分子科学的アプローチによる遺伝子発現の制御と機構の解明京都大学大学院理学研究科化学専攻生物化学研究室研究目的 : 2 つの分子化学的アプローチを駆使して研究を進めている 11) エピジェネティクな遺伝子発現の特異的な制御機構について DDAA フレームを利用して直接可視化し解析する手法の開発

(1)

Title DNAオリガミを使ってできること Author(s) 板東, 俊和; 杉山, 弘; 朴, 昭映; 山本, 清義; 谷口, 純一 Citation 京都大学アカデミックデイ2014 : ポスター/展示 (2014) Issue Date 2014-09-28 URL http://hdl.handle.net/2433/196011 Right Type Presentation Textversion author Kyoto University

(2)

分子科学的アプローチによる

遺伝子発現の制御と機構の解明

エピジェネティクな変化を１分子観測

11）エピジェネティクな遺伝子発現の特異的な制御機構について

、

　　DDNNAAフレームを利用して

、

直接可視化し解析する

手法の開発

：　２つの分子化学的アプローチを駆使して研究を進めている

DNA フレーム

~100 nm

研究目的

22）エピジェネティクな遺伝子発現の活性化能を付与した

　 DDNNAA配列特異的結合分子による

細胞の初期化

_•

分化の制御

N O H N N O N H O N H N O H N N O H N N O H N H N N O N H N N O N H N N O N H N H O N O N H O O H N OH N H O (+ 5'-WWCCWW-3' 3'-WWGGWW-5' SAHA I 京都大学　大学院理学研究科　化学専攻　生物化学研究室ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)においてOct 3/4 , Nanog の発現上昇

(3)

核

クロマチン

染色体

DNA

細胞膜

~50nm

細胞

人体＝約

_{60兆個の細胞で構成される}

核

＝細胞内小器官、内部に

_{46本の染色体を持っている}

染色体

＝細胞の遺伝情報の保存と伝達を担う

転写

mRNA

リボゾーム

　　　

翻訳

タンパク質（遺伝子）

クロマチン＝

_{DNAとヒストン（タンパク質）で構成される構造体}

（

_{Chromosome）}

（

_Chroma4n）

生物の構造・機能における基本単位

遺伝子発現

ヒストン

(4)

DDNNAA

1122塩基対からなる二本鎖DDNNAA の二重らせん構造モデル

主溝 ((mmaajjoorr ggrroooovvee)) と副溝 ((mmiinnoorr ggrroooovvee)) が交互に現れている

塩基対

((bbaassee ppaaiirr)) はらせん内部に存在している ((

実際に分子モデルで確認！

）

グアニン（

_G

）

シトシン（

_C

）

チミン（

_T

）

アデニン（

_A

）

N N N N O N H N N N N HN N N H N O H H N N O O H H 3 H 7 8 5 2 nm 1.1 nm _{2.2 nm} minor groove minor groove major groove major groove 3 7 8 5 major groove minor groove

B-DNA

C

A

T

base pair 5' 5' 3' 3'

G

塩基対(base pair): A-‐T, G-‐C塩基間で対を形成する塩基配列情報が保存されている生体分子右巻き二重らせん構造

(5)

1. 「塩基対」を利用して配列特異的に分子を構築することができる点 (program)

2. 空間的に「二重らせん構造体」として考えて設計することができる点 (geometry)

DNAの良い所

Rothemund, Nature, 2006, 440, 297.

“DNA 折り紙” 法

数百

nmスケールで様々な 2D, 3D のナノ構造体を望むように設計•合成することができる

ナノテクノロジー研究において魅力的な素材！「

_{DNA」は任意に形状を設計することができる！}

(6)

AFM (Atomic Force Microscope) : 原子間力顕微鏡

レーザー

検出器

カンチレバー

試料

カンチレバーの先につい

た針と試料の間に働く力

　　　　（原子間力）

レーザーで検出しながら、

試料の表面を針でなぞる

　　　　（走査する）

試料の表面の凹凸情報を

　画像（動画）として得る

1.$

$(program)$

2.$

$(geometry)$$$

DNA

$

Rothemund,,Nature,,2006,,440,,297.,

“DNA$

”$ $

nm

2D,$3D$

• $

DNA

$

1.$

$(program)$

2.$

$(geometry)$$$

DNA

$

Rothemund,,Nature,,2006,,440,,297.,

“DNA$

”$ $

nm

2D,$3D$

• $

DNA

$

(7)

多様な

_{DNAピースを任意に}

構成する技術

DNA ジグソウ

DNAと酵素の反応を

可視化する技術

40 nm 40 nm

特異的な機能を付与した単分子

DNAの挙動を観察する技術

9 8 7 6 5 4 3 2 1

DNAナノ構造の設計と構築

DNA フレーム

新規二次元構造体

Nature Nanotechnology, 6, 166 (2011) Chem. Eur. J. 16, 5362 (2010)

J. Am. Chem. Soc. 133, 14488　(2011)

ACS Nano, 5, 665 (2011) J. Am. Chem. Soc. 132, 1592 (2010)

J. Am. Chem. Soc. 132, 16311 (2010)

Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9412 (2010)

