は じ め に 我が国のイチゴ生産は，栽培面積7,000 ha，販売金額 1,700 億円と，イチゴは農業生産において極めて重要性 の高い品目である。しかし，近年，主要品種の変遷など により，難防除病害の被害が拡大している。特に，炭疽 病，萎黄病および疫病はイチゴの株を枯死させる病害で あり，イチゴ生産において経済的に大きな打撃を与えて いる。これらの病害の感染苗は，一定期間は病徴が現れ ず，感染していても外観では健全苗との区別が困難なた め，苗生産現場や圃場に持ち込まれ，病害感染の連鎖・ 拡大を引き起こしている。 そこで，千葉県農林総合研究センターを中核に，岐阜 大学をはじめ北海道，栃木県，静岡県，奈良県，佐賀県 の農業試験研究機関および株式会社ミヨシがプロジェク トチームを組み，遺伝子増幅法（PCR 法）によるイチ ゴ病害潜在感染苗の迅速診断技術の開発に取り組んだ。 本稿では，このプロジェクトの取り組みと研究成果につ いて紹介したい。 I イチゴ苗病害検査について イチゴの苗生産は，主にJA や公的機関が原原種苗を 維持・増殖し，生産者に配付している。生産者は，これ を親株として増殖した定植苗を，自家圃場に植えつけ果 実生産を行っている。したがって，この苗の流通・増殖 の各段階で，伝染性の病害に感染していない苗を育成・ 確保することが，苗生産において重要である。しかし， 現状では苗の生産時に病害に感染した苗を正確に判別す ることは困難である。このため，生産者は「この苗は大 丈夫か？絶対に病気にかからないようにしなければ」と いう意識が強く，苗に対する不安が精神的な負担となっ ている。その結果，過剰な農薬散布や必要以上の予備苗 の育成・確保を余儀なくされ，労力面，コスト面で多く の損失を受けている。このような苗生産に対する負担の 増加から，外部からの購入苗の利用を希望する生産者が 増加している。その一方で，苗生産を受託・販売する側 においても，苗の品質保証の観点から，効率のよい無病 苗検査システムが求められている。これらの問題を解決 するためには，苗の流通・増殖の各段階における苗の病 害検査体制の確立が急務である。 そこで，全国各地域の主要な産地および大量な苗生産 を目的としている企業団体の研究機関が共同で，苗の病 害検査方法を研究・開発するプロジェクトを計画した。 このプロジェクトは，平成21 年度新たな農林水産政策 を推進する実用技術開発事業に採択され，課題名「イチ ゴ健全種苗生産のための病害検査プログラムの構築」と して，平成21 年から 3 年間，第 1 に炭疽病・萎黄病・ 疫病の診断技術の開発，第2 に開発した診断技術につい て生産現場での信頼性評価・運用評価，第3 に病害検査 による病害発生の抑制効果の評価，第4 に開発した診断 技術の普及・定着を目標に，生産現場と結びついたイチ ゴ苗の病害検査システムの完成を目指して実施された。 II PCR 法によるイチゴ炭疽病の検出技術 Colletotrichum gloeosporioides によるイチゴ炭疽病は， イチゴ栽培において現在もっとも問題視されている重要 病害で，推定被害面積890 ha，被害金額 35 億円と見積 もられている。本病の主要な第一次伝染源は潜在感染苗 と推定されている（岡山，2009）。また，炭疽病潜在感 染苗では，発病前であっても分生子が飛散していること が確認されており（稲田ら，2011），効果的な防除対策 を行うには潜在感染苗の早期発見が必要である。 現在，生産現場では，エタノール浸漬法（ISHIKAWA, 2003）や選択培地を用いた平板希釈培養法（培養法）等 を用いて，苗の病害検査が行われている。エタノール浸 漬法は，安価であること，特殊な機材が不要なことから， 生産現場に広く普及している。 一方，炭疽病の病原菌である C. gloeosporioides は，同 じ種であるにもかかわらずイチゴを枯らす強病原性菌と イチゴに影響のない非病原性菌の存在が確認されている （口絵①）（植松ら，2002）。エタノール浸漬法や培養法 では，これらの強病原性菌と非病原性菌の識別が難し く，非病原性菌感染株も陽性株と判定するケースがあ る。SUZUKI et al.（2010）は，主要イチゴ産地から収集し た強病原性菌および非病原性菌についてrep―PCR によ る解析を行い，強病原性菌の大部分は一つのグループに
