作 製 と 評 価
曵 地 七 星 、 嶋 﨑 洋 子 、 石 川 容 子 、 鈴 木 祥 子 、 蒲 生 恒 一 郎 、 中 溝 万 里 、 中 村 成 幸 、 大 石 弘 司
（ 受 付 ： 平 成 27 年 7 月 30 日 、 受 理 ： 平 成 27 年 11 月 13 日 ）
〔TECHNICAL REPORT〕
Production and Evaluation of Reference Antigen and Reference Serum for Potency
Test of Egg Drop Syndrome-1976 Inactivated Vaccine.
Nanase HIKICHI, Yohko SHIMAZAKI, Yohko ISHIKAWA , Shoko SUZUKI, Koichiro GAMOH, Mari NAKAMIZO, Shigeyuki NAKAMURA and Koji OISHI
National Veterinary Assay Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, 1-15-1 Tokura, Kokubunji-Shi, Tokyo,185-8511 Japan
(Received: 30th July 2015, Accepted: 13th November 2015) Abstract
The potency test of egg drop syndrome-1976 (EDS-1976) inactivated vaccine is performed by the haemagglutination (HA) test. We prepared the candidate reference antigen and candidate reference positive sera used for the HA test, checked inactivation of the antigen and evaluated the HA titer of the antigen and the antibody titer of the positive sera based upon the biological products standard. As a result of the examination, the HA titer of the antigen was 640, and antibody titer of candidates of two kinds of reference positive sera were 256 and 64, respectively. Based on these results, we judged these candidates to be suitable as new references for EDS-1976 haemagglutinin production.
要 旨 産 卵 低 下 症 候 群 －1976 を対象と する不活化 ワクチンの 国家検定に おける力価 試験は、赤 血球 凝 集 抑 制 試 験 に よ り 行 わ れ て い る 。 現 在 、 当 所 で は 動 物 用 の 生 物 学 的 製 剤 標 準 品 の 確 保 に 取 り 組 ん で お り 、そ の 一 環 と し て 当 該 試 験 に 用 い る 赤 血 球 凝 集（HA）抗原及び参 照陽性血清 を新た に 作 製 し 、 動 物 用 生 物 学 的 製 剤 基 準 に 準 拠 し て 、 抗 原 の 不 活 化 を 確 認 し 、 抗 原 価 、 及 び 参 照 陽 性 血 清 の 抗 体 価 に つ い て 評 定 を 行 っ た 。そ の 結 果 、HA 抗原候補品 の抗原価 は 640 倍、2 種類の 参 照 陽 性 血 清 候 補 品 の 抗 体 価 は そ れ ぞ れ 256 倍及び 64 倍であり、 産卵低下症 候群－1976 を対 象 と す る 不 活 化 ワ ク チ ン の 力 価 試 験 を 行 う 上 で 妥 当 で あ る と 判 断 し た 。 緒 言
産 卵 低 下 症 候 群 －1976（egg drop syndrome-1976。以下 「EDS」と いう。）は 、産卵鶏に おけ る 産 卵 低 下 及 び 卵 殻 異 常 卵 の 産 卵 を 主 徴 と す る 感 染 症 で あ り 、 ア デ ノ ウ イ ル ス 科 に 属 す る 産 卵
