(Sinorhizobium melitoti )

1808 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.48No.13(2003)

Review

マメ科植物における共生と器官形成の

全身的制御システム

川口正代司

ミ ヤ コ グサ と ダ イ ズ の 超 根 粒 着 生 変 異 体 を用 い た 研 究 か ら,器 官 間 コ ミ ュニ ケ ー シ ョ ン を介 し て根 粒形 成 の バ ラ ンス を 維 持 す る 遺 伝 子HAR1/NARKが 特 定 さ れ た.HAR1/NARKは ロ イ シ ン リ ッチ リ ピー トを 含 む 受 容 体 型 キ ナ ー ゼ を コー ド して お り,根 か ら輸 送 さ れ る 感 染 シ グ ナ ル を全 身 で受 容 して い る と考 え ら れ る.興 味 深 い こ と にHAR1/NARKは,シ ロ イ ヌナ ズナ の 遺 伝 子 の な か で 細 胞 間 コ ミ ュニ ケ ー シ ョ ン を介 して 茎 頂 構 築 を 司 るCLV1と 最 も 近 縁 で あ っ た.マ メ科 植 物 は 根 粒 菌 と の共 生 関 係 を 確 立 す る 進 化 プ ロセ ス で,CLV1様 遺 伝 子 を リ クル ー トした と思 わ れ る 、 器 官 間 コ ミ ュニ ケ ー シ ョン 根 粒 形 成HAR1CLV1全 身 的 制 御 は じめ に 植 物 の 器 官 形 成 は常 に 動 的 で あ る.胚 発 生 の 初 期 段 階 で 器 官 の 発 生 運 命 が 決 定 され る動 物 と は異 な り,植 物 は 胚 発 生 以 後 も,葉 や 花,側 根 な どの 器 官 を 次 か ら次 へ と 生 み 出 して い く.そ の よ う な植 物 の 発 生 様 式 に お い て, 細 胞 間 コ ミュ ニ ケ ー シ ョ ンの 重 要 性 は さ ま ざ ま な レベ ル で 指摘 され て い る.細 胞 間 コ ミュ ニ ケ ー シ ョ ンの 代 表 的 な 例 と し て,茎 頂 分 裂 組 織 の 細 胞 増 殖 を 負 に 制 御 す る CLAⅤTA(CLⅤ)が あ る.CLⅤ1は ロ イ シ ン リ ッチ リ ピ ー ト(LRR)を もつ 受 容 体 型 キ ナ ー ゼ で_{,CLⅤ2と 茎 頂 深} 層 部 で レセ プ ター 複 合 体 を 形 成 し,茎 頂 表 層 細 胞 か ら分 泌 さ れ るCLⅤ3ペ プ チ ドを 受 容 し,細 胞 増 殖 を 抑 制 す る1,2). 一 方 ,植 物 の 器 官 形 成 は細 胞 間 コ ミュ ニ ケ ー シ ョ ンの み な らず,遠 距 離 シグ ナ ル伝 達 を介 した 器 官 間 コ ミュ ニ ケ ー シ ョ ンに よ っ て も制 御 され て い る.い ま だ 分子 レベ ル の 知 見 は 少 な い が,一 例 と し て トウ モ ロ コ シ の INDE-TERMINATE (ID)遺 伝 子 を あ げ る こ と が で き る3).こ の 遺 伝 子 が トラ ンス ポ ゾ ン に よ り破 壊 さ れ た 系 統 は花 芽 を つ け る こ とが で きず 永 続 的 に葉 をつ く り続 け る.し か し, ID の 発 現 は花 芽 の 分 化 す る茎 頂 で は 認 め られ ず 若 い 葉 の 先 端 部 に 限 定 さ れ て い る こ とか ら, ID の 転 写 産 物 そ の も の,あ る い は そ の は た ら き に よ っ て 葉 で 合 成 さ れ る 花 成 促 進 因 子 が 茎 頂 に 送 ら れ,花 芽 が 誘 導 さ れ る と 考 え ら れ て い る4).ま た 発 生 で は な い が,局 所 的 に 受 け た 傷 害 な ど の ス ト レ ス を 全 身 に 伝 え る 防 御 応 答 は,植 物 の 全 身 獲 得 抵 抗 性(systemic acquired resistance)と し て 広 く 知 ら れ て い る5).次 に 紹 介 す る マ メ 科 植 物 に お け る 根 粒 形 成 の オ ー ト レ ギ ュ レ ー シ ョ ン も そ の 例 外 で は な い. Ⅰ.根粒 形 成の オ ー トレギ ュ レー シ ョン:現 象の 発見史 1952年,イ ギ リ ス のNutmanは ア カ ツ メ ク サ の 根 の 根 粒 を鋭 利 な ナ イ フで 切 除 す る と,根 粒 が 形 成 され て い な い 根 の 部 分 に新 た に根 粒 が 形 成 され る こ と を 見 い だ し た6).こ れ は 先 に 形 成 され た 根 粒 が あ との 根 粒 形 成 を抑 制 す る と考 え る と う ま く説 明 で き,器 官 レベ ル に お け る オ ー トレギ ュ レー シ ョ ン,す なわ ち 自 己抑 制 機 構 の 発 見 で あ る.一 般 に根 粒 の 形 成 は 硝 酸 な ど の 窒 素 化 合 物 に よ Masayoshi Kawaguchi,新 潟 大 学 理 学 部 自 然 環 境 科 学 科(現 東 京 大 学 大 学 院 理 学 系 研 究 科)/JST CREST E-mail : masayosiCbiol. s.u-tokyo.ac.j p

