Agilent's Next Generation Mciroarray System - 1 Million Feature Platform

eArray7.6 ベイト設計ガイド

SureSelect ターゲット

エンリッチメント

システム

カスタムキット

※ with the Wizardは

ライブラリ作成途中での内容確認が できないので 使用を推奨していません。

2011.10. version 3.4

概要 p2～11

DNAキャプチャキット p12～

BaitGroupの作成 p23～

Libraryの作成p58 ～

Quoteの作成 p70 ～

RNAキャプチャキット p75～

BaitGroupの作成 p78～

Libraryの作成 p58 ～(上記DNAキャプチャと同じページをご参考ください）

Quoteの作成 p70～(上記DNAキャプチャと同じページをご参考ください）

既存のカタログキット（ライブラリ）に追加するライブラリの作成 p87～

SureSelectデータ解析時のBuildに関する注意点 p108～

変更箇所

Version3.4の主な変更箇所

 Repeat Maskに関する推奨の変更 Version3.3の主な変更箇所

 キャプチャ性能を最大にするためのMaximize Performanceの機能の記述を追加  Exon Interval FinderでのUTRを除く機能の記述を追加

 Windows Maskerの機能の追加  Supplemental Libraryの作製および追加方法のUpdate Version3.2の主な変更箇所  RNAキャプチャ製品のデザイン方法の記述を追加  DNAキャプチャの複数ELID製品（最大34Mb,5ELID分）のデザイン方法の記述を追加  カタログプラスカスタムキットに関する記述のUpdate Version3.1.3の変更箇所 • イネ、アカゲザル、マーモセット、メダカゲノムを追加 （2010年10月時点） • SureSelect新製品を追加 Version3の変更箇所 • ゲノムBuild情報を追加（2010年5月時点） • インデックスカスタムキットに関する記述を追加

• Human All Exonプラスカスタムキットに関する記述を追加 Version2の変更箇所

DNAキャプチャキットとRNAキャプチャキット

DNAキャプチャ用キット

キャプチャ対象はゲノムDNAです。最大 34 Mbまでのターゲット領域がキャプチャできます。

キャプチャしたいゲノムDNA上のエクソンまたは任意の領域にベイトがデザインされます。

エクソンキャプチャ Bait キャプチャしたい領域設定

RNAキャプチャ用キット

キャプチャ対象は転写産物です。最大 6.8 Mbまでのターゲットがキャプチャできます。

キャプチャしたい転写産物の配列に対してベイトがデザインされます。

インデックス

(Index)キット

• 複数のサンプルを1レーンもしくは1区画に混合してシーケンスする手法です。マ

ルチプレックスシーケンスまたはバーコードシーケンスとも呼ばれます。個々の

サンプルを識別するために、各サンプルの

DNAフラグメントには、固有のインデ

ックス（バーコード）配列を付加させます。

SureSelectのプロトコルでは、イン

デックス配列の付加は、ベイトによるキャプチャ（

Enrichment）の後のPCRの

過程で行われます。

• カスタムデザインのキットで、Baitがカバーするターゲット領域が3Mb未満の場

合、インデックスキットが自動的に選択されます。

Adapter1 Internal Adapter サンプルの配列 Adapter2 インデックス（バーコード）配列 サンプルごとに異なる配列 異なるバーコード配列を付けた複数のサンプルを 混合してシーケンス

カタログキットとカスタムキット

DNAキャプチャ用カタログキット

Human All Exon 50Mbキット

Human All Exon V2キット

Human All Exon キット

Human Kinomeキット

Human Chr Xキット

Mouse All Exonキット

DNAキャプチャ用カスタムキット

対応生物種 全 15 種類

DNA Capture MP1 < 200kb

DNA Capture MP2 200kb - 500kb

DNA Capture MP3 500kb – 1.49Mb

DNA Capture MP4 1.5Mb – 2.99 Mb

DNA Capture MP0 3Mb – 6.8Mb

DNA Capture 2ELIDs 最大 13.6Mb

DNA Capture 3 ELIDs 最大 20.4Mb

DNA Capture 4 ELIDs 最大 27.2Mb

DNA Capture 5 ELIDs 最大 34.0Mb

DNAキャプチャ用

カタログプラスカスタムキット

Human All Exon 50Mbプラスキット

Human All Exon V2プラスキット

Human All Exon プラスキット

Human Kinomeプラスキット

RNAキャプチャ用カタログキット

Human Kinome RNAキット

RNAキャプチャ用カスタムキット

対応生物種 全 77 種類

RNA Capture MP1 < 200kb

RNA Capture MP2 200kb - 500kb

RNA Capture MP3 500kb – 1.49Mb

RNA Capture MP4 1.5Mb – 2.99 Mb

RNA Capture MP0 3Mb – 6.8Mb

目的のキットがカタログ製品にない場合、eArrayを使用してカスタムキットを作成できます。

カスタムキットは、ターゲットサイズまたはELID数によって価格が変わります。

SureSelect

XT

_キット

対応次世代シーケンサ：イルミナ Genome Analyzerペアエンド マルチプレックスシーケンス

Applied Biosystems SOLiD フラグメントライブラリ、ペアエンドライブラリ バーコードシーケンス

※ 必要な反応数のインデックスアダプタは含まれます。

※ Herculase II、AM Pureビーズなど他に実験に必要な試薬類があります。

gDNAの抽出、ライブラリの作成、キャプチャハイブリダイゼーションまで

必要な試薬がセットになったキットです。インデックスアダプタも必要数

含まれており、安心して使用することができます。

SureSelect eArrayのフロー

ログインからオーダーまで

ログイン

ターゲットに

Baitデザイン

ライブラリ

作製

ライブラリ

の注文

ユーザー登録無料！

ご利用約款への同意が必要です。

Library

Bait Group1

Bait Group 2

Bait Group 3

…..

