ギ一理エ学研究所内 Kyoto (JP) 渡逼誠也 (WATAN- ABE, Seiya) [JP 几 P]; 京都府宇治市五ケ庄国立大学法人京都大学ェネルギー理エ学研究所内 Kyoto (JP). NZ, の _M, PG, PH, PL, PT, Rの _, RS, RU,

(12) ft 許 協力条約に基づ いて公開された国際出願 (19) 世 界知的所有 権機関 国際事 務局 (43) 国際公開日 2009 年7 月30 日(30.07.2009) (51) 国際特許分類 AND TECHNOLOGY)[JP/JP]; 〒1008921東京都千代 C12N 1/19(2006.01) C12P 7/06(2006.01) 田 区霞が関一丁目3番 1 号 Tokyo (JP). C12N15/09(2006.01) (72) 発明者 および (21) 国際出願番号 PCT/JP2009/050929 (75) 発明者

/

願人(米国についてのみ): 松鹿昭 I (MAT-SUSHIKA,Akinori)[JP/JP]; 〒7370197 広島県呉市広 (22) 国際出願日 2009 年 1月22 日(22.01.2009) 末広2 T 目 2 番 2号 独立行政法人産業技 術総 合 研究所 中国セン ター内Hiroshima (JP)_・澤山茂樹 (25) 国際出願の言 語 日木 語 _{(SAWAYAMA,Shigeki)[JP/JP]; 〒7370197広島県呉市} (26) 国際公開の言 語 日木 語 広末広2 T 目2番2号 独立行政法人産業技 術総 合 研究所 中国セン ター内 Hiroshima(JP)_・井上 宏 (IN-(30) 優 先 権子一タ OUE,Hiroyuki)[JP/JP]; 〒7370197広島県呉市広末広 特願2008-014080 2008 年1月24日(24.01.2008) JP 2 T 目2 番2 号 独立行政法人産業技 術総 合研究所 特願2008-211274 2008 年8月20_日(20.08.2008) JP 中国セン ター内Hiroshima (JP)・牧野圭祐(MAKINO, Keisuke)[JP/JP]; 〒6 110011京都府宇 治市 五ケ庄国立 (71) 出 願人 米国を 除 全て の指定国 につ いて) : 独 大学法人 京都大学エ ネルギー理 エ学研究所内Kyoto 立行政法人産業技 術総 合研究所 (NATIONALIN¬ (JP). 小 瀧 (KODAKI, Tsutomu)[JP/JP]; 〒6 110011 STITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE 京都府宇 治市 五ケ庄国立大学法人 京都大学エ ネル

続 葉有

(54) Title: HEXOSE-PENTOSE COFERMENTING YEAST HAVING EXCELLENT XYLOSE FERMENTAB ILITY AND METHOD OF HIGHLY EFFICIENTLY PRODUCING ETHANOL USING THE SAME

(54) 発明の名称:キシロース発酵 能が優れた六炭糖 ・五炭糖同時発 酵 酵母およびそれを用いたエ タノー ルの高効率

生産 方 法

(57) Abstract: Provided is a genetically modified yeast which expresses xylose reductase (XR), (wild or mutant) xylitol dehydrogenase (XDH) and xylulokinase (XK). Also provided is a method of highly efficiently producing ethanol from xylose by using the above yeast. A genetically modified yeast which carries genes of Pichia stipitis-o g XR and (wild or modified) XDH and Saccharomyces cerevisiae-o g n XK having been transferred thereinto via chromosomal integration, has a high xylose fermentation speed, enables the production of ethanol from xylose at a high efficiency and shows a high xylose fermentability in the presence of glucose; a method of producing ethanol at a high efficiency from a saccharified solution originating in a xylose- and lignocellulose-based biomass by using the above yeast; and a method of improving the xylose fermentability of the genetically modified yeast as described above by an a㏄limatization treatment.

(57) 要 約 : キシロースレダク ターゼ (XR) 、 (野 生型または変異型) キシ リトー ル デヒ ドロゲナーゼ (XDH) 、キシルロキ ナーゼ (XK) を発 現する遺伝 子組換え酵母および それを用いたキシロースからエ タ ノー ル を高効率に生産する方法の提 供。 Pichia stipitis 由来のXRおよび (野生型または改変型) XDH、な らび にSaccharomyces cerevisiae 由来のXKの各遺伝子を染 色体 組込みによ り導入した、キシロース発酵速 度が速 、 キシロースからエ タノー ル を高収率に生産でき_、かつ グ ルコースの存在 下 で キシロース発酵 能が高 い遺伝_子 組換え酵母、な らびにそれを用いたキシロースおよび リグノセルロース系バイオ マス由来の糖化液からエ タ ノー ル を高効率に生産する 方法。さらに本発明の遺伝 子組換え酵母 を順化処理によ りキシロース発酵 能を向上させる方法。

ギ一理エ学研究所内Kyoto (JP)_・渡逼 誠也 (WATAN- NZ, の_M, PG, PH, PL, PT,Rの_,RS,RU, SC, SD, SE, SG, ABE, Seiya)[JP几P]; 〒6 110011京都府宇 治市 五ケ庄 SK, SL, SM, ST, SV, SY, TJ,TM, TN, TR, TT, TZ, UA, 国立大 学法人 京都大 学_ェネルギー 理 エ学研究所内 UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.

Kyoto (JP).

(84) 指定国(表示のない限り、全ての種類の広域保護が可 能 ): ARIPO (BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA, SD, (74) 理人_:平木祐輔 ，外(HIRAKI,Yusuke_{et ai.); 〒}

SL,SZ,TZ, UG, ZM, ZW), -XーラシT (AM, AZ, BY, 1050001東京都 港 区虎ノ門 4丁目3番2 0号 神谷町

KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ヨ i (AT,BE, BG, M T ピ_{ル 1 9 階 Tokyo(JP).} ーロツ

CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS,IT,LT, LU, LV,MC, MK, MT, NL, Nの, PL, PT, RO, (81) 指定国(表示のない限り、全ての種類の国内保護が SE, SI,SK,TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN,

可能)・.AE,AG,AL,AM,AO, AT,AU,AZ,BA,BB, BG, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).