Systemic regulatory system sustaining symbiosis and organ development in legume

っ て 抑 制 され る.よ っ て 根 粒 菌 の ニ トロ ゲ ナ ー ゼ に よ る 窒 素 固 定 産 物 が さ らな る根 粒 形 成 を 抑 制 して い る 可 能 性 が 考 え られ る 。 しか しNutmanは 窒 素 固 定 す る 前 の 根 粒 原 基 を切 除 して も一 過 的 に根 粒 の 誘 導 が み られ る こ と か ら,根 粒 お よび 根 粒 原 基 が さ らな る 根 粒 形 成 の イ ン ヒ ビ ター と して 機 能 す る こ と を指 摘 した. 1983年,PieceとBauerは 根 粒 菌 を ダ イ ズ の 根 に 時 間差 で 感 染 させ る 方 法 に よ りオ ー トレギ ュ レー シ ョ ンの タ イ ミ ン グ を 計 測 した7),そ の 結 果,最 初 の 感 染 後15 時 間 目 よ り根 粒 形 成 の 抑 制 効 果 が 観 察 され た.ダ イ ズ の 場 合,根 粒 は感 染 後 お よそ1週 間 で 現 わ れ る ので,そ の タ イ ム ス ケ ー ル か ら考 え る と根 粒 の フ ィー ドバ ック制 御 は 予 想 以 上 に早 くか ら生 じて い る こ とが わ か る. 1984年,KosslakとBohloolは ダ イ ズ の根 を2つ に 分 け る ス プ リ ッ トル ー ト法 を取 り入 れ,時 間 差 をお い て根 粒 菌 を 感 染 させ る と い う 実 験(ス プ リ ッ トル ー ト実 験*Dを 試 み た(図1a)8).す る と根 粒 形 成 の抑 制 効 果 は 感 染 を受 け て い な い も う片 方 の 根 に 伝 播 す る こ とが 観 察 され た.こ れ は,根 粒 形 成 の フ ィー ドバ ッ ク制 御 が,感 染 根 か ら遠 距 離 シ グ ナ ル 伝 達 を介 して 非 感 染 根 に 伝 播 す る こ と を示 した 最 初 の 実験 で あ る. Ⅱ.遠 距 離 シ グ ナ ル 伝 達 を 駆 動 するNodフ ァクター 1980年 代 は,こ れ ら の 感 染 生 理 学 的 実 験 と並 行 して,根 粒 形 成 や 共 生 窒 素 固 定 に 必須 な 共 生 菌 側 の 遺 伝 子 が 相 つ い で ク ロ ー ニ ング され た時 期 で あ っ た . そ の なか で も宿 主 植 物 との初 期 相 互 作 用 か ら根 粒 の誘 導 に 欠 か せ な い の が,π04遺 伝 子 群 で あ る 。1990年 代 に 入 る とnod遺 伝 子 群 の は た らき に よ っ て合 成 さ れ る根 粒 形 成 因 子Nodフ ァ ク タ ー の 構 造 が 決 定 さ れ た9,10).Nodフ ァ ク タ ー は3∼5個 のN-ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン よ り な る キ チ ン オ リ ゴ マ ー を 基 本 骨 格 と し,そ の 非 還 元 末 端 にC16ま た はC18の 脂 肪 酸 側 鎖 が 結 合 し た リ ポ キ チ ン オ リ ゴ 糖 で あ る.CaetanrAnollesとBauer は,nod遺 伝 子 領 域 を 欠 損 し た ア ル フ ァ ル フ ァ 根 粒 菌 (Sinorhizobium melitoti )を 用 い,ス プ リ ッ ト ル ー ト実 験 を 行 な っ た11).そ の 結 果,Nod遺 伝 子 領 域 を 欠 損 す る 根 粒 菌 を 感 染 さ せ て も,根 粒 の 抑 制 効 果 は 非 感 染 根 に 伝 播 し な か っ た.こ の こ と は,Nod遺 伝 子 産 物 に よ り合 成 さ れ るNodフ ァ ク タ ー が,遠 距 離 シ グ ナ ル 伝 達 を 介 し た フ ィ ー ドバ ッ ク 制 御 を 駆 動 し て い る と い う こ と を 示 唆 し て い る. Nodフ ァ ク タ ー が 直 接 的 に 遠 距 離 シ グ ナ ル 伝 達 の ス イ ッ チ を 入 れ て い る と い う こ と は,2002年vanBrussel ら が ヤ ハ ズ ノ エ ン ドウ を 用 い た ス プ リ ッ トル ー ト実 験 に よ り証 明 し た12).彼 ら は 実 生 の 片 方 の 根 を 弱 い 緩 衝 液 の 中 に 浸 し,そ の 中 にNodフ ァ ク タ ー を 投 与 す る と,Nod フ ァ ク タ ー 未 処 理 の 根 に 根 粒 抑 制 効 果 が 伝 達 さ れ る こ と を 示 し た の で あ る.同 様 の 結 論 は,ア ル フ ァ ル フ ァ 根 粒 菌 のNodフ ァ ク タ ー を 根 に 直 接 投 与 し た ス プ リ ッ ト ル ー ト実 験 か ら も 得 ら れ て い る13).Nodフ ァ ク タ ー が 根 粒 形 成 の 誘 導 の み な ら ず,遠 距 離 シ グ ナ ル 伝 達 を 介 し た 負 *1ス プ リ ッ トル ー ト実 験:無 菌 的 に 育 て た 植 物 の 根 系 を2つ に 分 け,そ れ ぞ れ を ル ー トA,ル ー トBと し,ま ず ル ー トAに 根 粒 菌 を 感 染 さ せ,次 に 数 十 時 間 の イ ン タ ー バ ル を お い て ル ー トBに 根 粒 菌 を 感 染 さ せ る.2∼4週 間 の 感 染 期 間 を お い て ル ー トB根 の 根 粒 数 を カ ウ ン トす る.根 粒 形 成 の フ ィ ー ドバ ッ ク 制 御 が ル ー トAか ら ル ー トBに 伝 播 して い れ ば,ル ー トBに お け る 根 粒 着 生 数 は ル ー トAよ り も著 し く減 少 す る. 図1ダ イ ズの スプ リ ッ トルー ト法(a)と 根 粒 形成の 遠距 離 シグナル 伝達(b)

