報告
福井県沿岸で漁獲されたズワイガニとベニズワイの交雑雌
A natural hybrid female of Chionoecetes opilio and C. japonicus collected in the coastal water of
Fukui Prefecture
山本岳男
1・柳本 卓
2・児玉晃治
3Takeo Yamamoto, Takashi Yanagimoto and Koji Kodama
はじめに 日本海にはズワイガニとベニズワイが分布し，と もに重要な漁業対象種である．本海域では，両種の 中間的な外部形態を有することから両種の交雑と推 測された個体の報告が，古くからある（Nishimura & Mizusawa, 1969; 堀井・土井，1989; 富山県水産試 験 場・ 島 根 県 水 産 試 験 場・ 鳥 取 県 水 産 試 験 場， 1989; 原 田・ 大 谷，2006; 廣 瀬 ら，2003; Oh et al., 2011）．近年は遺伝学的な分析手法が発展したこと により，日本海で確かに両種が交雑していること が， 幼 生（本 多，2013） と 成 熟 個 体（Kim et al., 2012）で確認され，さらに交雑個体は全て母方種が ベニズワイで父方種がズワイガニであることが報告 されている（Kim et al., 2012）．しかし日本海にお いて，交雑が認められた成熟個体の報告は，韓国沿 岸からあるのみで（Kim et al., 2012）, 日本の沿岸か らは無い．我々は2018年2月3日に，福井県越前町 沖のベニズワイの籠漁において漁獲された，雌の交 雑とおもわれる個体（以下，便宜的に本交雑個体と 称する）を入手した（Fig. 1）．ここでは，本交雑個 体についてDNA分析と外部形態の調査を行ったの で，その特徴を報告する． 材料と方法 DNA分析 2018年2月4日に福井県沖の日本海（北緯36度 38.8分，東経135度38.1分）の水深約950 mにおい てベニズワイのカニ籠漁により漁獲された，ズワイ ガニとベニズワイの交雑と思われる雌個体を，生き た状態で受け取った．本交雑個体の母方種と父方種 を特定するため，サンプルとして歩脚の筋肉を約 100 mg採取して70％エタノールで固定した．DNA 抽出には，QuickGene（クラボウ）を用いた．得ら れたDNAをテンプレートとして，ユニバーサルプ ライマーを用いてPCR法によりmtDNAのCOI領域 と核DNAのITS1領域を増幅した．ユニバーサルプ ライマーには，COI領域用（Folmer et al., 1994）に L5956（5′-cacaaagacattggcaccct-3′） とH6558（5′-ct-cagaatgacatttgtcctga-3′） を，ITS1領 域 用（Sajdak & Phillips, 1997）にMD-1（5′-cttgactatctagaggagt-3′） と 5.8SH（5′-agcttgcgttcttcatcga-3′）を用いた．サーマ ルサイクラーとしてABI9700（Applied Biosystems） を用いた．PCR反応は94℃ 2分加熱後，94℃ 30秒， 1 （国研）水産研究・教育機構日本海区水産研究所小浜 庁舎 〒917–0117 福井県小浜市泊26
Obama Laboratory, Japan Sea National Fisheries Research Institute, Japan Fisheries Research and Education Agency, 26 Obama, Fukui 917–0117, Japan
E-mail: [email protected]
2 （国研）水産研究・教育機構中央水産研究所
〒236–8648 神奈川県横浜市金沢区福浦2–12–4 National Research Institute of Fisheries Science, Japan Fisheries Research and Education Agency, 2–12–4 Fukuu-ra, Kanazawa, Yokohama, Kanagawa 236–8648, Japan
3 福井県水産試験場
〒914–0843 福井県敦賀市浦底23–1
Fukui Prefectural Fisheries Experimental Station, 23–1 Urasoko, Tsuruga, Fukui 914–0843, Japan