BH, BR,BW,BY, BZ, CA, CH, CN,Cの,CR,CU, CZ, DE,

DK,DM,Dの_,DZ, EC, EE, EG,ES, FI, GB, GD, GE, GH, 添付 公開書 GM, GT,HN, HR,HU, ID,IL,IN, IS, KE, KG, KM,KN,

KP,KR, KZ,LA, LC, LK, LR, LS, LT,LU,LY,MA,MD, 電子形式によ り別個に公開された明細書の配列表部 ME,MG, MK,MN, MW,MX, MY, MZ,NA,NG, NI,Nの, 分、請 求に基づき国際事務局から入手可能

明

細

苫

キ

シ

ロ

ー

ス

発

酵

能

が

優

れ

た

六炭

糊

_ト

_五

_炭

_{糖 同}

_時

_発

_酵酵

_母

_お

_よ

_び

_そ

_れ

_を用

い

た

エ

タノ

ー

_ル

の高効 率生産方法

技

術分野

０００1 本発明は、キ_シロース発酵速 度が速く_、

_かつ

_{キシロース}

_か

_ら

_ェ

_{タノールを高収率生} 産

す

ることに加え、グ_ルコースの存在 下でもキ_シロースが発酵 できる遺伝子組換え酵 母

_ぉ

_ょびそ

_れ

を用

_い

たキ_シロース

や

キ_シロースを含

_む

糖化液

_か

ら

_ェ

タノー_ルを高効 率生産

す

る方法に関

す

るものである。

背

景

技

術

０００2 近年、バイオ

_ェ

タノ_{ールは地球 温 暖化 対}策

や

化石資源代替のために諸 外回で需 要が急増して

_い

る。バイオ

_ェ

タノ_{ール生産 の主役 は高}

_い

発酵効率をも

_つ

酵母( a c cha om ces Ce

ev s ae)

であるが、197０年代に

ェ

タノール生産菌 であるZ m o m onas mob

sに関

す

る研究が盛んに行 わ

れ

、198０年代後半

か

ら_{は遺伝子組}換え大腸 菌(Esc_he ch a Co )にょる

ェ

タノール生産が報告さ

れ

た。高濃度の

ェ

タノール生産菌として知ら

れ

て

_い

る _・c e

_{ev s aeや}

Z_・mob sは、五炭糖 であるキ_シロースやアラビノースを利用

す

ること_ができな

_い

_。こ

_れ

_{に対し、E} ・c o はここに示した全ての糖類 を利用できるが 、 菌体当たり_{の生産性 は} ・c e ev s ae

や

Z・mob sょりも低

い

。木質系バイオマス

か

らの 効果的な

_ェ

タノー_ル生産技術の確立のために、五炭糖

_か

ら効果的に

_ェ

タノー_ルを生 産

す

る微生物の開発 は重要な研究課題である。特に、木質系バイ_オマスの糖化液に 多呈に含 ま

_れ

るキ_シロースを高効率に

_ェ

タノー_ルヘ変換

す

る微生物の開発が望ま

_れ

て

_い

る。酵_母へのキ_シロース発酵性 の付 与 に関しては、Pu

_due

大学の o博士

や

un d大学のグ_ループが成功して

_い

る(図8を参照 )。

一

方、フロリ_ダ大学のn g _am博士はZ mob s由来の2種の

ェ

タノ_ール合成酵 素遺伝子を導入

す

ること_にょり_{、また米回回} 立再生可能

_ェ

ネ_ルギー研究所(_{NRE ) の}グ_ループは、大腸 菌 由来の4種のキ_シロー ス代謝系酵 素遺伝子を導入

す

ること_にょり_{、キシロース発酵性 の付 与 に成功して}レ

_巧

(図8を参照 )。さらに最近にな

_っ

て、鳥取大学の梁瀬 博士のザイモバクター(Z oba c e a ae)

や

地球 環 境産業 技術研究機 構(R T E )_の湯川博士のコリネ型 細 菌など

の新規微生物に

_つい

てもキシロース発酵性 を付 与

す

ること_{に成功して}

_い

_る。し

_か

_しな が ら、

_い

_ず

れ

の遺伝子組換え微生物も、キシロース発酵能(_エタノ_ール収率

や

発酵速 度)_の改苦など、実用ィヒ

_す

_{るには依然として多}く_{の課題が残}さ

_れ

_て

_い

_る。 ０００3 キ_シロースを発酵 できる酵母と_してP ch a S p sなどが知ら

れ

て

い

るが、エタノール 耐性が低く_{、またキシロース代謝系はグルコースなどの糖類 の存在 下で抑制}さ

_れ

るこ とも多

_い

。そこでキ_シロース

_か

ら_エタノー_ルを生産

す

るために、_{・c e ev} s a eに_{P ・} p s由来 のキ_シロース_レダクターゼ(以

_XR)