2011年7月時点 DNAキャプチャ用では15種類 RNAキャプチャ用では77種類の 生物種をサポート その他のゲノムは独自 デザインのBaitをUpload

10反応分から

オーダー可能

ターゲット領域 １キットあたり DNAキャプチャ用では 約100kb~34Mb RNAキャプチャ用では 約100kb～6.8 Mb

用語と定義

• Bait: ベイト

– ゲノムのターゲット領域に相補的な配列をもつ、120baseの長

さのシングルオリゴシーケンス

釣りの例えからの用語 ゲノム

DNAの池（Pond）の中のターゲット

領域を釣ってくるためのエサ（

Bait）

• Bait Group: ベイトグループ

– ひとつ、もしくは複数のターゲット領域にデザインされたBait

のグループ

• Library: ライブラリ

– ひとつ、もしくは複数のBait Groupから成る

– ひとつのキットとして製造されるオリゴのセット

用語と定義

• ELID （Enrichment Library ID）

– SureSelectライブラリのID番号です。この番号により、個々のライブラリが認

識されます。

eArrayから情報を得るときや、オーダーの際に必要となる番号で

重要な情報です。カスタムキットを作製してオーダーする際は、必ずこの番号

を記録しておくようにします。

• 1ELIDに入れられる最大ベイト数

– 57,680です。SureSelectのベイトはまずアレイとして製造され、アレイから切

り離されてビオチン化

cRNAに転写されます。アレイ１枚に搭載できるスポット

数が、

1ELIDのベイト数の上限となります。

• 1キットに入れられる最大ELID数

– ベイト数が57,680を超えると、ELIDの数が増えていきます。DNAキャプチャ

の場合、ひとつのキットには、

5ELID(最大34Mb)まで入れることができます。

キットの型番と価格は

ELIDの数によって変わります。RNAキャプチャキットは

１

ELIDのみです。Rocheのキットも1ELIDのみの対応です。

• アクセス:

https://earray.chem.agilent.com/earray/

• はじめてのアクセスの場合

Request for Registration

が必要

• 参考；登録に関する資料

http://www.chem-agilent.com/pdf/2_Workspace_Toroku_101216.pdf

はじめに

Agilent eArrayへのアクセス

レジスタには e-mailアドレスが 必要 登録には多少お時間 をいただきます。

• Application Type を選択

Agilent eArray

アプリケーションの選択

Switch Application Type をクリックして DNAキャプチャの場合 SureSelectTarget Enrichmentを選択 RNAキャプチャの場合 SureSelect RNA Enrichmentを選択

SureSelect Target Enrichment

DNAキャプチャ

SureSelect RNA Enrichment

RNAキャプチャ

eArrayがサポートしているゲノム 2011年7月時点 1/2

（

Buildにご注意ください！）

•ヒト H. sapiens, UCSC hg19, GRCh37, February 2009

(2010年5月1日よりhg18からhg19に変更)

•マウス M. musculus, UCSC mm9, NCBI Build 37, July 2007

•ラット R. norvegicus, UCSC rn4, HGSC Version 3.4, November 2004

•イヌ C. familiaris, UCSC canFam2, v2.0, May 2005

•ウシ UCSC bosTau4, Baylor build Btau_4.0, October 2007

もしくは

UMD UMD3.1, UMD build UMD_3.1, August 2009

•ニワトリ G. gallus, UCSC galGal3, WUSTL v2.1, May 2006

•ショウジョウバエ D. melanogaster, UCSC dm3, BDGP Release 5, April 2006

•線虫 C. elegans, UCSC ce4, WormBase WS170, January 2007

•出芽酵母 S. cerevisiae, UCSC sacCer1, SGD, October 2003

•分裂酵母 S. pombe, NCBI Build 1.1, February 2002

eArrayがサポートしているゲノム 2011年7月時点 2/2

（

Buildにご注意ください！）

•アラビドプシス A. thaliana, TAIR 10, November 2010

•イネ O.sativa, IRGSP5, June 2008

•アカゲザル M. mulatta, UCSC rheMac2, Dpse_2.0, January 2006

•マーモセット C. jacchus, UCSC calJac3, WUGSC 3.2, March 2009

•メダカ O. latipes, UCSC oryLat2, NIG/UT MEDAKA1, October 2005

•ゼブラフィッシュ D. rerio, UCSC danRer6, Sanger Zv8, December 2008

eArrayのSureSelectアプリケーションで行うこと

１．シーケンスで読みたい領域（ターゲット）を決定

２．ターゲット領域に対してBaitをデザイン

３．Bait Groupを集めたライブラリ を作成

gDNAのどの位置でもターゲット領域として設定可能

ゲノムDNA

Enrichしたい領域

Bait

Bait Group1

Library

Target interval

Bait Group2

遺伝子名や

RefSeqIDでエクソン領域をサーチし、ベイトデザ

インが可能

［ステップ１］

ベイトを作成したい遺伝子のリストを準備

GeneSymbol, Accession IDでサーチ可能

［ステップ２］

eArrayで目的遺伝子のエクソン領域（または全領域）をサーチ

［ステップ３］

サーチされた領域に対して、ベイトライブラリを作成

Bait

Exon Interval Finder

エクソン領域の位置のみをサーチ

UTRを含む、含まないを選択可能

Interval Finder

UTRとIntronも含めて遺伝子領域の位置をサーチ

• Without the Wizard の選択を推奨（本マニュアルではWithout the

Wizard を解説）

メソッドの選択

利点

問題点

どんなときに

使用するか

Following the

Wizard

*

ガイド付き

• 標準的な流れに沿ったガイド付き

• デザインの開始からSubmitまで

ガイド

• ライブラリが完成するまで

詳細を確認できない

•Baitのデザインできなかった

領域を示す“fate” ファイル

にアクセスできない

最もシンプルなデザ

インをするときのみ

実施（基本的に推奨

しない）

Independent

of the Wizard

ガイドなし

•Baitがデザインできなかったターゲット

領域の確認が可能

•パラメータを変えて、Baitを再設計する

ことが可能

•各ターゲット領域に対して、いくつの

Baitが設計されたかなど、デザインの

詳細をライブラリ作成途中に確認可能

• デザインのガイドがない

ターゲットセットの

デザインを最適化す

るために、ある程度

の試行錯誤が予想さ

れる時に使用

ライブラリ作成までのワークフロー

• キャプチャしたい遺伝子リストを準備している場合

• キャプチャしたい領域の位置情報を準備している場合

キャプチャしたい遺伝子の

エクソンまたはその遺伝子領域の

位置情報をサーチ

サーチされた位置情報を

元にベイトをタイリング

デザイン

キャプチャしたい領域の

位置情報を入力

入力された位置情報を

元にベイトをタイリング

デザイン

ライブラリ作成までのワークフロー 続き

ターゲット領域に対して

Baitをタイルし、Bait

Groupを作成

Baitがデザインされな

かった領域や、デザイン

されたBaitの数を確認

必要に応じて、設定を変更して

Baitを再デザイン

Bait Groupをまとめた

Library作成

(最小Bait Group数=1)