55℃ 30秒，72℃ 2分を30サイクルし最後に72℃で 7分加熱して行った．PCR反応溶液はDNA溶液1 μl, 2.5 mMdNTP溶液2.5 μl, 10×Buffer（TaKaRa）2.5 μl, 50 μMの 各 プ ラ イ マ ー 0.5 μl, TaKaRa Ex Taq Poly-merase 0.125 U, 総量が25 μlになるように超純水を 加えた．1.5％アガロースゲル（NuSieve3 : 1, TaKa-Ra）で電気泳動し，エチジウムブロマイド染色に より，PCR産物の増幅を確認した．Quick PCR Puri-fication Kit（Qiagen）により増幅産物を精製した． 精製したCOI領域のPCR産物をテンプレートにし て， PCRで用いた同じプライマーによりBigDyeTer-minatorKitVer3.1（Applied Biosystems）を用いてシー ケ ン ス 反 応 を 行 っ た． 蛍 光 シ ー ケ ン サ ーABI PRISM 3730XL Genetic Analyzer（Applied Biosys-tems）により電気泳動することによって塩基配列を
決定した．精製したITS1領域のPCR産物を用いて，
TOPO TA Cloning kit（Invitrogen） を 用 い てTAク ローニングを行った．M13（5′-gtaaaac gacggccag-3′） とM13R（5′ -caggaaacagc tatagac-3′）のプライマー を用いて形質転換した大腸菌によりコロニーPCR を行った．PCRの反応条件等は上記と同様である． mtDNAと同様に，精製したPCR産物について塩基 配列を決定した．インターネット上の遺伝子相同性 検 索 ソ フ トBlast（Altschul et al., 1990）によって， 得られた塩基配列がズワイガニ属のどの種と近いか を調べた．また，得られた塩基配列とBlast分析で 相同性の高かったベニズワイ（AB193504）とズワ イ ガ ニ（AB193499）の塩基配列を用いてKimura two-parameter法（Kimura, 1980）で遺伝距離を算出 し，近接接合法（Neighbor Joining method, 以下NJ 法）（Saitou & Nei, 1987）で系統樹を作成した．系
統 樹 の 信 頼 性 を1000回のブートストラップ検定
（Felsenstein, 1985）で評価した．これらの解析には， MEGA 7.026（Kumar et al., 2016）を用いた．得られ た 塩 基 配 列 は， ア ク セ ッ シ ョ ン 番 号LC3779441 （COI領域）とLC377934からLC377943（ITS1領域） でDNAデータバンクに登録した． 形態調査 本 交 雑 個 体 の 甲 幅 と 甲 長 を デ ジ タ ル ノ ギ ス （CD67-S20PM, ミツトヨ）を用いて0.1 mmの精度 で 測 定 し た． 既 報（深 滝，1965; Kim et al., 2012） でズワイガニとベニズワイの識別形質とされてい る，甲羅側縁（甲幅の最大部付近）の左右の小棘
Fig. 1. Natural hybrid female of Chionoecetes opilio and C. japonicus. A) dorsal view; b) lateral view; c) egg clutch; d)
egg. Arrows indicate spine at side of lateral margin in carapace (A) and two lines of granules on lateral carapace (B)．
（Fig. 1A矢印）, 甲羅甲縁部の顆粒状突起列（Fig. 1B 矢印）を調べた．貯精嚢の内部組織を生物顕微鏡で 観察し，精子の有無を調査した．本交雑個体が外仔 卵を有していたことから（Fig. 1C）, 卵を10粒程度 採集してブアン液で固定し，実体顕微鏡で発生の有 無を調査した．外仔卵数を推定するため，全ての卵 を70℃で6時間熱した後，乾燥重量を計測した．乾 燥させた卵から約4～17 mgの6個のサブサンプル を取りだし，そこに含まれる卵数を実数計数した． そして両者の関係から，総卵数を外挿で推定した． 結 果 DNA分析 本交雑個体のCOI領域の塩基配列（LC3779441） は，すでに報告されているベニズワイガニと99％ 以上の最も高い相同性が認められた（Table 1A）． 交雑個体のITS1領域について，TAクローニングに よって塩基数が876から954の10のクローンが得ら れた（LC377934–377943）．これらの塩基配列と既 知 の ズ ワ イ ガ ニ（AB193499） と ベ ニ ズ ワ イ （AB193504）を用いて系統樹を作成したところ，二 つのクレード（LC377934, 377935, 377940, 377941と LC377936, 377937, 377938, 377939, 377942, 377943） に分かれた（Fig. 2）．そこで各クレードから一つず つ の ク ロ ー ン の 塩 基 配 列（LC377934, LC377937） に つ い てBlast分析を行ったところ，LC377934と LC377937は そ れ ぞ れ， 既 知 の ズ ワ イ ガ ニ （AB193499）およびベニズワイ（AB193504）の塩 基配列と99％の一致率で類似した（Table 1B, C）． こ れ ら の 結 果，LC377936, 377937, 377938, 377939, 377942, 377943の ク レ ー ド は ズ ワ イ ガ ニ， LC377934, 377935, 377940, 377941のクレードはベニ ズワイのクラスターであると考えられた（Fig. 2）． 形態調査 本交雑個体は甲幅が96.6 mm, 甲長が92.4 mmで あった．ベニズワイの明瞭な特徴である甲羅側縁の
