Short Communication
J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn. 52（2）: 99 ─ 104Detection of Carbonylated Proteins Induced by
Long-Wavelength UV and Blue Light Irradiation
Using Keratin Film
＊Toshihiro Fujii, Yumiko Ito
＊＊
Faculty of Textile Science and Technology, Shinshu University
Light irradiation causes the generation of reactive oxygen and induces protein modifications
such as carbonylation. This protein modification is employed as a marker of oxidation stress.
Hu-man hair keratin film has been known to be an effective device to measure the formation of
car-bonylated proteins caused by UV irradiation in daily life. When the keratin film was exposed by
long-wavelength UVA（L-UVA）high energy visible light（HEV）
（380─530 nm）irradiation, the
formation of carbonylated proteins could be confirmed and the relative amount was about 40％
compared with that by a solar simulator（300─2500 nm）. This value was higher than expected and
could not be ignored. Addition of UV absorbers such as benzophenone-3 and
methoxydibenzoyl-methane revealed the inhibitory effects on the carbonyl formation by the solar simulator.
How-ever, the inhibitory effect was low or disappeared in the case that the keratin film was exposed to
L-UVA─HEV irradiation. Among the visible lights, monochromatic blue light／HEV（400─
500 nm）irradiation significantly caused the formation of carbonylated proteins compared with
those by green light（500─550 nm）and red light（600─700 nm）irradiations. Thus, the keratin film
will be a highly sensitive and convenient biomaterial to detect carbonyl formation by blue
light／HEV as well as UV irradiation.
Key words : human hair, keratin film, carbonyl formation, detection device, high sensitivity
analysis, UVA, blue light, HEV, benzophenone-3, methoxydibenzoylmethane
＊ Received, September 19, 2017; Accepted, December 7, 2017
＊＊ 3─15─1, Tokida, Ueda 386─8567, Japan
doi.org/10.5107/sccj.52.99
ケラチンフィルムを利用した長波長紫外線と
ブルーライトが引き起こす
カルボニルタンパク質の検出
＊藤 井 敏 弘，伊 藤 弓 子
＊＊信州大学 繊維学部