1810 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.48No.13(2003) の 制 御 因 子 と し て もは た ら く こ と は,根 粒 の発 生 分 化 と そ の バ ラ ンス の 安 定化 機 構 を解 明 す る うえ で の 重 要 な ポ イ ン トで あ る. た だ し,根 粒 形 成 の 制 御 はNodフ ァ ク ター が 駆 動 す るオ ー トレギ ュ レー シ ョ ンで す べ て 説 明 が つ く もの で は な い.他 の制 御 因 子 と して,硝 酸 な どの 窒 素 化 合 物14)や 感染 過 程 を抑 制 す るエ チ レ ン15,16)が有 名 で あ る.ま た ミ ヤ コ グ サ か ら 単 離 さ れ た 光 や 重 力 応 答 に 異 常 を 示 す astray 変 異 体17,18)や タ ル ウ マ ゴ ヤ シ の sunn 変 異 体19)な どは 新 た な根 粒 形 成 の抑 制 機 構 に光 を 当 て る可 能性 が あ る.し か し,本 稿 で は根 粒 形 成 の オ ー トレギ ュ レー シ ョ ン との 関 連 が 明確 で あ る もの に 限 っ て 紹介 す る こ と にす る.

Ⅲ.ダ イズ超根粒清生変異体

1985年,Gresshoffら の グ ル ー プ は ダ イ ズ のBragg品 種 に エ チ ル メ タ ン ス ル ホ ン 酸(EMS)処 理 を 行 な い,超 根 粒 着 生(supernodulation)変 異 体*2 nts を 単 離 し

た20,21). nts はnitrate tolerant symbiotic の 略 で,高 濃 度

の 硝 酸 存 在 下 で も根 粒 を 形 成 す る こ とか ら名 づ け ら れ た.通 常 根 に お け る根 粒 の 形 成 領 域(nodulation zone) は オ ー ト レギ ュ レー シ ョ ンに よ り強 く制 限 さ れ て い る. しか しnts変 異 体 で は,本 来 根 粒 形 成 が 抑 制 さ れ る 部 位 にお い て も根 粒 が 形 成 さ れ,nodulation zoneが 広 が っ て い た.翌 年,nts変 異 体 を 用 い た 接 ぎ木 実 験 よ り,シ ュ ー トの 遺 伝 子 型 が 根 の 表 現 型 を決 め て い る こ と が わ か っ た.す な わ ち,ntsの 根 に 野 生 型 の シ ュ ー トを 接 ぐ と根 粒 形 成 は 正 常 に 行 な わ れ,一 方,野 生 型 の根 に 鷹 の シ ュ ー トを 接 ぐ と根 に 過 剰 な 根 粒 が 形 成 さ れ た の で あ る22).以 上 の 結 果 か ら根 粒 の 抑 制 因子 の 発 生 器 官 は シ ュ ー トで あ り,そ こ で合 成 さ れ る何 らか の 因子 が 根 に 伝 達 され,さ らな る根 粒 形 成 が 抑 制 され る と考 え られ る よ う にな った. nts 変 異 体 に お け る 遠 距 離 シ グ ナ ル伝 達 を 介 した 抑 制 効 果 は ど うで あ ろ う か.nts変 異 体 を用 い た ス プ リ ッ ト ル ー ト実験 か らは,非 感 染 根 にお け る根 粒 形 成 の抑 制 は 有 意 に観 察 され な か っ た23).こ れ はnts変 異 体 にお い て 感 染 根 か ら非 感 染 根 へ の 遠 距 離 シ グ ナ ル 伝 達 が 失 わ れ て い る こ と を 意 味 し て お り,そ の 結 果 根 粒 が 過 剰 に 着 生 し た と 解 釈 で き る.以 上,nts変 異 体 よ り得 ら れ た 知 見 を 接 ぎ 木 実 験 よ り得 ら れ た 結 果 と す りあ わ せ る と,根 粒 形 成 の フ ィ ー ドバ ッ ク 制 御 は,根 と シ ュ ー ト を 介 し た 全 身 的 な 器 官 間 コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン に よ っ て 成 り 立 っ て お り,根 粒 お よ び 感 染 根 か ら シ ュ ー トに 伝 達 さ れ る 「感 染 シ グ ナ ル 」 と,そ れ を 受 け て シ ュ ー トか ら 根 に 輸 送 さ れ る 「オ ー ト レ ギ ュ レ ー シ ョ ン シ グ ナ ル 」 よ り構 成 さ れ て い る と 考 え ら れ る(図1b).そ の 後 「オ ー ト レ ギ ュ レ ー シ ョ ン シ グ ナ ル 」 の お も な 発 生 器 官 は 葉 で あ る こ と が, Harperら に よ る 接 ぎ 木 実 験24)や 佐 藤 と 大 山 に よ る ダ イ ズ 単 葉 か ら 誘 導 し た 不 定 根 へ の 根 粒 着 生 実 験25)か ら示 唆 さ れ て い る.茎 頂 が 「オ ー ト レ ギ ュ レ ー シ ョ ン シ グ ナ ル 」 を 合 成 し て い る 可 能 性 が 指 摘 さ れ た こ と も あ る が,茎 頂 を 取 り 除 い て も 根 粒 形 成 に は 影 響 し な い の で こ れ は 棄 却 さ れ る. そ の 後 ダ イ ズnts変 異 体 と 同 じ 表 現 型 の も の は い く つ か 単 離 さ れ て い る.Harperら がWilliams品 種 よ り単 離 し た 超 根 粒 着 生 変 異 体NOD1-3,NOD3-726),赤 尾 と 河 内 に よ っ て エ ン レ イ 品 種 よ り単 離 さ れ たEn650027)が あ る.こ れ ら の ダ イ ズ 変 異 体 は,遺 伝 解 析 に よ りす べ て 同 じ1遺 伝 子 の 変 異 に 由 来 す る こ と が 明 らか と な り,近 年 で はnts1と し て 報 告 さ れ て い る28).