Table 1. The results of blast analysis for sequences of Chionoecetes crab collected at the Sea of Japan．
A) COI (LC3779441)
Order DNA Acc. No. Species name Japanese name Identities Identities (％)
1 HQ909099 Chionoecetes japonicus ベニズワイ 658/658 100
2 AB211160 Chionoecetes japonicus ベニズワイ 652/654 99
3 AB211161 Chionoecetes japonicus ベニズワイ 651/654 99
4 HQ322675 Chionoecetes japonicus ベニズワイ 635/639 99
5 DQ882045 Chionoecetes angulatus トゲズワイガニ 615/615 100
B) ITS1 (LC377934)
Order DNA Acc. No. Species name Japanese name Identities Identities (％)
1 AB193504 Chionoecetes japonicus ベニズワイ 875/877 99
2 AB193506 Chionoecetes japonicus ベニズワイ 873/877 99
3 AB193505 Chionoecetes japonicus ベニズワイ 873/877 99
4 HQ909101 Chionoecetes japonicus ベニズワイ 867/870 99
5 AB546598 Chionoecetes tanneri ミゾズワイガニ 698/708 99
C) ITS1 (LC377937)
Order DNA Acc. No. Species name Japanese name Identities Identities (％)
1 AB193499 Chionoecetes opilio ズワイガニ 950/954 99
2 HQ909100 Chionoecetes opilio ズワイガニ 945/947 99
3 AB193500 Chionoecetes opilio ズワイガニ 949/954 99
4 AB193501 Chionoecetes bairdi オオズワイガニ 919/956 96
棘は存在するが不明瞭であった（Fig. 1A, B）．甲羅 後縁辺部の二本の顆粒状突起列は，後縁から徐々に 近づき第二歩脚と第三歩脚の付近で近接するが交わ らなかった（Fig. 1B）．外仔卵数は62,100個と推定 された．卵には明瞭な胚体形成が観察されず，未受 精卵であった（Fig. 1D）．貯精嚢内に精包および精 子は無かった． 考 察 本交雑個体のmtDNAのCOI領域の塩基配列は， ベニズワイと高い相同性を示したことから，母方種 がベニズワイと推定された．さらに本交雑個体の核 DNAのITS1領域の塩基配列の分析結果から，本個 体はベニズワイとズワイガニの交雑個体で，父親種 はズワイガニと考えられた．ズワイガニとベニズワ イの交雑個体の母方種と父方種を特定したのは，韓 国沿岸におけるKim et al. (2012)に次いで2例目で， 日本の沿岸では初めてである．若狭湾沖において， ズワイガニは水深約200～600 mに，ベニズワイは 水深約500 m以深に分布し（廣瀬ら，2003）, 水深約 500～600 mには両種の雌雄がともに出現する（廣 瀬ら，2003）．従って，交雑は両方向に起こる可能 性があるが，Kim et al. (2012)が調べた42個体およ び本研究の1個体は全て母方種がベニズワイ，父方 種がズワイガニであった．交雑が一方向に限定され る原因を動物行動学の観点から調べたWirtz (1999) は，その主な要因は，一般に雌は周囲に同種の雄が 存在する場合は異種の雄を拒絶するが，同種の雄が 存在しない場合はやむなく他種の雄を受け入れる， すなわち雄が不足している種の雌ほど他種と交配し やすいためと推察している．