角膜創傷治癒におけるSPARCの役割について
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(2) 博 士 学 位 論 文. 角 膜 創 傷 治 癒 に お け るSPARCの. 役 割 につ い て. 平 成10年12月. 近畿大学大学 院医学研究科 外科学系専攻(指導:大 鳥利文 教授). 原. 英. 徳.
(3) 角 膜 創 傷 治 癒 に お け るSPARCの. 役 割 につ い て. 近畿人学医学部眼科学教室 原. 英. (指導:大 鳥. The. of SPARC. Role. 利文. 教 授). in Corneal. Hidenori Department. Wound. Healing. Hara. of Ophthalmology,. Kinki University (Director. 徳. School of Medicine. : Prof.. Toshifumi. 抄. Otori). 録. 角 膜 創 傷 治 癒 に お け るsecretedproteinwhichisacidicandrichincysteine(SPARC)の を 検 討 す る た め,角. 膜 実 質 細 胞 の α一smoothmuscleactin(α. 家 兎 角 膜 に 穿 孔 創 を 作 成 し,1週. 間 後 にSPARCお. 一SMA)発. 役割. よ び α 一SMAに. 現 とSPARCの. 関 係 を 検 討 した.. 対す る特異 抗 体 を用 いて免 疫 組 織. 染 色 を 行 っ た 。 ま た,継. 代 培 養 した 家 兎 角 膜 実 質 細 胞 の 培 養 液 中 にSPARCやtransforminggrowth. factor一 β(TGFβ)を. 添 加 し,細 胞 の α一SMA発. 発 現 量 をWeSternblOtting法. 局 在 を 認 め な か っ た.一. 質 細 胞 お よ び そ の 周 囲 にSPARCが. 質 細 胞 が 認 め ら れ た.培 る 細 胞 数 がSPARCの. 発 現 し,同. 濃 度 依 存 的 に 増 加 し た.SPARC添. 促 進 作 用 は,抗TGF一. 方,角. 膜 損傷 部 の 角膜 上 皮 の. 時 に 損 傷 部 実 質 に α 一SMAを. 養 角 膜 実 質 細 胞 の 培 養 液 中 にSPARCを. 量 が 有 意 に 増 加 して い る こ と がwesternblotting法 るSPARCの. ら に 細 胞 の α 一SMA. を 用 い て 半 定 量 し た,. 正 常 家 兎 角 膜 で は 上 皮 お よ び 実 質 にSPARCの 基 底 細 胞 層,実. 現 を 免 疫 組 織 学 的 に 検 討 し た.さ. 発 現 した 実. 添 加 す る こ と に よ り α 一SMAを. 加 に よ っ て,角 で 認 め られ た.角. 発 現す. 膜 実 質 細 胞 が 発 現 す る α 一SMA. 膜 実 質 細 胞 の α 一SMA発. 現 に対 す. β 抗 体 の 添 加 に よ って 抑 制 さ れ た.. 以 上 の こ と か ら角 膜 損 傷 部 に 出 現 す るSPARCは. 実 質 細 胞 を 活 性 化 し てmyofibroblastに. 実 質 の 創 傷 治 癒 に 重 要 な 役 割 を 演 じて い る こ と が 示 唆 さ れ た.さ. ら に こ のSPARCの. 変 化 さ せ,. 作 用 機 序 にTGF一. β が 関 与 して い る こ と が 示 唆 さ れ た,. Key. words. : corneal. wound. healing,. cysteine. ( SPARC) ,. factor-. (TGF-13). keratocytes, a -smooth. secreted muscle. —1—. actin. protein. wh. IC. ( a -SMA) ,. h is acidic transforming. and. rich growth. in.
