Title DNAオリガミを使ってできること Author(s) 板東, 俊和; 杉山, 弘; 朴, 昭映; 山本, 清義; 谷口, 純一 Citation 京都大学アカデミックデイ2014 : ポスター/展示 (2014) Issue Date 2014-09-28 URL http://hdl.handle.net/2433/196011 Right Type Presentation Textversion author Kyoto University
分子科学的アプローチによる
遺伝子発現の制御と機構の解明
エピジェネティクな変化を1分子観測11)エピジェネティクな遺伝子発現の特異的な制御機構について
、
DDNNAAフレームを利用して
、
直接可視化し解析する
手法の開発
: 2つの分子化学的アプローチを駆使して研究を進めているDNA フレーム
~100 nm研究目的
22)エピジェネティクな遺伝子発現の活性化能を付与した
DDNNAA配列特異的結合分子による
細胞の初期化
•
分化の制御
N O H N N O N H O N H N O H N N O H N N O H N H N N O N H N N O N H N N O N H N H O N O N H O O H N OH N H O (+ 5'-WWCCWW-3' 3'-WWGGWW-5' SAHA I 京都大学 大学院理学研究科 化学専攻 生物化学研究室 ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)においてOct 3/4 , Nanog の発現上昇
核
クロマチン
染色体
DNA
細胞膜
~50nm
細胞
人体=約
60兆個の細胞で構成される
核
=細胞内小器官、内部に
46本の染色体を持っている
染色体
=細胞の遺伝情報の保存と伝達を担う
転写
mRNA
リボゾーム
翻訳
タンパク質(遺伝子)
クロマチン=
DNAとヒストン(タンパク質)で構成される構造体
(
Chromosome)
(
Chroma4n)
生物の構造・機能における基本単位遺伝子発現
ヒストン
DDNNAA
1122塩基対からなる二本鎖DDNNAA の二重らせん構造モデル
主溝 ((mmaajjoorr ggrroooovvee)) と副溝 ((mmiinnoorr ggrroooovvee)) が交互に現れている
塩基対
((bbaassee ppaaiirr)) はらせん内部に存在している ((
実際に分子モデルで確認!
)
グアニン(
G
)
シトシン(
C
)
チミン(
T
)
アデニン(
A
)
N N N N O N H N N N N HN N N H N O H H N N O O H H 3 H 7 8 5 2 nm 1.1 nm 2.2 nm minor groove minor groove major groove major groove 3 7 8 5 major groove minor grooveB-DNA
C
A
T
base pair 5' 5' 3' 3'G
塩基対(base pair): A-‐T, G-‐C塩基間で対を形成する 塩基配列情報が 保存されている生体分子 右巻き二重らせん構造1. 「塩基対」を利用して配列特異的に分子を構築することができる点 (program)
2. 空間的に「二重らせん構造体」として考えて設計することができる点 (geometry)
DNAの良い所
Rothemund, Nature, 2006, 440, 297.“DNA 折り紙” 法
数百
nmスケールで様々な 2D, 3D のナノ構造体を望むように設計•合成することができる
ナノテクノロジー研究において魅力的な素材!「
DNA」は任意に形状を設計することができる!
AFM (Atomic Force Microscope) : 原子間力顕微鏡
レーザー
検出器
カンチレバー
試料
カンチレバーの先につい
た針と試料の間に働く力
(原子間力)
レーザーで検出しながら、
試料の表面を針でなぞる
(走査する)
試料の表面の凹凸情報を
画像(動画)として得る
1.$
$(program)$
2.$
$(geometry)$$$
DNA
$
Rothemund,,Nature,,2006,,440,,297.,“DNA$
”$ $
nm
2D,$3D$
•
$
DNA
$
1.$
$(program)$
2.$
$(geometry)$$$
DNA
$
Rothemund,,Nature,,2006,,440,,297.,“DNA$
”$ $
nm
2D,$3D$
•
$
DNA
$
多様な
DNAピースを任意に
構成する技術
DNA ジグソウ
DNAと酵素の反応を
可視化する技術
40 nm 40 nm
特異的な機能を付与した単分子
DNAの挙動を観察する技術
9 8 7 6 5 4 3 2 1DNAナノ構造の設計と構築
DNA フレーム
新規二次元構造体
Nature Nanotechnology, 6, 166 (2011) Chem. Eur. J. 16, 5362 (2010)J. Am. Chem. Soc. 133, 14488 (2011)
ACS Nano, 5, 665 (2011) J. Am. Chem. Soc. 132, 1592 (2010)
J. Am. Chem. Soc. 132, 16311 (2010)
Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9412 (2010)
DDNNAAナノ構造の設計と構築、機能化、可視化する技術