LibraryのSaveとSubmit

オーダー（Quote作成）

カスタムキット ２種類の作成方法

• 独立したライブラリの作成

下記の２種類のカスタムキットの作成方法となります。P.21以降を

参照ください。

– カスタムキット

– インデックスカスタムキット

• カタログキットに追加するライブラリの作成

カタログキットにカスタムキットを追加したライブラリの作成方法とな

ります。独立したライブラリの作成方法とは異なりますので、P.87以

降を参照ください。

独立したライブラリの作成方法

- カスタムキット

- インデックスカスタムキット

※カタログプラスカスタムキットの作成については P. 87 以降を

参照ください。

カスタムキットとインデックスカスタムキット

(重要)

• カスタムキットをデザインする場合、ターゲット領域に対して最終的に

設計された

Baitsがカバーする領域の合計と、シーケンサの種類やリード

長により、キットの種類が自動的に決定されます。

• Baitがカバーするターゲット領域が

3Mb未満の場合、インデックスカス

タムキットが自動的に選択

されますのでご注意ください。

3Mb未満のタ

ーゲットサイズでは、インデックスではないキットを選択することがで

きません。

• インデックスカスタムキットを作成した場合は、インデックス（マルチ

プレックス

/バーコード)用にBaitと試薬が最適化されるので、インデッ

クスキット用のプロトコルで実験を行う必要があります。

• ベイトの数が57,680を超えるとELIDの数が増えていきます。ELIDの数

が複数になった場合、キットは自動的に

SureSelect

XT

のタイプとなり、

インデックス対応のプロトコルとなります。

• Baits

のページを選択し、

Search

をクリック

• Searchをクリックすると、キャプチャ領域をサーチする画面に入る

Bait Groupの作成

Baitのデザイン（遺伝子リストから開始する場合）

Baits をクリック Search をクリック

Bait Groupの作成

search方法の指定

Interval FinderかExon Interval Finderのどちらかを選択

Exon Interval Finder (UTR含む)

Interval Finder

指定した遺伝子の全領域の位置をサーチ

指定した遺伝子のエクソン領域の位置をサーチ

ここにチェックを 入れると 既知のUTRを除外して Coding Exon領域だけを

Bait Groupの作成

Interval FinderとExon Interval Finderの例

Example: E2F1

Bait Groupの作成

Interval FinderとExon Interval Finder 使用上の注意

入力またはUploadしたGeneSymbolやAccession IDが、UCSCでサーチできるIDでないと、

サーチができません。

UCSCでサーチできないIDを使用すると、サーチがおこわなれません。（エラーは出ません）

どのTermでサーチが行われなかったかは、

“Download unfound terms”で確認することができます。

必ずサーチ後に、サーチ対象の遺伝子についてすべてサーチが行われているかどうか

“Download unfound terms”をクリックして、内容を確認してください。

例：ABLなど下記のTermは、

この用語ではUCSCに登録されて

いないので、サーチされて

いません。サーチできる用語に

変更して、サーチをやり直す必要

があります。

Unfoundterm

ABL

BCL2ALPHA

BCL2BETA

CRK-II

Bait Groupの作成

search termとSpeciesの入力

1. Search typeを選択 Gene Symbol、Accession No.

またはCytoBand ただしCytoBandの場合はBand全体の 領域になります。 3. Species を選択 現時点でサポートしている 生物種は限定されています。 ※次ページ参照 4. Searchをクリック 5. Search結果が 表示される 2. Search termを入力 選択したTypeに従って Search Termを入力します。

Bait Groupの作成

Bait Groupの作成

Run Bait Tiling

1. ベイト設計を行う領域を選択します。 サーチされた領域すべて（Select Entire

Result)もしくはエクソンを個別に チェックして選択

2. Run Bait Tilingを選択すると、この領域 情報が自動的にBait Tiling画面に

Bait Groupの作成

複数の

search termを入力する場合

1. Search typeを選択 Gene Symbol、Accession No.

またはCytoBand ただしCytoBandの場合はBand全体の 領域になります。 3. Species を選択 現時点でサポートしている 生物種は限定されています。 ※p28参照 2. Accession番号、Cytobandまたは Gyne SymbolにCapture対象の リストを入力 Option1. 画面に直接タイプする場合 入力例（Accessions) | 記号で各Accession番号を セパレートする必要があります。 NM_012257|Q0055|NM_012298 Option2. テキストファイルを Uploadする場合の 入力例（GeneSymbol) それぞれのGeneSymbolが異なる 行に記載されている必要があります。 ファイルはタブ区切りテキスト ファイルとして保存してください。 カンマなどの記号は使用できません。

Bait Groupの作成

複数の

search termでのSearch結果

DownLoad Unfound Termsを クリックして、サーチされなかった Termがないことを 必ず確認してください。(p.26参照) 1. ベイト設計を行う領域を選択します。 サーチされた領域すべて（Select Entire Result)もしくはエクソンを個別に チェックして選択

2. Run Bait Tilingを選択すると、この領域 情報が自動的にBait Tiling画面に

Bait Groupの作成

Baitのデザイン

• Baits

のページを選択し、

Bait Tiling

をクリック

• Bait tailingをクリックすると、Bait Groupをデザインする設定画面に入る

Baits をクリック

Bait Groupの作成

Baitのデザイン

1. design jobの名前を 入れる. これがBait Groupの名前になり ます。

2. Sequencing TechnologyとDesign Strategy:

Sequencing Technologyを選択してUse Optimized Parametersをチェックすると アジレント社が現時点で最適化している条件が自動的 に選択されます（詳細は次ページ）。パラメータを 変更したいときは、この選択を外します。 4. Species:ターゲット領域のEnrichmentの対象と なるゲノムを選択します。. ゲノムを選ぶと自動的 にBuildが決まります。（変更できません）