(4) 緒. 言 角 膜 実 質 は 角 膜 全 体 の 約90%以. 薄 層(1amella)の. 上 の 厚 み を 有 し,主 と して1型. コ ラ ー ゲ ン と プ ロ テ オ グ リカ ンよ りな る 実 質. 間 に 存 在 す る 角 膜 実 質 細 胞 か ら構 成 さ れ て い る1.角. 膜 実 質 の形 状 と透 明 性 は1型. ンの 規 則 正 しい 格 子 状 配 列 に よ り維 持 さ れ て い る.角 膜 実 質 に 損 傷 が 加 わ る と,他 形 成 と搬 痕 部 の 収 縮 が 生 じ る2β.こ 状 を 変 化 さ せ,実 近 年,角 る.こ. コラーゲ. の 結 合 組 織 と 同 様 に,疲. 痕. の 角 膜 実 質 の搬 痕 組 織 お よ び そ の 収 縮 は コ ラ ー ゲ ン線 維 の 配 列 や 角 膜 形. 質 の 透 明 性 や 屈 折 度 を 変 化 させ る2・3.. 膜 に切 開 を 加 え 形 状 を 変 化 させ る こ と で 角 膜 の屈 折 力 を 変 化 さ せ る角 膜 屈 折 矯 正 手 術 が 行 わ れ て い. の 屈 折 矯 正 手 術 の 問 題 点 と して,術. 安 定 さが あ げ られ る が,こ. 後 長 期 に わ た って 角 膜 形 状 が 変 化 す る こ と に よ る屈 折 矯 正 効 果 の 不. の こ と に も角 膜 実 質 の疲 痕 収 縮 が 関 与 して い る と考 え られ る 姫.そ. れ ゆえ 角膜 実質. 創 傷 治 癒 の メ カ ニ ズ ム を 解 明 し,こ れ を コ ン トロ ー ル す る こ と は臨 床 的 に も重 要 で あ る と 考 え られ る. 角 膜 実 質 の 創 傷 治 癒 に は,角 代 謝 の 遅 い 細 胞 で あ る.一 られ て い る6.こ. 方,損. 常 角 膜 に お い て,実. 呼 ば れ2,α. 膜 損 傷 部 の 創 収 縮 に 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る2,3.搬. し て 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 収 縮 モ デ ル が 用 い ら れ て い る が7-'2,こ. ゲ ン ゲ ル 収 縮 に α 一SMAが myofibroblastへ. 質細 胞 は. 傷 部 で は 実 質 細 胞 は活 性 化 し増 殖 や 蛋 白 合 成 を 行 っ て い る こ と が 認 め. の よ う な 活 性 化 し た 角 膜 実 質 細 胞 は,myofibroblastと. こ と が 認 あ られ て お り,角 mode1と. 膜 実 質 細 胞 が 重 要 な 役 割 を 演 じて い る.正. 関 与 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い るユ ゜.こ. と形 質 転 換 す る機 序 に は細 胞 密 度13やTGF一. 一SMAを. 発現す る. 痕 収 縮 のinvitro. の実質細 胞 による コ ラー. の 角 膜 実 質 細 胞 が 活 性 化 し,. β1° な ど が 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る が,. 未 だ 不 明 な 点 が 数 多 く残 さ れ て い る. 日 比 野 ら は,角. 膜 実 質 細 胞 を コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 で 培 養 し,角. に よ る コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 収 縮 を 促 進 す る こ と を 報 告 し だ1.日 ゲ ン ゲ ル 収 縮 促 進 因 子 を 精 製 し,そ BM-40と. も呼 ば れ,細. れ がSPARCで. 比 野 は,角. 膜上皮細胞 培養上清 中か ら コラー. あ る こ と を 報 告 した1乳SPARCは. 胞 外 マ ト リ ッ ク ス に 分 類 さ れ て い る 分 子 量 約43kDaの. は 生 体 組 織 に お い て 幅 広 く分 布 し,血. 管 内 皮 細 胞",線. と の 報 告 が な さ れ て い る.SPARCは,最 組 織 の 発 生,分. 膜上 皮細 胞 培 養上 清 が培 養 角膜 実質 細 胞. オ ス テ オ ネ ク チ ン,. 糖 蛋 白 質 で あ る14.SPARC. 維 芽 細 胞15,平 滑 筋 細 胞16な ど か ら分 泌 さ れ て い る. 初 はanti-adhesivefactorと. し て 報 告 さ れ た が,近. 化 お よ び 創 傷 治 癒 に 関 与 して い る と 考 え られ て い る14.角 膜 に お け るSPARCの. 作 用 は 明 らか で は な い が,SPARCが. 年 で は, 生物 学 的. 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 収 縮 を 促 進 す る こ と か ら12,角 膜 実 質 の. 癩 痕 収 縮 に 関 与 す る こ と が 考 え ら れ る. そ こ で 本 研 究 で は,角. 膜 実 質 創 傷 治 癒,特. 収 縮 時 に 角 膜 実 質 細 胞 が 発 現 す る α一SMAを. に,疲. 痕 収 縮 に お け るSPARCの. 指 標 と し て 用 い,SPARCの. 役 割 を知 るた め角膜 搬痕 役 割 お よ びSPARCとTGF一. β の 相 互 作 用 に っ い て 検 討 した.. 方. 法. 材 料 お よ び試 薬 白 色 家 兎(日 7.2;以. 下PBSと. 本 在 来 種,雌,体 略 す)は. 重2-3kg)は. 日 水 製 薬,0.25%ト. 北 摂 産 業 よ り購 入 し た.リ リ プ シ ン溶 液,0. 一2一. .02%EDTA溶. ン酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(pH 液,minimumessential.