DNA ナノテクノロジー
DNA 折り紙技術
DNA トランスポーター
High-‐speed AFM imaging system
~300 nm ~300 nm
~100 nm
Rewiew: Angew. Chem. Int. Ed. 51, 874 (2012)
Nature Nanotechnology, 7, 169 (2012)
京都大学 大学院理学研究科 化学専攻 生物化学研究室
一本鎖 DNA テンプレート (M13mp18 DNA: 7249 bases) 相補的な塩基配列を持つ DNA (226 種類)
プログラム化された
DNA 構築
85oC-‐15oC (-‐1oC/min) ~100 nm (288 塩基) ~70 nm (12回の折り返し)DNAオリガミの折り方:2次元DNAナノ構造体の構築方法
TTCAGGGT AAGTCCCA AGCCTTCA TGGCGTGA TGAATGCC ACTTACGG ACCGCACT TCGGAAGT
32-‐mer staple 一本鎖DNA
一本鎖DNA M13mp18
高解像度AFMイメージ
Staple (かすがい、ホッチキス)DNA
II II I bottom bottom II I III bottom II IV III I top
2s-‐3s
4s-‐9s
11s-‐12s
開箱プロセスの
AFM イメージ
1 image / secBox
folding
DNA Box 構造形成と、開箱プロセスのリアルタイム観測
375 x 500 nm2D
opened Box
750 x 1000 nm3D
Box
folding
Org. Biomol. Chem. 9, 2075-‐2077 (2011).
10s
DNA Box 構造が段階的に開いていく様子を
リアルタイムで観察することに成功した
動的光散乱法(DLS)による分析 観測値: 直径 68 nm (89%) (計算値: 直径67 nm)
Top Side IV
Side II Side III Side I BoMom
opened Box
+StapleN
A
N
パスルピース monomer 200 x 200 nmO
D
複数の
DNAパスルピースからプログラム化された自己集合によって、文字を表示させる
I
G
F
E
H
DNAナノ構造体が優れた「ナノマテリアル」になる可能性を示している
自己集合
自己集合
500 x 500 nm 525 x 525 nm D N A
複数の
2次元DNAジグソウピースを用いるプログラム化した2次元自己集合
450 X 450 nm
D N A J I G S A W
ACS Nano, 5, 665-‐671 (2011).
2次元DNA ジグソウピースによる自己集合技術は、
水平と垂直、両方向へ応用が広がっていくだろう
D N A J I G S A W
ACS Nano
No. 5 Vol. 1, 2011
(表紙に採用された)
40 nm (128 bp) 40 nm (16 duplexes) 25nm (80 bp) 25nm (80 bp) 18 nm (7 duplexes) 23 nm (9 duplexes) 80 nm (32 duplexes) 90 nm (288 bp)
4種の連結部を内包した
DNA
フレーム構造体の設計
2次元
DNAフレームの開発: 一分子観察を可能にする有用な観測技術として
連結部
には任意の配列、長さをもった
DNA鎖を組み込むことが可能
20 nm (64 bp) 10 nm (4 duplexes)我々の開発技術:
DNA
フレーム技術によって
DNA
の構造変化や酵素反応を単分子観測する
DNA メチル化転移酵素
DNA 再構成酵素
高速AFM測定技術 DNA オリガミ技術DNA
フレーム単分子観察技術
DNAの構造変化
G-‐4重鎖構造の形成
酵素反応
G-‐4重鎖構造 40nmx40nmのナノ観察空間EcoRI メチル化転移酵素
A
B
C
D
1 frame / sec
CTGTAGCTCATCATGT GGAGACTCTA GAGTGTTCCT GATGGCCGT GAATTC AAGGCGGTG GGTGCGCGTT GCTCCTCACT
CCTCTGAGAT CTCACAAGGA CTACCGGCA CTTAAG TTCCGCCAC CCACGCGCAA CGAGGAGTGA TCAATTAAGAGGGCAG
TTGCCTGAGAGTCTGG CGAGC GGAGACTCTA GAGTGTTCCT GATGGCCGT GAATTC AAGGCGGTG GGTGCGCGTT GCTCCTCACT TCCTC
GCTCG CCTCTGAGAT CTCACAAGGA CTACCGGCA CTTAAG TTCCGCCAC CCACGCGCAA CGAGGAGTGA AGGAG TACAACAA ATAACAGC
40x40 nmのナノ空間内の
単一の酵素分子の挙動を
リアルタイム観察
Sequence-‐specific M. Eco RI
tensed
duplex strand
64 bp
dsDNA
relaxed
duplex strand
74 bp
dsDNA
DNAフレーム内で
起きているメチル化反応の
数をカウントする
A B C D 64 bp dsDNA
40 nm
74 bp dsDNA40 nm
酵素
(EcoRI) の結合と反応の様子をリアルタイムで1分子観察する
メチル化観測数:
74
塩基対
(緩んだ状態)=43%,
64
塩基対
(張った状態)=13% (118 フレーム中)