Ⅳ.モ デルマメ科植物ミヤコグサhar1変

異体

マ メ科 植 物 は エ ン ドウ,ダ イズ,ヤ エ ナ リな ど遺 伝 学 的 あ るい は生 理 学 的 実 験 に広 く使 われ て い た が,一 般 に 形 質 転 換 が 難 し く,か つ ゲ ノ ム サ イ ズ が 大 きい た め に シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ で な され て い る よ う なゲ ノ ム や 分 子 遺 伝 学 的解 析 が 遅 れ て い た.日 本 に 自生 す る ミヤ コ グサ (Lotus japonicus) は,形 質 転 換 が 可 能 で ゲ ノ ム サ イ ズ が 約450 Mbと 小 さ い た め に,タ ル ウ マ ゴ ヤ シ(Medicago trunca-tula) と と も に 近 年 マ メ 科 植 物 の モ デ ル と して 注 目 さ れ て い る29,30).ミ ヤ コ グ サ に お い て は と く に こ こ 数 年 に お け る 国 内 で の 基 盤 研 究 が 目 覚 ま し く,か ず さDNA研 究 所 で は す で に ミ ヤ コ グ サ の 全 ゲ ノ ム 配 列 決 定 プ ロ ジ ェ ク *2超 根 粒着 生 変 異 体:野 生 株 の 根粒 着 生 数 が 数倍 か ら10倍 程 度 に増 加 した 変異 体.根 粒 の過 剰 形 成 に伴 い,宿 主 の根 の 伸 長 が 阻害 され る ため,根 にお け る根 粒 の密 度 は 際 だ っ て増 大 す る.窒 素 飢 餓 条 件 下 で 育 て た 野 生株 の場 合,主 根 の 全 長 に対 して お よ そ30%が 根 粒 形 成領 域(nodulation zone)で あ る が,オ ー トレギ ュ レー シ ョンが破 綻 した 超根 粒 着 生 変異 体 で は70%程 度 に まで 広 が る.し か し エチ レ ン感 受 性 が低 下 したsickle超 根粒 着 生 変 異体 で は根粒 形 成 領 域 は 広が らず,そ の範 囲 内 での 感 染糸 形 成 と根 粒 数 が増 加 す る.

トを進 め て い る. 筆 者 らは,ミ ヤ コ グ サ にEMS処 理 を 行 な い32系 統 の 共 生 変 異 体 を単 離 した.そ の 中 か ら,オ ー トレギ ュ レ ー シ ョンの 破 綻 に よ る もの と思 わ れ る超 根 粒 着 生 変 異 体 harl (Ljsym78) (図2)31)に 焦 点 を 絞 り.原 因 潰 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ を 試 み た.こ の har1 変 異 体 は ミ シガ ン州 立 大 学 のSzczyglowskiら の グ ル ー プ が 超 根 粒 着 生 変 異 体 と し て 最 初 に 報 告 し た も の で32,33),変 異 体 名 は 超 根 粒 着