5. Genomic Target Intervals: Enrichした

いターゲット領域の位置情報を入れます。 直接入力するか、前ページまでの方法で サーチするか、事前に作成したファイル をUpLoadします。位置（Map情報）の指 定の方法は決まっています。次ページ以 降の例を参照ください。

7. Avoid Genomic Intervals:

• Repeat masked regionsを除くために選択します。 • eArray7.6から、 Defaultの設定はWindows Maskerに 変更になりました。（次ページ以降参照） • Windows MaskerまたはRepeatMasker以外に、Baitを デザインしたくない領域があれば、位置情報を直接入力 するか、事前に作成したファイルをUpLoadできます。 8.Submit: 設定が終了した時点で Submitを選択します。 注意） 同じ名前でも 入力できます。 （上書きされま せん） 空白は使用でき ません。他にも 使用できない 記号があります。 3.Strand 通常は Senseを 指定します。 注）次ページ以降 を参照

6.:Extend Interval Boundaries 3’ and 5’

5のGenomic Target Interval Boundariesで入力 した領域から、3’および5’方向に延長した

Sequencing TechnologyとProtocol

2011年7月時点で、対応シーケンサは下記の通りです。

Illumina Genome Analyzerシリーズ, HiSeqシリーズ

Life Technologies AB SOLiDシリーズ (5500のPEは

アーリーアクセス）

Roche 454FLX, Juniorシリーズ

Illumina protocol

・Single-EndかPaired-Endかで試薬が変わりますので使用する

Protocolを選択してください。

・Single-EndもしくはPaired-Endを選択するとTiling Frequency

は2xtilingで、Long Read(75bp+)を選択すると1xtilingとなります。

・Long Read(75bp+)で2xtilingを選択したい場合、次ページ以降を

参照してください。

SOLiD protocol

どちらを選択しても、SureSelect製品としては同じもの

となります。

Roche protocol

Bait Groupの作成

Design Strategy

1. Change the parameters: “Use Optimized Parameters” オプションの 選択を外すと、パラメータを変更できます。

2. Centered versus Justified: (次ページ参照)

3. Bait Length: 現時点では 120 bp が、唯一設定できる Baitの長さです。

4. Bait Tiling Frequency: （次々ページ参照）

1X, 2X, 3X, 4X, and 5X はBait 同士のオーバーラップの設定です。 ターゲットの末端では.この設定は適用されていません。 Defaultの推奨は2xtilingです。1xtilingより2xtillingの方が より高いキャプチャ効率が得られるデータがありますが、 2xtiling以上の頻度ではそれほど変化はありません。 ただし、タイリング頻度を上げると、より狭い、もしくは小さ なターゲットに対して、カバー率を上げる可能性があります。 5. Allowed overlap into

avoid regions: Centered baits を選択する と、はみ出したBaitがター ゲット以外の領域とオー バーラップします。 この場 合、もしターゲットが Repeat Masked Regionと隣

り合っていたら、ここで設 定した長さのオーバーラッ プは許容されます。オー バーラップを許容したくな いときは”1bp”を入力します。 Centered: まずターゲット領域の中央に Baitを置き、そこからター ゲット領域全体に等間隔にな るようにBaitをタイリングし ます。ターゲット領域の末端 では、通常Baitが少し はみ出た状態になります。

Why use this? このデザイン がもっともよくテストされて います。 Justified: Baitはターゲットの末端から デザインされます。ターゲッ ト領域にきっちりおさまらな い場合は、両末端をそろえた 状態で、すべてのBaitの位置 が少しずつシフトします。 ターゲット領域からBaitがは み出すことはありません。

Why use this? ターゲット領 域以外にBaitをデザインした くない時に利用します。 6. Strand: Sense鎖を選択すると ベイトはSense鎖でデザイ ンされ、製品であるビオチ ン化cRNAベイトは antisenseシーケンスとなり ます。このcRNAベイトが Sense鎖のgDNAをキャプ チャしますが、最終的には PCRの過程がはいるため、 両鎖がシーケンスされます。 基本的にはSense鎖を選択 してください。

Bait Groupの作成

Centered と Justified の違い

Centered (Defaultで推奨)

Justified

(b) ターゲット領域がBaitの長さのちょうど２倍の場合

baits

(a) 大きなターゲット領域の場合( 2x tilingの例)

(c) ターゲット領域がBaitより短い場合

target region

 Centered

と

Justified

で

同じ

_Bait

が

デザインされる。

Centered

では

bait

は ターゲット領域を超えて等 間隔にデザイン

Justified

では

bait

は ターゲット領域に末端を合 わせてデザイン。 一部タイリング頻度が設定 と異なる部分ができる。

 Centered

と

Justified

で

同じ

_Bait

が

デザインされる。

Bait Groupの作成

Bait Tiling Frequency

baits target region

3x tiling

overlap: 40bp

baits target region

2x tiling

overlap: 60bp

baits target region

5x tiling

overlap: 24bp

baits target region

4x tiling

overlap: 30bp

baits target region

1x tiling

overlap: なし

※ベイトの重なりがないため、同じベイト数で ターゲットをより広い領域で設定できる。 イルミナでは75bp以上の長さで読むことが必要。 ※1xtilingよりもキャプチャ効率が上がるため Defaultの設定として推奨。これより高い Tiling Frequency ではキャプチャ効率は さほど変わらない。

Bait Groupの作成

Sequencing TechnologyとBait Tiling Frequency

※ SOLiDのPaired-Endシーケンスについては、ベイト設計、アダプタ付きDNAの調製とSureSelectによる

キャプチャのプロセスはフラグメントシーケンス(end-sequencing）と全く同一です。

Sequencing Technology

Sequencing Protocol

Bait Tiling

Frequency

-default setting

Bait Tiling Frequency

(Option)

illumina

Single-End

2x

2x, 3x, 4x, 5x

illumina

Paired-End

2x

2x, 3x, 4x, 5x

illumina

Single-End Long Read (75bp+)

1x

1x, 2x, 3x, 4x, 5x

illumina

Paired-End Long Read (75bp+)

