バイオ解析チーム教育セミナーMS09

ベンチトップ型四重極Orbitrap

“Q-Exactive”によるProteome解析

サーモフィッシャーサイエンティフィック㈱

アプリケーション部

アプリケ

ション部

肥後

大輔

Thermo Scientific: Mass Spectrometers

TSQ Vantage

Q-Exactive

Exactive

＋

2

LTQ

LTQ FT Ultra

LTQ Orbitrap

ベンチップ型四重極Orbitrap “Q-Exactive”

•

MS scan：m/z50-4,000

•

Q1 isolation：～m/z2500

•

Isolation width：>0 4amu

74cm

•

Isolation width：>0.4amu

•

MS/MS：m/z50-4,000

•

質量精度：

1ppm(内部標準)

5ppm(外部標準)

•

分解能：

17,500@12Hz

140,000@1Hz

•

Pos/Neg切り替え測定(<1s)

94cm

3

g切り替え測定(

)

•

Data dependent MS/MS測定

•

SIM測定

91cm

ベンチップ型四重極Orbitrap “Q-Exactive”

•

HCD collision cell

• Predict AGC

• Prefilling + HCD-MS/MS

• 高感度/高速なMS/MS測定

•

Quadrupole mass filter (Q1)

• 円柱面ではなく双曲面の四重極

• 高分解能モードでも透過効率を維持

• SIMモードによる定量

高感度/高速なMS/MS測定

SIMモ ドによる定量

•

S-lens

高イオ

透過効率

4

• 高イオン透過効率

•

Orbitrap detector

• 新しいFTプログラム: Enhanced FT

• 従来よりも1.8倍の高分解能 ( or 高速化)

ベンチップ型四重極Orbitrap “Q-Exactive”

•

S-lens

高イオ

透過効率

5

• 高イオン透過効率

従来のイオンガイド

S-Lens: Stacked Lens

•

従来のトランスファーチューブを短

く切断して、代わりにS-Lensを搭載

•

イオン透過効率が向上

S-Lens

8 5 9 0 9 5 10 0 N L : 8 .8 0 E 3 m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 + 2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S A lp D u a lID 7 _ 5 m m t p 6 _ 2 m m C L 8 0 t h _ 0 6 N L : 8 .8 0 E 3 8 5 9 0 9 5 10 0 N L: 1.0 7E 3 m / z = 2 73 .50 - 2 74 .50 + 2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S A lp S t d LT Q 10 0 f g _ 0 1 N L: 1.0 7E 3 m / z = 2 73 .50 - 2 74 .50 + 2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 2

Standard LTQ

Intensity: 1.1E3

Intensity: 8.8E3

+S-Lens:

x5

x5

S-Lens: Stacked Lens

3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0 R el a tiv e Abu nda nc e m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 + 2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S a lp d u a lid 7 _ 5 m m t p 6 _ 2 m m c l8 0 t h _ 0 7 N L : 8 .8 0 E 3 m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 + 2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S a lp d u a lid 7 _ 5 m m t p 6 _ 2 m m c l8 0 t h _ 0 8 N L : 8 .8 0 E 3 m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 + 2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S a lp d u a lid 7 _ 5 m m t p 6 _ 2 m m c l8 0 t h _ 0 9 N L : 8 .8 0 E 3 m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 + 2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S a lp d u a lid 7 _ 5 m m t p 6 _ 2 m m c l8 0 t h _ 1 0 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0 N L: 1.0 7E 3 m / z = 2 73 .50 - 2 74 .50 + 2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 3 N L: 1.0 7E 3 m / z = 2 73 .50 - 2 74 .50 + 2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 4 N L: 1.0 7E 3 m / z = 2 73 .50 - 2 74 .50 + 2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 5 N L: 1.0 7E 3 m / z = 2 73 .50 - 2 74 .50 + 2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 6 N L: 1.0 7E 3 m / z = 2 73 .50 - 2 74 .50 + 2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S A lp S t d LT Q 10 0 f g _ 0 7 N L: 1.0 7E 3 m / z = 2 73 .50 - 2 74 .50 + 2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 8

7

0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1.0 T im e (m in ) 0 5 10 15 2 0 2 5 0 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1.0 1.2 T im e (m in ) 0 5 10 15 2 0 2 5

5 injections of Alprazolam

x7~10の感度（イオン透過効率）向上

ベンチップ型四重極Orbitrap “Q-Exactive”