(5) medium(MEM)培. 養 液 は 阪 大 微 生 物 病 研 究 会,ウ. パ ー ゼ は 合 同 酒 精,Clostridiumhistolyticum由 プ ラ ス チ ッ ク 培 養 皿(6穴)と. 来collagenase,antipain. β1)は. ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 は 宝 酒 造,FITC標. ナ ー ル 抗 体,ペ. ,pepstatinAはSIGMA社,. 日 本BECTONDICKINSON社,マ. 識 ウ サ ギ 抗 マ ウ スIgG,マ. ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ウ サ ギ 抗 マ ウ スIgG,ヤ. ギ 血 清,ビ. ウ ス 抗TGF一 マ ツ ナ ミ 硝 子 社,ジ. チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸,過. タ ン,Tween20,ロ. オ チ ン 化 ヤ ギ 抗 マ ウ スIgG,. β モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 はGenzyme社,. ア ミ ノ ベ ン ジ ジ ン 四 塩 酸 塩,phenylmethylsulfonyl 酸 化 水 素,ド. デ シ ル 硫 酸 ナ ト リ ウ ム,ト. ー ダ ミ ン 標 識 フ ァ ロ イ ジ ン は 和 光 純 薬 工 業,エ. ホ ル ム ア ル デ ヒ ド は ナ カ ラ イ テ ス ク 社,ベ ト ・ゲ ル ⑪ は フ ナ コ シ 社,ブ. ノ ク ロ. ト 血 小 板 由 来osteonectin. (SPARC)はHaematologicTechnologies社,マ Si正an-coatedslideglassは. ウ ス抗 ヒ ト ウ ス 抗 ヒ ト α 一SMAモ. streptABComplex/HRP,DABChromogentabletsはDAKO社,ヒ. fluoride(PMSF),エ. ィ ス. バ イ オ コ ー ト ⑪ カ ル チ ャ ー ス ラ イ ド(8wells)はFALCON社,human. transforminggrowthfactor-beta1(TGF一 SPARCモ. シ 胎 児 血 清(FCS)はJRHbiosciences社,デ. リス ア ミノ メ. チ レ ン グ リ コ ー ル ビ ス 四 酢 酸,パ. ー メ ル ・ ヘ マ ト キ シ リ ン は 武 藤 化 学 薬 品,5-15%プ. ラ. リキ ャ ス. ロ ッ ク エ ー ス ⑪ は 大 日 本 製 薬 か ら購 入 し た.. 実験方 法 正 常 角 膜 お よ び 角 膜 創 傷 治 癒 に お け るSPARCと. α一SMAの. 局在. 家 兎 角 膜 中 央 部 に ダ イ ア モ ン ドナ イ フ を 用 い て 幅3mmの ビ タ ー ル 静 脈 注 射 に て 麻 酔 死 さ せ 眼 球 を 摘 出 し,4%パ 膜 輪 部 付 近 に 剃 刀 で 切 開 を 加 え,前 4℃ で4時 glass上. 間 固 定 し た 後,パ. に て 伸 展 した.脱. peroxidaseを TBS溶. 穿 孔 創 を 作 成 し た.1週 ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ーPBSに. 房 内 に4%パ. 酸 化 水 素 一TBSで15分. 浄 後,二. 次 抗 体(ビ. 体(1:50)と4QCで. 洗 浄 後,StreptABComplex/HRPと リ ン で1分. に20%ヤ. 一 晩 湿 箱 内 に て 反 応 さ せ た.TBSに. 徹,封. 入 後,光. ギ 血 清 を含 ん だ. ウ ス 抗 ヒ トSPARC抗. 体(1:100) て10分. 毎 に5回. で 一 晩 湿 箱 内 に て 反 応 さ せ た.さ. 室 温 で30分 間 反 応 さ せ,DABを. 間 核 染 色 を お こ な い 脱 水,透. 注 入 して. 洗 浄 し内 因 性. 間 浸 し,次. の 後,マ. オ チ ン化 ヤ ギ 抗 マ ウ スIgG,11400)と4℃. 後 に角. 薄 切 切 片 作 成 後,Silan-coatedslide. パ ラ フ ィ ン後,50mMTrisbufferedsaline,pH7.4(TBS)で. 液 に て 室 温 で30分 間 ブ ロ ッ キ ン グ を お こ な っ た.そ ウ ス 抗 α一SMA抗. 浸 し,20分. ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ーPBSを. ラ フ ィ ン包 埋 を お こ な っ た.4μmの. ブ ロ ッ ク す る た め0.3%過. ま た,マ. 間 後 に ペ ン トバ ル. 用 い て 発 色 さ せ た.ヘ. 学 顕 微 鏡(Zeiss社)下. 洗 らに. マ トキ シ. で 写 真 撮 影 を お こ な っ た.. 角膜実質細 胞 の培養 家 兎 を ペ ン トバ ル ビ タ ー ル 静 脈 注 射 に て 麻 酔 死 さ せ 速 や か に 眼 球 を 摘 出 した.滅 洗 浄 し角 膜 片 を 作 成 し た.内. 皮 細 胞 を デ ス メ 膜 と共 に ピ ン セ ッ トで 機 械 的 に 除 去 し た 後,残. デ ィ ス パ ー ゼ と 反 応 さ せ 上 皮 を 剥 離 した.そ /ml)内. で 溶 解 し,遊. は ユ0%FCSを 養3代. 目 か ら4代. の 後,角. 膜 実 質 コ ラ ー ゲ ン を 細 菌 性co11agenase溶. 離 し た 角 膜 実 質 細 胞 を 遠 心(1000rpm,5分)に. 含 むMEM培. 菌 し たPBSで. 養 液 で 培 養 し,ユ. 週 間 毎 に1:2の. 目 の 角 膜 実 質 細 胞 を 使 用 し た.. 一3一. て 回 収 し た.得 割 合 で 継 代 培 養 し た.今. 眼球 を った 角 膜 を 液(1mg. られ た 実 質 細 胞 回 の実 験 で は培.