1x

1x, 2x, 3x, 4x, 5x

SOLiD

end-sequencing

2x

1x, 2x, 3x, 4x, 5x

SOLiD

Paired-End

2x

1x, 2x, 3x, 4x, 5x

Bait Groupの作成

インデックスカスタムキットの

Bait Tiling Frequency

3Mb未満の領域をキャプチャするインデックスキットでは

Tiling frequency を 1 x tiling にする必要がありません。

(1 x tiling は通常、2 x tiling の1ELIDでのキャプチャ上限を超えた

3.4Mb以上の広い領域をキャプチャするために設定します。）

3Mb以下のサイズのインデックスキットでは 2 x tiling の設定を

推奨します。

illuminaのLong Read(75bp+)を使用する場合でも、より高いキャプチャ

効率を重視する場合は、2xtilingを推奨します。

Bait Groupの作成

Tiling FrequencyがCoverageに与える影響

Bait Groupの作成

インデックスカスタムキットの

Bait Tiling Frequency変更

3Mb未満の領域のキャプチャ で、イルミナのPaired-End Long Readを選択した場合 Use Optimized Parameter

のチェックを外します

Bait Tiling Frequency を 2x に変更します。

Bait Groupの作成

Strand

gDNAのキャプチャの場合、通常はSenseを選択します。

Senseを選択すると、Sense側のStrandをキャプチャするための

cRNA Baitが製造されます。キャプチャ後のPCRにより、キャプチャ

されたsense側のDNAは２本鎖となり、両鎖がシーケンスされます。

Bait Groupの作成

Target Intervalsの入力フォーマット

Option 1. 直接この画面にタイプもしくは Copy＆Pasteで入力 入力フォーマットは下記の例を参照してくだ さい。 chrX:100003816- 100003948|chrX:100004037- 100004218|chrX:100004314- 100004465|chrX:100004329-100004465|chrX:100004804-100004888 それぞれのintervalは、| 記号でセパレートさ れている必要があります。カンマなどの記号 は使用できません。Intervalの数が多いような ら、Option2の利用をお勧めします。

Option 2: ターゲットの位置情報(the genomic interval）を含んだファイルをUpload : Uploadする場合のフォーマットは下記の例を参照。 それぞれのIntervalは、異なる行に記載されている 必要があります。ファイルはテキストファイルと して保存してください。カンマなどの記号は 使用できません。 まずUploadをクリックし,続けて Browseをクリッ クして Upload Fileを選択します. 前述のサーチ 機能を用いた 場合、位置 情報は自動 入力されます。 Option 3. ここをクリックすると、入力したinterval から3’方向または5’方向にキャプチャ領域を 拡張することができます。（次ページ参照）

Bait Groupの作成

Target Intervals領域の拡張

ここをクリックすると、入力したinterval から3’方向または5’方向にキャプチャ領域を 拡張することができます。拡張するサイズは3’側と 5’側で異なる値(bp)を入力することができます。

Bait Groupの作成

Repeat Masked Regionsの選択

・Repear MaskerはUCSC RepeatMasker trackの領域です。

・Windows Maskerの詳細は下記の文献をご参照ください。

WindowMasker によるRepeat Maskは

NCBIのWindows Masker tool のdefault parametersにより行われます。

・実験の目的に応じて、どちらか適切な方のRepeat Mask機能を使用してください。

判断に迷う場合は、従来から使用していたRepeat Masker機能の使用を推奨します。

eArray7.6から新たな機能として追加

従来のRepeat Mask

Repeat MaskerとWindow MaskerのIntersection 領域で、もっとも緩やかなMaskとなります。

Bait Groupの作成

Bait Group のStatusの確認

• SubmitしたBait Group のStatusは、

Home

ページ(左図)の Pending Jobs か、もしくは

Baits

ページ (右図)の下に表示され、確認できます。

• さらに次のStepには

Baits

ページから進みます。

Bait Groupの作成

View Design Details (I)

• Bait Group のデザインのサマリを見るには

Baits

ページの

View Design

をクリックしま

す。

Bait Groupの作成

View Design Details (II)

• Design Summary, Design Details, Target

Fate, Fate Details File, Bed File のタブを切り

替えて、

Baitのデザインを確認できます。 (それぞ

Bait Groupの作成

Download the Design (I)

•

Baits

ページの

Download を

クリックし、

Bait のデザインファイルをダウンロードしま

す。

Bait Groupの作成

Download the Design (II)

downloaded zipには、以下の5種類のファイルが含まれます:

Example of a BED file:

Example of a TDT (tab delimited table) file:

Example of a Fate file:

Example of a Summary file:

Bait Groupのチェック

BaitがデザインされなかったTargetの確認

• MS-ExcelでBaitTiling_fate

ファイルをオープン

•

Status

でソートし、Statusがfailedになっているか、Passしていないターゲット領域を

確認

– Failedのターゲット領域は、Genome build に正しくアサインできなかったもので、位置情報が

誤っている可能性があります。

•

Baits Generated

でソートし、baitがデザインできなかったターゲット領域を確認

– 例 BaitTiling_sum （左図）: 8423 - 8081 = 342 のターゲット領域に対し、Baitがデザイン

できなかった。具体的にどの領域に対して、

Baitがデザインできなかったかを

BaitTiling_fate

（右図）で確認。

Bait Groupのチェック

UCSC Browser上でのBait Designの確認

2010年4月までにデザインされたSureSelectのbaitは

NCBIのBuild36, hg18のシーケンスに対して

デザインされています。

2010年5月からデザインされたSureSelectのbaitは

GRChのBuild37, hg19のシーケンスに対して

デザインされています。

UCSC Browserを使用する場合

Buildが一致していることを確認してください。

Add custom tracksボタンを

押します

Bait Groupのチェック

UCSC Browser上でのBait Designの確認

Browseでbedファイル

を選択し、

Submitを押します。

Bedファイルが

読み込まれるので

Go to genome browser

を選択します。

Bait Groupのチェック

UCSC Browser上でのBait Designの確認

• BEDファイルはカスタムトラックとしてUCSCブラウザにUploadされ

ターゲット領域に対して、どのようにBaitがデザインされたかを確認できます。

chrX のある領域の

エクソンに対して

デザインされたBait

の確認

ひとつのエクソ

ンに対してデザ

インされたBait

をZoomして確認

Baits

Genes

RepeatMasker

Baits

Genes

RepeatMasker

Bait Groupのチェック

Re-Tilingできる可能性のあるTarget領域の確認

Baits

Genes

RepeatMasker 1. Fateファイルの中で baitが作成されてい ないTargetを選択 3. この例では、右側のエクソンはRepeatMasker trackと重なって いるため“repeats”として同定されています。Repeat Maskerが Baitをデサインしない領域（Avoid）として設定されているので Baitの数が0となります。