低 下 症 候 群 －1976 ウイルス（以 下「EDSV」という。 ）によって 引き起こさ れる。本病 の予防 に は 不 活 化 ワ ク チ ン が 用 い ら れ て お り 、 単 味 の ワ ク チ ン の ほ か に 、 ニ ュ ー カ ッ ス ル 病 や 鶏 伝 染 性 気 管 支 炎 と 混 合 さ れ た ワ ク チ ン が 承 認 さ れ て い る 。 動 物 用 生 物 学 的 製 剤 基 準（ 農 林 水 産 省 2002。以下「動生剤基準」という。）に収載され てい る EDS を 対象とする 単味又は混 合不活化ワ クチン（以 下「EDS 不 活化ワクチ ン」という 。）の 有 効 性 を 確 認 す る た め の 力 価 試 験 は 、 ワ ク チ ン を 注 射 し た 鶏 の 血 清 を 用 い た 赤 血 球 凝 集 抑 制 試 験（ 以 下「HI 試験」という。）により行わ れており、この試験に 用いる赤血 球凝集抗原（以下 「HA 抗 原 」という。 ）について は、動生剤 基準におい てその規格 が設定され ている。 現 在 、 動 物 医 薬 品 検 査 所 で は 、 動 物 用 生 物 学 的 製 剤 等 の 品 質 管 理 等 を 適 切 に 行 う た め 、 業 務 プ ロ ジ ェ ク ト と し て 、 動 物 用 生 物 学 的 製 剤 の 品 質 管 理 の た め の 標 準 品 （ 参 照 微 生 物 株 、 標 準 製 剤 、 参 照 血 清 等 ） の 確 保 に 取 り 組 ん で い る 。 ま た 、 平 成 20 年 10 月に導入さ れたワクチ ンのシ ー ド ロ ッ ト シ ス テ ム は 、ワ ク チ ン 製 造 用 株 及 び 製 造 用 細 胞 株 に つ い て 規 格 を 設 定 し 、GMP に基 づ く 製 造 及 び 品 質 管 理 を 行 う こ と で 品 質 の 向 上 及 び 安 定 化 を 図 る も の で あ り 、 こ れ ら に よ り 、 品 質 管 理 試 験 に お い て 、 一 定 の 品 質 の 標 準 品 を 用 い る 必 要 性 が 高 ま っ て い る と こ ろ で あ る 。 HI 試 験 を力価試験 として規定 している EDS ワク チ ンは 7 所 社 19 品目（平成 27 年 7 月 30 日 時 点 ） 存 在 し 、 本 試 験 に 必 須 で あ る HA 抗原 は、ワクチ ンの品質確 保において 重要な役割 を担 っ て い る 。 そ の た め 、 一 定 の 標 準 品 を 用 い る こ と に よ っ て 品 質 確 保 に 寄 与 す る こ と を 目 的 と し て 、 今 般 、 参 照 陽 性 血 清 と 共 に 標 準 品 作 製 の 検 討 を 行 っ た 。 ま た 、 作 製 し た そ れ ら の 候 補 品 に つ い て 、 標 準 品 と し て 適 当 な 品 質 を 備 え て い る か ど う か の 評 定 試 験 を 行 い 、 良 好 な 成 績 が 得 ら れ た の で 、 そ の 結 果 を 報 告 す る 。 材 料 及 び 方 法
１ 鶏 胚 肝 初 代 （ 以 下 「CEL」 と い う 。 ） 細胞 の 作 製 及び EDSV JPA-1 株 培 養 の 検 討
EDS 不活 化 ワクチン力 価試験に供 する HA 抗 原は、動生 剤基準にお いては「産 卵低下症候 群 -1976 ウイ ルス JPA-1 株又は同 等と認めら れた株を生 ワクチン製 造用材料の 規格 1.3 の 発育あ ひ る 卵 で 増 殖 さ せ て 得 た 尿 膜 腔 液 又 は 生 ワ ク チ ン 製 造 用 材 料 の 規 格 2.1.3 の 鶏胚肝初代 細胞で 増 殖 さ せ て 得 た 培 養 上 清 に 0.2vol ％になる ようにホル マリンを加 えて不活化 したもの。」と規 定 さ れ て い る 。 そ こ で 今 回 、EDS 不活化ワク チン力価試 験用 HA 抗 原候補品を 作製するた め、 次 の 方 法 で CEL 細 胞の作製及 び EDSV JPA-1 株の 培 養を行った 。