日本海のベニズワイ漁 業は大型雄を選択的に漁獲しており，漁場における 雄の割合は，大和堆の27％を除いて約9～16％と大 きく雌に偏り，雌の交配相手が不足する精子制限の 可能性が示唆されている（養松，2009）．一方，ズ ワイガニ資源における雄の割合は35～37％で，ベ ニズワイに比べて高い（山崎，1996, 2000）．従っ て，雄ベニズワイの少なさが雌ベニズワイの交配相 手の不足を招き，ベニズワイを母方種とする交雑個 体が生じやすくなっているのかもしれない．一方 で， 魚 類（伊 藤 ら，2006） や 貝 類（Zhang et al., 2012; Xu et al., 2014）で知られているように，異種 を人工授精しても発生が一方向でしか起こらない現 象が，ズワイガニとベニズワイの交配でも起こって いる可能性がある． 本交雑個体の外部形態は，前述した日本海のKim et al. (2012)および他海域で採集されアイソザイム 分析により交雑と確認された個体（鳥澤・三橋， 1989; 石田・川田，2003）の，甲羅後縁辺部の二本 の顆粒状突起列は交わらず，甲羅側縁の棘は存在す るがやや不明瞭である特徴と一致した．またこの特 徴は，これまで外部形態から交雑と推定されていた 個 体（Nishimura & Mizusawa, 1969; 堀 井・ 土 井， 1989）とも一致した． 本 交 雑 個 体 の 甲 幅 は96.6 mmで， 外 仔 卵 数 は 62,100個であった．これまでの報告では，成熟した 雌のズワイガニとベニズワイの甲幅は，ともに約 90 mmが最大である（伊藤，1970, 1976; 今，1974; 今・安達，2006）．したがって，本交雑個体の甲幅 は，両種と比較すると大きい部類に含まれる．外部 形態から交雑と推定された個体の外仔卵数について は，これまで堀井（1982）と原田・大谷（2006）に よる記述がある．堀井（1982）は，交雑個体の甲幅 は71～98 mmで 外 仔 卵 数 は0～107,100個（ほ と ん どは6万個以下）としているが，甲幅と外仔卵数の
Fig. 2. Neighbor-joining tree of the sequences
of ITS1 region constructed using Kimura two parameter distances for our sample (LC377934–377943), Chionoecetes opilio (AB193499), and C. japonicus (AB193504). The numbers on the nodes indicate boot strap probabilities (1000 replications). Bootstrap values ＞70％ are shown on branch nodes. Scale bar: Kimura’s two-parameter distance．
関係は示していない．原田・大谷（2006）は外部形 態から交雑個体を識別し，交雑個体の外仔卵数はズ ワイガニに比べて少ないと報告しているが，具体的 な数値を示していない．ズワイガニの甲幅（x）と 抱卵数（y）の関係は今・安達（2006）が報告して おり，それは初産個体でy＝3063.4x－170904, 経産 個体でy＝4498.4x－248393と表わされている（今・ 安 達，2006）． こ れ ら の 式 に 本 交 雑 個 体 の 甲 幅 96.6 mmを代入すると，初産個体で約125,000個， 経産個体で186,000個と推定され，本交雑個体の外 仔卵数（62,100個）は同サイズのズワイガニの約30 ～50％と推定され，原田・大谷（2006）の指摘と一 致する結果となった．またベニズワイでは，伊藤 （1976）が甲幅80 mm以上での抱卵数は，8～11万 個としており，本交雑個体の外仔卵数は同サイズの ベニズワイの約50～80％と推定され，本交雑個体 の外仔卵数はベニズワイと比較しても少ないと考え られた． 本交雑個体は貯性嚢の内部に精子が存在せず，外 仔卵も未受精であった．交雑個体が産卵前から精子 を持っていなかったか，持っていたが産卵で全て 使ったうえで卵を受精させられなかったのかは不明 である．過去に日本海においては，ズワイガニとベ ニズワイガニの交雑個体のF2や，受精した外仔卵 を有する雌は報告されていない．一方で，東北太平 洋岸においては，アイソザイム分析でズワイガニと ベニズワイガニの交雑と確認された雌において，発 眼した外仔卵を持つ個体が存在することが報告され ている（石田・川田，2003）．日本海においてもよ り多くの交雑個体を調査することで，太平洋岸のよ うに戻し交配が発見される可能性がある． 謝 辞 本交雑個体を漁獲し提供していただいた，越前町 漁協所属大喜丸の船長および乗組員にお礼申し上げ る． 文 献
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