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2015 Nov % 7 00 ~ h 3 d I /R mg /kg h 10% 400 mg /kg Longa MCAO 4 10 mg /kg 2 h 0. 2 ml /100 g 6 h 23 ~ 25

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◇基础研究◇ 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办 CN 34-1206 / R,ISSN 1009-2501 http: / /www. cjcpt. com 2015 Nov; 20( 11) : 1208 - 1211 2015-06-13收稿 2015-09-25 修回 山东省医药卫生科技发展计划项目 ( 2014WS0119) 武彩霞,女,博士研究生,副教授,主要从事药理学教学与科研工作。 Tel: 0539-6173387 E-mail: sdyx91@ 126. com

杜冠华,通信作者,男,研究员,博士生导师,主要从事神经药理学与 新药发现研究。

Tel: 010-63165184 E-mail: dugh@ imm. ac. cn

匹诺塞林对局灶性脑缺血再灌注大鼠

脑组织急性损伤的神经保护作用

武彩霞

1

,杜冠华

2 1 山东医学高等专科学校,临沂 276000,山东;2 中国医学科学院药物研究所 & 北京协和医学院,药物靶点研究与药物筛选北京市重点实验室,北京 100050 摘要 目的: 探讨并确证匹诺塞林对脑缺血再灌 注急性损伤的神经保护作用,进一步为匹诺塞林 治疗缺血性脑卒中的临床应用提供依据。方法: SD大鼠 50 只,随机均分为假手术组、模型组、匹 诺塞林 1 mg / kg 组、匹诺塞林 3 mg / kg 组、匹诺塞 林 10 mg / kg 组,其中模型组及匹诺塞林各给药组 采用大脑中动脉阻塞法( middle cerebral artery

oc-clusion,MCAO)建立脑缺血再灌注模型,分别与

大脑中动脉阻塞 2 h 再灌注同时给药,6 h后取血

并断头取脑,制作病理切片。HE 染色观察额顶 叶皮层( 缺血半暗带) 和纹状体病理变化,尼氏染 色观察海马 CA1 区形态变化。酶联免疫吸附法 ( enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 检测 大鼠血清神经元特异性烯醇化酶( neuronal specif-ic enolase,NSE)及 S100-β 蛋白水平。结果: 匹诺 塞林能够改善大鼠急性局灶性脑缺血再灌注的脑 组织皮层、纹状体和海马神经元的形态,降低血清 中 NSE 和 S100-β 蛋白的水平( P < 0. 05 或 P < 0. 01) 。结论: 匹诺塞林能减轻缺血再灌注造成 的脑组织急性损伤,具有神经保护作用。 关键词 匹诺塞林; 脑缺血再灌注急性损伤; 神经 元特异性烯醇化酶; S100-β 中图分类号: R965. 2 文献标志码: A 文 章 编 号: 1009-2501( 2015) 11-1208-05 匹诺塞林,又称生松素、乔松素、松属素等,是 蜂胶中含量最高的一种黄酮类化合物。前期研究 表明,其能减轻脑缺血再灌注造成的神经细胞凋 亡,改善神经功能[1-2],主要用于治疗缺血性脑卒 中,现在正处于临床研究阶段。为了进一步确证 匹诺塞林的药效,并为深入探讨其作用机制提供 依据,本实验选用大鼠局灶性脑缺血 2 h 再灌注 6 h模型,从组织形态学及神经功能等方面观察 匹诺塞林对脑缺血再灌注造成的急性脑组织损伤 的作用。初步结果已经表明,匹诺塞林能减小梗 死面积,降 低 神 经 功 能 缺 损 评 分,改 善 神 经 功 能[3] 。本研究进一步观察匹诺塞林对缺血及缺 血周围区脑组织皮层、纹状体和海马神经元形态 的影响,并 测 定 血 清 神 经 元 特 异 性 烯 醇 化 酶 ( neuron-specific enolase,NSE) 及 S100-β 的水平, 以期对匹诺塞林神经保护作用的药效评价提供参 考。

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材料与方法

1. 1 主要试剂与仪器 注射用匹诺塞林( 批号: 200901) ,中国医学科学院药物研究所新药开发 室吴松教授课题组提供; 多聚赖氨酸,Sigma 公司 ( 美国) ; 栓线,北京沙东生物技术有限公司,型号 A2 级,2838-100; S100-βELISA 试 剂 盒,NSE ELISA试剂盒,武汉博士德公司; EOS450D 数码 相机,日本佳能公司; 微板光学测定仪,spectraMax M5,Molecular Devices,CA,USA。 1. 2 动物 SPF 级 SD 大鼠 50 只,雄性,体质量 260 ~ 300 g,中国医学科学院实验动物所提供,合 格证号: 京 SCXK0007。饲养条件: 室温 25 ℃ ,湿