生 と非 感染 時 の根 の形 態 異常hypernodulation and

aber-rant root formation (主根 が.短く側 根 が 多 い)に 由来 す る. デ ン マ ー ク のStougaardら が 単 離 し た 超 根 粒 着 生 変 異 体Ljsym16 34)も,の ち に har1 と 同 じ遺 伝 子 の変 異 で あ る こ とが わ か っ た.よ っ て 典 型 的 な超 根 粒 着 生 を与 え る ミヤ コ グ サ の 変 異 体 は 現 時 点 でhar1 の み で あ り,根 粒 非着生変異 体や窒 素固定 変異体 と比較 す る と現象にかか わ る遺 伝 子 数 が きわ め て 少 な い.そ の 後har1 変異 体 を 用 い た 接 ぎ 木 実 験 に よ り,har1は ダ イ ズ 超 根 粒 着 生 変 異 体nut1と 同 様 に シ ュ ー ト に よ っ て 制 御 さ れ て お り35,36),また ス プ リ ッ ト ル ー ト実 験 か ら は,感 染 根 か ら 非 感 染 根 へ の 遠 距 離 シ グ ナ ル 伝 達 を 介 し た 根 粒 抑 制 活 性 を 失 っ て い る こ と が 示 さ れ た36).非 感 染 時 のhar1変 異 体 は 主 根 の 伸 長 が 抑 制 さ れ,側 根 数 が 野 生 型 の2∼3倍 に 増 え て い る.こ の 形 質 も シ ュ ー トに よ っ て 制 御 さ れ て い る こ と が 報 告 さ れ て い る35). Ⅴ.ミ ヤ コグ サ にお け るポジ シ ョナル ク ロー ニ ング har1 変 異 体 が 単 離 さ れ た90年 代 の 後 半 は,ミ ヤ コ グ サ に お い て 分 子 遺 伝 学 的 解 析 の 交 配 パ ー ト ナ ー*3も 確 定 し て お ら ず,ま た 分 子 連 鎖 地 図 も ほ と ん ど 描 け て い な い 状 態 で あ っ た.筆 者 ら(駒 場 を 中 心 に,千 葉 大 学 の 原 田 久 也 ら,農 業 生 物 資 源 研 究 所 の 河 内 宏,川 崎 信 二 ら に よ る 共 同 研 究)は,広 く使 わ れ て い る 岐 阜 県 由 来 の 系 統Gifu B-129の 交 配 パ ー ト ナ ー と し て 沖 縄 県 宮 古 島 由 来 の MiyakojimaMG-2037)を 用 い,原 因 遺 伝 子 の ポ ジ シ ョ ナ ル ク ロ ー ニ ン グ を 試 み た. ま ず,ダ イ ズnut1変 異 体 と ミ ヤ コ グ サhar1変 異 体 の 表 現 型 の 類 似 か ら 同 じ 遺 伝 子 の 変 異 に 由 来 す る も の と 仮 定 し,さ ら に 両 者 の ゲ ノ ム の 間 に マ イ ク ロ シ ン テ ニ ー (染 色 体 上 に お け る 相 対 的 な 遺 伝 子 の 位 置 関 係 が 種 を こ え て 保 持 さ れ て い る こ と)が 存 在 す る の で は な い か と 予 測 を 立 て た.ダ イ ズnut1近 傍 に 位 置 す るDNAマ ー カ ー を ミヤ コ グ サESTデ ー タ ベ ー ス の な か か ら 探 し_,連 鎖 解 析 を 行 な う と 鷹1近 傍 に マ ッ プ さ れ て い た 糖 輸 送 体 遺 伝 子 や ア ル ド ラ ー ゼ 遺 伝 子 は,ミ ヤ コ グ サ で もhar1 近 傍 に 位 置 し て い る こ と が 判 明 し た.次 にAFLP (amplified fragment length polymorphism)解 析 よ り得 ら れ た 共 優 性 マ ー カ ーE2M16-C160はhar1か ら0.11 cMに マ ッ ピ ン グ さ れ,こ れ を 基 点 に ゲ ノ ム 解 析 を 進 め 候 補 遺 伝 子 を 特 定 し た.候 補 遺 伝 子 が 原 因 で あ る こ と は,ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム を 介 し た 形 質 転 換 に よ る 相 補 実 験 に よ っ て 証 明 さ れ た36). 今 ま で マ メ 科 植 物 で は こ の 相 補 実 験 が 難 し く,遺 伝 子 の 生 物 学 的 機 能 を 結 論 づ け る こ と が 困 難 で あ っ た が,今 回 の ポ ジ シ ョ ナ ル ク ロ ー ニ ン グ と ミ ヤ コ グ サ 形 質 転 換 個 体 の 作 製 に よ っ て,初 め て 遺 伝 子 機 能 を 明 ら か に す る こ と が で き た.筆 者 ら の チ ー ム と独 立 に,Stougaardの チ ー ム も か ず さDNA研 究 所 と 協 力 しhar1変 異 体 の 原 因 遺 伝 子 の ポ ジ シ ョ ナ ル ク ロ ー ニ ン グ に 成 功 し て い る35). *3交 配 パ ー トナ ー:分 子 連 鎖地 図 の構 築 や ポ ジ シ ョナ ル ク ロー ニ ン グに お い て活 用 で き る標 準 系 統 に対 す る エ コ タ イプ あ るい は系 統. ミヤ コ グサ で は突 然 変 異 体 の単 離 な どで岐 阜 県 由来 の系 統Gifu B-129が 世 界で 広 く使 わ れ て い る.そ れ に 対 す る交 配 パ ー トナー と し て,筆 者 らが 見 い だ し た 沖 縄 県 宮 古 島 由 来 のMiyakojima MG-20,デ ンマ ー ク のNiels Sandalら が 提 唱 す る ア ル ジ ェ リ ア 由 来 の Lotus fiticaulis が あ る.か ず さDNA研 究 所 で はMiyakojima MG-20の 大 規 模EST解 析 や 全 ゲ ノ ム 配 列 決 定 プ ロ ジ ェ ク トを 進 め て い る. 図2ミ ヤ コ グ サ 超 根 粒 着 生 変 異 体 力har1

(a)野 生 型(Gifu B-129),(b)har1(Ljsym78)変 異 体.無 窒 素 条 件 下 でhar1変 異 体 に根 粒 菌 を感 染 さ せ る と 根粒 過 剰 着生 の た め 生長 が抑 制 さ れ る.

1812 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.48No.13(2003)

Ⅵ.HAR1/NARK遺

伝子の構造と発現

HAR1 遺 伝 子 は986個 の ア ミ ノ 酸 か ら な る 分 子 量 108Kの 受 容 体 型 キ ナ ー ゼ 蛋 白 質 を コ ー ド し て い た. HAR1蛋 白 質 はN末 端 側 に シ グ ナ ル ペ プ チ ド と 推 定21 個 の ロ イ シ ン リ ッ チ リ ピ ー ト(LRR)か ら な るLRRド メ イ ン,中 央 に 膜 貫 通 ド メ イ ン,そ し て 細 胞 内 に セ リ ン/ ス レ オ ニ ン 型 キ ナ ー ゼ ドメ イ ン よ り 構 成 さ れ て い た. HAR1 の ダ イ ズ の オ ー ソ ロ グ と 考 え ら れ るGmCLV1B を,超 根 粒 着 生 系 統En6500で 調 べ た と こ ろ,LRRド メ イ ン と 膜 貫 通 ドメ イ ン の 間 に ナ ン セ ン ス 変 異 が 生 じ て い た(図3)36).ダ イ ズ GmCLV1B はCLVJ 様 遺 伝 子 と して ク ロ ー ニ ン グ され て い た もの の そ の 生 物 学 的機 能 は不 明 で あ っ た が38),今 回 の ミヤ コ グサ の 分 子 遺 伝 学 的 解 析 か ら,ダ イ ズ 遺 伝 子 の 機 能 を 示 す こ と が で き た.Gresshoff ら の チ ー ム も5系 統 のnts1 変異 体 でGmCLV1 B に変異 が 生 じて い る こ と を見 い だ し, nts1 変異体 の原 因遺 伝

