博 士 （ 医 学 ） 茶 本 健 司 学位論文題名
The Critical Role of Thl − dominat Immunity ●
mTumorImmunology ●
（腫瘍免疫におけるTh1 主導型免疫応答の重要性）
学位論文内容の要旨
多 くの 癌 抗原 が人 癌等 で同 定された現在 、がんに対する免疫治療法に 期待がよせられている。し かし 現 在広 く行 わ れて いる 癌ワ クチ ン療法はただmztjor histocompatibility complex (MHC) classI結合 性癌 抗 原ベ プチ ド だけ を免 疫す る方 法が主流であ り、あまり治療効果が期待で きないのが現状である。ま た免 疫 パ ラン スはThl/Th2パラ ンス に よっ て制 御さ れて い るが 、ど の様 な 免疫 パラ ンス の状 態 が最 も効 率良 く 抗腫 瘍免 疫 を誘 導で きる のか 現時点であま り厳密に吟味されていない。 私は担癌生体における免疫 抑制 を 打 破し 最終 目標 であ る 癌特 異的cytot・ のdCTlymphom．e（Cnjを 誘 導す るた めに 、自 然 免疫 、獲 得性 免 疫 を 含 め たm11夕 イ プ 主 導 型の 環境 、 すな わち 恥ゆ ヶ1型免 疫を 担 癌生 体に 導入 する 必 要が ある こと を 世 界 に 先 駆 け 主 張 し て き た 。 特 に 癌 特 異 的n11細 胞を 中心 とし てBゆe11型 免疫 を活 性 化し 、最 も効 率の良い 、臨床応用可能な癌免疫治療 法の開発とそのメカニズム の解析を行ってきたのでここに報告する。
D´rhl細胞治療のMHCクラスII陰性 腫癌への応用とそのメカニズ ムの解析
【 目 的 】 当研 究室 では これ ま で′ ．11が直 接反 応 し得 るMHCclaSsn陽性 腫瘍 を 用い て、 冊11細 胞治 療 が 有効 で あり 生着 した 癌が 実 際に 拒絶 されることを実証していき た。しかしヒトに応用するこ とを考えた 場 合 、 ヒ ト の 腫 瘍 で は ほ と ん ど の 腫 瘍 がMHCdaSsu陰 性 腫 瘍 で あ る 。 皿11細 胞 治 療 の臨 床へ の 応用 を 考 え た 場 合 、MHCdaSsn陰 性 腫 瘍 を 拒 絶 で き る 新 し い 戦 略 を 考え る 必要 があ る。 そこ で 今回 、MHCdaSs n陰 性 でMHCdaSsI陽 性 腫 瘍 に 対 し て も 皿11細 胞 治 療 カ 潮 で あ る こ と 証 明 し 、 そ の 初 期 腫 瘍 免 疫 活 性化メ カニズムについて検討したの で報告する。
【 方 法 お よ び 繊MHCdassH陰 性 腫 瘍 と し てEI′4にovalbmin（ 〇VA） 遺 伝 子 を 導 入 し たEGー7 を 用 い 、O、 ′A特 異 的 なTh1はar2ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス の ナ イ ー プCD4陽 陸T細 胞 か ら 誘 導 し た 。 治 療 はC57BL/6にBG−7（2X1∞ を 接 種 し 腫 瘍 径 が8〜10mmに な っ た と こ ろ で 開 始 し た 。1回 治 療にっ きO、′ApIla晒nく200ug）を 腫瘍内投与し、Oヽり丶特異的皿11（2x10つを尾静注により投与した。2日 お き に3回 治 療 を 行 っ た と こ ろ 、Th1の み、 癌抗 原の みを 投 与し たマ ウス では 全 く腫 瘍の 拒絶 は 誘導 で き な か っ た が 、 両 者 を 同 時 に 投 与し た 時に のみ 腫瘍 は完 全 に拒 絶さ れた 。次 ぎ に、 螢光 ラベ ル され た A］e期 て ）V．A抗 原、CF顕yrh1細 胞を 用い 腫瘍 拒 絶に 至る 初期 腫 瘍免 疫活 性化 機構 を詳細に 検討した。
そ の結 果 、腫 瘍内 投与 され たA］e翻く ）v．Aを プ ロセ シン グし たAPC（dendnacceu：DC，maCt10phage： Mゆ は15分 以 内 に 所 属 リ ン パ 節 に 移 住し 、m11細 胞もi．v． 投与 後15分以 内に 各 リン パ節 、脾 、 腫瘍 内 に 移 住 し た 。 興 味 深 い こ と に の ′Aとm11細 胞両 者を 投与 さ れ腫 瘍を 完全 に拒 絶 した 群に おい て のみ 、 治 療 開 始35時 間 前 後 で 所 属 リ ン パ節 に おけ る移 入皿11細 胞 の激 しい 分裂 が観 察 され た。 また 、 その 現
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象に伴って、宿主DC，M￠，natural killer (NK) cell，CD4+T，CD8+T細胞も同時に活陸化され、初期活性 化マ ーカーCD69の強発現 が誘導 された。さらに、所属リンパ節の初期腫瘍免疫活性化段階において AI:℃/Thlの直接接着を介した相互作用も観察された。所属リンパ節に引き続き、腫瘍内においても移入 rIhlの活発な分裂カ諦鼈忍され、さらに2回治療後には、Thlによるlocal helpの活性化により、腫瘍内 に癌特異的te缸召mer十CD8゛のLが高頻度に誘導されていることが証明された。所属リンパ節や腫瘍内 に浸 潤したCD8゛T細胞はEG一7特異的に細胞傷害活性を示し、〇VAte缸．amerを添加することで細胞 傷害活性が消失した。従って皿11細胞のlocalhelp導入によって腫瘍内に誘導されたtetramer十CD8＋ CILが腫瘍拒絶の最終エフェクター細胞として働いているもの考えられた。