Baitがデザインされなかったターゲットに対して、どうしてもBaitを設計したい場合は、そのターゲット

領域に対しリピート領域との重なりを許容するよう設定を変更して、新しいBait Groupを作成することが

できます。 両方のBait Groupを１つのLibraryに入れることができます。ただし、リピート配列との

重なりを許容すると、キャプチャ効率に影響を与えます。

2. BED ファイル を UCSC browserで表示させ、ターゲッ ト上でzoomすると、baitがデザ インできない理由が確認できま す。

Bait Groupの作成

Create Bait Group

Home ページのPending Jobs で Bait Group creation のStatus が

確認できます。

Bait Group のデザインに問題がなければ, Create Bait Groupをクリック

ひとつのBait Group のCreationを待つ間、必要に応じて

別のBait Groupをデザインすることが可能です。

すべての

Bait Group のデザインの完了

• ライブラリの作成に入る前に、ひとつのライブラリに入れる予定のすべてのBait

Groupのデザインを完了させます。

• 複数のBait Groupをひとつのライブラリに入れるケースとしては:

– 異なるターゲット領域に対して、異なるデザイン条件を設定した場合

– 自分がすでにデザインしていたBait Groupを、新規のBait Groupに加えたい場合

– ターゲット領域のタイプの違いに合わせて、それぞれ独立したBait Groupを作成したい場

Libraryの作成

Libraryに入れるBait Groupの選択

1. Bait Groups のページをクリック,

Browse BaitGroupかSearchをクリッ クして目的のBaitGroupを表示

2. ひとつのライブラリの中に入れるBait Groupにチェックマークを

入れて選択、ベイトの合計数が57680を超えると、ライブラリ数が 増えて、価格も変わります。

Libraryの作成

Speciesの選択

1. 生物種(species)を 選択 2. Next をクリック

現時点では生物種の選択による違いは

ありません。

すべてアジレント社内部QC用のコントロール

が追加されます。

将来のUpgradeに向けた設定です。

Libraryの作成

ベイトの数が

1ELID分を超過した場合

上記のメッセージが画面に現れます。

このメッセージが出ると、ベイト数に応じた2~5までのELID数の製品に

変わります。価格も変わりますので、ご注意ください。1ELID製品を

デザインしたい場合は、ターゲットサイズ、ベイトのTiling Frequency、

Replicate数を見直して、ベイトの数を

57,680以下に

減らすようにして

ください。

Libraryの作成

Libraryの定義付け

1. ライブラリの名前 を設定 2. Baitの長さを選択 （現在は120bpのみ） 3. 必要に応じて Description, Keywords, とCommentsを入力 4. Library のStatisticsを確認 ここではあといくつのBaitを ライブラリに入れることが できるかがわかります。 利用可能なうち 何％を 使用しているか わかります。 ※後述 5.ベイトが57,680を 超えた場合、ライブラ リ数がここに表示され ます。 6. ベイトのBoostingを 選択（次ページ参照）

Agilent Recommended Boosting

• Maximize performance

– キャプチャ効率が最大になるように

eArrayが相対的なベイト濃度を自動的に調製します。ベイト濃度が自動

的に調製されるため、複数のベイトグル―プを使ってLibraryを作製する

ときに、ベイトグループごとに

Replicate Numberを入力することがで

きません。通常は、この機能を使用することを推奨しています。

• Maximize capacity

- 複数のベイトグループを使ってLibraryを作製す

るときに、入力した

Replicate Numberに基づいて、利用できる最大数

までベイト数を増やす機能です。

Libraryの作成

% Occupied before auto replication

% Occupied before auto replication

デザインしたBaitとアジレント既定のコントロールBait

の数が、設計可能な全Baitに占める割合

例）デザインしたBaitの数が12,000の場合、コントロールベイト

70を含んだ全Bait数が57,750なので

12,000 / 57,750 = 20.8 %

特に繰り返し回数を指定しないときには、最大Bait数まで

自動的にReplicationされます。

Libraryの作成

ライブラリの詳細を確認

Option. Maximize Capacityを

選択している場合。 Replicateの数を入力 必要であれば、Bait Group の 繰り返し回数を変更 （通常は１） 1. Base Coverageの確認 Calculateボタンをクリックして、ライブラリのターゲットサイズを計算し、確認し ます。ターゲットサイズにより、製品型番と価格が変わりますのでご注意ください。 MP1: <200 kb, MP2: 200-499 kb, MP3: 500kb-1.49 Mb, MP4: 1.5 – 2.99 Mb MP0: 3-6.8 Mb Calculateボタンをクリックすると 下記のようにターゲットサイズが計算されて表示されます。 2. Library(ELID)の数を確認 ベイト数が57,680を超えると、Library(ELID)の数が 増えていきます。Library数が増えると、キットの型 番と価格も変わりますので、ご注意ください。 必要に応じて、目的のLibrary数になるように 変更します。

Libraryの作成

ライブラリの詳細を確認

<重要> Library(ELID)の数を確認 ベイト数が57,680を超えて、Library(ELID)の数が 2 になった例です。Library数が増えると、キットの 型番と価格も変わりますので、ご注意ください。 必要に応じて、目的のLibrary数になるように 変更します。

Libraryの作成

ライブラリの詳細を確認した後、

Save

1. LibraryのStatusを変更 ライブラリをSubmitしたい場合は、Completeを選択. まだ変更する可能性がある場合は、DraftかReviewを選択 2. Saveをクリック Draft：Save後作成 者が変更可能です。 Review:ワークグルー プメンバーは、この ライブラリのVersion を作成できます。 Complete：save後の 変更は不可能ですが Submitはされていな い 状態です。

