博 士 （ 農 学 ） 上 野 豊
学 位 論 文 題 名
微生物検出・定量の新規手法開発及び
動物消化管微生物群集解析への応用に関する研究 学位論文内容の要旨
本研究では、分子生物学的技術に基づく、微生物群集中の特定グループ定量に適した手法を開発 した。さらに、開発した手法を用いて動物消化管微生物群集の解析を行い、様々な環境変化に対応 して迅速に群集構造が変化していることを明らかにした。
1．微生物検出・定量新規手法の開発
本研究では現在の分子生物学的技術をもとにした、微生物群集中の特定グループの定量を迅速に 行 える手法 を考案 し、その 有用性 を検証し た。本手 法は、 リポヌク レアーゼH (RNaseH）とDNA プ ローブを 用いた反応系により、すべての微生物に由来する小サブユニットリボソームRNA (SSU
rRNA)の中から特定微生物に由来するものだけを選択的に切断し、ほかの微生物由来のrRNAと区別
して検出することを特徴とする。この着想に基づぃて、微生物群集から標的微生物を特異的に検出 す るため の条件 検討を行 った。大 腸菌rRNAを 用いて 、DNAプ ローブとRNaseHによる 配列特 異的 rRNA切 断が起 こることを確認後、切断反応条件を最適化した。反応液中にホルムアミドを添加す る ことによ り、既 に開発さ れてい るDNAプ ローブを使用した配列特異的rRNA切断が可能であるこ とを示し、本手法によるさまざまな分類レベルのグループ検出を可能にした。また、開発手法により 廃水処理汚泥・牛糞において形成されている微生物群集中の特定グループを定量し、実環境サンプ ルへの利用が可能であることを示した。以上より、本手法は、環境サンフンレや医療サンフンレ中に含ま れ る 特 定 微 生 物 を 、 検 出 、 定 量 す る た め の 手 法 と し て有 用 で ある こ と を明 ら か に した 。
2．動物消化管微生物群集解析への応用
（ 1） 配 列 特 異 的 SSU rRNA切 断 法 に よ る ル ー メ ン 微 生 物 群 集 の 定 量 的 解 析 開発手法の動物消化管微生物群集解析への応用として、ウシルーメン微生物群集のグループ別定 量を行った。まず、現在知られているルーメン微生物の分子的解析結果を系統分類の観点から詳細 に検討し、ルーメン内の代表的な細菌群を検出できるDNAプローブの開発を行った。これらのプロ ーブを使用して、ウシルーメン内溶液から抽出したRNA溶液を試料とし、本手法に供した結果、ル ーメン内に存在する微生物（細菌及ぴ古細菌）の70%以上をグループ別に定量可能であった。本試 験は、ウシルーメン微生物群集の主要メンバーを定量した最初の実例であり、種カの条件設定下で の 飼 養 試 験 に お け る 、 ル ー メ ン 微 生 物 群 集 の 動 態 解 析 に利 用 可 能で あ る こと を 示 した 。 ―80―
(2)暑熱ストレスがウシルーメン細菌叢に及ばす影響の評価
暑 熱ストレ スがウシ ルーメ ン細菌叢に及ばす影響を調査するため、乳牛育成牛4頭を用いた飼養 試験を行った。本手法を用いた定量的解析により、暑熱ストレスによってルーメン細菌叢の構成が、
グ ループレ ベルで変 化して いること を示し た。っま り、気 温の上昇 に伴ってE rec talr￡ coccoidesグルー プ及びStreptococcusが 増加した 一方で 、Fibrobac terが減少した。さらに、
Firmicu tesに属する未培養細菌群であるUnknown Clostridium clusterが、ルーメン細菌叢の主 要メンバーとして存在していることを示すとともに、その一部にっいては暑熱ストレスの影響で量 的に変動する傾向にあることを明らかにした。このようなルーメン細菌叢の変動は、環境温度の上 昇に応じて粗飼料の採食量が減少し、相対的に配合飼料の採食比率が高くなるといった採食内容の 変化と関係していることを明らかにした。
(3)配列特異的SSU rRNA切断法による子牛糞便細菌叢推移の解析