(6) 角 膜 実 質 細 胞 の α 一SMA発. 現(immunocytochemistry). 細 胞 密 度 が 角 膜 実 質 細 胞 の α 一SMA発. 現 に及 ぼす 影 響. 細 胞 培 養 用 の バ イ オ コ ー ト⑪ カ ル チ ャ ー ス ラ イ ド(8wells)上 (4,10,40,400個/mm2)で. 播 種 し10%FCSを. 数 秒 固 定 し た 後,PBSを に て5分 後,ロ. 毎 に3回. 用 い て 洗 浄 し,マ. 洗 浄 後,FITC標. 含 むMEM培. ウ ス抗 α 一SMA抗. SPARCが. 培 養 角 膜 実 質 細 胞 を40個/mm2の 清 無 添 加 のMEM培. 加 し て3日. 間 培 養 し た.そ. 無 作 為 に5視 ま た,α. 体(1:50)と4℃. ア セ ト ンで. で 一 晩 反 応 さ せ た.PBS. 室 温 で1時. 間 反 応 さ せ た.PBSで. 間 反 応 さ せ,70%グ. 洗浄. リセ ロ ー ル に て 封 入 し落 射. 現 に及 ぼす 影 響 細 胞 密 度 で 播 種 し10%FCSを. 養 液 に 交 換 し,種 の 後,上. 野 に お け る α 一SMAを. 一SMAの. 約1時. 間 培 養 し た,冷. で 写 真 撮 影 を お こ な っ た.. 角 膜 実 質 細 胞 の α 一SMA発. そ の 後,血. 養 液 で6日. 識 抗 マ ウ スIgG(1:40)と. ー ダ ミ ン 標 識 フ ァ ロ イ ジ ン(50μ9/ml)と. 式 蛍 光 顕 微 鏡(Zeiss社)下. に 培 養 角 膜 実 質 細 胞 を種 々 の細 胞 密 度. 含 むMEM培. 養 液 で2日. 間 培 養 し た.. 々 の 濃 度(0,0.1,1,10μg/ml)のSPARCを. 述 と 同 様 に α 一SMAに. 添. 対 す る 免 疫 染 色 を 行 っ た.さ. らに 顕 微 鏡 下 で. 発 現 す る 細 胞 の 割 合 を 測 定 し た.. 蛋 白 量 をwesternblotanalysisを. 用 い て 検 討 した.ト. て そ れ ぞ れ の 角 膜 実 質 細 胞 を 回 収 した.1x105個. リプ シ ン溶 液,EDTA溶. 液 を用 い. の 角 膜 実 質 細 胞 を 細 胞 溶 解 液(pH7.4;1%SDS,25mM. Tris,1mMEGTA,1mMEDTA,2mMPMSF,5μg/mlantipain,5μg/mlpepstatinA)20μ1 を 用 い て 溶 解 し た.こ. の 角 膜 実 質 細 胞 溶 解 液20μ1を5-15%sodiumdodecy1…1'計epolyαuッ1ロmide. gelを 用 い て 電 気 泳 動 を お こ な いpolyvinylidenedifluororide(PVDF)膜 で 約1時. 間 室 温 に て ブ ロ ッキ ン グ を 行 っ た後,マ. 0.05%のTween20を. 含 ん だPBSに. 1時 間 反 応 さ せ,洗 Analyzerを. 浄 後,DAB法. 洗 浄 後,ペ. β,抗TGF一. そ の 後,血. 清 無 添 加 のMEM培. β 抗 体(5μg/ml)を. の 蛋 白 量 をwesternblotanalysisを. 体(1:500)と4℃. で 一 晩 反 応 さ せ た.. ら れ た バ ン ドの 強 度 をCybernetics社. 製 のGeLPro. 現 に及 ぼす 影 響. 細 胞 密 度 で 播 種 し10%FCSを. 含 むMEM培. 養 液 に 交 換 し,SPARC(5μg/ml),TGF一 間 培 養 後,細. 室温で. た.. β抗 体 が 角 膜 実 質 細 胞 の α一SMA発. 添 加 し て3日. ⑧ ロ ック エ ー ス. ル オ キ シ ダ ー ゼ 結 合 抗 マ ウ スIgG(1:1000)と. に て 発 色 さ せ た,得. 培 養 角 膜 実 質 細 胞 を40個/mm2の. 成. ウ ス抗 α 一SMA抗. 用 い て 測 定 し,対 照 群 の 強 度 と比 較(%control)し. SPARC,TGF一. TGF一. て3回. に 転 写 した.ブ. 胞 の α一SMA発. 養 液 で2日. 間 培 養 し た.. β(1ng/ml),お. よび抗. 現 を 観 察 し た.ま. た,α. 一SMA. 用 い て 検 討 し た.. 績 図1に. 正 常 角 膜 と創 傷 後1週. 間 目 のSPARCと. α.SMAの. は 内 皮 細 胞 に 局 在 す る こ と が 認 め ら れ た(図1A,矢 ま た,上. 皮 細 胞,実. 質 細 胞,内. 印)が. 皮 細 胞 の い ず れ に も α.SMAの. 一4一. 局 在 を 示 す.正 上 皮 細 胞,実. 常 角 膜 で はSPARC(図1A) 質 細 胞 に は 認 め ら れ な か っ た.. 発 現 は 認 め な か っ た(図1C).一. 方,穿.