•

Quadrupole mass filter (Q1)

• 円柱面ではなく双曲面の四重極

• 高分解能モードでも透過効率を維持

• SIMモードによる定量

SIMモ ドによる定量

Hyperbplic Rods (Q1)

双曲面を持つHyperbolic Rods

™

分解能を上げても高い透過効率を維持

円柱面を持つRound rod

••

ユニット分解能

ユニット分解能

Quantum

_••

_{ユニット分解能}

_{ユニット分解能}

9

•

プリカーサーイオンのアイソレーション：～

m/z2,500まで対応

•

SIMモードの測定：感度（S/N）とダイナミックレンジの向上

•

HR/AMによるターゲット定量

nc

e

₄₀

60

80

100

195.0876

_N=248,402

NL: 1.94E8

[150.00-2000.00]

Full MS@m/z150 to 2,000

S/N = 745

Selected ion monitoring: Q1 mass filter

0

20

40

60

80

100

R

e

la

tiv

e

Abunda

0

20

195.0877

N=20,741

NL: 1.12E8

[190.10-200.10]

SIM@m/z190 to 200

S/N = 5,400

3000

4000

5000

6000

e

ctrum)

m/z195

Caffeine

Q1 filter: 10amu

10

0

1000

2000

3000

195.082 195.084 195.086 195.088 195.09 195.092 195.094

S/N (s

p

e

S/N (FMS)

S/N (SIM10)

Sensitivity gain 5 – 10 x

ベンチップ型四重極Orbitrap “Q-Exactive”

•

HCD collision cell

• Predict AGC

• Prefilling + HCD-MS/MS

• 高感度/高速なMS/MS測定

高感度/高速なMS/MS測定

11

BSA 20fmol: m/z474.23 (0.79ppm), z=3, MS/MS

BSA 20fmol: m/z978.48 (1.99ppm), z=2, MS/MS

13

MASCOT search result: MS tol.=10ppm, MS/MS tol.=0.02Da

BSA 20fmol: m/z1014.40 (0.46ppm), z=3, MS/MS

ベンチップ型四重極Orbitrap “Q-Exactive”

15

•

Orbitrap detector

• 新しいFTプログラム: Enhanced FT

• 従来よりも1.8倍の高分解能 ( or 高速化)

““...Static charges can not be stable in

...Static charges can not be stable in

electrostatic fields...”

electrostatic fields...”

静電場によるイオンのトラップ

Linear traps

Segmented-ring traps

Orbital traps

16

Orbitrapでのイオンの軌道

•

Characteristic frequencies:

•

Frequency of rotation ω

_φ

•

Frequency of radial oscillations ω

r

•

Frequency of axial oscillations ω

z

r

2

2

⎟

⎞

⎜

⎛ R

m

ω

ω

1

2

2

−

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

=

R

R

_m

z

ω

ω

ϕ

z

17

2

−

⎟

⎠

⎜

⎝

=

R

m

z

r

ω

ω

q

m

k

z

/

=

ω

{

/

2

ln(

/

)

}

2

)

,

(

2

2

2

m

m

r

R

R

r

z

k

z

r

U

=

⋅

−

+

⋅

φ

Lord of the ion rings: “リング”の形成

Electrodynamic

Squeezing

“Fast” Injection

A.A. Makarov, Anal. Chem., v.72

(2000), No.6, p.1156-1162.

A.A. Makarov, US Pat. 5,886,346,

1999.

k

Lord of the ion rings: “リング”の維持

z

m

k

/

=

ω

19

1. 周波数の決定はフーリエ変換を利用→質量の情報へ

2. 高感度かつ高分解能を得るためには、イオンを持続的に運動する必要がある

→さらなる高真空度を要求

精密質量を妨害する要因

質量の誤差

1)装置の温度変化に対する

観測質量のシフト

mass shift (m/z 524) vs. TIC

2.00

4.00

6.00

8.00

ppm

)

質量の誤差

測定時間

20

-8.00

-6.00

-4.00

-2.00

0.00

2.00

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

TIC

de

v

ia

ti

on (

イオン強度の増加

2)検出器の飽和による

観測質量のシフト

観測質量の精度はシグナル強度に依存

mass shift (m/z 524) vs. TIC

2.00

4.00

6.00

8.00

(ppm

)

質量誤差

（ｐｐｍ）

Intensity

-8.00

-6.00

-4.00

-2.00

0.00

2.00

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

TIC

de

v

ia

ti

on

(

強いシグナル

21

R.T.