PCR 法を用いたイチゴ病害潜在感染苗検査法の開発
鈴木 健・吉田 菜々子
千葉県農林総合研究センターDevelopment of an Inspection Method Using PCR for the Dection of Strawberry Seedlings Diseased with Latent Infection. By Takeshi SUZUKI and Nanako YOSHIDA
類別されることを報告しており，PCR 法を用いて，こ のグループに属する菌を特異的に検出するプライマーを 作製している（鈴木ら，2008）。また，平山ら（2008）は， 炭疽病菌に潜在感染しているイチゴから病原菌DNA を 効率的に採取する方法を報告している。 そこで，本プロジェクトでは，PCR 法によるイチゴ 炭疽病の潜在感染株迅速診断技術の開発に取り組んだ。 以下に本法の手順を紹介する（図―1）。すなわち，①イ チゴの外葉葉柄基部を試料として採取する，②試料をサ ンプルチューブの中で前培養し，菌を増殖させる，③増 殖した菌体からDNA を抽出する，④強病原性菌特異検 出プライマーを用いたPCR を行い感染の有無を判定す る。検査の判定に要する時間は，培養法では2 週間以上 必要であるが，PCR法では前培養を含め3 ∼ 4日である。 図―2 は，奈良県のイチゴ苗生産現場において，同じ サンプルをPCR 法，選択培地を用いた培養法とエタノ ール浸漬法により検定を行った結果の比較である。エタ ノール浸漬法と培養法では，強病原性菌も非病原性菌も 検出してしまうが，PCR 法では強病原性菌のみを検出 している。 また，強病原性菌のみの検出率を比較すると，PCR 法は，エタノール浸漬法および培養法の3 倍であった。 なお，検査にかかる費用を計算したところ，PCR 法は 1 検体当たり178 円であった。 III PCR 法によるイチゴ萎黄病の検出技術 イチゴ萎黄病は，Fusarium oxysporum f. sp. fragariae によって引き起こされる土壌病害である。現在栽培され ているイチゴ品種は本病に対して感受性のものが多く， 全国的に発生が多くなっている。高温性病害である本病 はイチゴ栽培の育苗期に発生が多く，その伝染方法は土 壌伝染および育苗時にはランナーで伝染する。 栄養繁殖性のイチゴは，潜在感染した親株が翌年の伝 染源になるため，親株の潜在感染株検定を行い，汚染苗 を圃場へ持ち込まないことが最も大切である。近年，民 間業者による親株の販売や各都道府県や産地間での苗の リレー生産が増加し，苗の移動による広域的な汚染リス クが増大していることから，潜在感染株検定の重要性が ますます高まっている。 これまでイチゴ萎黄病菌の検出には，Fusarium oxys-porum 選択培地による培養法が一般に用いられてきた。 しかし，この方法では異なる分化型を含めたイチゴ萎黄 病菌以外の Fusarium 属菌も検出されるため，培養法に よる菌分離の後に生物検定を行う必要があり，判定に1 か月以上を要する。そのため，潜在感染した親株が圃場 へ持ち込まれて被害が拡大することが多い。 病原性菌株 非病原性菌株 検査日数：3∼4 日間 従来の培地法では検査に２週間以上が必要 病原性菌株 非病原性菌株 外葉の 葉柄基部 潜在感染 イチゴ苗 液体培地，2 日間 ①サンプリング 検査日数：3 ∼ 4 日間 従来の培養法では検査に2 週間以上が必要 ②前培養 ③DNA 抽出 ④nested PCR によるDNA 増幅 ⑤電気泳動による検出 イチゴ炭疽病菌の検出 図−1 PCR によるイチゴ炭疽病感染苗検査法のフローチャート 非病原性菌 強病原性菌 非病原性菌 強病原性菌 0 2 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 PCR 法 培養法 エタノール 浸漬法 検出率︵ ％ ︶ 4.5 1.5 1.5 3.5 注）生物検定により，非病原性菌はイチゴに病徴 を出さないことを確認した． 図−2 親株苗増殖圃場におけるイチゴ苗の炭疽病保菌検 定結果 （データ提供：奈良県農業総合センター）