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度 65% ,每日 7∶ 00 ~ 19∶ 00 光照 12 h,明暗交替; 自由进食饮水。实验前适应饲养环境 3 d。 1. 3 实验分组与给药 大鼠 50 只,随机分为假 手 术 组,模 型 组 ( I /R 组 ) ,匹 诺 塞 林 1、3、 10 mg / kg 组,每组 10 只。术前禁食 12 h,自由饮 水。10% 水合氯醛溶液( 400 mg /kg) 腹腔注射麻 醉。参考 Longa 等建立的 MCAO 法[4],制备大脑 中动脉栓塞模型。血流阻断 2 h 后,拔出栓线,形 成再灌注。再灌注同时立即尾静脉注射给药( 给 药体积相同,0. 2 mL /100 g 体重,假手术组及模 型组给予等体积生理盐水) ,再灌注 6 h 后取血, 取脑,进行指标检测。 假手术组只进行术前麻醉和颈总动脉、颈外 动脉、颈内动脉分离术,不结扎血管也不导入栓 线。在室温 23 ~ 25 ℃ 条件下,进行手术。手术 过程中保持温度恒定,并注意术后动物保暖。 1. 4 取材与指标检测 1. 4. 1 观察缺血侧脑组织病理变化 大鼠脑缺 血 2 h 再灌注 6 h 后,分别在假手术组、模型组、 匹诺塞林 10 mg /kg 组随机选取 3 只动物,水合氯 醛麻醉,依次剪开皮肤,胸腔,充分暴露心脏,剪开 左侧心尖部,以灌注针朝主动脉方向插入,止血钳 夹闭,输注生理盐水,于右心耳下部剪开右心房, 至流出液变清,换用 4% 多聚甲醛 PBS 液继续灌 注至动物全身僵硬,肝脏发白为止,然后断头取 脑,用刀片切去前部端脑和后部小脑,放入 4% 多 聚甲醛继续固定 48 h,常规脱水,石蜡包埋,在大 脑皮层额顶叶区和纹状体区做5 μm 脑切片,常规 HE染色,光镜下对同一部位进行拍照,观察脑组 织额顶叶皮层和纹状体的病理变化; 尼氏染色法 ( 焦油紫染色) 观察海马 CA1 区神经元损伤变化。 1. 4. 2 血清 NSE 及 S100-β 的测定 各组大鼠 断头处死时,取血。置 4 ℃ 冰箱,待血液凝固后, 5 000 r / min 离心 10 min,小心取出 血 清。按 照

S100-β ELISA试剂盒、NSE ELISA 试剂盒说明测

定血清 NSE、S100-β 水平。

1. 5 统计学处理 结果以均数 ± 标准差( x ± s)

表示,组间比较采用单因素方差( ANOVA) 分析, 结合 Student-Newman-Keuls post hoc 检 验,P <

0. 05 表示差异具有统计学意义。

2

结果

2. 1 HE染色 由图 1 可以看出,假手术组动物 皮层组织结构细胞排列紧密,形态完整,大脑皮质 神经元核大而圆,核仁清晰。模型组动物皮层组 织结构呈现大量坏死灶,神经细胞数量减少,胞核 固缩,着色加深,甚至有些细胞核、质界限不清,部 分细胞呈三角形,并出现炎性细胞浸润,出现大量 液化性坏死灶及囊性变,残存细胞较少。匹诺塞 林 10 mg /kg 组与模型组相比,神经元形态改变较 轻,胞体完整,可见尚存的大脑皮质的正常神经元 排列结构,炎性细胞浸润减轻。 图 1 缺血再灌 6 h 缺血侧大脑额顶叶皮质区 HE 染色 ( × 200) A:假手术组; B: 模型组; C: 匹诺塞林 10 mg / kg 组。 由图 2 可以看出,假手术组纹状体细胞排列 整齐,神经元形态完整,核仁清晰,无炎性浸润。 缺血 2 h 再灌 6 h 后,纹状体损伤明显,表现为组 织坏死,仅有少量正常神经元,细胞周围间隙被坏 死组织充填,部分细胞核消失,细胞缩小,细胞周 围间隙增大,甚至出现网状结构,炎性浸润明显。 匹诺塞林 10 mg /kg 组纹状体神经元呈轻度缺血 改变,细胞核少量消失,少部分细胞缩小,细胞周 围间隙增加不明显,炎性浸润减轻。 图 2 缺血再灌 6 h 缺血侧大脑纹状体 HE 染色( × 200) A:假手术组; B: 模型组; C: 匹诺塞林 10 mg / kg 组。