（ １ ）18～ 20 日 齢 SPF 発 育 鶏 卵 由 来 鶏 胚 か ら 肝 臓 を 摘 出 し 、細 切 後 、0.1vol%PSK(ペ ニ シ リ ン ・ ス ト レ プ ト マ イ シ ン ・ カ ナ マ イ シ ン )を 添 加 し た リ ン 酸 緩 衝 食 塩 液 （ 以 下 「 PBS」 と い う 。 ） で 洗 浄 す る 。 （ ２ ） 肝 臓 を 0.2vol%ト リ プ シ ン 溶 液 に よ り 37℃ 、 5 分 間 撹 拌 処 理 し 、 静 置 し た 後 、 上 清 を 吸 引 除 去 す る 。 （ ３ ） （ ２ ） の 肝 臓 消 化 物 を 0.2vol%ト リ プ シ ン 溶 液 に よ り 、 37℃ 、 3～ 8 分 間 撹 拌 処 理 し 、 上 清 を 牛 胎 子 血 清 （ 以 下 「 FBS」 と い う 。 ） 入 り 滅 菌 瓶 に 移 し て 4℃ で 保 存 す る 。 こ の 作 業 を 3 ～ 4 回 繰 り 返 す 。 （ ４ ） （ ３ ） で 得 ら れ た 上 清 を ナ イ ロ ン メ ッ シ ュ で ろ 過 し 、 800rpm、 3 分 間 遠 心 す る 。 （ ５ ）沈 殿 物 を 細 胞 増 殖 用 培 養 液（ 0.1%PSK 及び 7vol% FBS 添 加 MEMα培 地）に浮遊 させ、1 ×106個 /mｌ に 調 整 後 、コ ラ ー ゲ ン コ ー ト 処 理 し た 6 穴 プ レ ー ト に 4ml/穴 ず つ 分 注 し 、37℃ 、
5vol％炭酸 ガス下で培 養する。
（ ６ ）翌 日 、培 養 液 を 吸 引 除 去 後 、PSK 添 加 PBS で 細 胞 を 洗 浄 し 、細 胞 維 持 用 培 養 液（ 0.1%PSK 及 び 1vol% FBS 添 加 MEMα培 地）を加え た後、コン フルエント になるま で 4 日間培 養する。 （ ７ ） コ ン フ ル エ ン ト と な っ た CEL 細 胞 に 0.1ml 当 た り 103.0TCID50に 調 整 し た EDSV JPA-1 株
を 0.2ml/穴 ずつ接種し 、37℃で 90 分間感作 後、細胞維 持用培養液 を添加し て 37℃、5vol％炭 酸 ガ ス 下 で 培 養 す る 。 （ ８ ） 経 時 的 に 培 養 上 清 を 採 取 し 、 抗 原 価 を 測 定 す る 。 ２ EDS 不 活 化 ワ クチ ン 力 価 試験 用 HA 抗 原 候 補 品 の作 製 HA 抗原 候補品の作 製において は、上述の 培養条件を 基本として 、15～16 日齢 SPF 発育鶏卵 由 来 鶏 胚 か ら CEL 細 胞 を 作 製 し 、 5×105個 /mｌ ～ 1×106個 /mｌ の CEL 細 胞 を コ ラ ー ゲ ン 処 理 培
養 容 器 で 培 養 後 、EDSV JPA-1 株 をコンフル エントとな った CEL 細胞に接種 し、培養後 、HA 試 験 に よ り 抗 原 価 1024 倍以上とな ったことを 確認して培 養上清を採 取した。培 養上清を 3000rpm で 10 分間 遠心分離し て得られた 上清に、0.2vol%とな るようホル マリンを添 加後、4℃ で 26 日 間 以 上 不 活 化 処 理 し た 。 動 生 剤 基 準 の 「 産 卵 低 下 症 候 群 －1976（ア ジュバント 加）不活化 ワク チ ン 」 等 に 準 じ て 培 養 細 胞 を 用 い る 場 合 の 不 活 化 試 験 を 実 施 し 、 不 活 化 が 確 認 さ れ た 培 養 上 清 に つ い て 5w/v％とな るように乳 糖を添加し て混合後、ガラスバイ アルに 1ml ずつ分注し 、凍結 乾 燥 を 行 い 、EDS 不活 化ワクチン 力価試験 用 HA 抗 原 候補品とし た。 ３ 参 照 陽 性 血 清 候 補 品 の 作 製