子 を 新 た にNARK (nodule autoreguration receptor

kinase) と 命 名 し て い る39). 興 味 深 い こ と に, HAR1/NARK と 最 も高 い 相 同 性 を 示 した シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 遺 伝 子 は, CLAVATAI (CLV1) で あ っ た.CLⅤ1はCLⅤ2と レ セ プ タ ー 複 合 体 を 形 成 し,茎 頂 分 裂 組 織 のL1,L2層 で 分 泌 さ れ るCLV3ペ プ チ ドをL3層 内 で 認 識 し て い る1,2).当 初, HARD やNTS1 は シ ュ ー トで 合 成 さ れ る オ ー ト レ ギ ュ レ ー シ ョ ン シ グ ナ ル の 合 成 酵 素 あ る い は シ グ ナ ル 分 子 そ の も の を コ ー ド し て い る と 予 測 さ れ て い た が,ク ロ ー ニ ン グ に よ っ て ヒ ン トが 得 ら れ た の は む し ろ 「感 染 シ グ ナ ル 」 の ほ う で あ っ た.CLⅤ1,CLⅤ2レ セ プ タ ー 複 合 体 がCLⅤ3ペ プ チ ド を 認 識 し て い る こ と か ら,HAR1の リ ガ ン ドは 根 粒 菌 の 感 染 に よ り 誘 導 さ れ るCLⅤ3様 の 短 い ペ プ チ ドで あ る 可 能 性 が 考 え ら れ る.「 感 染 シ グ ナ ル 」 はNodフ ァ ク タ ー 処 理 に よ っ て 誘 導 さ れ る と 考 え ら れ る た め12・13), Nodフ ァ ク タ ー 処 理 に よ り 誘 導 さ れ るCLⅤ3様 の 分 泌 性 ペ プ チ ドが 見 つ か れ ば よ い が,現 時 点 で そ の よ う な も の は 検 出 さ れ て い な い.そ の 他 の 候 補 と し てNodフ ァ ク タ ー 処 理 に よ っ て 根 の 木 部 に 隣 接 す る 細 胞 で 速 や か に 強発 現 す る遺 伝 子ENOD 40 が あ る9). ENOD 40 は 短 い ペ プ チ ドを コー ドして い る とい わ れ る もの の,そ の生 物 学 的 役 割 は 依 然 不 明 の ま ま で あ る.HAR1のLRRド メ イ ン は酸 性 に 偏 り,NARKの そ れ は塩 基 性 に 偏 る.ミ ヤ コ グ サ の 予 想ENOD40ペ プ チ ドは 塩 基 性 な の に 対 し, ダ イ ズ の そ れ は酸 性 で あ る40).こ れ は両 者 が 電 気 的 に引 き合 う と考 え る と都 合 が よ い.し か し こ の 可 能 性 を含 め,今 後HAR1/NARKの リ ガ ン ドを 明 らか にす る ため の 注 意 深 い 実験 は必 須 で あ る. HAR1 遺 伝 子 は,根,茎,葉,花 な ど さ ま ざ ま な 器 官 で 全 身 的 に発 現 して い た が.感 染 後21日 目 の 根 粒 で は 抑 制 さ れ て い た.ま た CLV1 が 特 異 的 に 発 現 して い る 茎 頂 で は, HAR1 の 発 現 は 強 く抑 制 さ れ て い た36).同 じ 結 果 は ダ イ ズ の 茎 頂 分 裂 組 織 で も示 さ れ て い る39).ダ イ ズ に はCLV1 に よ く似 た 遺 伝 子 がNARK (GmCLV1B)の ほ か に も う1つ (GmCLV1A)存 在 す る38).そ れ がCLV1の 図3シ ロ イ ヌナ ズナCLV1,ミ ヤ コ グ サHAR1,ダ イ ズNTS1(NARK) 受 容 体 型 キ ナ ー ゼ の1次 構 造 比 較 黒 矢 印 は塩 基 置換,白 矢 印 はイ ン トロ ン の 挿 入部 位,%は ア ミ ノ酸 レベ ル の相 同 性.

オ ー ソ ロ グ と して 茎 頂 で 特 異 的 に発 現 し,細 胞 増 殖 の 制 御 に 関 与 して い る か ど うか は ま だ 明 らか に され て い な い.

Ⅶ.共 生成立過程における遺伝子のリクルー ト

シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 全 ゲ ノ ム 配 列 の 決 定 に よ り受 容 体 キ ナ ー ゼ と し て は た ら く と思 わ れ る も の は450種 も 知 られ て お り,ま た そ の な か でLRRド メ イ ン を も つ も の は216 種 に も 及 ぶ41).先 に 述 べ た よ う にHAR1やNARKは そ の な か で,CLⅤ1と 最 も 近 縁 で あ っ た.ま たCLV1に は キ ナ ー ゼ ドメ イ ン に1つ の イ ン トロ ンが 存 在 す る が,そ の 位 置 と 数 はHAR1と/NARKで 維 持 さ れ て い た36/.し た が っ てHAR1の 起 源 は 植 物 の 茎 頂 維 持 に は た ら く CLV1 様 遺 伝 子 と考 え られ,マ メ科 植 物 と根 粒 菌 との 共 生 成 立 過 程 にお い て,細 胞 間 コ ミュニ ケ ー シ ョン を介 し て 分 裂 組 織 構 築 を 制 御 す る遺 伝 子 が 根 粒 共 生 系 に リ ク ル ー トさ れ_{,器 官 問 コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ンを介 して全 身 的 に} 根 粒 形 成 を 制 御 す る 遺 伝 子 へ と機 能 転 換 した 可 能性 が 考 え られ る.あ る い は,シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ のCLW様 遺 伝 子 の機 能 は 未 知 な も の が 多 い が,そ の な か に はHAR1/ NARKの よ う に 遠 距 離 シ グ ナ ル伝 達 に 関 与 す る も の が 存 在 し,そ れ を根 粒 共 生 系 に リ クル ー トした可 能 性 もあ る. HART/NARK と CLV 1 との 進 化 的 類 縁 関 連 は,両 者 の 遺 伝 子 構 造 の 類 似 の ほ か に も,エ ン ドウ の超 根 粒 着 生 変異体Pssym 28 か ら も示 唆 さ れ る.こ の 変 異 体 はhart 1同 様 シ ュ ー ト制 御 で あ り,ま た 茎 で はclv変 異 体 の よ う に 茎 頂 が 肥 大 し 帯 状 に な る42).エ ン ドウ の も う1つ の 超 根 粒着 生 変異 体Pssym 29 はHARD の オ ー ソ ロ グ で あ る こ と が わ か っ て い る の で35), Pssym 28 変異体 の原 因遺 伝 子 は,お そ ら く CLV2 様 遺 伝 子 を コ ー ド し て お り, PsSYM29と レ セ プ ター 複 合 体 を形 成 して い る と 予 想 さ れ る.1つ の 遺 伝 子 変 異 に よ っ て根 と 茎 頂 の双 方 の 細 胞 増 殖 の ブ レ ー キ が か か ら な いPssym 28 変 異体 の存 在 は,現 象 的 に も茎 頂 分 裂 組 織 にお け る フ ィー ドバ ック 制 御 と根 粒 形 成 に お け る遠 距 離 シ グ ナ ル伝 達 を介 した制 御 をつ な ぐ も の で あ り,そ の 遺 伝 子 の 単 離 が 待 た れ る.