光照射は活性酸素の生成を引き起こし，カルボニル化などのタンパク質修飾を誘発する。このカル ボニル化タンパク質の形成は酸化ストレスのマーカーとして用いられてきている。ケラチンフィルム は日常生活レベルにおける UV 照射に起因するカルボニル化タンパク質を検出するための有効な生 体材料であることが知られている。従来までは困難であった長波長 UVA∼高エネルギー可視光線 （HEV）（380∼530 nm）においてのカルボニル化タンパク質形成がこのフィルムの使用により確認で き，ソーラーシミュレータ（300∼2500 nm）照射と比べて約 40％もの生成量が認められた。代表的 な UV 吸収剤であるベンゾフェノン─3 およびメトキシジベンゾイルメタンは，UVA∼HEV による カルボニル形成への阻害効果は低かった。可視光線の中で，ブルーライト／HEV（400∼500 nm）が 緑色光（500∼550 nm）と赤色光（600∼700 nm）照射と比べ，より高いカルボニル形成も引き起こ すことが示された。 ＊ 2017.9.19 受付，2017.12.7 採用 ＊＊ 〒386─8567 上田市常田 3─15─11. 緒 言
健康意識の高い昨今においては，光老化に通じるサン バーンやサンタンなどを防ぐための日焼け止めは夏場だけ でなくオールシーズンのアイテムとなってきている。その 効果は紫外線（UV）の中で UVB（280∼320 nm）だけで なく UVA（320∼400 nm）も対象とされてきている。しか し，短波長側の UVA（S-UVA；320∼370 nm）が主な対象 と な っ て い る が， 長 波 長 側 の UVA（L-UVA；370∼400 nm）を遮断できる薬剤は少ない。可視光線の短波長領域 （400∼500 nm）が注目されている。このエネルギーは紫外 線と比べて低いものの皮膚の深部まで透過する性質をもつ ため，ブルーライト／高エネルギー可視光線（HEV：high energy visible light）とも呼ばれている。ブルーライト／HEV の細胞に与える基礎研究として， 青，緑，黄，赤色の LED ライトを用いて線維芽細胞に照 射した結果，コントロールの暗所での培養と比べ，ブルー ライト照射下では細胞数や増殖率が低下することが知られ ている1）。この影響は緑色光でわずかであり，黄色と赤色 光ではほとんど見られないことから，ブルーライトが細胞 の生存に悪影響を与えていることが示されている。作用機 序として，細胞内活性酸素の生成を誘発することが一因で あると考えられている。 紫外線に代表される太陽光照射により発生する活性酸素 は，生体において非特異的にタンパク質・酵素，脂質など を酸化して，その変性・失活を引き起こす。タンパク質の 酸化修飾としてカルボニル化はよく知られており，酸化ス トレスマーカーとして用いられている。このマーカーはカ ルボニル化タンパク質に特異的に結合する蛍光試薬と蛍光 顕微鏡などを用いて高感度に観察され，皮膚への光照射に よるカルボニル化の誘発が確認されている2）∼4）。カルボニ ル化は肌の変色や色素沈着を引き起こす一因となることが 報告されている3）。テープストリッピングにより採取した ヒト皮膚における主なカルボニル化タンパク質としてケラ チンが同定されており，UVA 照射を受けるとこのカルボ ニル化は増大する5）。太陽光照射システムを用いて毛髪を 照射すると，カルボニル化タンパク質が生成されることが 知られている6）, 7）。われわれは毛髪タンパク質を自己集合 させて作製したケラチンフィルムを使用すると，毛髪試料 よりも 5∼10 倍も高感度でカルボニル形成を検出すること を報告している8）。これらの結果は，ケラチンフィルムを 使用すればカルボニル形成が高感度に検出できることを示 している。
ケラチンフィルムを利用した長波長紫外線とブルーライトが引き起こすカルボニルタンパク質の検出 本研究では，太陽光照射システムと LED を使用して， 各種の光照射が引き起こすカルボニルタンパク質の形成に ついてケラチンフィルムを用いて検討した。その結果， L-UVA とブルーライト／HEV 照射によってもカルボニル 化が生じることが確認できた。また，UV 吸収剤であるベ ンゾフェノン─3（BP-3）と t ─ブチルメトキシジベンゾイ ルメタン（BMDM）の影響についても報告する。
2. 実 験
