序 文
結核菌の分子疫学的解析には，IS6110 をプロー ブ と し た Restriction fragment length polymor- phism（RFLP）分析が主に用いられている
1）．我々 はこれまで，同一ゲルにおいて泳動した RFLP パターンを目視により比較し，患者間における感 染の有無の判定に使用してきた
2）3）．近年，都市部 における若年層の集団感染事例
4）や， 日雇い労働者 及び路上生活者等住所不定者の感染事例
5）6）など，
患者の活動範囲が広いため接触者の特定が困難な
事例が増加している．このような事例において感 染源追求や感染範囲の特定など疫学調査を行うに は，広範囲で発生した多くの患者から分離された 菌株の RFLP パターンを長期にわたり比較する 必要があるが，複数のゲルで分析した RFLP パ ターンの比較を目視で行うことは困難である．
多数の RFLP パターンを同時に分析する手段 として，系統樹解析ソフトウェア （解析ソフト） に よるクラスター分析が試みられ，患者間の分子疫 学的検討
7）〜9）に有効であることが報告されている．
これらの報告では，クラスター分析の類似度計算 に共通バンドの有無に基づき類似度が計算され る
10）Dice 係数法（Dice 法）が用いられている．ク ラスター分析を行うには，まず RFLP パターンの
千葉県で分離された結核菌の Restriction Fragment Length Polymorphism パターンのクラスター分析
千葉県衛生研究所細菌研究室
岸田 一則 横山 栄二 内村眞佐子 一戸 貞人
（平成 17 年 3 月 17 日受付）
（平成 17 年 7 月 14 日受理）
多数の結核菌 IS6110-restriction fragment length polymorphism（RFLP）パターンを，外部マーカーの みで補正してクラスター分析する方法を検討した．
正確なバンドの認識が可能な電気泳動用ゲル濃度は 1.4％ であった．外部マーカーは，結核菌 RFLP パターンのバンドが多く分布する範囲に多数のフラグメントを有する MW III が適当であった．外部 マーカーを両端と中央の 3 レーンに配置することにより，ソフトウェアによるパターンの認識精度が向 上した．
千葉県内の患者由来 74 株のパターンを，類似度計算時のパラメーターとしてトレランス値 0.8％，最適 化値 0.5％ に設定してクラスター分析したところ，8 感染事例由来 19 株は事例ごとに類似度の高いクラ スターに分類された．外部マーカーを使用し，至適な電気泳動条件やパラメーターの設定を行うことで，
精度の優れた RFLP クラスター分析が可能となった．
〔感染症誌 79：672〜679，2005〕
要 旨
別刷請求先：（〒260―8715）千 葉 市 中 央 区 仁 戸 名 町 666―2
千葉県衛生研究所細菌研究室
岸田 一則
Mycobacterium tuberculosis, cluster analysis, IS6110, restriction fragment length polymorphism（RFLP）
Key words：
Table 1 Investigated isolates derived from epidemiological outbreaks Numbers of IS6110 bands
of isolate Relationship
Numbers of isolates Outbreak
Additional Common
0 10
Family 2
1
0 1
Family 2
2
0 17
Hospital 2
3
0 16
Nursing home 2
4
0 15
Coworker 2
5
0 16
Family and neighbor 3
6
2 18
Hospital 4
7
1 12
Family 2
8
バンド位置を解析ソフトに自動認識させるが，
バックグランドの状況やバンドの重なり等により 手動の修正が必要な場合が多い
11）．従って Dice 法による解析においては，手動による修正がバン ド認識に差異を生じ，類似度に影響を与える可能 性がある．不十分なバンド認識を生じる別の原因 として，電気泳動時に発生する RFLP パターンの ずれや歪みが挙げられる．解析ソフトはこのよう なパターンのずれや歪みを，同時に泳動する分子 量マーカーの出現バンドを指標として補正するこ とから，RFLP パターンをクラスター解析する場 合は，すべてのサンプルに分子量マーカーを混合 して泳動する内部マーカーを使用してパターンの 補正を行うことが推奨されている