弱いシグナル

精密質量を妨害する要因の解決１ ～イオン量制御～

・Auto Gain Control (AGC)

MSスペクトルの観測を行う前に、プレスキャン(~1msec)を行い、

予め溶出ピークのイオン量を確認し、観測を行う際には適切なイオン量を導入

ソフトウェアによる自動制御で、実際の操作では全く気が付きません。。。

0 10 20 30 40 50 60 0 100 200 300 400 500 600 Scan Number Injection Time (ms)

Injection Time

イオン溜め込み時間

イオン強度

22

0.0E+00 1.0E+08 2.0E+08 3.0E+08 4.0E+08 5.0E+08 6.0E+08 7.0E+08 8.0E+08 0 100 200 300 400 500 600 Scan Number Scaled TIC

(counts)

Scaled TIC

mass shift of m/z 524

2 00

4.00

6.00

8.00

pm

)

AGC OFF

精密質量を妨害する要因の解決１ ～イオン量制御～

-8.00

-6.00

-4.00

-2.00

0.00

2.00

0

20

40

60

80

100

120

140

scan number

de

v

ia

ti

on (

p

mass shift (m/z 524) vs. TIC

4 00

6.00

8.00

m

)

23

-8.00

-6.00

-4.00

-2.00

0.00

2.00

4.00

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

TIC

de

v

ia

ti

on (

p

p

m

イオン量を制御していないと、

その強度の増減に影響して観

測質量の誤差が生じてしまい

ます。

AGC ON

mass shift of m/z 524

4.00

6.00

8.00

p

m)

精密質量を妨害する要因の解決１ ～イオン量制御～

-8.00

-6.00

-4.00

-2.00

0.00

2.00

0

20

40

60

80

100

120

140

scan number

de

v

ia

ti

on (

p

p

mass shift (m/z 524) vs. TIC

4 00

6.00

8.00

m

)

制御されたイオン量範囲

24

-8.00

-6.00

-4.00

-2.00

0.00

2.00

4.00

0

2000

4000

6000

8000

TIC

de

v

ia

ti

on (

p

p

m

適切なイオン量によって

質量分析精度が向上

設定分解能と測定時間の比較

12

14

Orbitrap

+ Enhanced FT

Acquisition speed

Hz

2

4

6

8

10

Orbitrap

25

0

2

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

Resolusion

HCD-MS/MS: Prefilling in C-trap

RP70k

256ms

17.5k

64ms

MS2

MS2 MS2

MS2 MS2

MS2

MS2

MS2 MS2

MS2

Full MS

MS2

₁

MS2

2

MS2

3

MS2

4

MS2

5

MS2

6

MS2

7

MS2

8

MS2

9

MS2

10

イオン貯め込み

時間（Sec）

26

1 Full MS scan + Top10-MS/MS測定のサイクルタイム (Sec)

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1 Full MS scan + Top10-MS/MS = 1 sec

E.Coli tryptic digested 1 ug：nanoLC-MS(30k)-ddTop10(17.5k)

27

サンプルおよび測定/解析Method

Proteome Discoverer 1.3, MASCOT ver2.3

Count only rank1 peptide, FDR<1%

E.Coli / Yeastのタンパク質

・還元アルキル化（CAM）

・Trypsin消化

nanoLC：Easy nLC ( Thermo scientific)

nanoLC：Easy nLC ( Thermo scientific)

・Trap column：0.1x10mm, ODS

(Easy column, Thermo scientific)

・Analytical column：0.075x100mm, ODS

(日京テクノス)

・移動相A：水+0.1%ギ酸

・移動相B：アセトニトリル+0.1%ギ酸

・グラジェント：0-35%B(120min)

・Flow rate：300nL/min

28

MS：Q-Exactive (Thermo scientific)

・Full MS scan：m/z300-1500 (RP70k)

・ddTop10：HCD NCE30(RP17.5k)