J. Am. Chem. Soc. 132, 1592 (2010).
DNA 鎖を折り曲げてアデニンの N6 位を メチル化するメチル転移酵素
Eco RI on the tensed 64mer dsDNA
張った状態
double-‐loops B D A C
再構成された生成物
B D A C
基質
separated dsDNAs
DNA-‐酵素複合体の形成
B D A C 5 s 10 s 15 s 20 s 25 s 30 s 35 s 40 s 45 s 50 s Cre 四量体による再構成反応プロセスを初めてリアルタイムで直接観察することに成功した Cre 四量体は再構成の後、4つのモノマーに解離している0.2 frame / sec (5 x speed)
DNAフレーム内での酵素(Cre)による再構成反応のリアルタイム観察
Cre
再構成DNA組換え酵素
40 x 40 nm の領域で
直接観察
Eco RI methyl transferase on the 74bp DNA strand
DNAフレーム技術によって様々な酵素のダイナミックな結合や反応過程をリアルタイムで観察する
180 x 180 nm, Scan rate: 1.0 frame / sec Holiday Junc\on : 4 s 5 s 6 s 7 s 8 s 9 s 64bp 40 nm 74bp 40 nm 40 nm 40 nm 72bp 72b p
Cre recombinase on the Holiday Junc\on
J. Am. Chem. Soc., 132, 1592-‐1597 (2010)
J. Am. Chem. Soc. 2010, 132,
1592–1597 ).
(8-oxoguamine
glycosylase
pyrimidine dimer glycosylase)
(Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49,
9412–9416).
64 塩基対(張った状態) と74 塩基対(緩んだ状態)
張力による酵素の反応性の違い
観察結果: より折り曲げやすい
74 塩基対の配列が
メチル化されやすい
Cre : Holiday Junc4on を経由して DNA組換え酵素
鎖交換反応を触媒する 4本の鎖の間で 形成される構造
T-loop
[3+1] Hybrid 型の G-‐四重鎖構造はT-‐loop形成において安定な構造であることを提唱 (2008)
J. Am. Chem. Soc. 130, 16470 (2008).
濃度依存的な
Tm値
ゲルシフト解析
+KCl
-‐KCl
1 5’-‐GGGTTAGGGTTAGGG(T)21GGGT-‐3’ 2 5’-‐GAGTTAGGGTTAGGG(T)21GGGT-‐3’ 3 5’-‐GGGTTAGAGTTAGGG(T)21GGGT-‐3’ 4 5’-‐GGGTTAGAGTTAGGG(T)21AGGT-‐3’ 5 5’-‐AGGTTAGAGTTAGGA(T)21AGGT-‐3’ [3+1] Hybrid 型の G-‐四重鎖構造 ヒトテロメア配列 [5’-‐(GGGTTA)n-‐3’] K+ K+3’-TGGGTTT
5’-GGGTTAGGGTTAGGGTTT
5’-CTGTAGCTCAACATGT-GGAGACTCTAGAGTGTTCCTGATGGCCGTGAA---TTCAAGGCGGTGGGTGCGCGTTGCTCCTCACT-GAACACCCTGAACAAA-3’
3’-CCTCTGAGATCTCACAAGGACTACCGGCACTT-5’ AAGTTCCGCCACCCACGCGCAACGAGGAGTGA-5’
3’-TGGGTTT-3’-CTAAGAGAACAAACGA-GCTCGCCTCTGAGATCTCACAAGGACTACCGGCACTT---AAGTTCCGCCACCCACGCGCAACGAGGAGTGAAGGAG-TACAACAAATAACAGC-5’
5’-CGAGCGGAGACTCTAGAGTGTTCCTGATGGCCGTGAA-3’ TTCAAGGCGGTGGGTGCGCGTTGCTCCTCACTTCCTC-3’ 5’-GGGTTAGGGTTAGGGTTT- 64量体 二本鎖DNA 74量体二本鎖DNA
100 mM KClを添加後
KClが入っていない時
1000 x 750 nm 1000 x 750 nm[ 3 + 1 ]
G-‐四重鎖構造
G-‐四重鎖構造形成 : 44% (220 frames counted) A B C D A C B D 225 x 225 nmDNAフレーム技術によって「単分子」のG−四重鎖構造への形成を確認する
K+ K+拡大
20 mM Tris buffer (pH 8.0) 10 mM MgCl2 100 mM KCl 20 mM Tris buffer (pH 8.0) 10 mM MgCl2 10 sec / frame