及_びキ_シリトー_ルデヒドロゲナーゼをコード

す

る遺伝子を導入し、キシロース代謝能を獲得さ

_せ

る育種が進めら

れ

て

_い

る(_非特許 文献 、非特許文献2 、非特許文献3 ) (_{図 を参照})_。 ０００4 し

_か

し、この遺伝子組換え酵母にお

_い

てキ_シロース

_か

らの嫌 気的_エタノー_ル発酵効 率は依然と_して低く_{、満足できるものではな}

_い

_{。さらに発 酵 の過程で中間代謝物キシ} リト_{ールが蓄積して炭素変換効率を減少}さ

_せ

ると

_い

ぅ問題が存在

す

る。こ

れ

らの欠点、 は、木質系バイ_オマス

_か

らの効果的な_エタノ_{ール生産にお}ける持続的

・

連 続的な発 酵プロセスをより_効率化

_す

_{るための大きな障告}と_なる。 ０００5 このよぅな低

_い

_エタノー_ル変換効率の主な原因と_{して、キシ}ロース代謝酵 素(XR とX D )間の補 酵 素依存性 の違

_い

による細胞内の酸化還 元状態の不均衡が指摘さ

_れ

_て

い

る(非特許文献4 、非特許文献5 )。

す

なわち、X Rは、キシロースをキシリト_ールに変 換

す

る際に補酵 素と_{して、おもにNADP を使用 してNAD}

_P

_に変換

_す

_る

_一

_方、X D は 、キ_シリトー_ルをキ_シルロース_へと変換

す

る際に補酵 素として、NA D を使用 してNAD に変換

す

る(_{図 を参照})_{。この様に両酵 素の補 酵 素に対}

_す

_{る要求性 のアンバランス} を生じること_{で、補酵 素供給の最的バ}ランスを崩し、その結 果、キ_シリト_ール

_か

_らキシ ルロース_への変換が効率よく_進行

_せ

_{ず、最終的にキシロース}

_か

_{らエタノールへの変} 換効率が低く_なると_{推 定}さ

_れ

_る。 ０００6 さらに、 _{・c e ev s ae}が もともと保持して

_い

るキ_シルロキナーゼ(以

_X

) の活性が弱

い

ことも、このよぅな低

_い

_エタノー_ル変換効率の原因の

_一つ

と_して指摘さ

_れ

て

_い

る(非 特許文献6、非特許文献7 )。そこでこの改苦策と_して、X Rおよ_びX D に加えて _{・c e} ev s a e由来のX を過剰発現さ

_せ

、この組換え酵母を用

_い

て、キ_シロース

_か

ら_のエタノ ー_ル生産効率を向上さ

_せ

るとレぢ方法_が報告さ

れ

て

_い

_る(_{特許文献 を}参照)_。その

際、X R X D およ_びX を酵母内で適切な_レベ_ルで発 現さ

_せ

ること_が極めて重要 であ ること_が報告さ

_れ

_て

_い

る。例えば、キシロース

_か

ら_のエタノー_ル生産効率を上げるため に、X Rおよ_びX D の最適 な発現呈の比率に

_つい

ては、おお

む

ね理解が進んで

_い

る (_{非特許文献8、非特許文献9 、非特許文献 ０})_。し

_か

_{しなが ら、XKに関しては、その} 発現呈はどのく_ら

_い

_{が最適であるの}

_か

_に

_つい

_{て議論が分}

_かれ

_て

_い

_る。

_す

_{なわち、P d} e大学の o博士はXKの活性が高

_い

ことが重要であると述_べており_{、実際、キシロー} ス代謝飴を遺伝子組換えによ

_っ

て付与 した acc h a _{om ces}酵母 424 A _N

T)

株を 用

_い

て、キシロース

_か

ら_エタノー_ルを高収率に得て

_い

る(非特許文献8 )。

一

方、 _und 大学

や

別のグ_ループらは、X R D Kをコード

す

る遺伝子をそ

れ

ぞ

れ

別の染色体 上に栄養 要求性型発 現カセ_ット_を用

_い

_{て組込んだ実 験株 由来の遺伝子組換え酵母} を作製し、XKの活性が過剰であると_{酵母の増 殖 阻告を引き起 こ}

_す

_{ので、適度に構 成} 的に発 現さ

_せ

る_のがよ

_い

と_報告して

_い

_る(_{非特許文献7、非特許文献} ) ０００7 また、NAD"要求性

_か

らNADP" 要求性_へと補酵 素の特 典性 を変換したX D (改変型 X D ) を作製 し、この改変型X D をX R と共に発 現

す

る遺伝子組換え酵母を作製し、 この遺伝子組換え酵母を用

_い

て、キシロース

_か

ら_のエタノー_ルを生産

す

る方法が報 告さ

_れ

_て

_い

る(_{特許文献2を参照})_。(_{図 を参照})_。 ０００8 近年、バイ_オマス資源を発酵して得ら

れ

る_エタノー_ルなどを液体燃料もしく_は化学 原料と_して利用

_す

ること_{が、注目、検討}さ

_れ

_ており_{、その実用化技術 開発が促進}さ

_れ

て

_い

る。そのため、バイ_オマス資源の実用化経 済性 のために、上記酵母より_もエタノ ー_ル生産能の高

_い

酵母株が求めら

_れ

て

_い

る。 特許文献1 :特表2０００

5０

9988 号公報 特許文献2 :特開2００6

6213

号公報 特許文献3 :特開昭6 2

65679

号公報 非特許文献 :Ch u B C ら B o e c h n o o gy Advances, V o 25 Pp 425

44

(2００7) 非特許文献2 : J e _esT W Cu _en Op n o n n B o e c h n o o g V o 7 Pp

7

(2００6) 非特許文献3 _{: J e esT W ら A p p e d M c ob o og} an d B o e c h n o o g V o 63 Pp 49 5

5

０9 2００4) 非特許文献 :B _{u nenbe g} Mら A p p e d M c _{ob o og} an d B o e c h n o o g V o 8

p p 287

292

(1983) 非特許文献 :Ko e e ら A p p e d M c _{ob o og} an d B o e c h n o o g V o 38 Pp 776

783

(2００4) 非特許文献6 :Deng X Xら A p p e d B o c h e m s an d B o e c h n o o g V o 4 25 Pp 193

199

(199 ０) 非特許文献7: ohansson B ら A p p e d an d E nv _{onmen a} M c _{ob o og} V o 67 Pp 4 249

4255

2００1) 非特許文献8 E a s s o n A ら E n z m e an d M c _{ob a} T e c h n o o g V o 29 Pp 8 8

297

( 2００1) 非特許文献g _{:Jeppsson M EM Y e a s Resea} ch V o 3 Pp 167

175

(2００3) 非特許文献1０: W a d on M

_b

A p p e d M c _{ob o og} an d B o e c h n o o g V o 48 p p 218

224

(1997) 非特許文献1 : ed ak M A p p e d B o c h e m s an d B o e c h n o o g V o 113 6 p p 4０3

4

6 (2００4) 非特許文献12 : ら A p p e d M c _{ob o og} an d B o e c h n o o g V o 69 Pp 9 5 5_０3 (2００3)