12）．しかし内部 マーカーの使用は，リプロービング等煩雑な操作 が必要となるため，設備や人員に限りのある施設 では実施が難しい．
今回我々は外部マーカーを補正のための指標と して使用し，多数の菌株の RFLP パターンをクラ スター分析することを目的に，RFLP およびクラ スター分析条件について検討した．さらに得られ た条件で県内患者分離菌株についてクラスター分 析を実施し，その有効性について検討した．
材料および方法
1．使用菌株
1999 年から 2004 年において，千葉県内の医療 機関で分離された 74 株の結核菌を使用した． その うち 55 株は患者間に調査した限りでは直接疫学
的関連の認められなかった散発事例由来株で，19 株は 8 感染事例（Outbreak 1〜8）由来株である．
目 視 で は Outbreak 1〜6 由 来 株 は 事 例 ご と に RFLP パターンが一致したが，Outbreak 7，8 由 来株は RFLP パターンにバンド 1 本あるいは 2 本の付加が認められた（Table 1） ．
2．DNA 抽出
医療機関から搬入された菌株を工藤 PD 培地
（日本ビーシージ） 上で培養し発育 2 週間以内の新 鮮培養菌を使用した．ビーズ入りチューブ Lysing Matrix A（Q-BIOgene）を使用して菌株 2 エーゼ をバッファー 750
µL （0.3MTris-HCl， 6mM EDTA，
0.1M NaCl，RNase 0.01units pH8.0）に懸濁後クロ ロホルム 600
µL と混和しビーズ式細胞破壊装置 MS300（TOMY）で 2,000rpm300 秒処理して DNA を抽出し，フェノール
!クロロホルム
!イソアミル アルコール（25：24：1）溶液で精製した．DNA 濃度は蒸留水に溶解後 OD 値を測定して決定し た．
3．RFLP パターン検出
電 気 泳 動 用 ゲ ル は I. D. NA Agarose（CAM- BREX） 150mL を用い，150mm×200mm のゲルト レーで作成した．ゲル上に作成した 16 サンプル ウェル（6mm×1mm） のうち 13 ウェルを泳動に使 用した．抽出した DNA2
µg を
PvuII（TOYOBO）
4.5U で 2 時間以上消化後 0.5
µg をウェルに ア プ
ライし，TBE バッファーを冷却循環しながら 200
V で 6 時間電気泳動した．ナイロンメンブレンに
トランスファー後，ジゴキシゲニン標識した IS
6110プ ロ ー ブ
7）を ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 液 EASYHYB （Roche） に 20ng
!mL の濃度で混合し，
45℃ で 20 時間ハイブリダイゼーションした．IS
6110とハイブリダイズした DNA 断片のパター ンの CDP-Star（Roche）による化学発光を，ルミ ノ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー LAS1000（FUJI- FILM）を使用して TIFF ファイル形式で記録し た．
4．クラスター分析
解析ソフトは，Fingerprinting II Ver. 3.0（Bio- Rad）を 使 用 し た．TIFF フ ァ イ ル で 記 録 し た RFLP パターンを取り込み，外部マーカーの各フ ラグメントの泳動距離を標準化機能により一致さ せて RFLP パターン全体を補正した．解析ソフト のバンド検索フィルターを初期設定のパラメー ター値で使用して自動的にバンドを検索した後，
バンドを目視により確認し，手動による修正を 行った．類似度計算は Dice 法により行い，Un- weighted Pair Group Method with Aristmetic mean（UPGMA）でクラスター分析した．バンド 位置補正のためトレランス値は 0.8％ に 設 定 し た．さらに，パターンのバンド数と位置に関する 補正のため最適化値を設定した．
5．電気泳動ゲル濃度
ゲル濃度 1.0％，1.2％ 及び 1.4％ の 3 枚のゲル で同一株の RFLP パターンを検出し，自動バンド 認識機能で検出されたバンド数の違いを調べた．
6．外部マーカーに使用する分子量マーカーの 違いが RFLP パターン補正に与える影響