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2. 2 匹诺塞林对缺血再灌注大鼠脑海马 CA1 区 形态的影响 图 3 结果表明,假手术组海马 CA1 区无明显损伤,锥体细胞排列整齐致密,形态完 整,胞核大而圆,染色较浅,核仁清晰。缺血再灌 6 h后,大鼠海马 CA1 区神经细胞已经严重受损, 神经细胞排列松散,深染,出现明显的细胞缺失, 残存细胞成缺血样改变,为瘦长型,甚至出现部分 细胞核消失,细胞仅存轮廓呈空泡样,即迟发性神 经坏死。匹 诺 塞 林 10 mg /kg 组 显 著 减 少 海 马 CA1区神经细胞损伤后的丢失,增加存活的神经 元数量,改善存活神经元形态。 2. 3 匹诺塞林对脑缺血再灌注大鼠血清 NSE 及 S100-β 水平的影响 如表 1 所示,与假手术组比 较,模型组大鼠血清 NSE、S100-β 水平显著升高 ( P < 0. 01) ; 与模型组比较,匹诺塞林 3、10 mg /kg 能显 著 降 低 血 清 NSE 水 平 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ; 匹诺塞林 1、3、10 mg /kg 均能显著降低血 清 S100-β 水平( P < 0. 05 或 P < 0. 01) 。 图 3 缺血再灌 6 h 缺血侧大脑海马 CA1 区神经元形态 ( 尼氏染色法,× 200) A:假手术组; B: 模型组; C: 匹诺塞林 10 mg / kg 组。 表 1 匹诺塞林对脑缺血再灌注 6 h 大鼠血清 NSE 及 S100-β 水平的影响( x ± s,n = 10) 组别 NSE( ng /mL) S100-β( pg / mL) 假手术组 模型组 匹诺塞林 1 mg /kg 匹诺塞林 3 mg /kg 匹诺塞林 10 mg /kg 43. 00 ± 11. 72 413. 98 ± 18. 32c 392. 65 ± 49. 19 368. 97 ± 36. 15e 296. 16 ± 25. 53f 55. 57 ± 6. 16 358. 18 ± 49. 29c 121. 14 ± 14. 61e 112. 52 ± 20. 72e 52. 77 ± 11. 34f 与假手术组比较cP < 0. 01; 与模型组比较eP < 0. 05,fP < 0. 01。

3

讨论

急性脑血管病发病率、病死率及致残率都很 高,且近年来不 断 攀 升,严 重 威 胁 人 类 健 康[5] 。 而脑缺血再灌注造成脑组织急性细胞坏死和细胞 凋亡,是造成急性脑缺血损伤的直接原因,是在脑 缺血的基础上发生的病理过程。但局灶性脑缺血 发生后,不同脑区、不同细胞发展至不可逆损伤的 进程是不同的。有资料表明,不同部位神经元对 缺血性损伤易感性也不同,海马最为敏感,其神经 细胞最易受损伤,其余依次为小脑、纹状体和皮 层[6] 。缺血再灌注时间的不同对脑梗死区的影 响和它们的内在联系已备受关注[7] 。在缺血再 灌注不同阶段,各种损伤因素可能存在交互,或顺 序、或并行,贯穿整个病理发展过程,针对每一个 环节的干预措施都能影响损伤的进展。在匹诺塞 林的前期研究中,已经证实其能减小大鼠永久性 局灶性脑缺血、缺血再灌注 6 h 及 24 h 的梗死面 积[8-10] 在本实验中,进一步证实了匹诺塞林能 改善大鼠脑缺血再灌注损伤急性期神经细胞形 态,减轻海马 CA1 区,纹状体及大脑皮层的损伤, 具有神经保护作用。结合前期研究结果,提示匹 诺塞林在脑缺血再灌注早期就已经发挥了明显的 神经保护作用,其作用机制复杂,可能贯穿于脑缺 血和再灌注整个过程。 NSE主要参与生物体内的糖酵解代谢,催化 α-磷酸甘油酸转化成为磷酸烯醇式丙酮酸。现已 发现 αα、ββ、γγ、αβ、αγ 5 种烯醇化酶同工酶,均 存在于细胞浆中,但只有 γγ 型特异性地存在于 神经元和神经内分泌细胞,被命名为 NSE。其含 量由高到低依次为脑、脊髓、周围 神 经 节[11-13] 。 正常情况下,体液 NSE 含量很低,当脑组织受缺 血缺氧等因素损伤时,细胞完整性遭到破坏,NSE 释放,通过血脑屏障进入血液和脑脊液。所以血 液和脑脊液 NSE 的含量可以反应神经元死亡的 程度[14-17]。 S100-β蛋白存在于中枢神经系统的神经胶 质细胞、前部垂体细胞和郎罕细胞,可促进神经元 分化、轴 突 生 长、胶 质 增 生 以 及 细 胞 内 钙 的 稳 定[18],被 认 为 是 神 经 胶 质 细 胞 的 标 志 蛋 白。

(4)