参 照 陽 性 血 清 候 補 品 の 作 製 に は 、CEL 細胞 で培養し た EDSV JPA-1 株上 清をホルマ リンによ っ て 不 活 化 し た も の と 、 オ イ ル ア ジ ュ バ ン ト （Montanide ISA71VG;SEPPIC 社 ）を 3：7 となる よ う に 混 合 し 、乳 化 し た も の を 免 疫 抗 原 と し て 用 い た 。免 疫 抗 原 を 5 週齢 の SPF 鶏（ 白色レグ ホ ン 種 ） の 脚 部 筋 肉 内 に 注 射 し 、3～4 週後 に採血して 得られた血 清を参照陽 性血清原液 とし、 HI 抗体価 を測定した 。原液は EDS 抗体陰 性血清（非 免疫 SPF 鶏群から採 取した血清 ）を用い て 、HI 抗 体価 512 倍及び 64 倍に調整後、 保存剤とし てアジ化ナ トリウム を 0.01vol%となるよ う 添 加 し 、ガ ラ ス バ イ ア ル に 1ml ずつ分注後 、凍結乾燥 し、参照陽 性血清候補 品 PS-H 及 び PS-L と し た 。 ４ EDS 不 活 化 ワ クチ ン 力 価 試験 用 HA 抗 原 候 補 品 の評 定 HA 抗 原 候補品の抗 原価及び参 照陽性血清 候補品の抗 体価の評定 は、「産卵 低下症候群 －1976 （ ア ジ ュ バ ン ト 加 ）不 活 化 ワ ク チ ン 」等 動 生 剤 基 準 に お け る EDS 不活化ワク チンの力価 試験法 に 準 拠 し て 行 っ た 。 （ １ ） HA 試験 （ EDS 不活化 ワクチン力 価試験用 HA 抗原 候補 品） HA 抗原 1 バイアル を PBS 0.5ml で 溶解 したものを 試験に用い た。96 穴 プレート（ Ｕ字）を 用 い て 、PBS で 2 倍 階段希釈し た各抗原希 釈列 25μl に、PBS 25μl を加え た後、0.5vol%鶏赤 血 球 浮 遊 液 50μl を 加え、振と う混合し、室温に 1 時 間静置した 後に判定し た。HA 反 応の判定 は 、穴 全 体 に 一 様 な 赤 血 球 凝 集 が 認 め ら れ る 完 全 凝 集 を HA 陽 性 とし（ Figure 1）、完 全凝集を 示 し た 最 高 希 釈 倍 数 を 抗 原 価 1 単 位とした。 （ ２ ） HI 試験 （ 参照陽性血 清候補品）
2 種類の 参照陽性血 清候補品 PS-H 及び PS-L をそれ ぞれ PBS 1mL で 溶解 したものを 試験に用 い た 。各 血 清 1 容に 25w/v％カオ リン液 3 容 を混合し、室温で 20 分間処理後 、遠心して 得られ た 上 清 を 4 倍希釈血清 とした。カ オリン処理 した血清を プレート上 で更に PBS で 2 倍階 段希釈 し 、 各 血 清 希 釈 列 の 25μl に、HA 抗原 候補 品から 25μl 中 4 単 位に調整し た抗原液 を 25μl ず つ 加 え て 振 と う 混 合 し た 。30 分 間 室 温 で 静 置 し た 後 、 0.5vol%鶏 赤 血 球 浮 遊 液 を 各 穴 に 50μ l ず つ 加 え て 振 と う 混 合 し 、 室 温 で 60 分間 静置後、判 定した。 HI 反 応 の判定は、プレートを 傾けて行っ た。穴の底 の血球の流 れ（垂れ）の形状が血 清対照 （ 血 清 25μl と PBS 25μl を混 合後、鶏赤 血球浮遊 液 50μl を 加えたもの ）のそれと 同じものを 完 全 凝 集 抑 制 と し 、 完 全 凝 集 抑 制 を 示 し た 血 清 の 最 高 希 釈 倍 数 を HI 抗体 価と した（ Figure 2)。 結 果 １ CEL 細 胞 の 作 製及 び EDSV JPA-1 株 培 養 の 検 討
CEL 細胞 は培養翌日 に培地交換 し、不要な 細胞等を除 去すること によって、培養 5 日目 でコ ン フ ル エ ン ト な 状 態 と な っ た（Figure 3）。EDS JPA-1 株接種後経 時的に培養 上清を採取 し、抗 原 価 を 測 定 し た と こ ろ 、培 養 上 清 中 の 抗 原 価 は 、接 種 3 日目から上 昇し、7 日 目以降は 512～1024 倍 を 示 し た （Table 1） 。 ２ HA 試 験 （ EDS 不 活 化 ワ クチ ン 力 価 試験 用 HA 抗 原 候 補 品 ） 評 定 試 験 の 結 果 、 凍 結 乾 燥 後 無 作 為 に 抽 出 し た ２ 本 の HA 抗原 候補品の抗 原価は、い ずれも 640 倍であ った。また 、再現性を 確認するた め、複数の 試験実施者 で試験を実 施したとこ ろ、 一 致 し た 結 果 が 得 ら れ た （Table 2）。 ３ HI 試 験 （ 参 照 陽性 血 清 候 補品 ） 評 定 試 験 の 結 果 、 ２ 種 類 の 参 照 陽 性 血 清 候 補 品 の HI 抗体価は、 PS-H が 256 倍、 PS-L が 64 倍 で あ っ た 。 ま た 、 再 現 性 を 確 認 す る た め 、 複 数 の 試 験 実 施 者 で 試 験 を 実 施 し た と こ ろ 、 そ れ ぞ れ 一 致 し た 結 果 が 得 ら れ た （Table 3）。 考 察