発

明の開

ぅ_示

発

明

が

解

がさ

し

ようと

す

_る

_課

_題

０００9 従来法では、木質系バイオマス資源

_か

ら効率的_にエタノー_ルを製 造

す

ること_はでき な

_か

_っ

たので、木質系バイ_オマス資源

_か

ら_エタノー_ルを安価に効率的に製 造

す

ること ができる有効な方法が望ま

れ

て

_い

た。こ

れ

は、木質系バイ_オマスの糖化液に多呈に 含 ま

_れ

るキ_シロースを利用できる微生物が限ら

_れ

て

_い

ること、またキ_シロースを高効率 にエタノ_ールヘ変換

す

る微生物が開発さ

_れ

て

_い

な

_い

こと、さらに従来のキ_シロース発 酵性 を付 与した遺伝子組換え微生物でも、グ_ルコースの存在 下では実質的にキシロ ースを発酵 できな

_い

(_{グルコースにょ}

_っ

_{て発 酵が抑制さ}

_れ

る

_に

とが主な原因であ

_っ

た ００1０ そこで、本発明では、キ_シロース

_か

ら_エタノー_ルを高収率生産でき、

_かつ

グ_ルコース の存在 下でもキシロースが発酵 できる遺伝子組換え酵母_おょびそ

れ

を用

_い

た_エタノ

一ルの効果的な生産方法を提供

す

る。

課

題 を

解決

す

る

ための

手

段

００11 本発明者らは、上記課題を解決

す

_べく_{鋭意 検討した結 果、酵母染色体に効率}よく 組込めるキシロース代謝系(XR、野生型 ある

_い

は改変型 XD およ_びXK)発現

ヵ

セ ットを作製し、この発 現

ヵ

セ_ット_{を宿 主酵母細胞に導入して、キシ}ロース_をエタノー_ル ヘ 高効率に生産できる遺伝子組換え酵母を作製した。 ００12 さらに本発明では上記キシロース代謝系発現

ヵ

セ_ット_を ・ce

ev

s ae などの適当な 宿 主酵母株に導入

す

る育種に加えて、強力なキシロース発酵性 を獲得 した宿 主酵 母株の選 定 を行

_っ

た。当該選 定は、キ_シロース

_か

ら_エタノー_ルを効果的に生産さ

_せ

る 上で重要 である。この理 由は以下の通り_{である。キシ}ロース

_か

ら_エタノー_ルを工業的 に高効率生産さ

_せ

る上で重要な_ファクターとして、_エタノー_ル収率と_エタノー_ル生産 性 の向上がある。この二

つ

のファクターは、大容呈、低コス トの工業操 作にお

_い

て非 常に重要 である。_エタノー_ル収率の向上は原料コス トに影響を与える。

一

方、_エタノ ー_ル生産性 の向上は、バイオプロセス設備の主要なコス トの決 定的な要素と_なる。収 率と_{生産性 は}と_{きには分 けて考えるこ}と_{ができるが 、プロセス全体の最適化では、収} 率と_{生産性 の両方を加味して行 わなけ}

_れ

_ばならな

_い

_。エタノ_ール生産性 は某質 (キ_シ ロース) の比消費速 度に依存して

_い

るので、もしキ_シロース比消費速 度の向上がプロ セスにお

_い

て実現

す

れ

ば、_エタノー_ル生産性 は副生産物(キ_シリト_ール、グリ_セロール 等 )の生産を最小限に抑えること_によ

_っ

_{てコス ト的には容認 できるレベルに達}

_せ

_ら

_れ

る 。このよぅな状態で、_エタノ_ール収率と_エタノ_ール生産性 は両方とも最適化

す

ること_が 望ま

れ

る。

す

なわち、_エタノー_ルを高

_い

収率で生産し、

_かつ

キ_シロース

_か

ら_のエタノー ル発酵速 度が速

_い

酵母株が、最も実用ィ_{か 工業化}

_す

_{るのに適して}

_い

_{る。さらに、通常} のキ_シロース発酵性 を付 与した遺伝子組換え酵母は、グ_ルコースの存在 下では実質 的にキ_シロースを発酵 できな

_い

ので (グ_ルコースによる発酵の抑制)、この問題を解決

す

ること_{が工業化のための課題 である。そのために、グルコース抑制を解除}

_す

る代謝 工学的な手法に加えて、グ_ルコースの発 酵速 度 の速

_い

酵母株の選 定も、工業的にキ シロース

_か

ら_エタノー_ルを発酵

す

る上で重要になる。 ００13 本発明では、優

れ

たキシロース発酵能を保 持

す

る酵母株を選別

す

るために、遺伝

子組換えの宿 主酵母と_{して5種類の酵母株を選 んだ。}

_す

_{なわち、実 験株のD452}

₂

_株 およ_びNV c 株、工業株のT Pe 1(パン酵母)株、R

2

株( _ERM B P

754

号)およ_び 焼酎3_号株 (_{協会 系酵母})_である(_{図2を参照})_。D452

2

_株は

_一

_倍体であり_{、他の4種} 類の酵母( _{NV c 株、T Pe 株、R}

2

_{株および焼酎}3_号株)_{は二倍体である。なお、1} R

2

株は凝集性酵母であり、連 続発酵、繰り_{返し発 酵が可能 な、}より_実用ィ_{か 工業化} に即 した酵母株と_して知ら

_れ

_て

_い

_る(_{特開昭6 2}

₆₅₆₇₉

_{号公報 を参照})_。 ００14 上記キシロース代謝系発現カセ_ット_{を、上記5種類の宿 主細胞株に導入し、この中}

か

ら、キ_シロースをエタノー_{ルヘ 高効}率に生産できる遺伝子組換え酵母を選 抜した。 この遺伝子組換え酵母が、キシロースの

み

なら_ずキシロースを含

む

混合糖

や

糖化液

か

らも_エタノ_{ールを高効率に生産で}きること_{を見出し、本発明を完成}さ

_せ

るに至

_っ

た。 ００15 さらに、上記キシロース代謝系発現カセ_ット_{を導入した遺伝子組換え酵母を、}

_一

_連 のキシロースを含

む

培 地で順化処理

す

ること_によ

_っ

_{て、当該遺伝子組換え酵母のキ} シロース発酵能を向上できること_{を見出し、本発明を完成}さ

_せ

るに至

_っ

た。 ００16

す

なわち、本発明は以下のと_おり_である。 ００17 X R遺伝子、X D 遺伝子およ_びX 遺伝子が染色体組込

み

により_導入さ

_れ

_て

_い

る、キ_シロース

_か

ら_エタノー_ルを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。 ００18 2 X R遺伝子およ_びX D 遺伝子が酵母由来である、 」の遺伝子組換え酵母。