そこで，本プロジェクトでは萎黄病の病原菌である F. oxysporum f. sp. fragariae に特異的な塩基配列を探索し， 潜在感染株から萎黄病菌のみを検出する方法を開発した （須賀ら，2011）。 萎黄病の検査では，潜在感染した苗を対象とする場合 と根を含む土壌を試料とした場合の2 種類の方法を開発 した（図―3）（平山ら，2011）。汚染源がある程度特定で きる状況で，土壌伝染が疑われる場合には培養土を，親 株からのランナー伝染が疑われる場合にはランナーを用 いる。しかし，実際には汚染源を絞りきれないことも多 いため，本検査法では可能な限り培養土とランナーの両 方を用いて検出精度を高めるようにしている。 苗の検査は，ランナーや葉柄基部を試料に用い，Fo― G2 選択培地（NISHIMURA, 2007）で前培養を行い，増殖さ せた菌体からDNA を採取し PCR を行う方法を採用し た。これは，イチゴ導管内に感染している萎黄病菌を培 養液中で増殖させることで，煩雑な摩砕作業を省く目的 もある。一方，根および土壌の検査は，DNA 抽出方法 としてLIらの改変塩化ベンジル法（LI et al., 2011）を用 いることで可能となった。土壌からのDNA の抽出につ いては，DNA の土壌吸着や阻害物質の影響等の問題を 克服するために，これまで様々な方法が開発されてきて いるが，LIらの方法は，様々な土壌から安定的にDNA 抽出を可能とした。 表―1 は，イチゴ萎黄病に感染した親株から発生した 小苗がどの程度感染していたかをPCR 法と従来法であ る培養法で調査し，比較した結果である。同じ葉柄基部 を試料とした場合の検出率を見ると，PCR 法は培養法 に比べ3 倍以上の高感度であった。このように PCR 法 による萎黄病感染苗検査法は，従来法と比べ有利である と考えられた。 IV PCR 法によるイチゴ疫病の検出技術 イ チ ゴ 疫 病 は，Phytophthora nicotianae，P. cactorum および Phytophthora sp. によって引き起こされる土壌病 害である。主に産地で発生して問題となるのは P. nico-tianae と P. cactorum である。疫病菌はイチゴのクラウ ンと根の基部から感染し，クラウンの褐変と根の腐敗を 引き起こして植物体を萎凋・枯死させる。これらの病徴 は，イチゴ炭疽病とよく似ており，炭疽病もクラウンの 褐変を呈するため，一見しただけでは疫病と炭疽病の区 別は難しく，産地ではしばしば疫病と炭疽病が混同され て処理されている。疫病と炭疽病では有効な防除薬剤が 異なるため，両病害が混同されると適切な防除がなされ ず，菌の残留による再発が懸念される。 本病は，発病圃場の罹病残さや土壌が伝染源となるほ か，感染苗の持ち込みによって発生する場合も考えられ ランナー採取 培養土採取 表面殺菌 Fo―G2 液体培地 （振とう培養） Fo―G2 液体培地 （静置培養） PrepMan1/2 法 改変塩化ベンジル法 萎黄病菌検出用 プライマー アガロースゲル 電気泳動 ①サンプリング ②前培養 ③DNA 抽出 ④PCR ⑤判定 図−3 PCR によるイチゴ萎黄病感染苗検査法のフローチャート 表−1 イチゴ萎黄病菌感染親株から採苗した苗における PCR 法 および従来法による検出率 検査法 検査試料 1） （部位） 供試株数 萎黄病菌検出株率 （％） PCR2） 葉柄基部 根 75 75 34.7 46.7 培養法3） 葉柄基部 75 10.7 1）2010 年 5 月 10 日にイチゴ萎黄病菌分生子懸濁液を親株（品 種： さがほのか ）に灌注接種．