2.1. フィルムの作製 毛髪は化学的な処理を施していないボランティアから提 供された複数の頭髪を使用した。毛髪タンパク質溶液は， 250 mmol／L DTT を 含 む 信 大 法 溶 液（5 mol／L 尿 素，2.6 mol／L チオ尿素，25 mmol／L Tris-HCl，pH 9.0）にて 50℃， 24 時間抽出した。ろ過と遠心により不溶性残渣を取り除 き，タンパク質溶液（20∼30 mg／mL）を得た。回収した タンパク質溶液に酢酸を混合後，蒸留水を満たした培養 シャーレ（φ35 mm）にキャスティングし，不透明型ケラ チンフィルムを形成させた。フィルムは 24 時間以上洗浄 し，自然乾燥後に使用した9）∼11）。 2.2. 照射試験と UV 吸収剤 ケラチンフィルム（15∼20 mg／シャーレ）は半分をアル ミホイルで遮 し，太陽光照射システム（SXL-500 V2， セリック株式会社；300∼2500 nm）を用い，紫外線強度は 約 1.8 mW／cm2（365 nm）となるように位置を調整して照 射実験を行った。光学フィルターとして，DF-76-B（ダイ クロイックフィルター，セラテックジャパン株式会社）を 使用した。LED の光源は 3 波長調光 LED 光源システム（株 式会社シバサキ）を用い，このときの光強度は紫外線・日 射量・照度計（TM-208 UV LIGHT METER，ケニス株式会 社）で測定し，放射照度として示した。 UVB の 吸 収 剤 で あ る BP-3 と UVA の 吸 収 剤 で あ る BMDM はエタノールに溶解し，ヘリオプレート（Helio-screen 社）に 11 mL／cm2の条件で均一に塗布した。乾燥さ せた後にケラチンフィルム上にのせ，その上から光学フィ ルターの有無の条件で光照射を行った。吸収剤の吸収スペ クトルは紫外可視分光光度計（UV-2700，島津製作所）を 用いて測定した。 2.3. カルボニル化タンパク質の検出 カルボニル化タンパク質はカルボニル基に特異的に結合 するヒドラジノ基をもつ蛍光試薬フルオレセイン 5─チオ セミカルバジト（5-FTSC）を用いて検出した。光照射を したケラチンフィルムに，20 mmol／L 5-FTSC 溶液（pH 5.5） を加えて 25℃で 15 分間インキュベートした。反応後，未 反 応 の 5-FTSC を 除 去 す る た め に，2X SCC 溶 液（0.1％SDS，300 mmol／L NaCl，30 mmol／L クエン酸ナトリウム緩 衝液，pH 7.0）を用いて 25℃で 5 分間 2 回の洗浄を行った 後，0.2X SSC 溶液（0.1％ SDS，30 mmol／L NaCl，3 mmol／L クエン酸ナトリウム緩衝液，pH 7.0）を用いて 50℃で 20 分間 2 回の洗浄を行った。さらに蒸留水にて 25℃で 1 分間 6 回の洗浄を行った。洗浄後のフィルムは室温にて自然乾 燥させた。すべての工程は遮光条件下にて実施した。蛍光 強度は蛍光光度計（Fluoroskan Ascent FL，Therm Fisher）を 用いて，485 nm の励起光と 538 nm の蛍光の組合せで測定 し，遮 部位のブランク値を引いた値で示した8）。また， 蛍光顕微鏡（VB-G25，Keyence）による観察も行った6）, 7）。
3. 結 果
3.1. 太陽光照射システムによるカルボニル化タンパク 質の形成 本研究で使用している UV カットフィルター（DF-76-B） の特性を調べたところ，370 nm 以下と 540 nm 以上の波長 の光はほとんど通過させなかった（Fig.─1a）。そこで，太 陽光照射システムとケラチンフィルムの間に入れて照射を 行い，カルボニル化タンパク質の形成を調べた。DF-76-B フィルターの有無に関わらずカルボニル形成量は照射時間 に比例して増加した（Fig.─1b）。4 時間照射で比較すると， フィルターを通過した光においても約 43％のカルボニル 化タンパク質を生成していることが明らかとなった。 3.2. カルボニル形成に与える UV 吸収剤の影響 代表的な UV 吸収剤である BP-3 と BMDM を選択し， そ の 吸 収 ス ペ ク ト ル を 調 べ た。BP-3 は UVB（280∼320 nm），BMDM は UVA（320∼400 nm）の波長領域に大きな 吸収ピークを示した（Fig.─2）。BMDM のみが L-UVA（370∼ 400 nm）においても吸収をもつが，400 nm 付近は低い値 であった。次に，単独の吸収剤（0.5％）と混合液（0.5％ ＋0.5％）がカルボニル形成に与える影響をフィルター無 し（1 時間照射）とフィルター有り（4 時間照射）の条件 で調べた（Table─1）。フィルター無しの条件では両吸収剤 はカルボニル形成を抑え，その混合液は相加的な抑制作用 を示した。一方，フィルター有りの条件では，BP-3 には 抑制作用が見られないが，BMDM においては抑制作用が 見られた。