(7) 孔 創 作 成 後1週 SPARCの. 間 目 の 角 膜 で は,損 傷 部 表 面 を被 覆 した 上 皮 の 基 底 細 胞 層 及 び 創 傷 部 の 実 質 細 胞 に. 局 在 が認 め られ た(図1B).α. 現 して い る こ とが 認 あ られ た(図1D).こ SPARCが. 発 現 して お り,SPARCが. 質 細 胞 で の α一SMAの. 図1酵. 一SMAもSPARCの. 局 在 と同 様 に創傷 部 の実 質 細 胞 に 強 く発. の こ とか ら角 膜 の創 傷 部 に お いて 角 膜上 皮 お よ び 実 質 細 胞 に. 角膜 創 傷 治 癒 に関与 して い る こ とが示 唆 さ れ た.ま たSPARCと. 実. 発 現 に は何 らか の関 係 が あ る こ とが示 唆 され た.. 素 抗 体 法(ABC法)に 抗SPARC抗 細 胞 にSPARCの 抗 α一SMA抗. よ る角膜 組 識 像. 体 に よ る反 応(A,B),正. 常 角 膜 組 識 像(A)矢. 印:内 皮. 局 在 を認 め た,穿 孔 創 作 成 後1週 間 目の 角膜 組 識 像(B),. 体 に よ る反 応(C,D),正. 常 角膜 組 識 像(C),穿. 孔創作成後. 1週 間 目の 角膜 組 識 像(D)(×20). 角 膜 実 質 細 胞 のmyofibroblastへ. の 形 質 転 換 に は細 胞 密 度 が 関 係 して い る こ とが報 告 され て い る1へそ. こで 細 胞 密 度 が 角 膜 実 質 細 胞 の α一SMA発 現 に及 ぼ す 影 響 を 検 討 した(図2).細 (4個/mm2)で (図2A).細 400個/mm2で (図2BC,D).こ. は,ほ とん どの 角 膜 実 質 細 胞 の細 胞 内 に α一SMAに 胞 密 度 が 高 くな る につ れ て α一SMAを. 胞 密 度 が 最 も低 い 群. 特 異 的 な線 状 に 蛍 光 が 認 め られ た. 発 現 して い る 角 膜 実 質 細 胞 数 は減 少 し,細 胞 密 度. 培 養 した 角 膜 実 質 細 胞 で は α一SMAを. 発 現 して い る細 胞 は ほ とん ど認 あ られ な か った. の こ とか ら角膜 実 質 細 胞 の α一SMA発 現 は細 胞 密 度 に影 響 され る こ とが 明 らか と な. り,以 降 の実 験 で は培 養 条 件 を同 一 の細 胞 密 度(40個/mm2)と. 一5一. した..
(8) 図2角. 膜 実 質 細 胞 の 細 胞 密 度 に よ る α 一SMA発. 現 率 へ の影 響. 細 胞 密 度 を4個/mm2(A),10個/mm2(B),40個/mm2 (C),400個/mm2(D)に. 図3に. 抗 α 一SMA抗. 像 を 示 す.実 一 方 ,一. 体(図3A)と. ロ ー ダ ミ ン標 識 フ ァ ロ イ ジ ン(図3B)に. 質 細 胞 は 紡 錘 状 の 形 状 を 示 し,す. 部 の 細 胞 で は α 一SMAに. して 培 養(×10). べ て の 細 胞 でF-actinが. 特 異 的 な 線 維 状 の 蛍 光 が 認 め ら れ,こ. 大 き く伸 展 して い る こ と が 観 察 さ れ た(図3A).. よ る2重. 染色 の強 拡大. 線 維 状 に 染 色 さ れ た(図3B). れ らの 細 胞 は 他 の 細 胞 に比 べ て.
(9) 図3抗. α 一SMA抗. 体(図3A)と. ロ ー ダ ミ ン標 識 フ ァ ロ イ ジ ン(図3B)に. よる. 2重 染 色(×40). 次 にSPARCが. 角 膜 実 質 細 胞 の α 一SMA発. 培 養 した 場 合(SPARC濃 た(図4D).一. 方SPARCを. 割 合 は 添 加 し たSPARCの. 度,0μg/ml)で. 現 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 した(図4).SPARCを は α 一SMAを. 添 加 せず に. 発 現 して い る 角 膜 実 質 細 胞 は 殆 ど認 め な か っ. 添 加 して 培 養 した 場 合 に は 一 部 の 細 胞 で α 一SMAの. 発 現 が 認 め られ,そ. 濃 度 に 比 例 して 増 加 し て い る こ と が 観 察 さ れ た(図4A,B,C).. の.