・Charge state：Z=2 and 3

・Dynamic exclusion

四重極Q1によるIsolation widthの効果

E.Coli = 500 ng

Iso width=2.0

Iso width=0.7

Iso width=0.4

Input

51,746

51,644

52,012

PSM

10,851

10,838

10,043

Peptide

6,123

6,219

5,894

4000

5000

6000

7000

6,123

6,219

_5,894

p

,

,

,

Protein

1,178

1,216

1,197

Average score

43.08

47.64

47.49

Peptide ID

Protein ID

29

0

1000

2000

3000

000

1

2

3

1,178

1,216

1,197

Isolation

Width = 2.0

Isolation

Width = 0.7

Isolation

Width = 0.4

同定ペプチドの質量誤差：Isolation width = 0.7

15

<15ppm :10,838 ( 100% )

<5ppm : 9,598 ( 88.56% )

<3ppm : 8,658 ( 79.89% )

0

5

10

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Error

( ppm )

30

-15

-10

-5

Number

of peptide

Isolation widthによる同定タンパク質のオーバーラップ

Mascot (B2)

53

78

Isolation

Isolation

Width = 0.7

1,216 protein

Mascot (A2)

76

83

1002

Isolation

Width = 0.4

1,197 protein

1002/1385

= 72.3%

31

Mascot (C2)

52

41

Isolation

Width = 2.0

1,178 protein

E.Coliタンパク質の同定結果

E.Coli

20 ng

50 ng

100 ng

500 ng

Input

42,056

45,724

46,437

54,276

PSM

5,045

6,515

6,902

11,013

Peptide

p

3,320

4,172

4,345

5,815

Protein

787

897

933

1,162

Average score

43.44

44.01

44.57

47.26

4,000

5,000

6,000

Peptide ID

Protein ID

3,320

4,172

4,345

5,815

32

0

1,000

2,000

3,000

1

2

3

4

20 ng

50 ng

100 ng

500 ng

787

897

933

1,162

同定タンパク質の再現性

50ng 1

st

_run

897 protein

50ng 2

nd

_run

885 protein

p

p

807/976

= 82.7%

33

500ng 1

st

_run

1,162 protein

500ng 2

nd

_run

1,176 protein

1069/1272

= 84.0%

微量プロテオーム解析

Yeast protein with reported cellular copy number*

600

ins

100

200

300

400

500

10 ng 100 ng 1000 ng

umber

of Indentified Prote

34

*Yeast cellular protein copy numbers are from Weissman and co-workers, Nature, 2003, 16, 737-41.

0

Cellular Copy Number in Log-phase Growth Cells

N

Extracted from: C:\Xcalibur\data\Zhiqi\ID_QE\20110321_10ngYeastDigest_Top10_140min_01.raw #23048 RT: 77.42 FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z=645.83948 Da, MH+=1290.67168 Da, Match Tol.=20 mmu

L G N D D E V I L F R

L G N D D E V I L F R

MASCOT IonScore: 90

微量プロテオーム解析

High confidence identification from 10 ng of Yeast Digest

b₅⁺-NH₃

y₆⁺-H₂O

1120 55273

y₉⁺

y₂⁺

322.18576

y₈⁺

1006.51752

y₆⁺

776.46594

y₁₀⁺

1177.57886

y₁⁺

175.11826

y₇⁺

891.48932

y₅⁺

647.42157

y₃⁺

435.26990

y₄⁺

548.35284

10 20 30 40 50 In tens ity [c ount s ] ( 10^ 3)

L G N D D E V I L F R

L G N D D E V I L F R

MASCOT IonScore: 90

Exp Value: 3.8 E-9

35

Peptide of YOR020C,

149

copy number, identified from

10 ng

yeast digest

b₅ -NH₃

498.17874

y₆ H₂O

758.45410

1120.55273

200 400 600 800 1000 1200 m/z 0 10

Method of Q Exactive

FULL MS / DD-MS² (TOPN)

General

Polarity positive

Full MS

Microscans

1

Resolution

70,000

AGC target

1e6

Maximum IT

60 ms

0.075x120mm ODS column (Nikkyo tech)