混合液と含めてその抑制作用は，フィルター無 し の 条 件 と 比 べ て 低 い 値 で あ っ た。BP-3 と BMDM は L-UVA∼ブルーライト／HEV が引き起こすカルボニル形成 には効果的な抑制はできないことが示された。 3.3. LED 照射とカルボニル化タンパク質の形成 光学フィルターを使用した実験結果（Fig.─1b）から， 紫外線だけでなく可視光線においてもカルボニル形成は生 じる可能性が示された。そこで，より波長範囲の狭いLED 光源を使いカルボニル形成能について調べた。光源 と し て は ブ ル ー（B）， グ リ ー ン（G）， レ ッ ド（R） の LED を選択した。ブルー光源は 400∼500 nm，グリーン光 源は 500∼550 nm，レッド光源は 600∼700 nm に吸収をも ち，各光源の極大波長は，445 nm，520 nm，660 nm であっ た（Fig.─3a）。3 種類の光源で 48 時間ケラチンフィルムを 照射した結果，ブルーライトを含む可視光線照射において もカルボニル形成を検出することができた（Fig.─3b）。 3.4. ブルーライトによるカルボニル化タンパク質の 形成 カルボニル形成を確認するために，太陽光照射システム で 1 時間照射したフィルムをコントロールとして，最も高 い蛍光強度を示したブルーライトで 48 時間照射したケラ チンフィルムの蛍光顕微鏡観察を行った。遮 部位のフィ ルムと比べて，5-FTSC による蛍光強度が強くなっている ことから，カルボニル形成の確認ができた（Fig.─4a）。 ブルーライトの放射照度を一定（12.7 W／m2）として照 射時間との関係を調べたところ，カルボニル形成は照射時 間に比例して増大した（Fig.─4b）。次に，ブルーライトの 照射時間を一定（72 時間）として放射照度との関係を調 べたところ，カルボニル形成は放射照度のレベルに比例し て増大した（Fig.─4c）。最も低い放射照度（2.1 W／m2）は， 約 1000 lux の照度であった。
4. 考 察
本研究において，各種の光照射によるカルボニル形成の 検出にケラチンフィルムは高い感度で適用できることが示 された。この理由としては以下のことが考えられる。 ① カ ル ボ ニ ル 化 の 対 象 と な る ア ミ ノ 酸（Lys, Arg, Thr, Pro）の含量が 26％含まれている12） 。② 信大法で抽出され るタンパク質から自己組織化する性質を利用してフィルム を形成させているため，変性ケラチンは除かれるために未Table─1 Effects of BP-3 and BMDM on the formation
of carbonylated proteins.
UV absorber
Filter
Carbonylation（％）
BP-3
−
＋
73±6.1
100±5.4
BMDM
−
＋
60±8.5
82±9.7
BP-3＋BMDM
−
＋
46±6.6
84±7.1
The keratin films were exposed to the solar simulator
irra-diation with （4 h） and without （1 h） DF-76-B filter.
Flu-orescent intensities without the UV adsorbers were
calcu-lated as 100％. Data are the mean±S.D. （n＝4）.
Fig.─2 Absorption spectra of 0.002％ BP-3 and 0.001％
BMDM.
Fig.─1 Optical transparency of DF-76-B filter and
for-mation of carbonylated proteins by the solar
simulator with and without the optical filter.
（a）Absorption spectrum of DF-76-B filter.（b）
Non-translucent keratin films were exposed to
the solar simulator irradiation with （
●） and
without the DF-76-B filter （
○）. After reactions
with 5-FTSC, fluorescent intensity of the films
was detected by microplate fluorometer. Data
are the mean±S.D. （n＝3）.