００19 3 X R遺伝子およ_びX D 遺伝子が、Candida hehatae ch a S p sおよびPac h

so en a

""oph

s

か

らなる群

か

ら選 択さ

れ

る酵母に由来

す

る、 2 」 の遺伝子組換え酵 母。 ００2０ 4 X R遺伝子およ_びX D 遺伝子が、P ch a S p sに由来

す

る、 3 」 の遺伝子組換 え酵母。 ００21 5 X K遺伝子が、酵母または細 菌 由来 である、 」の遺伝子組換え酵母。

００2 2 6 XK 伝子が Candida hehatae ch a S p s ach so en an n o p h s acc

h a _o c e s Ce ev s ae chizosacca o c e s _{P o} b eおよびEsche ch aC らなる群

か

ら選 択さ

_れ

_{る酵母または細 菌 由来 である、 5}」_{の遺伝子組換え酵母。} ００2 3 7 X K遺伝子が、acc h a _{om ces}Ce ev s ae に由来

す

る、 6

」

００2 4 8 X R遺伝子およ_びX D 遺伝子がP ch a S p sに由来 し、

かつ

X 遺伝子が acc h a _o c e s Ce ev s a eに由来

す

る、 」 の遺伝子組換え酵母。 ００2 5 9 X R遺伝子、X D 遺伝子およ_びXK遺伝子が構成的に発 現さ

_れ

_る、 」

～

8」_の

い

ず

れか

の遺伝子組換え酵母。 ００2 6 ０ X R遺伝子、X D 遺伝子およ_びXK遺伝子が恒常的に発現

す

るP GKプロモー ターにより_、そ

_れ

_ぞ

_れ

_発現さ

_れ

_る、 9」_{の遺伝子組換え酵母。} ００2 7 X D 遺伝子が 、補酵素要求性 をニコチンアミ_{ドアデニンジヌクレオチド}リ_ン酸( NA D P )型に改良した改変型X D (配_列番 号 )をコード

す

る、 」

～

０」の

_い

_ず

_れ

か

の遺伝子組換え酵母。 ００2 8 2 X R遺伝子、X D 遺伝子およ_びXK遺伝子が、まと_めて

_一つ

_{の対立遺伝子上に} 相同組換えによ

_っ

て染色体DNA に組込ま

れ

る、または各 遺伝子がそ

れ

ぞ

れ

_{別 々}の 対立遺伝子上に相 同組換えによ

_っ

て染色体DNA に組込ま

れ

る、 」

～

」の

_い

ず

れか

の遺伝子組換え酵母。 ００2 9 3」 遺伝子組換え酵母が acc h a _{om ces} Ce ev s aeより作製さ

れ

る、 」

～

2」の

い

ず

れか

の遺伝子組換え酵母。 ００3０ 4 」

～

3」の

_い

_ず

_れか

の遺伝子組換え酵母を用

_い

た、キシロース

_か

ら_エタノ ー_ルを生産

す

る方法。 ００31 5

～

3」の

_い

_ず

_れか

の遺伝子組換え酵母を用

_い

た、リ_グノセ_ルロース系バ イ_オマス

_か

ら調製した糖化液

か

ら_エタノ_{ールを生産}

_す

る方法。 ００3 2 6」 順化処理により_、 」

～

₃」_の

_い

_ず

_れか

_{の遺伝子組換え酵母のキシ}ロース発 酵能を向上さ

_せ

る方法。

発

明の効果

００3 3 本発明の遺伝子組換え酵母は、高効率でキ_シロース_をエタノ_ールヘ変換できる(_キ シロース発酵速 度が速く_、

_かつ

_{キシロース}

_か

_{らエタノールを高収率生産}

_す

_{る)。また、} 通常はグ_ルコース存在 下だと_キシロース発酵が阻告を受けるが、本発明の遺伝子組 換え酵母は全てグ_ルコースの存在 下でもキ_シロースを同時に発 酵 でき、特に工業株( R