Ⅷ.共 生と器官形成の全身的制御システム

本 稿 で は 根 粒 形 成 の オ ー トレギ ュ レー シ ョ ンとそ れ を 支 え る 受 容 体 型 キ ナ ー ゼ の 話 を して きた.今 回 得 られ た 分 子 的 知 見 と過 去 の 生 理 学 的 実 験 と を統 合 す る と図4に 示 す モ デ ル が 考 え られ る.ま ず 根 粒 菌 の 分 泌 す るNod フ ァ ク ター を根 が受 容 す る と 「感 染 シ グ ナ ル」 が 合 成 さ れ,そ れ は 速 や か に シ ュ ー トに輸 送 され る.そ れ をHAR 1/NARKが 認 識 し,リ ン酸 化 を 介 し て 「オ ー トレギ ュ レ ー シ ョ ン シ グ ナ ル」 を 合 成 す る.「 オ ー トレギ ュ レー シ ョ ン シ グナ ル」 は シ ュ ー トか ら根 へ 送 られ,さ らな る 根 粒 形 成 を抑 制 す る.窒 素 飢 餓 状 態 の 宿 主 に 根 粒 が形 成 さ れ る と,共 生 窒 素 固 定 に よ り生 長 が 促 進 さ れ る.そ れ は 内 生 の 「感 染 シ グ ナ ル」 と 「オ ー ト レギ ュ レー シ ョ ン シ グ ナ ル」 の 濃 度 の低 下 を も た ら し,HAR1/NARKを 介 した根 粒 形 成 の 抑 制 を解 除 す る.こ の よ う な し くみ に よ って 個 体 の サ イ ズ に見 合 っ た 数 の根 粒 が形 成 さ れ る と 予 想 さ れ る. さ て 読 者 の な か に は,そ も そ も な ぜ 器 官 を 分 化 す る 際,シ ュ ー トを介 した全 身 的 な 制 御 をす る の か と疑 問 を もつ 人 もい る だ ろ う.こ れ を 説 明 す る に は,根 粒 と い う 共 生 窒 素 固 定 器 官 は宿 主 に とっ て 有 用 で あ る が,ま た非 常 に コ ス トの か か る器 官 で あ る と い う こ とを 述 べ る必 要 が あ る.根 粒 は 共 生 窒 素 固 定 に 光 合 成 産 物 の2∼3割 を 消 費 し,ニ トロ ゲ ナ ー ゼ の 活 性 発 現 に も多 くのATPが 必 要 と さ れ る.し た が っ て根 粒 の 過 剰 形 成 は,個 体 全 体 の生 長 に は ね 返 る問 題 で あ る 。 個 体 の 生 育 を 阻害 す る ほ どに 根 粒 が 形 成 さ れ れ ば,共 生 は 寄 生 へ と転 化 す る.共 生 の バ ラ ンス を 維 持 す る た め に,根 の 感 染 情 報 を地 上 部 に あ げ,常 に個 体 全 体 で 新 た に 器 官 をつ くれ る状 態 か否 か の判 断 を して い る と予 想 され る. 進 化 的 に マ メ科 植 物 と根 粒 菌 の 共 生 成 立 過 程 を考 え て み る.マ メ科 の祖 先 はお よ そ9千 万 年 前 に 出 現 した とさ れ る が,そ の よ うな 太 古 のマ メ科 植 物 に とっ て 根 粒 菌 と の 共 生 は窒 素 源 獲 得 の う え で 願 っ て も な い もの で あ っ た ろ う.そ れ に よ り貧 栄 養 の土 壌 へ の 進 出 が 可 能 と な り, 競 争 の 少 な い場 で の 繁 殖 が 期 待 で きる か らで あ る.し か しな が ら,根 粒 菌 の 過 剰 感 染 と共 生 窒 素 固 定 に伴 う多 大 な コ ス トは,宿 主 の 生 長 を著 し く 阻 害 す る こ と に な る. 根 粒 菌 と相 互 作 用 を始 め た ば か り の マ メ科 植 物 は きわ め て 不 安 定 な状 態 に 陥 った こ とが予 想 され る.そ の よ うな 個 体 内 部 の 不 安 定 さ を,CLV1様 遺 伝 子 を根 粒 形 成 へ と リ ク ル ー トす る こ と に よ っ て解 消 し,共 生 と器 官 形 成 の 新 た な 安 定 化 シ ス テ ム を築 い た の で は あ る ま いか.し か も根 粒 形 成 を感 染 部 位 周 辺 の 局所 的 な 制 御 に まか せ る の