作 製 し た CEL 細胞 に おいて、EDSV JPA-1 株の HA 抗 原は、接種 後 3 日目以 降から検出 され、 約 7 日目か ら 512 倍又 は 1024 倍 以上の抗原 価を示した 。本試験に よって EDSV JPA-1 株 が CEL 細 胞 で 良 好 に 増 殖 す る こ と が 示 さ れ た 。 今 回 、 新 た に 作 製 さ れ た EDS 不 活化ワクチ ン力価試験 用 HA 抗 原 候補品にお いては、1 バイ ア ル を PBS 0.5ml に溶 解した場合 、640 倍の 抗原価であ ることが確 認され、2 名の試験実 施者間 で も 一 致 し た 抗 原 価 が 得 ら れ た 。EDS 不活化 ワクチンの 動生剤基準 における小 分製品の力 価試 験 で は 、4 単位に調整 した HA 抗 原を用いる ことから、 本 HA 抗 原 候補品は力 価試験に供 する に 当 た り 、 均 一 か つ 十 分 な 抗 原 価 を 有 す る と 考 え ら れ た 。 2 種類の参 照陽性血清 候補品 PS-H 及び PS-L は、1 バ イアルを PBS 1mｌ に 溶解した場 合に、 そ れ ぞ れ 256 倍及び 64 倍の HI 抗体価を示 した。また 、２名の試 験実施者間 で測定し た HI 抗 体 価 は 一 致 し 、 再 現 性 が 認 め ら れ た こ と か ら 、 今 回 作 製 し た 参 照 陽 性 血 清 候 補 品 は 試 験 ご と の 変 動 を 評 価 す る 上 で も 有 用 で と 考 え ら れ た 。 144
Table 2. Results of potency test of candidates for the reference HA antigen.
1 A 640
B 640
2 A 640
B 640
Experimenter
Antigen Potency (HA titer)
以 上 に よ り 、 今 回 作 製 し た HA 抗 原及び参照 陽性血清は 、力価試験 を行う上で 十分な品質 を 有 し て お り 、 ま た 各 製 造 所 社 に お い て 製 造 さ れ る HA 抗 原を更新す る際に、客 観的に評価 する た め の 指 標 と し て も 有 用 で あ る と 考 え ら れ る こ と か ら 、 標 準 品 と し て 妥 当 と 判 断 さ れ た 。 引 用 文 献 農 林 水 産 省 （2002）動 物用生物学 的製剤基準 ．平成 14 年 10 月３ 日農林水産 省告示第 1567 号 145
Table 1. Potency (HA titer) of EDSV JPA-1strain after inoculation to CEL cells.
1 2 3 4 7 8 9
Potency (HA titer) ＜１ ＜１ 8 32 ≧1024 512 ≧1024
days after virus inoculation.
146
Table 2. Results of potency test of candidates for the reference HA antigen.
1 A 640
B 640
2 A 640
B 640
Experimenter
Antigen Potency (HA titer)
147
Table 3. Results of potency test of candidates for the reference positive sera.
PS-L PS-H A 64 256 B 64 256 A 64 256 B 64 256 HI titer of candidates HA antigen Experimenter 2 1 141