2

株( ERM B P

754

号)_{およびT Pe 株 を宿 主}と

_す

る遺伝子組換え酵母は、グ ルコース存在 下でキ_シロース発酵が促進さ

_れ

る。さらに本発 明では、キ_シロース代謝

系 (XR _{XD 、お}よ_{ひXK) 遺伝子を効率}よく_{全て染色体組込}

_み

_により_導入して

_い

_るの て、_ブラスミト_て導入

_す

_るより_{も安定してお}り_{、またブラス}ミト_{を保 持}

_す

_{るための栄養 要} 求性 の最少培 地てはなく、栄養豊富な完全培 地

や

糖化抜て直接 増 殖さ

_せ

ること_かて きるのて、増 殖 速 度、糖代 謝速 度も_上昇

_す

_{る。実際、本発明の遺伝子組換え酵母を} 用

_い

て木質系_ハイオマス

_か

ら調製した糖化被 を発酵さ

_せ

た結 果、ク_ルコースなと_の 六炭糖の

み

なら

す

キ_シロースなと_の五炭糖も効率よく_{エタノールに変換}

_す

_ること_かて きた。加えて、キ_シロース発酵能か比較的低

_い

組換え酵母株ても、

一

連のキ_シロース を含

む

培 地て選 択圧を

か

けなから継代的に培養

す

る順化処理により_{、キシロース発} 酵能を顕著に向上し得る。したか

_っ

て、本発明により_{、木質系ハイオマス としてこ}

_れ

_ま て利用さ

_れ

ること_{か少 な}

_かっ

_たキシロースを次 世代の被体_エネ_ルキーと_して期待さ

_れ

て

_い

る_エタノー_{ルヘ 高効}率て変換てきる。 ００34 木明細菩 は本願 の優先権の某礎てある日本回特_{井 出}願2００8 ０14０8０号、2００8

21

1274 号の明細 菩およ_{ひ または図}面に記載さ

_れ

る内容を包 含

す

る。

図

面の

簡

単

な

説

明

００3 5 図 酵母 内のキ_シロース代 謝経 路を示

す

説 明図てある。図中、XRはキ_シロース還 元 酵 素、XD はキ_シリト_{ール脱水 素酵 素、X}

_K

_はキシルロキナーセをそ

れ

そ

れ

首味

す

る 。従来怯ては、Pc

h

a S p s由来のXRおよひXD ならひに accha o ces Ce

ev

s a e由来のX

K

のそ

れ

そ

れ

をコート

す

る遺伝子を酵母に導入

す

ること_により_キシロース発 酵酵母か作製さ

_れ

_{る。この従来怯に}よ

_っ

_て得ら

_れ

る遺伝子組換え酵母は、相当呈の キ_シリトー_ルか蓄積

す

るためにキ_シロース

_か

ら_エタノー_ルへの変換効率かそ

れ

ほと良 く_な

_い

_こと_{に加えて、クル}コースの存在 下てキ_シロース発酵 か抑制さ

_れ

る。

一

方、本願 発明の

一

実施形態ては、XR、野生型または変典型XD およひX

K

の発 現カセ

_オ

を 酵母染色体に組込

み

、こ

れ

ら_遺伝子群を適切に酵母 内て発 現さ

_せ

_ること_により_、六炭 糖

・

五炭糖 同時発酵酵母を複 数 作製

す

る。さらにその酵母株の中

_か

ら、キ_シロース発 酵速 度 か速く_、

_かつ

_{キシロース}

_か

_{らエタノールを高収率生産てきる酵母株を選 定}

_す

_る 。そ

れ

によ

_っ

て、本願発明による六炭糖

・

五炭糖 同時発酵酵母は高

_い

キ_シロース発 酵能を有し、_エタノ_ールを高効率的に生産

す

ること_{か可能てある。} 図2 遺伝子組換え酵母を作製

す

るための、キシロース代 謝用 の酵母染色体組込型

ブラスミ_ド(pA URX X D_H(WT)XR およ_びp AURX X D (A R dR)XR)と宿 主酵母(D452

2

株、NV c 株、T p e 株、R

2

株、およ_び焼酎3号)_を示

す

_{図である。} 図3 作製した遺伝子組換_え酵母にお

_い

て発 現さ

せ

た酵 素(XR _{X D XK) の比活} 性 を示

す

図である。 図4 NV c 株を宿 主と_{して作製 し}た遺伝子組換え酵母(N

WT

株およ_びN AR dR 株) による、YPX 培 地における嫌 気的

_ェ

タノ_ール発酵能(_{キシロース消費呈および}

_ェ

タノール濃度)とYPDX _{培 地}における嫌 気_的

_ェ

タノール発酵能(キ_シロース、グ_ルコー ス消費呈およ_び

_ェ

タノー_ル生産 最)_を示

す

_{図である。} 図5 R

2

株を宿 主として作製 した遺伝子組換え酵母( R

WT

_株およびR AR dR株) による、YPX 培 地に_おける嫌 気的

_ェ

タノー_ル発酵能(キ_シロース消費呈およ_び

_ェ

タノ ー_ル濃度)とYPDX 培 地に_おける嫌 気_的

_ェ

タノー_ル発酵能(キ_シロース、グ_ルコース消 費呈およ_び

_ェ

タノー_ル生産 最)_を示

す

_{図である。} 図6 Y P X培 地およ_びYPDX 培 地にお

_い

て、WT株とA R d R株を各宿 主酵母でそ

れ

ぞ

れ

比較した結 果、キシロース発酵能のよ

_か

_っ

た方の遺伝子組換え酵母(YPX _{培 地で} はD AR dR株 _N AR dR株

T

WT

株_およ_びR AR dR株 YPDX 培 地ではD AR dR 株、N AR dR株、T

WT

株およ_びR

WT

株) による、YPX 培 地およ_びYPDX 培 地にお ける嫌 気_的

_ェ

タノー_ル発酵能(キ_シロース消費呈およ_び

_ェ

タノー_ル生産 最)を示

す

図 である。 図7 R

2

株を宿 主酵母として作製 した遺伝子組換え酵母( R

WT

_株) _による、YPDX2 培 地に_おける嫌 気_的

_ェ

タノー_ル発酵能(グ_ルコース、キ_シロース消費呈およ_び

_ェ

タノ ー_ル、グリセロー_ル、キ_シリト_{ール生産 最})を示

す

図である。 図8 キ_シロースおよ_びキ_シロースを含

む

混合糖 を用

_い

たバ_ッチ発酵実 験にお

い

て、 こ

_れ

までに報告さ

_れ

て

_い

るキ_シロース発酵性が比較的優

れ

た遺伝子組換え酵母

・

微 生物_のキ_シロース発酵能と、本願発明によるR AR dR株_およ_びR

WT

株のキ_シロース 発酵能を比較した図である。 図9 R

2

株を宿 主酵母として作製 した遺伝子組換え酵母( R

WT

_株) _による、

_ュ

一カ リ

_か

ら調製_した糖化液における嫌 気的

_ェ

タノ_ール発酵能(グ_ルコース、キ_シロース消 費_呈およ_び

_ェ

タノー_ル、グリ_{セロール生産 最)を示}

_す

_{図である。}

図1０焼酎3_{号株 を宿 主酵}母と_{して作製 し}た遺伝子組換え酵母(

_WT

_株) と _T株 を順ィヒ_処理

_す

_{ることにより得た}

_WT(C

_{)株による、YPX 培 地における嫌 気的} エタノ_ー ル発酵能(増 殖、キシロース消費呈、およ_びエタノ_{ール生産 最})_を示

_す

_{図である。}

発

明を

実

施

す

る

ための最

良

の形

態

００3 6 X Rは、キシロースをキシリト_{ールに変換}

_す

_{る反応を触媒}

_す