外部マーカーはジゴキシゲニン標識分子量マー カー II（MW II, Roche）およびジゴキシゲニン標 識分子量マーカー III（MW III, Roche）を使用し た．同一ゲル上の 11 ウェルに MW III, MW II，同 一 株 由 来
PvuII 消 化 DNA を サ ン プ ル と し て 7 ウェル，MW III, MW II の順に配置し，RFLP パ ターンを検出した．7 レーンの同一サンプル由来 RFLP パターンを，MW II または MW III をそれ ぞれ外部マーカーに使用してクラスター分析し，
類似度 100％ と判定可能なトレランス値を求め た．
7．外部マーカー配置が RFLP パターン補正に 与える影響
外 部 マ ー カ ー を ゲ ル 上 の 13 レ ー ン の 両 端 2 レーンに配置（2 レーン配置）した 9 枚のゲルおよ び両端と中央の 3 レーンに配置（3 レーン配置）し た 9 枚のゲルを使用し，同一菌株由来の
PvuII 消 化 DNA を サ ン プ ル と し て す べ て の ゲ ル で RFLP パターンを検出し，それぞれについてサン プルの類似度を 100％ と判定可能なトレランス値 を求めた．
8．クラスター分析と疫学的関連性
感 染 事 例 由 来 お よ び 散 発 事 例 由 来 74 株 の RFLP パターンについてクラスター分析を実施し て，感染事例由来株間の類似度を調べた．
成 績
1．電気泳動ゲル濃度
3 枚の濃度の異なるゲルを用いて検出した同一 株の RFLP パターンを，解析ソフトで自動バンド 認識したところ，1.0％ および 1.2％ のゲルでは 19 本，1.4％ のゲルでは 20 本のバンドが認識された．
以後電気泳動は 1.4％ のゲルを使用した．
2．外部マーカーに使用する分子量マーカーの 違いが RFLP パターン補正に与える影響
同一菌株の RFLP パターンを類似 度 100％ と 判定可能なトレランス値は，外部マーカーに MW II を使用した場合で 0.34％，MW III では 0.27％
であった．以後，トレランス値がより低値であっ た MW III を外部マーカーに使用した．
3．外部マーカー配置が RFLP パターン補正に 与える影響
異なる 9 枚のゲルで泳動した同一株 の RFLP パターンを類似度 100％ と判定可能なトレランス 値は，外部マーカー 2 レーン配置で 1.34％，3 レー ン配置で 0.43％ であった．以後外部マーカーは 3 レーン配置で行った．
4．クラスター分析による感染事例由来株の分 類
ゲ ル 濃 度 1.4％ で 検 出 し た 結 核 菌 74 株 の
RFLP パターンを，3 レーン配置した MW III によ
り補正し，トレランス値 0.8％ を設定してクラス
ター分析を行った （Fig. 1） ．Outbreak 1〜5 由来菌
Fig. 1 Cluster analysis of RFLP patterns of 74 isolates ofM. tuberculosisand similar- ity of patterns from Outbreak 6. Similarity was calculated with the Dice coefficient using parameter settings at 0.8％ tolerance and 0％ optimization. 1―8：Patterns from outbreaks 1―8.
Fig. 2 Cluster analysis of RFLP patterns of 74 isolates ofM. tuberculosisand similar- ity of clusters including patterns from each outbreak . Similarity was calculated with the Dice coefficient using parameter settings at 0.8％ tolerance and 0.5％ opti- mization . 1 ― 8 ： Patterns from outbreaks 1 ― 8, ◎ Patterns from sporadic cases showed 100％ similarity to patterns from other cases, ○Patterns from sporadic cases showed 94.16％ similarity with patterns from Outbreak 8.