(10) 図4角. 膜 実 質 細 胞 のSPARC濃 SPARC濃. μg/mlで. して 培 養(×10). 発 現 し た 細 胞 の 割 合 はSPARC非 は約0.5%,1μg/mlで. 害1」 合 は 添 加 し たSPARCの. 現率へ の影響. 度10μg/ml(A),1μg/ml(B),0.1μg/ml(C),. 0μg/ml(D)に. α一SMAを. 度 に よ る α 一SMA発. 添 加 群 で は 約0.1%で. 約10%,10μg/mlで. 約50%と. あ っ た の に 比 べ て,SPARC濃 α 一SMAを. 濃 度 に 依 存 して 増 加 す る こ と が 認 あ ら れ た(図5).. 一8一. 度0.1. 発 現 して い る 実 質 細 胞 の.
(11) 図5角. 膜 実 質 細 胞 のSPARC濃 (図4に. 度 に よ る α.SMA発. 認 め ら れ た 細 胞 を ラ ン ダ ム に5視. 現 率 の 定 量 化(mean±S.E.M.,n=4). 野 に お け る α 一SMAを. 発 現 して い る細 胞. の 比 率 を 定 量). 種 々 の 濃 度 のSPARCを. 添 加 して 培 養 した 角 膜 実 質 細 胞(1x105個)に. ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ法 に て 検 討 し た(図6),α 出 さ れ た.SPARC非 ml)で. は,そ. 添 加 群 の α 一SMAの. れ ぞ れ200,250,4,000で. 量 が 増 加 す る こ と が 認 め ら れ た(図7).以. 一SMAは. 含 ま れ る α一SMAの. 約43kDaの. 位 置 に 単 一 の バ ン ド と して 検. バ ン ドの 強 度 を100と す る とSPARC添. あ り,添 加 したSPARCの 上 の 結 果 か らSPARCは. す る こ と が 明 らか と な っ た.. 一9一. 蛋 白量 を. 加 群(0.1,1,10μg/. 濃 度 依 存 的 に 角 膜 実 質 細 胞 内 の α一SMA 角 膜 実 質 細 胞 の α 一SMA発. 現 を促 進.
(12) 図6角. 膜 実 質 細 胞 のSPARC濃. 度 に よ る α一SMA発. 現 率 へ の影 響. (ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ法). 図7角. 膜 実 質 細 胞 のSPARC濃 (図6で. 度 に よ る α 一SMA発. 現 率 へ の影 響. 得 た バ ン ドを ゲ ル プ ロ ア ナ ラ イ ザ ー で 解 析 し半 定 量). (mean±S.E.M.,n=3). 角 膜 実 質 細 胞 の α 一SMA発 α 一SMA発. 現 をTGF一. 現 に 対 す るSPARCとTGF一. β1が. 促 進 す る こ と が 報 告 さ れ て い る1兜 そ こ で 角 膜 実 質 細 胞 の. β の 相 互 作 用 を 検 討 し た(図8).SPARCお. 加 して 培 養 した 角 膜 実 質 細 胞 で は(図8B,C),α と比 較 して 明 ら か に 増 加 して い た.し. 一SMAを. か し抗TGF一. よ びTGF一. βを添. 発 現 し た 細 胞 は コ ン ト ロ ー ル 群(図8A). β 抗 体 を 同 時 に 添 加 し て 培 養 し た 場 合 で は α 一SMA. を 発 現 す る 角 膜 実 質 細 胞 は 著 し く減 少 して い た(図8D,E,F).. 一10一.
(13) 図8角. 膜 実 質 細 胞 のSPARCに. よ る α一SMA発. 現 に対 す る 抗TGF一. β抗体 の影 響. (蛍 光 免 疫 染 色) 抗TGF一. β抗 体 非 添 加 群(A,B,C),抗TGF一. β抗 体 添 加 群(D,E,F). コ ン ト ロ ー ル 群(A),SPARC(5μg/ml)群(B),TGF一 群(C),抗TGF一. β(1ng/ml). β 抗 体 単 独 添 加(5μg/ml)群(D),SPARC+抗TGF一. 抗 体 同 時 添 加 群(E),TGF一. β+抗TGF一. 一11一. β抗 体 同 時 添 加 群(F)(×10). β.
