Title
Establishment and characterization of the cell line (GRO-80) from
5, 6-dimethoxysterigmatocystin-induced rat osteosarcoma( 内容
の要旨(Summary) )
Author(s)
牧田, 浩樹
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第344号
Issue Date
1997-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14801
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氏名 (本籍) 学位▲の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 牧 田 活樹､(岐阜県)･
博士(医学)二
甲第1■二34ノ4 号一 平成 9 年 3 月 25 日学位規則第4条第1項該当
Estab[ishmentapdchara9teri甲ti9nOfthece)Hine(GRO-80)from 5,6-dimethoxy岳t占rigm占totYstih-ihdi]CBd ratosteosarcoma (主査)教授 立 松 憲 親 (副査)教授 森 秀▲樹薮授
宮 由■英 雄 論 文 内 容 の 要 旨 実験的誘発骨肉腫から樹立された細胞株はラットやマウスの頭蓋骨などから得られる初代培養骨芽細胞に比べ,細胞の均一性があり.継代培養を重ねることによる性状の変化の少ないことから,骨代謝における骨芽細胞の生
物学的,生化学的特性を究明する骨芽細胞様細胞株として有用である｡また.腫瘍の病理学的特性を究明するこ とにおいても有用である｡本研究は真菌の1つであるA甲即官よ∼∼揖mび眈0わrの代謝産物から抽出した5t6_ dimethoxysterigmatocystinによって誘発された皮下継代移植可能なラット骨肉腫から培養細胞株(GRO-80) の樹立を試み,その骨芽細胞様の特徴を始めとする生物学的特性を検討した｡ 研究材料と方法 近交系堆F344ラットにおける5.6-dimethoxysterigmatocystinの連続経口投与実鰍こおいて発生した骨肉腫の 皮下継代移植株を実験材料として用いた｡本腫瘍は継代皮下移植にて維持でき,豊富な骨頬骨形成を有し,他臓 器への転移をはとんど認めない腫瘍である｡初代培養はt皮 F継代移植株80代目の腫瘍組織を,1mg/mlヒア ルロニダーゼと2mg/mlコラゲナーゼにより酵素消化して得た腫瘍細胞を用いて行った｡初代培養および継代 培養における培養液はRPMI1640にウシ胎児血清を10%添加して用いた｡初代培養細胞中に敷石状配列を示す多 角形の細胞からなるコロニーを認め,このコロニーからクローニングし樹立した細胞株をGRO-80と命名した｡ 本細胞株について,位相差顕微鏡による形態的観察に加えて,その増殖能を評価するため増殖曲線の作成および 倍加時間の算出と･対数増殖期におけるS期細胞の比率(5-bromo-2･一deoxyuridine(BrdU)標識率)を求めた｡ また一骨芽細胞様の特性を追求するためMajeskaらの方法によるアルカリフォスファターゼ活性の測定とアゾ色 素法によるアルカリフォスファターゼ細胞化学染色50〟g/mlのアスコルビン酸と10mMのβ-グリセロリン 酸を添加した培地を用いた培養器内での骨形成実験を行った｡さらに,骨芽細胞や骨細胞の細胞間におけるCa, CAMPなどの低分子の物質輸送の関与や骨芽細胞系細胞間の同調した機能発現に中心的な役割を果たしているこ とが推測されているギャップ結合の関連蛋白であるコネキシン43の免疫蛍光染色を行った｡加えて,本細胞株の F344ラットへの戻し移植実験も行った｡ 結果および考察 位相差顕微鏡による観察では樹立細胞株GRO-80は対数増殖期においては紡錘形ないし多角形を示し単層でシー ト状の増殖形態を示した｡飽和状態に近づくにつれて,細胞は密で小型の円形または多角形の形態になり,接触 阻害の欠如のため多層化したり浮遊する細胞も観察された0この形態学的特徴はすでに樹立,報告されている骨 肉腫由来の骨芽細胞様細胞株とほぼ同様の所見であった0本細胞株の増殖曲緑より求められた倍加時間は,約20 時間であった｡この細胞株の発育にはウシ胎児血清の添加を必要とし,10%ウシ胎児血清添加時のBrdU標識率 は3%ウシ胎児血清添加時の約2倍であった｡コネキシン43の免疫蛍光染色による観察では隣接する細胞間の接触 部位においてコネキシン43の発現を認め,コネキシン43が核周囲や細胞膜間との中間に存在するところも認めら れた0したがってt コネキシン43は核周囲から隣接する細胞間の接触部位へ移動する可能性が示唆された｡この-45-ような骨肉腫由来の骨芽細胞様細胞の特徴にもかかわらず,細胞株のアルカリフォスファターゼ活性は飽和状態 後も低く,通常の培養器内での骨形成は認められなかった｡またi-50βg/ぬ1のアスーカルビン酸と10mMのβ-グリセロリン酸を添加した培地を用いた骨形成実験でも石灰化結節は観察されなかっった｡一方∴細胞株の戻し移 植実験では一部に骨頬骨形成を伴う骨肉腫が形成された｡以上の結果より,1本樹立細胞株はギ車プ結合細胞間コ ミュニケーションなどの生物学的研究や骨肉腫の病理学的研究に有用であると考えられた｡.r㌧ '.､ ･ ･.､･､ ･▲ ■･ ト.● ･･ _･ L)････∴｣･･
･:論文審査の結果の要旨
‥ モ･申請者牧田浩樹は5･6-dim叫0茅アSterig甲atPCySt≠nによって誘発され串原下継代移植可能なラット骨肉腫から
培養細胞株(GRO-80)を樹立し,そゐ骨芽細胞様の癌徴を始めとする生物学的特性を明らかにした｡本研究で
樹立された細胞株は骨芽細胞系細胞間の同調した機能発現に中心的な役割を果たしていることが推察されている ギャップ結合の解明や転移の少ない骨肉腫から樹立された細胞株として骨肉腫の病理学的研究に有用であり,口 腔外科学の発展に少なからず寄与するもーのと認める｡二三･,∼べ 申 [主論文公表誌]′Establishmen二t･Ahd chara.cterizationlbf the c6111ine⊥J(GRO-80)fro血●5,6-dimethoxysterigiTlatdcystinこ ind11Ced rat osteosarcohla
l平成9年1月発行▲岐阜大医妃 45(1)ご62∼71 責 P ヽ t