株はそれぞれの事例ごとに，類似度 100％ のクラ スターに分類されたが，Outbreak 6 由来 3 株は類 似度 95.95％ のクラスターに分類された．
トレランス値 0.8％ 及び最適化値 0.5％ を設定 したところ（Fig. 2） ，Outbreak 1〜6 由来 3 株の RFLP パターンは類似度 100％ のクラスターに分 類された．肉眼的にバンド 2 本の違いが認められ た Outbreak 7 由来株は類似度 96.02％，バンド 1 本の違いが認められた Outbreak 8 由来株は類似 度 94.16％ のクラスターに分類された．
考 察
我々は多数の結核菌から類似度の高い RFLP パターンを示す株を効率的に検索することを目的 に，外部マーカーを使用して行う RFLP 及びクラ スター分析条件を検討した．その結果，電気泳動 に 1.4％ ゲルを使用することでバンドの認識が容 易となり，外部マーカーとして MW III を使用し た場合に低トレランス値が得られた．MW III は，
結核菌 RFLP パターンのバンドが多く分布する 10〜0.9kb の範囲
12）に MW II に比べ多数のフラグ メントを有することから，より適正な補正がなさ れたものと思われる． また， ゲル上の外部マーカー の配置は，13 レーンの両側 2 レーン配置に比べ両 側と中央の 3 レーン配置の場合に，複数ゲル上の 同一菌株の RFLP パターンを低レランス値で類 似度 100％ と判定可能であった． Braden ら
13）は，
分子量マーカーやゲルの大きさなど分析条件の検 討を行い， 外部マーカーを 20 レーン中 3 レーンに 配置してクラスター分析を行い，再現性に優れた 結果が得られたことを報告している．
今回使用した解析ソフトは類似度計算時のパラ メーターとしてトレランス値と最適化値の設定が 可能であるが，パラメーターの設定については基 準がなく，研究者が独自に設定して解析を行って いる．内部マーカーで補正する方法を用いて行っ た Dice 法による結核菌のクラスター分析で，Gill- espie ら
14）はトレランス値を 0.8％，Kremer ら
15）は 1％ に設定して類似度計算を行い，良好な結果を 得たと報告している．トレランス値は，高く設定 すると本来共通でないバンドを共通バンドと誤認 識する可能性があることから，本報ではトレラン
ス値を 0.8％ に設定し，最適化値を目視でパター ン が 一 致 し た 同 一 感 染 事 例 由 来 株 の 類 似 度 が 100％ と判定された 0.5％ に設定した．各パラメー ター値は，クラスター分析対象菌株の規模を拡大 するとより高い値の設定が必要とされる．しかし 正確なパターン分析を行うには，分析対象株をあ る規模に限定することによりパラメーター値をな るべく低く抑え，分析回数を増やすなどの工夫が 必要であろう．
得られた条件を用いて，千葉県で 1999 年から 2004 年に分離された結核菌 74 株の RFLP パター ンをクラスター分析した結果，同一菌による感染 と考えられ，目視で RFLP パターンの一致が認め ら れ た 6 感 染 事 例 由 来 株 は，事 例 毎 に 類 似 度 100％ のクラスターに分類された．また，バンド 2 本の付加が認められた多剤耐性菌の院内感染事 例（Outbreak 7）由来株及びバンド 1 本の付加が 認められた家族内感染事例（Outbreak 8）由来株 は， それぞれ類似度 90％ 以上のクラスターに分類 された．結核菌の RFLP パターンの変異は，3.2 年にバンド 1 本程度の割合で認められることが報 告
16）されている．結核は潜伏期間が長い疾患であ ることから， 類似度 90％ 以上のクラスターを形成 する患者間の疫学調査を実施することは，接触者 の特定が困難な事例における感染源や感染範囲を 調査するための有用な手段になると思われる．
今 回 行 っ た 74 株 の RFLP パ タ ー ン の ク ラ ス ター分析で，感染事例と同一クラスターに分類さ れた散発事例由来が 12 株認められた．また，疫学 的関連性の認められない患者由来の 6 株が，類似 度 100％ の 3 つのクラスターに分類された（Fig.
2） ．Gillespie ら
14）によって遺伝的に近縁ではない 菌株が類似度 100％ のクラスターに分類される例 が報告されており，さらに詳細に検討するには IS
6110単独による RFLP 分析だけでなく，他の解析 法の併用も必要と思われる．
今回我々が行った検討の結果から，至適な泳動
条件やクラスター分析条件を用い，内部マーカー
を使用せずに外部マーカーのみの補正で，精度の
優れた RFLP パターンのクラスター分析が可能
であることが示された．
謝辞：疫学調査にご協力いただきました関係保健所の みなさまに深謝いたします．なお本研究の一部は平成 15 年度結核予防千葉基金医学研究助成によります．
文 献
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