨 骨 梁 構 造 が 得 ら れ た 。

以 上 よ り ， AFD を 摂 取 さ せ た 卵 巣 摘 出 骨 粗 鬆 症 状 態 ラ ッ ト は NMD を 摂 取 し た ラ ッ ト と 比 較 し て 骨 量

お よ び 骨 質 の 改 善 が 有 意 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

Ⅴ ． 考 察

低 栄 養 骨 粗 鬆 症 お よ び 卵 巣 摘 出 骨 粗 鬆 症 ラ ッ ト に AFD を 経 口 摂 取 さ せ ，大 腿 骨

骨 幹 端 に お け る 骨 形 成 お よ び 骨 構 造 の 改 善 と 有 効 性 を 検 討 す る こ と を 目 的 に 2 つ

の 研 究 を 行 っ た 結 果 ， AFD の 安 全 性 と 両 モ デ ル ラ ッ ト に お い て NMD を 摂 取 し た

場 合 と 比 較 し て 有 意 に 高 い 骨 密 度 お よ び 骨 塩 量 と 密 度 の 高 い 海 綿 骨 骨 梁 構 造 が 得

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ら れ た 。す な わ ち ，研 究 Ⅰ で は 血 液 生 化 学 検 査 に お い て AFD 摂 取 群 の 中 性 脂 肪 が

低 値 を 示 し た 。こ れ は ISO の 肥 満 抑 制 効 果

に よ り 中 性 脂 肪 の 低 下 が 観 察 さ れ る

と い う 報 告 に よ る 変 化 が 生 じ た も の と 考 え ら れ る 。 一 方 ， 体 重 測 定 に お い て 急 激

な 体 重 減 少 を 認 め な か っ た こ と か ら 飼 料 の 安 全 性 が 確 認 さ れ た と 考 え ら れ る 。

BMD お よ び BMC は AFD 摂 取 群 に お い て 有 意 に 高 い 値 を 認 め ， 3D-map の 観 察 に

お い て も 同 様 の 結 果 が 観 察 さ れ た 。 さ ら に ， 骨 質 の 評 価 に 用 い た 骨 梁 構 造 計 測 に

お い て AFD 群 は NMD 群 と 比 較 し て 複 数 の 項 目 か ら 有 意 な 骨 質 の 値 が 得 ら れ ，さ

ら に 偏 光 顕 微 鏡 観 察 か ら ， AFD 群 は 密 度 の 高 い 海 綿 骨 骨 梁 構 造 と 強 い 偏 光 特 性 が

観 察 さ れ た 。 NMD と AFD が 同 じ カ ル シ ウ ム 濃 度 で あ り な が ら AFD が 有 意 に 低 栄

養 状 態 か ら 高 い 骨 量 と 骨 質 の 改 善 に 効 果 を 示 し た の は AFD の ISO ， FOS お よ び

ク エ ン 酸 カ ル シ ウ ム の 効 果 に よ る と こ ろ が 少 な く な い と 考 え ら れ る 。 研 究 Ⅱ で も

BMD お よ び BMC は AFD 群 は NMD 群 よ り も 有 意 に 高 い 値 を 示 し ，さ ら に 3D-map

に お い て AFD 群 は NMD 群 と 比 較 し て 高 い BMD が 観 察 で き た 。骨 梁 構 造 計 測 は ，

AFD 群 と NMD 群 に 有 意 な 差 を 認 め ， 海 綿 骨 骨 梁 の 密 度 が 高 い こ と が 観 察 さ れ ，

偏 光 顕 微 鏡 観 察 で は AFD 摂 取 群 は NMD 摂 取 群 と 比 較 し て 海 綿 骨 の 量 が 多 く 観 察

さ れ た 。 OVX に お け る 海 綿 骨 の 減 少 を ISO の エ ス ト ロ ゲ ン 様 作 用 に よ っ て 補 填 し ，

AFD に お い て 海 綿 骨 が 有 意 に 高 い BMD と し て 観 察 さ れ た も の と 考 え ら れ る 。 以

上 ， ２ つ の 研 究 で 観 察 さ れ た BMD ， BMC ， お よ び 骨 梁 構 造 計 測 に お け る 骨 の 回

復 は NMD と 比 較 し て AFD に 配 合 さ れ て い る 成 分 の 相 違 が 影 響 し て い る と 考 え

ら れ た 。 AFD は ， FOS

， ISO

, リ ン 酸 カ ル シ ウ ム お よ び ク エ ン 酸 カ ル シ ウ ム

が 配 合 さ れ て い る ほ か に AFD は Nakada ら

の 研 究 で 使 用 さ れ た 飼 料 を 改 良 し ，

リ ン 酸 カ ル シ ウ ム か ら ク エ ン 酸 カ ル シ ウ ム に 変 更 し ， カ ル シ ウ ム の 配 合 比 率 も 合

わ せ て 変 更 し た 。 ク エ ン 酸 カ ル シ ウ ム は ， 市 販 サ プ リ メ ン ト に お い て 利 用 さ れ て

い る 炭 酸 カ ル シ ウ ム と 比 較 し て ， 吸 収 さ れ る 際 に 必 要 な 酸 と キ レ ー ト 作 用 に よ り

結 合 し ，カ ル シ ウ ム 成 分 と し て 生 体 に 吸 収 さ れ や す い

た め で は な い か と 推 察

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さ れ る 。 さ ら に ， FOS に よ る カ ル シ ウ ム 吸 収 促 進 作 用 に よ り 血 中 カ ル シ ウ ム 濃 度 が 保 た れ ，骨 吸 収 の 抑 制 に 働 い た と 推 測 さ れ る 。ま た ， FOS の 作 用 で あ る 腸 内 細 菌 叢 の 変 換 作 用 に よ っ て ，摂 取 し た ISO が エ ク オ ー ル と な り 強 い エ ス ト ロ ゲ ン 作 用 が 発 揮 さ れ ，骨 吸 収 の 抑 制 に 働 い た も の と 考 え ら れ る 。今 後 は AFD の 代 謝 経 路 ， カ ル シ ウ ム 濃 度 の さ ら な る 調 整 と 至 適 な 摂 取 期 間 に つ い て 検 討 が な さ れ る 必 要 が あ る 。 AFD の 評 価 に あ た り 海 綿 骨 以 外 に も 着 目 が 必 要 で あ る と 考 え ら れ る が ， AFD は 低 栄 養 骨 粗 鬆 症 お よ び 卵 巣 摘 出 骨 粗 鬆 症 ラ ッ ト に お い て カ ル シ ウ ム の 吸 収 促 進 そ し て 骨 形 成 の 促 進 に 効 果 に よ っ て ， 減 少 し た 骨 量 の 回 復 と 骨 質 の 改 善 効 果 を 示 し た と 考 え ら れ る 。

Ⅵ ． 結 論

研 究 Ⅰ お よ び 研 究 Ⅱ の 結 果 よ り ， AFD は 低 栄 養 状 態 お よ び OVX の BMD ， BMC

お よ び 骨 梁 構 造 を 有 意 に 改 善 さ せ る 効 果 が 示 さ れ た 。よ っ て ， AFD は 骨 粗 鬆 症 に

対 し 骨 梁 構 造 を 改 善 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

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Ⅶ ． 参 考 文 献

1 ） Cabinet office, Government of

Japan;http://www8.cao.go.jp/kourei/whitepaper/w-2014/zenbun/s1_1_5.html 2 ） Cabinet office, Government of Japan;

http://www8.cao.go.jp/kourei/whitepaper/w-2015/html/gaiyou/s1_1.html

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