ケラチンフィルムを利用した長波長紫外線とブルーライトが引き起こすカルボニルタンパク質の検出 照射の蛍光強度は低くなる。③ フィルムは堅牢性を備え ているため長時間の光照射や界面活性剤を使ったその後の 分析処理にも十分に耐えられる7）, 8）。また，ヒト毛髪と類 似したアミノ酸組成をもつ羊毛由来のケラチンフィルムに おいてもカルボニル形成が確認されている4）。 毛髪タンパク質とほぼ同じアミノ酸組成をもつケラチン フィルムは，紫外線，ブリーチ，パーマ，熱などのさまざ まな刺激に耐えることができ，高感度で毛髪と類似した応 答ができることから，代替毛髪としての利用を提案してい る12）, 13）。さまざまな光源を用いてカルボニル形成を調べ た結果，従来までの紫外線に加えて L-UVA∼ブルーライ ト／HEV の波長における光照射においても相当量のカルボ ニル化タンパク質が形成することが明らかとなった（Fig.─ 1b）。ここで使用している太陽光照射システムと太陽光の 相対放射照度は，300∼700 nm においては特に類似した値 であることがメーカーから示されている。フィルターなし での照射は，真夏の長野県上田市の日光曝露と同程度の照 射量になるように設定していることから，以前の報告と同 様に実生活における光曝露においてもカルボニル化タンパ ク質は形成されることが示された6）, 7）。また，フィルター 有りでの照射条件では UVB 吸収剤の抑制作用はみられ ず，UVA 吸収剤は抑制作用を示すがその抑制率は低かっ た（Fig.─2）。実際に UV 吸収剤と UV 散乱剤を含む高い SPF 値と PA 値の日焼け止め（市販品）を使用した場合で も，カルボニル形成は完全には抑えることはできず，その 抑制率は約 30％にとどまっている14）。今後，L-UVA から 短波長領域の可視光線が誘発するカルボニル形成を抑制で きる薬剤が必要になると思われる。 LED 照明，PC，スマートフォンなどから発生する可視 光においても有意なカルボニル形成が検出され，特にブ ルーライト／HEV は高い値を示した（Fig.─3b）。これらの 機器は近い距離で長時間にわたり使用するため，発生する エネルギーは弱くとも，皮膚に加えて目の網膜への影響が 推測されており，加齢黄斑変性の原因となる可能性も示唆 されている15）, 16）。角質層などでのカルボニル形成には， UVA およびブルーライトにより活性酸素の生成がその初 期段階に関わっていることが報告されている4）。活性酸素 を消去するスーパーオキシドディスムターゼが働かないマ ウスの網膜では，光ダメージが高いことが知られてい る17）。これらの症状とカルボニル化を含めた酸化物との関 連性を検討する必要がある。
5. 結 論
高齢化社会を迎えているわが国において，「健康と美」 は継続されるべき社会と科学の課題である。紫外線対策 は，UVB から S-UVA，さらに L-UVA までの波長を対象と した多くのアイテムが開発されてきている。私たちは就寝 時間を除きほとんどの生活時間は光環境下で活動をしてい るため，屋内での対策はその必要性を含めて今後の問題と 思われる。ブルーライト／HEV を長時間浴びるライフスタ イルへの変化は目や皮膚への新たな影響が警告されてきて いる。実際，ブルーライト／HEV を遮 する眼鏡や症状を 軽減する目薬や化粧品が販売されてきている。 光が生体へ与える化学的反応の中で，初期段階に起きる カルボニル化は酸化ダメージのマーカーとして認知されて きている。本研究のケラチンフィルムを用いることによ り，紫外線だけでなく可視光においても長時間照射するこ とによりカルボニル化が形成されていることが明らかと なった。これは，動的な生体組織や細胞を使用した場合と は異なり，静的なフィルムでは反応生成物が代謝されるこ となく蓄積されることで測定を可能にしていることが想定Fig.─3 Formation of carbonylated proteins by LED light
irradiation.
（a）Photocharacterization of LED light sources.
（b）Keratin films were exposed to three kinds
of LED light irradiation for 48 h and fluorescent
intensity of the films was detected by microplate
fluorometer. Data are the mean±S.D. （n＝2）.
できる。このフィルムを活用することにより，光に依存し た酸化タンパク質の形成を抑制する物質の探索がなされる ことが期待される。
引 用 文 献
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