測定条件

Number of scan ranges

1

Scan range

300 to 1500 m/z

dd-MS² / dd-SIM

Microscans

1

Resolution

17,500

AGC target

5e5

Maximum IT

80 ms

Loop count

10

MSX count

1

TopN

10

Isolation window

2.0 m/z

Fixed first mass 140.0 m/z

NCE

30.0

Stepped NCE

―

dd Settings

36

Underfill ratio

0.1 %

Intensity threshold

6.3e3

Apex trigger

―

Charge exclusion

unassigned, 1, 4 - 8, >8

Peptide match

―

Exclude isotopes

on

Dynamic exclusion

30.0 s

LOCK MASSES

445.12003 Positive

391.28429 Positive

Sample

•

サンプルは0.1ug/uLと0.01ug/uLとなるように0.1%FAにて溶

解・希釈しました。

•

サンプルは設定濃度となるように注入量を変えて測定を行っ

ております。

RT:0.00 - 128.04 60 70 80 90 100 d anc e 54.40 576.29 78.92 472.77_477.3184.39 54.69 576.29 52.80 488.73 62.27 425.77 75.94 495.2987.47 590.81 67.97 416 25 111.77 NL: 1.37E9 Base Peak F: ms MS THP1_500n g_iso07_10

500 ng

1

st

_{Isolation width 0.7}

サンプル測定結果（BPC）Isolation widthの比較

60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 R e la tiv e A b u nd 55.99 416.25 966.59 516.80 48.74 599.77 _581.3173.00 46.97 567.78 94.62 895.95 43.99 719.28 99.96 839.47 103.87 851.46 40.44 430.76 117.58872.42120.68947.12 39.18 732.33 15.06 371.10 371.1031.85 8.34 371.10 371.1021.49 3.62 371.10 78.61 472.77 54.27 576.29 84.38 477.31 61.77 425.77 52.53 488.73 87.35 495.29 111.72966.59 75.60 NL: 1.33E9 Base Peak F: ms MS THP1_500n g_iso20_08

2

nd

_{Isolation width 2.0}

37

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 48.55 590.81 599.77 54.96 715.41 66.01 663.38_416.2567.73 60.13 394.74 46.71 567.78 94.58 895.95 96.55 601.31 43.77 719.28 90.93 782.06 103.92_851.46 112.56 872.91120.68947.12 42.61 510.51 38.94 732.33 17.44 371.10 371.1026.03 13.51 371.10 7.35 371.10 RT:0.00 - 126.17 20 40 60 80 100 55.66 576.29 _80.48 472.77 86.10 477.31 58.00 516.80 425.7764.85442.5967.81 590.8277.27 495.2988.95 112.73966.59 54.24 488.73 49.54 599.76 394.7463.09 22.08 371.10 17.14 371.10 1.18 371.10 371.1011.87 371.1032.39 445.1239.46 895.9595.17 101.01839.47 109.45445.12 119.43445.12 NL: 1.09E8 Base Peak F: ms MS THP1_20ng_ iso2_14

20 ng

Isolation width 2.0

サンプル測定結果（BPC）サンプル濃度の比較

20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 R e la tive A bu n d an ce 0 _55.49 576.29 85.99 477.31 80.53 472.77 57.61 516.80 425.7764.71 590.8277.28 495.2988.86 112.70 966.59 53.96 488.73 73.49 513.31 49.26 599.77 45.57 408.73 394.7462.81 97.61 601.31 95.37 895.95 100.86839.47104.49851.46 8.42 371.10 121.12 947.12 0.43 371.10 371.1018.82 371.1027.55371.1030.74445.1235.16 118.03872.41 79.64 472.77 55.16 576.29 85.16 477.31 63.44 425.77 88.01 495.29 76.44 590.81 53.66 488.73 516.8057.05 442.5966.86 112.13966.59 49.32 599.77 94.92 895.95 601.3196.99 46.14 408.73 104.15851.46 117.56_{872 41}120.77_{947 12} 41.42 514 81 34.47 26.48 18.41 13.54 9.72 NL: 2.98E8 Base Peak F: ms MS THP1_50ng_ iso2_16 NL: 9.08E8 Base Peak F: ms MS THP1_200ng _iso2_18

50 ng

200 ng

38

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Time (min) 0 20 40 60 80 100 0 851.46 _{872.41 947.12} 514.81 373.23 371.10 371.10 445.12 445.12 78.61 472.77 54.27 576.29 84.38 477.31 61.77 425.77 52.53 488.73 75.60 495.2987.35 111.72966.59 590.81 48.55 599.77 715.4154.96 _663.3866.01 94.58 895.95 96.55 601.31 43.77 719.28 103.92 851.46 112.56_872.91120.68_947.12 40.72 522.55 17.44 371.10 371.1026.03 13.51 371.10 7.35 371.10 445.1231.52 NL: 1.33E9 Base Peak F: ms MS THP1_500ng _iso20_08