伸長したランナー先端苗を随時 採苗し7 月 12 日にランナーを切り離した 75 株を供試．検定試料 は7 月 30 日にそれぞれ採取． 2）DNA 抽出は試料を Fo―G2（Fusarium 属菌選択培地）液体培 地で48 時間振とう培養後 MgEx kit により実施し，イチゴ萎黄 病菌検出用プライマーを用いたPCR を実施． 3）Fo―G2 培地を用いた培養法により検出． （データ提供：佐賀県農業研究センター）
る。そのため，親株の病害感染を判別する技術が求めら れていた。そこで，P. nicotianae および P. cactorum を 汚染土壌から検出する方法を開発した（LI et al., 2011）。 P. nicotianae および P. cactorum は全国に広く分布して おり，佐賀県や千葉県では，同一の圃場から2 種類の疫 病菌が同時に検出された事例があった。そのため本検査 法では，マルチプレックスPCR 法により 2 種の疫病菌 を同時に検出する方法を採用した（図―4）。 また，疫病感染イチゴ苗からの検出については，P. nicotianae 人工感染モデルを用いた調査を行い，P. nico-tianae はイチゴの根から高率に検出されることを明らか にした（表―2）（鐘ヶ江ら，2011）。 これらの成果をもとに，イチゴの根および土壌を検体 とし，マルチプレックスPCR 法を用いた疫病潜在感染 苗迅速検査法を確立した（図―5）。本法は，発病前の潜 在感染苗および汚染土壌からも病原菌の検出が可能であ る。疫病の感染は主に汚染土壌から侵入するものと考え 表−2 人工接種モデルにおける発病株からの P. nicotianae の部位別検出率 品種 調査株数 部位別検出率（%） クラウン 根 細根 葉柄基部（葉位） 1 2 3 4 とちおとめ さちのか 章姫 ふさの香 紅ほっぺ 桜香 紅香 2 2 2 5 8 9 9 100.0 100.0 100.0 60.0 87.5 88.9 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 87.5 77.8 100.0 50.0 100.0 100.0 100.0 87.5 100.0 100.0 100.0 50.0 50.0 60.0 50.0 100.0 100.0 50.0 50.0 0.0 80.0 62.5 77.8 88.9 100.0 50.0 50.0 60.0 62.5 55.6 88.9 50.0 0.0 0.0 100.0 75.0 33.3 77.8 注1）2010 年 9 月 29 日接種，10 月 27 日調査． 2）葉位は最外葉を1 とした． （データ提供：千葉県農林総合研究センター） ①サンプリング ②DNA 抽出 ③マルチプレックスPCR 根と土壌を採取 DNA 抽出 （改変塩化ベンジル法） P. nicotianae，P. cactorum 種特異プライマーおよび18S ユニバーサルプライマーによ るマルチプレックスPCR 2 ∼ 3％アガロースゲル 電気泳動により判定 ④電気泳動 図−4 PCR によるイチゴ疫病感染苗検査法のフローチャート P. nicotianae P. cactorum 18S プライマー 増幅産物 図−5 マルチプレックス PCR による疫病汚染土壌からの 疫病菌検出結果 （岐阜大学 景山幸二氏 原図）