DDNNAAナノ構造の設計と構築、機能化、可視化する技術

　　　　　　

DNA ナノテクノロジー

DNA 折り紙技術

DNA トランスポーター

High-‐speed AFM imaging system

~300 nm ~300 nm

~100 nm

Rewiew: Angew. Chem. Int. Ed. 51, 874 (2012)

Nature Nanotechnology, 7, 169 (2012)

京都大学　大学院理学研究科　化学専攻　生物化学研究室

(8)

(9)

一本鎖　DNA テンプレート (M13mp18 DNA: 7249 bases) 相補的な塩基配列を持つ DNA (226 種類)

プログラム化された

DNA 構築

85o_C-‐15o_{C
(-‐1}o_C/min) ~100 nm (288 塩基) ~70 nm (12回の折り返し)

DNAオリガミの折り方：2次元DNAナノ構造体の構築方法

TTCAGGGT AAGTCCCA AGCCTTCA TGGCGTGA TGAATGCC ACTTACGG ACCGCACT TCGGAAGT

32-‐mer staple 一本鎖DNA

一本鎖DNA　M13mp18

高解像度_{AFMイメージ}

Staple (かすがい、ホッチキス）DNA

(10)

II II I bottom bottom II _I III bottom II IV III I top

2s-‐3s

4s-‐9s

11s-‐12s

開箱プロセスの

_{AFM
イメージ}

1 image / sec

Box

folding

DNA Box 構造形成と、開箱プロセスのリアルタイム観測

375 x 500 nm

2D

opened Box

750 x 1000 nm

_3D

_Box

folding

Org. Biomol. Chem. 9, 2075-‐2077 (2011）.

10s

DNA Box 構造が段階的に開いていく様子を

リアルタイムで観察することに成功した

動的光散乱法_{(DLS)による分析} 観測値：　直径 _{68
nm
(89%)} (計算値：　直径67 nm)

Top Side IV

Side II Side III Side I BoMom

opened Box

+Staple

(11)

N

A

N

パスルピース monomer 200 x 200 nm

O

D

複数の

_{DNAパスルピースからプログラム化された自己集合によって、文字を表示させる}

I

G

F

E

H

DNAナノ構造体が優れた「ナノマテリアル」になる可能性を示している

自己集合

500 x 500 nm 525 x 525 nm D N _A

(12)

複数の

_{2次元DNAジグソウピースを用いるプログラム化した2次元自己集合}

450 X 450 nm

D N A J I G S A W

ACS Nano, 5, 665-‐671 (2011).

2次元DNA ジグソウピースによる自己集合技術は、

水平と垂直、両方向へ応用が広がっていくだろう

D N A J I G S A W

ACS Nano

No. 5 Vol. 1, 2011

（表紙に採用された）

(13)

40 nm (128 bp) 40 nm (16 duplexes) 25nm (80 bp) 25nm (80 bp) 18 nm (7 duplexes) 23 nm (9 duplexes) 80 nm (32 duplexes) 90 nm (288 bp)

４種の連結部を内包した

_DNA

フレーム構造体の設計

２次元

DNAフレームの開発: 一分子観察を可能にする有用な観測技術として

連結部

には任意の配列、長さをもった

_{DNA鎖を組み込むことが可能}

20 nm (64 bp) 10 nm (4 duplexes)

(14)

我々の開発技術：

DNA

フレーム技術によって

DNA

の構造変化や酵素反応を単分子観測する

DNA メチル化転移酵素

DNA 再構成酵素

高速AFM測定技術 DNA オリガミ技術

DNA

フレーム単分子観察技術

DNAの構造変化

G-‐４重鎖構造の形成

酵素反応

G-‐４重鎖構造 40nmx40nmのナノ観察空間

(15)

EcoRI メチル化転移酵素

A

B

C

D

1 frame / sec

CTGTAGCTCATCATGT GGAGACTCTA GAGTGTTCCT GATGGCCGT GAATTC AAGGCGGTG GGTGCGCGTT GCTCCTCACT

CCTCTGAGAT CTCACAAGGA CTACCGGCA CTTAAG TTCCGCCAC CCACGCGCAA CGAGGAGTGA TCAATTAAGAGGGCAG

TTGCCTGAGAGTCTGG CGAGC GGAGACTCTA GAGTGTTCCT GATGGCCGT GAATTC AAGGCGGTG GGTGCGCGTT GCTCCTCACT TCCTC

GCTCG CCTCTGAGAT CTCACAAGGA CTACCGGCA CTTAAG TTCCGCCAC CCACGCGCAA CGAGGAGTGA AGGAG TACAACAA ATAACAGC

40x40 nmのナノ空間内の

単一の酵素分子の挙動を

リアルタイム観察

Sequence-‐speciﬁc M. Eco RI

tensed

duplex strand

64 bp

dsDNA

relaxed

duplex strand

74 bp

dsDNA

DNAフレーム内で

起きているメチル化反応の

数をカウントする

A B C D 64 bp dsDNA

40 nm

74 bp dsDNA

40 nm

酵素

(EcoRI) の結合と反応の様子をリアルタイムで１分子観察する

メチル化観測数:

74 塩基対

（緩んだ状態）＝43%,

64 塩基対

（張った状態）＝13% (118 フレーム中)

J. Am. Chem. Soc. 132, 1592 (2010).

DNA 鎖を折り曲げてアデニンの N6 位をメチル化するメチル転移酵素

Eco RI on the tensed 64mer dsDNA

張った状態

(16)

double-‐loops B D A C

再構成された生成物

B D A C

基質

separated dsDNAs

DNA-‐酵素複合体の形成

B D A C 5 s 10 s 15 s 20 s 25 s 30 s 35 s 40 s 45 s 50 s Cre 四量体による再構成反応プロセスを初めてリアルタイムで直接観察することに成功した Cre 四量体は再構成の後、４つのモノマーに解離している

0.2 frame / sec (5 x speed)

DNAフレーム内での酵素(Cre)による再構成反応のリアルタイム観察

Cre

再構成

DNA組換え酵素

(17)

40 x 40 nm の領域で

直接観察

Eco RI methyl transferase on the 74bp DNA strand

DNAフレーム技術によって様々な酵素のダイナミックな結合や反応過程をリアルタイムで観察する

180 x 180 nm, Scan rate: 1.0 frame / sec Holiday Junc\on : 4 s 5 s 6 s 7 s _{8
s} _{9
s} 64bp 40 nm 74bp 40 nm 40 nm 40 nm 72bp 72b p

Cre recombinase on the Holiday Junc\on

J. Am. Chem. Soc., 132, 1592-‐1597 (2010)

J. Am. Chem. Soc. 2010, 132,

1592–1597 ).

(8-oxoguamine

glycosylase

pyrimidine dimer glycosylase)

(Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49,

9412–9416).

64 塩基対（張った状態）と74 塩基対（緩んだ状態）

張力による酵素の反応性の違い

観察結果：　より折り曲げやすい

　　　　　　　　

_{74
塩基対の配列が}

　　　　　　　　メチル化されやすい

Cre :　_{Holiday
Junc4on
を経由して}DNA組換え酵素

鎖交換反応を触媒する 4本の鎖の間で _{形成される構造}

(18)

T-loop

[3+1] Hybrid 型の G-‐四重鎖構造はT-‐loop形成において安定な構造であることを提唱 (2008)

J. Am. Chem. Soc. 130, 16470 (2008).

濃度依存的な

Tm値

ゲルシフト解析

+KCl

-‐KCl

1 5’-‐GGGTTAGGGTTAGGG(T)₂₁GGGT-‐3’ 2 5’-‐GAGTTAGGGTTAGGG(T)₂₁GGGT-‐3’ 3 5’-‐GGGTTAGAGTTAGGG(T)₂₁GGGT-‐3’ 4 5’-‐GGGTTAGAGTTAGGG(T)₂₁AGGT-‐3’ 5 5’-‐AGGTTAGAGTTAGGA(T)₂₁AGGT-‐3’ [3+1] Hybrid 型の G-‐四重鎖構造ヒトテロメア配列_{[5’-‐(GGGTTA)n-‐3’]} K+ _K+

(19)

3’-TGGGTTT

5’-GGGTTAGGGTTAGGGTTT

5’-CTGTAGCTCAACATGT-GGAGACTCTAGAGTGTTCCTGATGGCCGTGAA---TTCAAGGCGGTGGGTGCGCGTTGCTCCTCACT-GAACACCCTGAACAAA-3’

3’-CCTCTGAGATCTCACAAGGACTACCGGCACTT-5’ AAGTTCCGCCACCCACGCGCAACGAGGAGTGA-5’

3’-TGGGTTT-3’-CTAAGAGAACAAACGA-GCTCGCCTCTGAGATCTCACAAGGACTACCGGCACTT---AAGTTCCGCCACCCACGCGCAACGAGGAGTGAAGGAG-TACAACAAATAACAGC-5’

5’-CGAGCGGAGACTCTAGAGTGTTCCTGATGGCCGTGAA-3’ TTCAAGGCGGTGGGTGCGCGTTGCTCCTCACTTCCTC-3’ 5’-GGGTTAGGGTTAGGGTTT- 64量体二本鎖DNA 74量体二本鎖DNA

100 mM KClを添加後

KClが入っていない時

1000 x 750 nm 1000 x 750 nm

[ 3 + 1 ]

G-‐四重鎖構造

G-‐四重鎖構造形成 : 44% (220 frames counted) A B C D A C B D 225 x 225 nm

DNAフレーム技術によって「単分子」のG−四重鎖構造への形成を確認する

K+ K+

拡大

(20)

20 mM Tris buﬀer (pH 8.0) 10 mM MgCl₂ 100 mM KCl 20 mM Tris buﬀer (pH 8.0) 10 mM MgCl₂ 10 sec / frame

単分子レベルの

G−四重鎖構造の形成過程をDNAフレーム内で確認

200 x 200 nm A B C D

+ KCl

DNAフレーム技術によってG−四重鎖構造へのダイナミックな形成過程をリアルタイムで観察する

A B C D