Libraryの作成

ライブラリの

Submit

1. LibraryのStatusを変更 ライブラリをSubmitしたい場合は、Completeを選択 して、Saveします。 2. Saveをクリック

Libraryの作成

LibraryのSubmitの実行

1. 必要なコメントを入力し、Yesをクリック 2. 必要なコメントを入力し、 Design check listをクリック 3. ライブラリデザインにあたっての重要な 注意事項がまとめられています。必ず 全文をチェックし、OKならチェック マークを入れて Doneをクリック ※次ページ参照 4. ここで Yes をクリックすると、ライブラリ作成が完了し、submitされます。Submitしたライブラリを 実際にオーダーするためには、次の見積もり請求 （quote）に進みます. SubmitしただけではLibraryをオーダーしたことにはなりません。必ず次のquoteのステップが必要です。

Libraryの作成

Designにあたっての注意事項

現時点では、コントロール を設定しても、Baitの 設計には影響を与えません。 将来のUpdateのために コントロールとして区別したい Bait Groupについて コントロールの設定をします。 現時点では、Bait長は 120merで固定であり タイリングは設定に合わせて 自動的に行われます。

Bait GroupにReplicate Numberを 設定したときには、適切な 繰り返し回数を設定しているかどうか 再度確認ください。Maximize Performanceを選択した場合、Baitの 相対的な濃度は自動的に 調節されます。 使用を予定しているシーケンスの機種 とプロトコルが設定されていることを 確認してください。

Quoteの作成

見積もり依頼する

Libraryの選択

1. Libraries のページをクリック Search Library をクリック

2. 見積もり依頼するライブラリを選択、チェックマークを入れて

Order LibraryもしくはOrder XT Libraryをクリック

2. Library Name(一部でもOK)または ELIDで見積もり依頼したいLibraryをサーチ

<注意> キットの種類によっては Order LibraryもしくはOrder XT Libraryの

Quoteの作成

Library見積もり依頼の詳細を設定（必ずライブラリ設計者による設定が必

要）

1. 注文するライブラリのキットの個数を設定 3. １キットあたりの反応数（サンプル数）を選択: Reaction size の 100 とは、１つのライブラリを 100サンプルのCaptureに使用することを 意味します。 4. シーケンステクノロジの選択 （現在はイルミナGAとSOLiDと Rocheに対応） 6. Nextをクリック 5. シーケンスプロトコールの選択 作成するキットの種類により 選択できるプロトコルが表示されます。 2. デザインしたカスタムキットのBait数と キャプチャターゲットサイズを確認します。 ターゲットサイズによりキットの種類と価格 が決まるので、変更したい場合はライブラリ を作成しなおします。

Quoteの作成

Libraryキット見積もり依頼のreviewとSubmit

注文するLibraryの 内容を再確認して Request a Quoteを 前画面の入力により、キットの型番が自動的に決定 されます。また Library Detailに記載されている ELID が、ライブラリキットのID番号となります。 大変重要な情報ですので、必ず

Quoteの作成

Libraryキット見積もり依頼のreviewとSubmit

ベイトの数が多く、ELID数が上限の5つとなった例です。 この例では、S0334455がキット全体のELIDとなり 0334401,0334411,0334421,0334431,0334441が 内訳の5つのELIDとなります。 必ずPrintをクリック して、画面のプリント を保管ください。 注文するLibraryの 内容を再確認して Request a Quoteを クリック

アジレント社担当営業もしくは取り扱い販売店から

見積もり金額の提示 → 発注へ

RNAキャプチャキット

画面右上のSwitch Application

Typeをクリックして、 SureSelect RNA Enrichmentの

eArrayがサポートしているDatabase 2011年7月時点

77生物種

15

th

_{September 2010時点の}

UniGene databaseを

ベースにしています。

eArrayのSureSelect RNAキャプチャアプリケーションで

行うこと

Non-codingRNAキャプチャ

Bait

gDNA上でキャプチャしたい領域設定

Target Typeを選択します。Transcript targetsもしくはGenomic Interval

Transcript Targetの場合

UploadしたGeneBankのIDリストまたはFASTAのシーケンスをもとに、指定したtiling frequencyで

ベイトがデザインされます。UniGeneに登録されている転写産物をキャプチャしたい場合に用います。

Genomic Intervalの場合

UniGeneに登録されていない配列をキャプチャするために、gDNAの位置情報を指定する場合に

用います。

• Baits

のページを選択し、Bait Tiling

をクリック

• Bait Tilingをクリックすると、Baitをデザインする画面に入る

Bait Groupの作成

Baitのデザイン

Baits をクリック Bait Tiling をクリック

Bait Groupの作成

Baitのデザイン

1. Library CategoryがRNA Capture になっている

のを確認します。 _{次ページ以降参照}

4. Bait Tiling Frequency を入力します。

Defaultは2xtilingです。 3. Sequence Technology を 選択します。 iluminaもしくは AB (SOLiD) Protocolは自動的 に決定されます。 2. Job Nameを入れる. これがBait Groupの 名前になります。

Bait Groupの作成

Bait Tiling Frequency

baits target region

3x tiling

overlap: 40bp

baits target region

2x tiling

overlap: 60bp

baits target region

5x tiling

overlap: 24bp

baits target region

4x tiling

overlap: 30bp

baits target region

1x tiling

overlap: なし

※ベイトの重なりがないため、同じベイト数で ターゲットをより広い領域で設定できる。 イルミナでは75bp以上の長さで読むことが必要。 ※1xtilingよりもキャプチャ効率が上がるため Defaultの設定として推奨。

Tiling Frequencyを大きくすると

ターゲット領域のサイズは

減少します。

Bait Groupの作成

Baitのデザイン

5.生物種を選択。ここに 目的の生物種がない場合、 NAを選択し、 Transcriptome Fileとシーケ ンスをUploadしてデザイン できます。 6.ターゲットを入力 GenBanckのAccession番 号のリストを入力するか、 ターゲットの配列を FASTAフォーマットで Uploadします。ファイル はziipファイルの形式であ ることが必要ですので注意 ください。GeneSymbolは 使用できません。 7.Transcriptome Detailsの 入力 5で選択したものと同じ生物 種を選択します。 8.eArrayでサポートしていない生物種に対 してデザインする場合、Transcriptome ファイルをUploadします。FASTAフォー マットをzip化してUploadください。

Zip化

Bait Groupの作成

View Design Details (I)

• Bait Group のデザインのサマリを見るには

Baits

ページの

View Design

をクリックし

ます。

RNAEnrichment_tdt ファイルの確認

BaitScoreの意味

1.