_{る酵 素 である。X R遺伝子} は、

_かか

る酵 素 をコード

す

る遺伝子であ

れ

ば特に限定さ

_れ

な

_い

が、Candida hehatae ch a S p s 、およびPac h so e n an n o p h u sなどの酵母に由来

す

る。好ましくは、X R遺伝子は、P ch a S p sに由来

す

るものである。 ００3 7 X D は、キ_シリト_{ールをキシル}ロースに変換

す

る反応を触媒

す

る酵 素 である。X D 遺伝子は、

_かか

る酵 素 をコード

す

る遺伝子であ

れ

ば、特に限定さ

_れ

な

_い

が、Candida hehatae ch a S p s 、およびPac h so e n an n o p h u sなどの酵母 に由来

す

る。好ま しく_{は、X D 遺伝子は、P ch a S p sに由来}

_す

_{るものである。} ００3 8 X は、キ_シロース とATP を、キ_シルロース5リン酸とADP に変換

す

る反応を触媒

す

る 酵 素 である。XK遺伝子は、

_かか

る酵 素 をコード

す

る遺伝子であ

れ

ば、特に限定さ

_れ

な が Candida hehatae ch a S p s ach so en an n o p h u s acc h a o c e s C

e _{ev s ae} chizosacca _{om ces}P o b eおよびEsche ch aCo などの酵母または細 菌

に由来

す

る。好ましく_{は、XK遺伝子は、acc h a om ces Ce ev s aeに由来}

_す

_るもので ある。 ００3 9 こ

れ

らの遺伝子は、当業者に周 知である

一

般的な方法、例えば、_ハイブリ_ダイゼー ション法、PCR 法等によ

_っ

て得ること_{ができる。} ００4０ X D は、補酵 素 要 求性が変化した改変型を用

_い

ること_が望まし

_い

_{。野生型X D は}

一

般に、補酵 素として二コ_チンアミ_{ドアデニンジヌクレオチド(NAD") を使用}

す

_る。

一

_方 、本願における「_{改変型X D} 」_{は、補酵 素}と_{して二コチンア}ミ_{ドアデニンジヌクレオチド} リ_{ン酸(NADP") を使用}

_す

_{る。改変型X D は、NADP"を補酵 素}と_{して使 用}

_す

ること_が出 来

れ

ば、そのアミノ酸配列もしく_は塩基配タ _{は、特に制限しな}

_い

_{が、X D のア}ミノ_酸配 列の2０7_番目

_か

_ら21 1番目に対応

す

るアミノ酸の少 なくとも

_つ

を他のアミノ酸、例えば 、アラ_ニン、ア_ルギニン、セリ_{ンまたはスレオニンに置換さ}

_せ

_{たものが好まし}

_い

_{。X D の} アミノ酸配列で2０7_{番目のアスパ}ラギン酸をアラニンに置換さ

_せ

_たもの、2０8番目のイ

ソロ_イシンをア_ルキニンに置換さ

_せ

たもの、アミ_ノ酸配_列の2０9番目のフ_エ二_ルアラ_ニ

ンをセリ_ンもしく_{はスレオニンに置換}さ

_せ

たもの、およひアミノ_酸配列の21 1番目のアス

パラキンをア_ルキニンに置換さ

_せ

たものか特に好まし

_い

。さらに好ましく_{は、X D のア}

ミ_ノ酸配_列の2０7番目のアスパラキン酸をアラ_ニン、2０8番目のイソロ_イシンをア_ルキニ

ン、2０9番目のフ_エ二_ルアラ_ニンをセリ_ン、およひ21 1番目のアスパラキンをア_ルキニン に置換したものてある(配列番 号 ) (Watanabe _・ら、The J ou _na O B o og ca Chem

s _yVo 28０No Pp 1０3 4０

1

０349 (2００5)を参照 )。改変型X D は、補酵 素として

NADP を利用 してNADP に変換

す

る。そ

_れ

に対 し、X は補 酵 素と_しておもにNADP を利用 してNAD

P

に変換

す

るために、補酵 素供給_のハランスか保た

れ

、両遺伝子 を導入した酵母はキ_シロース

_か

らキ_シルロースまての変換を効率的に行う_こと_か可能 と_なる(図 を参照 )。 ００41 改変型酵 素の作製は、当核分野にお

_い

て周 知てある方怯、例えは、ランタム変典 およ_{ひ部位 特 典的変}典を用

_い

て作製

す

ること_{か可能てある。}

_一

_{般的に、ランタム変} 典怯ては、遺伝子_シヤノフリンク

や

ェ

ラープローンPCRを用

_い

て酵 素変異体プー_ルを 構築し、その中

か

ら目的の性 質 に改変さ

_れ

_{た変異体を}スクリ_ーニンク

_す

_{る。部位 特 典} 的変典怯ては、既知 のX D 遺伝子配列を某に設計した、所 定の位置に変典を導入 したX D クローニンク用プライ_マーを用

_い

てPCR を行う_ことによ

っ

て、クローニンク さ

_れ

たX D 遺伝子の所 定 の位置に変典を導入

す

ること_{かてきる。} ００4 2 こ

れ

ら3_{種の酵 素 を}コート

_す

_{る遺伝子を宿 主細胞内にて発 現}さ

_せ

る。その方怯は、 当業者 に公知てある

一

般的な分子生物学_的手怯を用

_い

て行う_こと_かてきる( amb _oo

ら Mo ecu a C o n n gA _LBORATORYMANUA

/second

ed o n C o d p n

g

a bo

_{abo a o}

ess

(1989) 参 照 )。

す

なわち、当核酵 素 をコート

す

る遺伝子を 適当な

_へ

クターに細

み

込

み

、その

_へ

クターを用

_い

て適当な宿 主生物を形 質伝換

す

る こと_により_行う_こと_{かてきる。} ００4 3 ヘクターと_{しては、遺伝子の導入お}よひ発現のために当業者に公知てある

一

般的 な酵母発_現ヘクターを用

_い

ること_かてきる。酵母 に導入

す

る際に用

_い

る

_へ

クターと_し ては、多コピー型(YEp型)、卓コピー型(YCp 型)、染色体細

み

込

み

型(Y p型)の

_い

す

れ

も用

い

ること_{か可能てあるか、染色体細}

_み

_込

_み

_型を用

_い

_{るのか好まし}

_い

_。

００4 4 ベクターには、目的の酵 素遺伝子の他に、宿 主細胞における複 製を可能と

_す

る複 製起 点、およ_{び形 質転換体を同定}

_す

る選 択_マーカー、さらに、好ましく_{は、酵母由来} の適切な転 写または翻訳制御配列が、所望により_{酵 素の遺伝子配列に連 結}さ

_れ

_て 含 ま

_れ

得る。制御配_列の例には、伝 写プロモーター、オペ_レーター、または

_ェ

_ンハン ザー、 RNAリ_{ボソーム結 合 部位、ならびに伝 写および翻訳開始および終結を調節}

す

る適切な配列が含 ま

れ

る。用

_い

ること_{ができる伝 写プ}ロモーターは、宿 主細胞内に て遺伝子発現を駆動できる限り_{、特に限定さ}

_れ

_{ず、例えばG A プロモーター、G A} ０ ロモーター、ヒート_ショックタ_ンパク_質プロモーター、M プロモーター、 5_フ。 ロ_モーター、P G _プロ_モーター、GAP _プロモーター、A D _プロモーター、A X _プロ