【結論】腫瘍内投与された癌抗原を提示した」゜齢は、抗原投与15分以内に腫瘍組織から所属リンバ節 に移住し、移入Th1と相互作用を示し、珊11細胞の活発な増殖および宿主抗腫瘍エフェクターの活性化 を誘導する。次ぎに、腫瘍内において移入Th1細I胞の活性化、さらには腫瘍特異的なtetramer十CD8゛CIL の活´陸化が誘導され、腫瘍の拒絶を誘導することが証明された。以上、n11細胞治療はMHCclaSsn陰 性MHCdassI陽性腫瘍を用いた治療モデルにおいても、locmh（め導入を介した抗腫瘍活性の増強が可 能であることが示された。
ID癌 特異 的Tcell receptor（1℃ 恥 遺伝 子 導 入に よ る 非特 異 的Thl細 胞の 腫 癌 へ のタ ー ゲ ッテ イング
【目的】I）ではlvlHC class II陰性腫瘍においても癌特異的Thlを用いて全身的な抗腫瘍免疫を惹起でき、
癌を完全治癒できることを述べた。しかしヒトに応用することを考えると癌特異的Thlを短時間で大量 に誘導することは現状では困難であるというもうーつの壁が存在する。今回私は、癌特異的TCR遺伝子 導入によって非特異的なIhl細胞の癌細胞へのターッゲッテイングに成功し、短期間で大量に癌特異的 Thl細胞を人工的にっくりだすことに成功したので報告する。
防 怯および結果】ここでは純粋にThl細胞の腫瘍へのターゲッテイング能カをみるためMHC class II 陽 性A20‑OVAを用いた 。パッケ ージン グ細胞：PJat一EとOVA特 異的なTCR遺伝 子をインサートした プ ラ ス ミド ベク ターpMX―DOTAE，pMX―DOTBEを もちい てトラン スフェク ション を行い、OVA特 異 的TCR遺伝子をコードしたレト口ウイルスベクターを作製した。マウスの脾臓からaCD3刺激によって あらかじめ誘導してきた非特異的′rhlに、このように作製したレトロウイルスを用いてOVA特異的TCR を遺伝子導入し抗原特異性を付与したところ、80％の効率でCD4+IくJl―26+ (KJ1―26；OVA特異的TCR 特異的に反応する抗体）のへルパーT細胞が得られ、この細胞群を精製して各種assayに用いた。こう し て得られ たKJ1−26+ ThlはMHC crassn結合 性OVAベ プタイドに特異的に反応し、IL‑4を産生せず IFN‑yのみを産生し、直接A20‑OVAに対してkiller activityやサイトカイン産生を示した。そこで次ぎ にこの人工的に加工された抗原特異的‑Ihl細胞が生体内において抗腫瘍効果を示すことができるか否か について検討した。ここではA20―OVA担癌マウスをcyc叩ha疆）hamideくく：Y）とTh1細胞の併用で治 療 する実験 系を用 いた。A201く）VA担癌マウスを低濃度Cmomg/kg）で処置した後に〇VA1℃：R−・
mtrばiuced皿11（5x19りとコント口ール′であるGFPセ1trdiU峨ぬ1h1を尾静注により投与したところ、
O、り丶特異的K：R遺伝子を導入した皿11を用いた群でのみ、全てのマウスにおいて腫瘍が完治した。こ れ はmuvOに お い て も 腫 瘍 特 異 的 に 反 応 し 、 抗 腫 瘍 免 疫 を 誘 導 で き た も の と 考 え ら れ る 。
【結論】以上より腫瘍特異的なm11細胞の誘導が困難な場合においても瓜ニRの遺伝子を導入することに よって腫瘍へのターゲッティングが可能なことが示され、実際に腫瘍が拒絶されることが明らかとなった。
こ の こ と は 皿 11細 胞 療 法 の 適 用 範 囲 の 拡 大 に 繋 が る も の と 期 待 で き る も の で あ る 。
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まとめ
これらの研究によ り、MHC classHが発現していない腫瘍においてもrIhl細胞治療は可能であり、癌 特異的Thl細胞カ濡導困難な場合においても迅速かつ簡便に特異的rIhlを誘導できることカ沫された。
これらのことはどんな場合においても理論上、癌抗原と癌特異的′1111が少量でもあれは、癌特異的7hl 細胞療法が可能であ ることを示唆している。今回はモデル癌抗原OVAを使用したが、今後はnatura】 tumor antigeriで同様の結果が得られるか検討する必要がある。またIhl細胞を用bゝた細胞治療では所 属リンパ節が中心的な役割を果たしており、rIhl細胞と癌抗原の投与方法もさらに追求していく予定であ る。
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