(14) ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 に よ る検 討 で も(図9),SPARC(Lane3)又 単 独 に 添 加 し た 群 で は α一SMAの 方,抗TGF一. バ ン ドの 強 度 は コ ン ト ロ ー ル(Lane1)と. β 抗 体 を 単 独 添 加 す る こ と で,α. (Lane2).さ. ら にSPARCやTGF一. 一SMAの. 図9角. よ る α一SMA発. 比 較 し て 増 加 し て い た.一. 現 促 進 作 用 も抗TGF一. 上 の こ と か ら,TGF一. 現 促 進 作 用 に もTGF一. 膜 実 質 細 胞 のSPARCに. β(Lane5)を. バ ン ドの 強 度 は コ ン トロ ー ル 群 に 比 べ て 減 少 し た. β に よ る 実 質 細 胞 の α一SMA発. て 拮 抗 さ れ る こ と が 認 め られ た(Lane4,6).以 現 を 促 進 し,SPARCに. はTGF一. よ る α一SMA発. β抗 体 に よ っ. β は 角 膜 実 質 細 胞 の α 一SMA発. βが 関 与 して い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た.. 現 に 対 す る 抗TGF一. β抗 体 の 影 響. (ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法) Lane1:コ. ン トロー ル群,Lane2:抗TGF一. β抗 体 単 独 添 加(5μg/ml)群. Lane3:SPARC(5μg/ml)群Lane4:SPARC+抗TGF一 添 加 群,Lane5:TGF一. β抗 体 同 時. β(1ng/ml)群,Lane6:TGF一. β+抗TGF一. β. 抗 体 同 時添 加 群. 考. 按 今 回 の 研 究 の 結 果,角. 局 在 が 認 あ られ た.ま た.培. 膜 創 傷 治 癒 過 程 に お い て 損 傷 部 付 近 の 上 皮 基 底 細 胞 層 と 実 質 細 胞 にSPARCの た 実 質 損 傷 部 に α一SMAを. 養 家 兎 角 膜 実 質 細 胞 の α 一SMAの. 依 存 的 に 充 進 し た.一. 方 、SPARCの. 今 回 の 実 験 に お い て,正. 発 現 に は 細 胞 の 密 度 が 影 響 し,ま α 一SMA発. 現 促 進 作 用 はTGF一. 常 角 膜 で は 内 皮 の み にSPARCの. 層 お よ び 角 膜 実 質 細 胞 にSPARCの 射 し て,前. 発 現 し た 角 膜 実 質 細 胞 が 出 現 して い る こ と が 認 め ら れ. 部 角 膜 切 除 を 行 い,創. 除 後 移 動 し て き た 角 膜 上 皮 にSPARCの. 局 在 を 認 め,角. の 報 告 は 今 回 の 結 果 と一 部 一 致 しな い が,こ. は,ネ. 加 に よ って 濃 度. β の 中 和 抗 体 で 抑 制 さ れ た.. 局 在 を 認 め,損. 局 在 を 認 め た.Latvalaら 傷 角 膜 に お け るSPARCの. たSPARC添. 傷 部 角 膜 で は上 皮 基 底 細 胞. コの 角 膜 に エ キ シマ レ ー ザ ー を 照. 局 在 に つ い て 検 討 し て い る.そ. の 結 果,切. 膜 実 質 に は 局 在 を 認 め な い と 報 告 して い る17.こ. れ は エ キ シ マ レー ザ ー で の 角 膜 切 除 で は 創 傷 面 が 実 質 表 面. と ほ ぼ 平 行 で あ り実 質 細 胞 の 反 応 が 弱 い の に 対 して,穿. 孔 創 で は実 質 表 面 に 垂 直 な 創 傷 で あ り 穿 孔 創 の. 方 が 実 質 へ の 侵 襲 が 強 い こ と な ど が 影 響 して い る と考 え られ た.ま. たSPARCと. α 一SMAを. 発 現 した 実. 質 細 胞 と の 局 在 が 近 似 し て い る こ と か ら,角 膜 実 質 の 創 傷 治 癒 に お け る 実 質 細 胞 の 活 性 化 にSPARCが 関 与 し て い る こ とが 考 え られ た.. 一12一.