500 ng

Percolatorを使用したMASCOT検索

39

各サンプル濃度における同定結果の比較

THP-1

500ng

200ng

50ng

20ng

# of MS/MS

42,169

41,347

38,296

33,724

PSM

10,891

10,054

7,071

3,901

peptide hit

8,691

7,972

5,681

3,193

protein hit

2,091

1,875

1,454

912

4000

5000

6000

7000

8000

9000

8,691

7,972

5,681

3,193

# of protein

# of peptide

40

0

1000

2000

3000

4000

1

2

3

4

500ng

200ng

50ng

20ng

2,091

_1,875

1,454

912

3,193

Isolation widthにおける同定結果の比較

THP-1, 500ng

Isolation 2.0

Isolation 0.7

Isolation 0.4

# of MS/MS

42,169

42,269

41,718

PSM

10,891

10,435

8,062

peptide hit

8,691

8,201

6,522

protein hit

2,091

2,048

1,849

5000

6000

7000

8000

9000

8,691

8,201

6,522

# of protein

# of peptide

41

0

1000

2000

3000

4000

1

2

3

Isolation

width = 2.0

2,091

2,048

_1,849

Isolation

width = 0.7

Isolation

width = 0.4

Qual / Quan proteome解析

Target peptide quan

タンパク質同定＆発現量変動解析

比較定量の手法

Label Free

SIEVE

ラベル試薬

43

TMT, SILAC, iTRAQ

N-term

and K

126-131

103-97

TMT reagent (229Da)

Pierce Biotechnology is Part of Thermo Scientific

TMT (Tandem Mass Tag)

Reporter

Balance

* * * * *

*

*

*

*

*

*

*

* *

* * *

*

*

126 Da

129 Da

•

ペプチドレベルでラベル化

•

N-末端 / Kのアミノ基に結合

44

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

127 Da

130 Da

131 Da

128 Da

•

多群間での比較定量が一度の分析結

果から解析可能

•

同定はMS/MSから、定量もMS/MSス

ペクトルから解析

Cleavable Linker

TMT試薬を用いたタンパク質発現変動解析

Mass Reporter

Mass Normalizer

Reactive Group

126-131

103-97

タンパク質可溶化

酵素消化

TMT126 (229Da)

45

TMT reagent (229Da)

126

103

127

102

TMT127 (229Da)

TMT試薬の

ラベル化

Cleavable Linker

TMT

2

_{： ２サンプルの比較}

126, 127

(Normalizer : 99 - 100)

TMT試薬を用いたタンパク質発現変動解析

Mass Reporter

Mass Normalizer

Reactive Group

80 90 100 0 130.1409 129.1374

MS/MS spectra

129

130

TMT126 (229Da)

(Normalizer : 99 - 104)

TMT

6

_{： ６サンプルの比較}

126, 127, 128, 129, 130, 131

46

126 127 128 129 130 131 132 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 128.1341 131.1382 127.1309 126.1281

126

127

128

131

126

103

127

102

TMT127 (229Da)

130.1409

+ 1.9 ppm

129.1374

- 3.0 ppm

128.1341

+ 2.6 ppm

131.1382

+ 1.2 ppm

127.1309

+ 1 5 ppm

exp. ratio 1 : 2 : 4 : 6 : 8 : 3

obs. ratio 1 : 2 : 4 : 7 : 8 : 3

126-131

TMT試薬を用いたタンパク質発現変動解析

b

4

b

2

b

1

100

ndance

130.1409

1156.6582

393.2339

230.1703

798.4240

506.3185

m/z

126

127

128

129

130

131

132

+ 1.5 ppm

126.1281

+ 2.9 ppm

Reporter

47

y

1

y

2

y

3

b

6

b

5

b

3

a

5

a

4

a

3

a

2

a

1

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

m/z

0

50

Re

la

tiv

e

A

b

u

175.1188

669.3823

365.2380

770.4313

359.2400

478.3249

_1139.6388

911.5057

641.3881

246.1567

_982.5510

883.5048

126~131

103~97

Discovery Quan (TMT) – accuracy and precision

1.4

n ratio

Peptide level quan error <5%

CV<13%

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

observed

expected

TMT

reporter io

n

48

0

127/126

128/126

129/126

130/126

131/126

Discovery Quan (TMT) - >97% of identified peptides were quantified

at 1% FDR

9000

10000

m

ber of peptides

a

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

unique peptide

total IDed MSMS spectra

quantifiable MSMS spectra

49

Nu

m

Amount of E. Coli digest

0

1000

2000

20ng

40ng

80ng

200ng

500ng

Accurate mass / High resolution MSでのSIM定量

•

Quadrupole mass filter (Q1)