Not masked and unique in genome.

2.

Not masked but may hit other regions/transcripts of the genome.

3.

Masked but unique

4.

Masked and not unique

RNAEnrichment_tdtファイルをOpenし 必ずBaitScoreを確認します。 BaitScoreが4のBaitがあれば、リピート 配列である可能性が高いので、デザイン から除外することを推奨します。 (次ページ参照) 2および3のScoreをライブラリに含めるか どうかは、実験の目的に応じて決定します。

BaitScore4を除外して再デザイン

1.

RNAEnrichment_tdt をExcelで開き、BaitScore4を除外したファイルを作成します。

2.

さらに、BaitIDとSequenceのカラムを残し、その他のカラムは削除します。

作製したベイトシーケンスファイルの

Upload

Baits→Upload をクリック

Speciesを 入力

Create New Bait Groupを選択し 名前を入力 File Formatは MINIMAL,Typeは TDTを選択 デザインに使用し たTiling Frequency を入力 作製したタブ区切 りテキストファイ ルを選択

作製したベイトシーケンスファイルの

Upload

Uploadしたテキストファ イルの先頭行にHeaderが ある場合は、ここをク リック Uploadをクリック

この後の作業は、DNAキャプチャと同様です。

Libraryの作成 p56～

Quoteの作成 p66～

をご参考ください。

カタログキット（ライブラリ）に

追加するライブラリの作成

-Human All Exonシリーズプラスカスタムキット

-Human Kinomeプラスカスタムキット

カタログキット（ライブラリ）に追加するライブラリの作成

• カタログキット（ライブラリ）に追加するカスタムライブラリは、1ELIDのサイ

ズであればこれまで作製した既存のライブラリでも、

Supplemental ライブラリ

でも、どちらも追加できるようになりました。

• Supplementalライブラリを新たに作る場合は、既存のベイトグループやUpload

したベイトグループからも作製できるようになりました。

• 2011年7月現在、カスタムライブラリを追加できる元のライブラリは以下のもの

になります。

– Human All Exon 50Mbキット (XTタイプ)

– Human All Exon v2キット (XTタイプ)

– Human Kinome キット (XTタイプ)

– Human All Exonキット (Non-XTタイプ)

• RNAキャプチャキットは対応していません。

• 追加するライブラリのデザインはDefault設定となります。設定の変更はできま

せん。

カタログキット（ライブラリ）に追加する

Supplemental

ライブラリの作成

Homeを選択します

Create Library from Bait Upload, Create Library from Existing Bait

Groups(s),

Create Library by Bait Tilingの

いずれかを選択して

Nextをクリック（ここでは Existing Bait Groupsからの例を説明）

Supplemental Libraryの作成

Speciesの選択

Speciesを選択して Nextをクリック

Supplemental Libraryの作成

Base Libraryの選択

2. Base Libraryを を選択します ここに記載のないキットは 選択できません。 1. Library Typeとして Supplementalを 選択します 3. Base Libraryとオーバーラップするベイトをデザ インに入れるか、入れないかを選択します。入れたく ない場合はここにチェックします。

Supplemental Libraryの作成

追加する

Bait Group(s)の選択

1. Addをクリックします。

2.目的のベイト グループを名前 でサーチして リスト表示させ 追加するグルー プを選択して Addをクリック 3. Doneをクリックします。

Supplemental Libraryの作成

ライブラリ作製条件の設定

Option. Maximize Capacityを

選択している場合。 Replicateの数を入力 必要であれば、Bait Group の 繰り返し回数を変更 （通常は１） ベイトのBoostingを 選択（61-62ページ参照）

Supplemental Libraryの作成

LibraryのSave

Supplemental Libraryのデザイン を 終了し、Submittedを選択します。 その前にDesign Checklist を チェックする必要があります。 まだ修正する可能性が ある場合はCompleteを選択 します Saveします。

Supplemental Libraryの作成

Designにあたっての注意事項

現時点では、コントロール を設定しても、ベイトの 設計には影響を与えません。 将来のUpdateのために コントロールとして区別したい Bait Groupについて コントロールの設定をします。 現時点では、ベイト長は 120merで固定であり タイリングは設定に合わせて 自動的に行われます。 適切なベイトグループで、ライブラリの 空き領域が埋められているかを 確認してください。 使用を予定しているシーケンスの機種 とプロトコルが設定されていることを 確認してください。

Supplemental Libraryの作成

Supplemental Library をSubmitして Saveすると表記の メッセージが画面に 現れます。

Supplemental Libraryの作成

確認

これはSupplemental Libraryの ELIDとなります。この時点では まだBase Libraryと統合された キットになっていませんので 注意ください。

Base Libraryと追加するLibraryの統合

1ELIDまでのLibraryとBase Libraryを統合したLibrary （カタログプラスカスタムキット）を作製します。 Combine Librariesを クリックします。

※カタログキットに追加する

ライブラリは、1ELIDまでの

サイズであれば、Supplemental

Libraryではない既存のライブラリでも

追加できるようになりました。

Base Libraryと追加したい Libraryの統合

統合

Library Nameの入力とBase Library Nameの指定

1. カタログプラスカスタムキット

のLibrary名を付けます。 2. Base Library を選択します。

Base LibraryとSupplemental Libraryの統合

追加する

Libraryの指定

追加したいライブラリを サーチし、追加するものを 選択してNextを クリック

Base Libraryと追加したいLibraryの統合

ELIDの確認

Base Libraryと追加したい Libraryの それぞれのELIDが表示されますので

間違いがないことを確認して Nextをクリックします。

Base Libraryと追加するLibraryの統合

統合

LibraryのSave

Baseと追加する Libraryを統合 したカタログプラスカスタムキットの デザインを終了し、見積もりが必要な 時には、Submittedを選択します。そ の前にDesign Checklist を チェックする必要があります。 まだ修正する可能性が ある場合はCompleteを選択 します

Base LibraryとSupplemental Libraryの統合

Combined Library をSubmitして Saveすると表記の メッセージが画面に 現れます。