乳牛 雌子牛4頭につ いて、 出生後1週齢 から12週齢 までの 糞便を定期的に採取し、本手法によ り 細 菌 叢 構 造 を 解析 し た 。そ の 結 果 、こ の 時 期の 子 牛 糞便 細 菌 叢が2つ の主 要 な 門で あ る Bac teroide tes.厄rmicuオおに属している菌で占められていることを明らかにした。そのほかの門に属 するグル‐プでは、出生時〜離乳前の時期にFaecalibac teriumイtopobiumが主要なメンバーであっ た。他にEn terobac teriaceae丶LactobacillurEnterococcus及ぴBifidobacteriumも検出された。
離乳後はこれらに代わって、Firmfcufesに属する未培養ルーメン細菌群や鬥む〇ぬcオばが検出され るようになった。こうした消化管細菌叢の変動は、特に離乳前後で顕著であり、子牛は成熟した反 芻動物になるまでの機能的、形態的な消化管の発達と対応して、細菌叢が変化していることが示唆さ れた。また本試験の結果、哺育期の子牛において、ビフィズス菌や乳酸桿菌が離乳前後の時期に消失 していることを明らかにした。
(4)プロ バイオテ ィック乳 酸桿菌 含有ヨー グルト の摂取が ヒト糞 便細菌叢 に及ばす 影響の評価 本手法は、ヒト糞便細菌叢を構成する主要グループの定量にも利用可能であることを示した。す な わち、 成人男女ボランティア15名によるヨーグルト摂取試験を実施し、市販のプロバイオティ ック乳酸菌含有ヨーグルトを摂取することによる糞便細菌叢への影響について調査した。20日間の ヨーグルト摂取により、プロバイオティック乳酸桿菌含有ヨーグルトを摂取したボランティアでは、
消化管におけるプロバイオティック株の生存が認められた。また、多くのポランティアにおいて、
ヨ ーグル トの摂取 期間中にBacteroider Prevotellaが減 少し、Erectale ‑ビcoccoidesグルー プが増加する傾向が観察された。また、ヨーグルト摂取前にBi idobac teriumの割合が低かった3 名のポランティアにおいて、ヨーグルト摂取期間中にその比率が増加していたことが観察された。
これらの傾向は、プロバイオティック乳酸菌含有の有無とは無関係に観察されたことから、特定種 類のヨーグルトを摂取することによる糞便細菌叢への影響は軽微であり、ヨーグルト摂取自体の影 響のほうが大きいと推察した。
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
微生物検出・定量の新規手法開発及び
動物消化管微生物群集解析への応用に関する研究
消 化 管 微 生 物 は 宿 主 動 物 の 健 康 や 栄 養に 多大 な 貢献 を果 たし てい るが 、そ の解 析は 対象 が 複雑 であ り 困難 を極 めて いる 。本 研究 はこ れら 微生 物群 集の 解析 に 有効な手法を開 発し、
そ の応 用を 図 った もの であ り、 内容 は以 下の よう に要 約さ れる 。
微 生 物 群 集 中 の 特 定 グ ル ー プ の 定 量 を迅 速に 行 える 手法 を考 案し 、そ の有 用性 を検 証し た 。 す な わ ち とDNAプ ロ ー ブ と 微 生 物 に 由 来 す る り ボ ソ ー ムRNA (rRNA)を反 応さ せ、 その 中 か ら 特 定 微 生 物 に 由 来 す る も の だ け をり ボヌ ク レア ーゼH(RNaseH）で 選択 的に 切断 し、
ほ か の も の と の 区 別 を 図 っ た 。 ま ず 大 腸 菌rRNAをDNAプ ロ ー ブ と 反 応 さ せ 、RNaseHに よ る 配 列 特 異 的 切 断 が 起 こ る こ と を 確 認 後、 ホル ム アミ ドの 適量 添加 によ り切 断反 応条 件を 最 適化 する こ とで 、様 々な 細菌 グル ープ の検 出が 可能 なこ とを 実証 し た。さらに本手 法によ り 廃 水 処 理 汚 泥 や 牛 糞 の 特 定 細 菌 グ ル ープ を定 量 し、 実環 境サ ンプ ルへ の利 用が 可能 であ る こと を示 し た。
本 手 法 を 用 い ウ シ ル ー メ ン 微 生 物 群 集の グル ー プ別 定量 を行 うべ く、 ルー メン 内の 代表 的 な 細 菌 群 を 検 出 で き るDNAプ ロ ー ブ の 開 発 を 行 っ た 。 ウ シ ル ー メ ン内 溶液 から 抽出 した RNAを 試 料 と し、 本手 法に 供し たと ころ 、ル ーメ ン 内に 存在 する 微生 物（ 細菌 及び 古細 菌）