•

Multi plex SIM

・同時に最大１０チャンネルをQ1で選択

50

•

Orbitrap detector

• 新しいFTプログラム: Enhanced FT

• 従来よりも1.8倍の高分解能 ( or 高速化)

nc

e

₄₀

60

80

100

195.0876

_N=248,402

NL: 1.94E8

[150.00-2000.00]

Full MS@m/z150 to 2,000

S/N = 745

Selected ion monitoring: Q1 mass filter

0

20

40

60

80

100

R

e

la

tiv

e

Abunda

0

20

195.0877

N=20,741

NL: 1.12E8

[190.10-200.10]

SIM@m/z190 to 200

S/N = 5,400

3000

4000

5000

6000

e

ctrum)

m/z195

Caffeine

Q1 filter: 10amu

51

0

1000

2000

3000

195.082 195.084 195.086 195.088 195.09 195.092 195.094

S/

N

(sp

e

S/N (FMS)

S/N (SIM10)

Sensitivity gain 5 – 10 x

with SIM mode

SIMによるペプチドターゲット定量

Qフィルターと高分解能MSによるSIMで高感度/高精度な定量

Exactive vs. TSQ Ultra - Calibration Curves

Antifungal drug curves : LC-ESI-TSQ Ultra - MS

Antifungal drug curves : LC-ESI Exactive - MS

hydroxy-Itraconazole

Itraconazole

Posaconazole

0 2 4 6 8 10

mg/L

Ar

ea Ratio

0 2 4 6 8 10

mg/L

Ar

ea Ratio

0 2 4 6 8 10

mg/L

Ar

ea Ratio

Voriconazole

Voriconazole-NO

Caspofungin

53

0 2 4 6 8 10

mg/L

Ar

ea Ratio

0 1 2 3 4 5

mg/L

Ar

ea Ratio

0 5 10 15 20 25 30

mg/L

Ar

ea Ratio

SIMによるペプチドターゲット定量 ( Low matrix )

4.E+09

•

Low amole detection

•

4 orders of linearity

•

CV<10% at 50amole

k Ar

ea)

_{S/N: >40}

10 ng Yeastに添加したペプチド標品の検量線

2.E+09

3.E+09

Peak Area

SSAAPPPPPR*

GISNEGQNASIK*

Log

10

(P

e

a

k

Log

10

(Sample Amount)

10amole

1fmole

100fmole

54

0.E+00

1.E+09

0

50

100

Sample Amount (fmole)

DIPVPKPK*

SIMによるペプチドターゲット定量 ( High matrix )

6E+08

rea)

S/N: 2.5-6

•

100amol- 1fmol detection for most targets

•

3 to 4 orders of linearity

1,000 ng Yeastに添加したペプチド標品の検量線

2E+08

3E+08

4E+08

5E+08

Peak Area

NGFILDGFPR*

GLILVGGYGTR*

Log

10

(Peak A

r

Log

10

(Sample Amount)

10amole

1fmole

100fmole

55

0E+00

1E+08

0

50

100

R

2

_{: 0.9997-1.0000}

Sample Amount (fmole)

まとめ

•

ベンチトップ型オービトラップ “Q-Exactive” によるタンパク質の

大規模解析の評価を行いました

•

新しいFTプログラム「Enhanced FT」によって高速な測定が可能な

り

1MS＋10MS/MSを1秒で観測することが可能でした

り、1MS＋10MS/MSを1秒で観測することが可能でした

•

Orbitrapの水冷式から、Q-Exactiveでは空冷式に変更したものの、質

量精度は安定している結果が得られ、<5ppmでの同定が可能でした。

•

繰り返し測定から同定されるタンパク質の再現性は80%以上である結

果を得ました。

•

より発現量の少ないタンパク質の同定が可能な高感度分析が可能でし

た。

56

•

SILACやiTRAQ、TMTなどのラベル化試薬を利用することにより大規

模な同定結果と同時に比較定量結果を得ることが可能でした。

•

SIMでのターゲット定量では4桁のダイナミックレンジで良好な直線性

が得られることが判りました。また、複雑なマトリクス条件下におい

てもamolオーダーでの定量が可能でした。