1814 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.48No.13(2003) で は な く,全 身 的 な 判 断 シ ス テ ム を構 築 す る とい うや り 方 に よ って. お わ り に Nutmanが 根 粒 形 成 の オー トレギ ュ レー シ ョ ン を 発 見 して か ら半 世 紀 が た つ.そ の 間 ミヤ コ グ サ と ダ イ ズ の 分 子 遺 伝 学 的 基 盤 が 整 備 され,そ の 現 象 の 中 心 に位 置 す る HAR1/NARK が 特 定 さ れ た.今 後 は こ れ を足 が か り と し て,「 感 染 シ グ ナ ル 」 と 「オ ー トレ ギ ュ レ ー シ ョ ン シ グナ ル」 の 分 子 的 実 体 の解 明 が 進 み,遠 距 離 シ グ ナ ル伝 達 を介 した フ ィー ドバ ッ ク制 御 の 姿 が よ り よ く見 え て く る だ ろ う.一 ・方,HAR1/NARKの 遺 伝 子 同 定 は マ メ 科 植 物 と根 粒 菌 の 進 化 プ ロ セ ス に 新 た な 光 を投 げ か け た.共 生 と器 官 形 成 の バ ラ ンス を維 持 す る た め に,マ メ科 植 物 は ど の よ う にCLV1様 遺 伝 子 を進 化 さ せ て き た の で あ ろ うか.ま た そ もそ もマ メ の 茎 頂 分 裂 組 織 は どの よ うに して 細 胞 増 殖 の バ ラ ン ス を制 御 して い るの で あ ろ うか. 生 物 間 相 互 作 用 か ら器 官 間 コ ミュ ニ ケ ー シ ョ ン,そ して 発 生,共 生 の安 定 化 と続 くこ の 一 連 の研 究 の 今 後 に期 待 した い. 1)竹 村 美 保 ・河 内 孝 之:蛋 白 質 核 酸 酵 素,47,1735-1739 (2002)

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図4HAR1/NARKを 介 し た根 粒 形 成 の 全 身 的 制 御 シ ス テ ム の モ デ ル 根 粒 菌 の 分 泌 す るNodフ ァ クタ ー に よ り根 粒 形成 が 誘 導 さ れ る と 「感染 シ グナ ル 」 が合 成 さ れ,そ れ は速 や かに シ ュー トに 輸 送 さ れ る,「 感 染 シ グ ナ ル 」 は HAR1に よ って 認 識 さ れ,リ ン酸 化 を 介 して 「オ ー トレギ ュ レー シ ョン シ グナ ル」 が 合成 さ れ る,「 オ ー トレギ ュ レー シ ョ ン シ グ ナ ル 」 は シ ュ ー トか ら根 へ 輸 送 さ れ,さ ら な る 根 粒 形 成 を抑 制 す る.根 粒 形 成 に よ る 宿 主 の 生 長 促 進 は 、 「感 染 シ グ ナ ル 」 と 「オ ー トレギ ュ レー シ ョン シ グ ナ ル」 の 内 生 量 を 低 下 さ せ, HAR1を 介 した 根 粒 形 成 の 抑 制 は解 除 さ れ る,

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川 口正 代司 略 歴:1992年 東京大 学大学 院理学系 研究 科相関理化学専 攻 博 士課程 修了,同 年 日本 学術振興会 特別 研究員,1993年 東 京大学教 養学部基礎科学科(現 大 学院総 合文化研 究科広域科 学 専攻)助 手,2001年 新潟 大学 理学 部 自然 環境科 学科 助 教 授 を経て,2003年 東 京大学大 学院理 学系研 究科生物科学 専 攻 助教授.研 究 テーマ:ミ ヤコ グサを用 いた共生 と器官 形 成 の分子的解 明.関 心事 ・抱負:生 物 間相互 作用が導 く器 官の生成 プロセスを分子 と理論の両 方向か ら追究 したい. symposium 未 来 開 拓 学 術 推 進 事 業 研 究 プ ロ ジ ェ ク ト

International Symposium on •gDevelopment and Regeneration of the Nervous System•h 日 時 平 成15年12月5日(金)13:00∼6日(土)13:00

場 所 岡 崎 コ ン フ ァ レ ン ス セ ン タ ー(愛 知 県 岡 崎 市 明 大 寺 町/名 鉄 東 岡 崎 駅 よ り徒 歩10分)

Symposists Alison K. Hall(Dept. of Neurosci. CWRU School of Med.) /Jeffrey D. Kocsis(Yale Univ. School of Med.) /Mark F.

Me-hler (Albert Einstein College of Med.) /Robert H. Miller (Case Western Reserve Univ.) /Charles D. Stiles (Harvard

Medical School) /伊 藤康 一(臨 床研)/小 野 勝 彦(生 理 研)/新 郷哲 郎(岡 山大 院 医 歯 学 総 合研)/鈴 木 諭(九 大 院 医)/ 竹 林 浩 秀(生 理 研)/仲 嶋 一 範(慶 応 大 医)/八 田 稔 久(島 根 医 大)/三 浦 正 幸(東 大 院 薬)

参 加 費 無 料(懇 親 会 参 加 費 は5,000円)

参 加 申 込 方 法 住 所 ・氏 名 ・所 属 ・Tel番 号,メ ー ル ア ド レ ス を 明 記 し,下 記 宛 にE-mailま た はFAXに て お 申 し 込 み 下 さ い. 参 加 申 込 締 切10月 末 日 主 催 者 小 野 勝 彦(生 理 研) LocalHost池 中 一 裕(生 理 研) 連 絡 先 岡 崎 国 立 共 同 研 究 機 構 生 理 学 研 究 所 窓 口:北 山 理 英(秘 書) Tel.0564-59-5249FAXO564-59-5247E-mail:[email protected] http: //www.nips.ac.jp/ninfo/sympo.html