S100-β蛋白分子量大,正常情况下不能通过血脑 屏障。当缺血缺氧等因素使脑组织神经胶质细胞 损伤时,S100-β 可通过同时破坏的血脑屏障进入 血液循环。因此,血清中 S100-β 蛋白水平能反映 中枢神经胶质细胞的损伤和死亡程度。 有学者认为血液中 NSE 和 S100-β 可以作为 生化标志物,用于判断脑损伤程度和预后[19] 。本 研究中,大鼠脑组织缺血 2 h 再灌注 6 h,血清中 NSE和 S100-β 显著升高,说明脑组织神经元与神 经胶质细胞在短期内损伤已经很明显,血脑屏障 严重破坏。匹诺塞林能显著减少大鼠脑缺血 2 h 再灌 6 h 时神经胶质细胞分泌 S100-β,并使血清 中 NSE 水平降低,提示匹诺塞林能保护血脑屏 障,在脑缺血再灌注急性期就已显示出神经保护 作用,与病理观察结果一致。 综上所述,本研究证实了匹诺塞林在脑缺血 再灌注造成的脑组织损伤早期就呈现出神经保护 作用,能减轻脑缺血再灌注急性期损伤,这为其临 床研究提供了重要参考。同时结合脑缺血再灌注 的病理机制和特点,也为进一步深入探讨匹诺塞 林的作用机制提供了重要启示。 参 考 文 献

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Experimental study on effect of galanthamine reducing inflammatory

reaction in sepsis

YANG Yi,YANG Jin

ICU of the Third People's Hospital of Chongqing City,Chongqing 400014,China ABSTRACT AIM: To study the effect of brain

cholinesterase inhibitors galanthamine on anti-in-flammatory response in sepsis. METHODS: 50 Male SD rats were randomly divided into sham oper-ated ( SO ) group, sepsis ( SEP ) group, galan-thamine ( Gal) group,atropine ( Atr) group,galan-thamine + atropine ( Gal + Atr) group. Sepsis mod-el was produced by cecal ligation and puncture ( CLP ) . After 6 hours,IL-6,IL-1β and arterial blood lactic levels in blood were determined,and the tissues of lung and liver were harvested for his-topathological analysis. RESULTS: Compared with SO group,IL-6,IL-1β and lactic levels in blood were increased ( P < 0. 05) and there were obvious pathologic changes in the lung and liver tissues in

SEP group. Compared with SEP group,IL-6,IL-1β and lactic levels in blood were all increased ( P < 0. 05) and there were more pathologic changes in the lung and liver tissues in Atr group. Compared with SEP group,IL-6,IL-1β and lactic levels in blood were all decreased ( P < 0. 05) and the lung and liver tissue pathologic changes were slighter in Gal group. Atropine would offset such effects. CONCLUSION: Galantamine might reduce the in-flammation of sepsis by the cholinergic anti-inflam-matory pathway.

KEY WORDS sepsis; cholinergic anti-inflamma-tory pathway; galanthamine

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Pinocembrin prevented brain acute injury induced by focal cerebral

is-chemia-reperfusion

WU Cai-xia

1

,DU Guan-hua

2

1

Shandong Medical College,Linyi 276002,Shandong,China; 2

National Center for Pharmaceutical Screen-ing,Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100050,China

ABSTRACT AIM: The aim of this work was to verify neuroprotective and properties of Pinocem-brin,then provide a reference for further analysis of its mechanism on ischemic stroke. METHODS: The study was carried out on 50 male Sprague-Daw-ley rats,weighing 260 - 300 g,which were divided into five groups: ( i) control ( n = 10) ,( ii) I /R ( n = 10) ,( iii) I /R + Pinocembrin 1 mg /kg ( n = 10) ; ( iv) I /R + Pinocembrin 3 mg /kg ( n = 10) ; ( v) I /R + Pinocembrin 10 mg /kg ( n = 10) . Focal cerebral ischemia / reperfusion rats were induced by middle cerebral artery occlusion ( MCAO) for 2 h followed by 6 h reperfusion. Pinocembrin was ad-ministered in doses 1 mg / kg,3 mg /kg,10 mg /kg re-spectively at the same time of onset of reperfusion.

Then the blood NSE and S-100β were determined in addition to observe the pathological change of hippo-campus,penumbra cortex,and corpus striatum re-spectively. RESULTS: Pinocembrin-treatment ( 3 mg / kg or 10 mg / kg) significantly suppressed the levels of blood NSE and S-100β,and improved the morphology of brain cortex,striatum and hippocam-pus of acute focal cerebral ischemia reperfusion( 10 mg / kg) . CONCLUSION: Pinocembrin has neuro-protective effects to prevent brain ischemia / reperfu-sion acute injury.

KEY WORDS Pinocembrin; acute cerebral ische-mia reperfusion injury; NSE; S100-β

参照

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