の70%以 上 を グ ル ー プ 別 に 定 量 可 能 で あ っ た 。 こ の 成 果 は ウ シ ル ー メン 微生 物群 集の 主要 メ ンバ ーを 定 量し た最 初の 実例 であ る。
次 に 暑 熱 スト レス カ ミウ シル ーメ ン細 菌叢 に及 ばす 影響 を調 査す るた め、 乳 用育 成牛4頭 を 用 い た 飼 養 試 験 に 本 手 法 を 応 用 し た 。気 温の 上 昇に 伴っ てル ーメ ンのE rec tale―e coccoidesグ ル ー プ 及 ぴStrep tococcusが 増 加 し た ー 方 で 、Fibrobac terが 減少 した 。さ ら に 、Firmicutesに 属 す る 未 培 養 細 菌 群 で あ るUnknown Clostridium clusterが 、主 要メ ン バ ー と し て 存 在 し て い る こ と を 示 し た。 また 、 その 一部 にっ いて は暑 熱ス トレ スの 影響 で 量 的 に 変 動 す る 傾 向 に あ る こ と を 明 らか にし た 。こ のよ うな 変動 は、 環境 温度 の上 昇に
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男 一
人 聡
泰
洋
朗
林 形
村 池
小
鎌
玖
小
授
皴
授
教
教
額
教
助
査
査
査
査
主
副
副
副
応じて粗飼料の採食量が減少し、相対的に配合飼料の採食比率が高くなるといった採食内 容の変化と関係していることを明らかにした。
さら に乳牛雌 子牛 4 頭に ついて、出生後1 週から 12 週齢までの糞便を定期的に採取し、
本 手 法に よ り細 菌 叢 を解 析 した 。 その 結果、子 牛糞便細 菌叢が 2 つ の主要な門 である Bac teroide tes. Firmicutes に属している菌で占められていることを明らかにした。そのほか の門に属するグループでは、出生時〜離乳前の時期にFaecalibac terium 、メtopobium が主要 なメンバーであった。離乳後はこれらに代わって、Firmicutes に属する未培養ルーメン細 菌群やFibrobac ter が検出されるようになった。こうした細菌叢の変動は、特に離乳前後 で顕著であり、子牛は成熟した反芻動物になるまでの機能的、形態的な消化管の発達と対応 して、細菌叢が変化していることが示唆された。また哺育期の子牛において、ビフアズス菌 や乳酸桿菌が離乳前後の時期に消失していることを明らかにした。
最後に、プロバイオティック乳酸桿菌含有ヨーグルトの摂取がヒト糞便細菌叢に及ばす 影響の評価に本手法を応用した。成人男女ボランティア 15 名によるヨーグルト摂取試験を 実施し、市販のヨーグルトを摂取することによる糞便細菌叢への影響について調査した。
20 日間のヨーグルト摂取により、消化管におけるプロバイオティック株の生存が認められ た 。 ま た 、 多 く の ボ ラ ン テ ィ ア に お い て 、 ヨ ー グ ル ト の 摂 取 期 間 中 に Bac teroides‑Prevotella が 減少し、 Erectale ‑C coccoides グループが 増加する 傾向 がみられた。また、ヨーグルト摂取前に Bif idobac terium の割合が低かった3 名のポラン ティアにおいて、ヨーグルト摂取期間中にその比率が増加していたことが観察された。こ れらの傾向はプロバイオティック乳酸菌含有の有無とは無関係に観察されたことから、特 定のヨーグルトを摂取することによる糞便細菌叢への影響は軽微であり、ヨーグルト摂取 自体の影響のほうが大きいと推察した。
以上の成果は、分子生物学的情報を駆使し、動物消化管の微生物群集を占める主要なグ ループの定量に適した手法を新たに開発できたことを明示しているぱかりでなく、開発し た手法を用い、諸環境に対応して変化する消化管細菌の群集構造をとらえたものである。
手法は応用性が高く、動物の消化管生理に関わる多くの情報を提供できると期待される。
よっ て、審 査員一同は 、上野豊 が博士（ 農学）の 学位を受 けるのに 十分な資格 を有 するものと認めた。
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