モーター等 を用

_い

ること_{ができるが 、}P GKプロモーターを用

_い

るのが好まし

_い

。選 択_マ ーカーと_{しては、通常使用}さ

_れ

るものを常法により_用

_い

_ること_{ができる。例え}ばテト_ラザ イクリ_{ン、アンピシ}リ_{ン、またはカナマイシンもし}く_{はネオマイシン、} ハイグロマイシンま たはスペクチノ_{マイシン等 の抗 生}物質耐性遺伝子

や

3 T P などの栄養 要求，性 遺伝子などが例示さ

_れ

_る。 ００4 5 宿 主細胞として用

_い

ること_{ができるもの}と_しては、特に限定

す

るものではな

_い

がCand

a hehatae ch a S p s ach so en an n o p h s acc h a o c e s Ce ev s ae お

よ_び chizosacca _{om ces} p o b eなどの酵母が挙げら

_れ

、特に acc h a _{om ces} Ce ev s

a eが好まし

_い

。さらに好ましく_{は、実験株のD452}

2

_{株およびNV c 株、工業株のT p} e 1(パン酵母)株、R

2

株( _ERMB P

754

号)およ_び焼酎3号株 (協会 系酵母)である (_図2を参照)_であり_{、特に好まし}く_{は、工業株}と_して知ら

_れ

_て

_い

るR

2

株 ( _ERMB P

7

5 4_号)_およ_びT p e 株である。 ００4 6 _{実 験}株と_{は実 験面での利便性 のために使わ}

_れ

_{る酵母株であ}り_、工業株(_実用株) と は実用 面での有用性 のために使わ

れ

て

_い

る酵母株である。例えば、ワイン、清酒

や

焼酎作り_に用

_い

ら

_れ

る酵母は工業株である。パン酵母は実 験_室レベ_ルでも使用さ

_れ

て

い

る_{ので、その意 味でほ実 験}株に入り_{得る。実験株は遺伝子型が分}

_か

_っ

_ており_、多 く_{の場合、栄養 要求性 の選 択マーカー遺伝子をも}

_っ

_たブラスミ_ドを導入_したり_、栄養 要求性型の発現カセ_ット_{を染色体へ組込める}よう_{に栄養 要求性遺伝子が変典した}り して

い

る。

一

方、工業株は栄養 要求性遺伝子が変典して

_い

な

_い

ので、栄養 要求性_マ

一カー遺伝子を保 持

す

る_ブラスミ_{ドを直接 導}入_したり_{、栄養 要求性型 の発 現カセッ}ト を直接 染色体に組込

む

こと_ができな

_い

_{。さらに、実 験株は接 合実 験}

_や

_{胞子形成実 験} に使 用さ

_れ

ること_が多

_い

_ので

_一

_倍体が多

_い

_{が、工業株は二倍体}

_や

_{四倍体 などの多倍} 体が多

_い

。 ００4 7 ベクターを宿 主細胞に導入

す

る方法と_しては、リ_ン酸

_か

レ_シウム法または塩化

_か

レ シウム 塩化_ルビ、ジウム法、_エレクトロポ_レーショ_ン法、_エレクトロ_インジ

_ェ

ク_ショ_ン法、P EGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用

_い

る方法などが挙げら

れ

る。 ００48 本発明の

_べ

クターは、栄養 要求性型 の発 現カセ_ット_{を含んでも、薬剤耐性型 の発} 現カセ_ット_{を含んでも}よ

_い

_が、好ましく_{は薬剤耐性型 の発 現カセッ}ト_{を含んで成る。薬} 剤耐性型 の発 現カセ_ット_を用

_い

_{た場合、遺伝子組換え酵母はYPD 等 の完全培 地でも} 培養

す

ること_{が可能であ}り_{、最少培 地にア}ミノ_酸等を加えた培 地で培養

す

る必要があ る栄養 要求性型 の発 現カセ_ット_{を導入した酵母}と_{比べて、増 殖 速 度を格段に高める} こと_{ができる。さらに、薬剤耐性型 の発 現カセッ}ト_を用

_い

_{た場合、酵母の栄養 要求性} 遺伝子を破壊

す

る_必要がなく_{、実用株 に直接 染色体組込}

_み

_できると

_い

ぅ_利点を有

_す

る。 ００49 本発明にお

_い

て好ましく_{は、XR D 、お}よ_{びX を構 成的に発 現}さ

_せ

_る。例えば、 XR XD 、およ_びX

K

遺伝子を染色体組込

み

型ベクター等に導入した後、酵母染色 体上に組込

み

、_シング_ルまたは数コピーで発 現さ

_せ

るのが好ま 、。こ

れ

らの遺伝子 は、まと_めて

_一つ

_{の対立遺伝子上に相 同組換えによ}

_っ

_{て染色体DNA に組込ま}

_れ

_ても 良く_{、また、各 遺伝子がそ}

_れ

_ぞ

_れ

_{別 々の対立遺伝子上に相 同組換えに}よ

_っ

_て染色体 DNA に組込ま

れ

ても良

_い

。好ましく_{は、3種の酵 素遺伝子は、ま}と_{めて宿 主のDNA} の

_一つ

の対立遺伝子上に組込ま

れ

て

_い

る。 ００5 ０ 本発明に係る遺伝子組換え酵母は、発酵反応により_{キシロース}

_か

_らエタノー_ルを生 産

す

ること_{が可能である。その際}、培 地に含 ま

れ

るキ_シロースの濃度は、0_・1

～

2０ 。、 好ましく_は0 ・5 。

～

０ 。、さらに好ましくは、4・5 であり、また培 地に含 ま

れ

るグルコ ースの濃度は、0_・1

～

2０ 。、好ましく_は0 ・5

～

０ 。、さらに好ましくは、4・5 である。 ００51 また、本発明に係る遺伝子組換え酵母は、発酵反応によりリ_グノセ_ルロース系バイ オマス

_か

ら調整した糖化液

_か

ら_エタノー_ルを生産

す

ること_{が可能である。糖化液は、}