られる。そのため，本法による検査は疫病のまん延防止 に貢献できる。 V 産地に適応した病害検査プログラムの確立 本事業により作成したイチゴ感染苗検査法は，各参画 機関の産地に導入し，評価と有効性の確認を行った。そ れぞれの産地では，主力品種が異なり，気候，栽培方法， 増殖体制も様々である。そこで，本プロジェクトでは， PCR 法による炭疽病，萎黄病，疫病の潜在感染苗検査 法を検査マニュアルとしてとりまとめ技術の標準化を図 った。この検査マニュアルをベースに，それぞれの産地 の苗生産体系の中で，いつ，どのように，どのくらいの 株数を検査すれば最も効率よく，高い効果が得られるか を検討した。これをもとに，各産地に適応させた検査プ ログラムを策定し，産地の先導的地域・団体等の苗生産 現場でシステムとして病害検査を実施している。 表―3 は，栃木県の各苗生産段階（県・JA 等の苗増殖 施設）に本検査システムを導入する前と導入した後での 果実生産圃場における炭疽病の発生状況を示したもので ある。苗の増殖現場への検査システム導入により，育苗 圃場（データ省略），本圃場ともに炭疽病の発生を少な く抑えることができた。これは，特に各苗生産段階にお いて炭疽病潜在感染株を未然に除去できたことや，生産 者が苗の病害発生リスクを具体的に実感できるようにな ったため病害防除の意識が高まったことが原因ではない かと考えている。このように潜在感染苗検査が定着し， 健全苗の育成・確保が実現されると，農薬の過剰散布も 抑制され，生産者にとっては精神的・肉体的にも安全・ 安心，消費者にとっても安心して食べられるイチゴの生 産が実現できるものと期待される。 なお，本事業の成果は，事業終了後に公開し，希望す るJA や普及指導機関，生産者組織，あるいは他の県へ 技術の伝達を行う予定である。 お わ り に PCR 法を用いた病害診断は，特殊な器具・試薬が必 要であり，一般的な技術となるには検査の環境整備が前 提条件となり，このことが本技術の導入・普及を妨げる 要因と考えられる。しかし，最近では，公的機関の機材 を利用できるオープンラボなどのサービスや植物病院 （プラントクリニック）構想等が具体化しつつあり，一 般の人がこれらの検査法を活用できる環境が整いつつあ る。近い将来，これらの方法が土壌診断などと同様に， 農業生産現場で普通に利用される技術になるものと確信 している。 引 用 文 献 1） 平山喜彦ら（2008）: 日植病報 74 : 198（講要）. 2） ら（2011）: 平成23年度日本植物病理学会大会（講要）： 76. 3） 稲田 稔ら（2011）: 九病虫研報 57 : 45 ∼ 50. 4） ISHIKAWA, S.（2003）: J. Gen. Plant Pathol. 69 : 372 ∼ 377.
5） 鐘ヶ江良彦ら（2011）: 関東東山病虫研報 58 : 113（講要）. 6） LI, M. et al.（2011）: Plant Disease 95 : 1270 ∼ 1278.
7） NISHIMURA, N.（2007）: J. Gen. Plant Pathol. 73 : 342 ∼ 348.
8） 岡山健夫（2009）: 農業技術 64 : 545 ∼ 552. 9） 須賀晴久ら（2011）: 日植病報 77 : 62（講要）. 10） 鈴木 健ら（2008）: 同上 74 : 198（講要）.
11） SUZUKI, T. et al.（2010）: J. Gen. Plant Pathol. 76 : 247 ∼ 253.
12） 植松清次ら（2002）: 日植病報 68 : 201 ∼ 202（講要）. 表−3 検査システム導入前後のイチゴ炭疽病発生状況（％） 調査地域 検査導入前（2009）の生 産圃場の発生状況1） 検査導入後（2011）の生 産圃場の発生状況2） 圃場1 圃場2 圃場1 圃場2 A B C 20.2 2.2 10.7 18.5 2.3 11.7 1.0 0.3 7.7 0.7 1.3 6.7 1）発病状況は，11 月 9 日に各地域 2 圃場を対象に各 600 株を 見取調査した． 2）発病状況は，11 月 18 日に各地域 2 圃場を対象に各 300 株を 見取調査した． （データ提供：栃木県農業試験場）