(15) 角 膜 実 質 創 傷 部 の 活 性 化 し た 角 膜 実 質 細 胞 はmyofibroblastへ 割 を 演 じて い る こ と が 考 え られ て い る2-5.し か で は な い.今 め ら れ,こ. と 形 質 転 換 し角 膜 搬 痕 収 縮 に 重 要 な 役. か し こ のmyofibroblastへ. 回 の 研 究 で は細 胞 密 度 に 反 比 例 して α 一SMAを. の こ と はMasurら. 質 細 胞 の α.SMA発 myofibroblastに. の 報 告 と一 致 し て い る13.さ. 発 現 した 細 胞 の 割 合 が 増 加 す る こ と が 認. ら に 今 回 の 結 果 か ら,SPARCが. 現 を 促 進 す る こ と が 明 ら か と な っ た.こ 形 質 転 換 さ れ る こ と を 示 唆 し て い る.以. の 形 質 転 換 の 機 序 は未 だ 明 ら. の こ と はSPARCに. 前 に,日. よ って 実 質 細 胞 が. 比 野 はSPARCに. よ って培 養角 膜 実. 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 収 縮 が 促 進 す る こ と を 報 告 し12,ま た,Iruela-Arispeら 線 維 芽 細 胞 で もSPARCに. は ネ ズ ミの 胎 児 由 来 の. よ っ て コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 収 縮 が 促 進 す る こ と を 報 告 し て い る18.一 方,コ. ン ゲ ル 収 縮 に は 細 胞 内 の α 一SMAに と か らSPARCに. 培 養角 膜 実. よ る 細 胞 の 収 縮 が 関 与 して い る こ と が 報 告 さ れ て い る7.こ. よ る コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 収 縮 促 進 作 用 は,SPARCに. い る こ と が 示 唆 さ れ た.さ. ら に,角. よ る α 一SMA発. ラー ゲ れ らの こ. 現促 進 作 用 を介 して. 膜 実 質 の 疲 痕 収 縮 に も損 傷 部 に 出 現 す るSPARCが. 作 用 して い る 可. 能 性 が 考 え られ た. TGF一 β は 創 傷 治 癒 に 作 用 す る サ イ ト カ イ ンの1つ や α一SMA発. で 線 維 芽 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 収 縮 促 進 作 用19. 現 促 進 作 用2°な ど が 報 告 さ れ て い る.ま. た 角 膜 の 創 傷 治 癒 に お い て もTGF一. βは重要 な役 割. を 演 じて い る こ と が 考 え られ て い る2!。 Kurosakaら. は 培 養 ウ シ 角 膜 実 質 細 胞 を 用 い てTGF一. β1が. 実 質 細 胞 の α 一SMA発. ン ゲ ル 収 縮 作 用 を 促 進 す る こ と を 報 告 して い る1兜 今 回,SPARCに 用 は 抗TGF一. β 抗 体 で 阻 害 さ れ た こ と はSPARCの. 在 ま でSPARCとTGF一 SPARC産. 作 用 がTGF一. β の 関 係 に つ い て の 報 告 は,Reedら. 現 作 用 とコ ラー ゲ. よ る 実 質 細 胞 の α 一SMA発. β を 介 して い る こ と を 示 唆 して い る.現 がTGF一. β1が. 皮 膚線維 芽細胞 に よ る. 生 を 促 進 す る こ と を 報 告 して い る の み で あ る22。今 回 の 結 果 か ら はSPARCも. 作 用 に 影 響 す る 可 能 性 が あ り,今. 後,創. 現促進作. 傷 治 癒 に お け るSPARCとTGF一. 逆 にTGF一. βの. βの相 互 作 用 にっ いて さ らに. 検 討 を 行 う 予 定 で あ る. 近 年,フ. ィ プ ロ ネ ク チ ン23・2"や 表 皮 成 長 因 子(EGF)25・26な. どの 生 理 活 性 物 質 を用 い て 角 膜 上 皮 創 傷 治 癒. を 積 極 的 に コ ン ト ロ ー ル す る 試 み が な さ れ 臨 床 応 用 さ れ っ っ あ る が,角 縮 に お け るSPARCの. 作 用 を 詳 細 に 検 討 す る こ と に よ り,角. 膜 実質 の創 傷治 癒 お よび疲 痕 収. 膜実 質の創 傷治 癒 を調 節 で きる可能 性 が 考. え ら れ た.. 謝. 辞 稿 を 終 え る に あ た り,御. 助 言,御. 校 閲 を 賜 り ま した 恩 師 大 鳥 利 文 教 授 に 深 甚 な る 謝 意 を 表 し ま す.ま. 指 導 を 賜 り ま し た 三 島 弘 講 師 な ら び に 日比 野. 剛,村. 上 純 子 博 士 に感 謝 の意 を 表 しま す 。 本 論. 文 の 一 部 はAssociationforResearchinVisionandOphthalmology年. 次 総 会(FortLauderdale,. Florida,1997年5月),AssociationforResearchinVisionandOphthalmology年. 次 総 会(Fort. Lauderdale,Florida,1998年5月),第100回. 日 本 眼 科 学 会 総 会(京. 眼 科 学 会 総 会(福. 国 際 眼 研 究 会 議 日 本 部 会(仙. 岡,1998年,4月),第10回. 発 表 した.. 一13一. た終 始 御. 都,1996年,5月),第102回 台,1995年12月)に. 日本 お いて.
(16) 文. 献. 1 . Gipson IL (1994) Anatomy H (eds) : The cornea, 2 . Jester. JV, Petroll. Boston,. JV,. Barry. keratocytes:. healing. RMR, JV. and Company,. actin. 8. Finesmith stages. In : Smolin. collagen. factor-. from. H, Kurosaka. gel contraction. binding. Invest. protein. keratotomy. in two. animal. I :. models. Vis Sci 33 : 3255-3270 P, Andrews. pathologic. RH (eds). P, Cavanagh in corneal. response. : The cornea,. of collagen. remodelling. HD, wound. of corneal. Boston,. and. Little,. Brown. on a -smooth. muscle. 159 : 161-175. JM (1990) Fibroblasts to contract. from. a collagen. HW, Beuerman. D, Kato K, Mashima contraction. of collagen Invest. wounds. of different. gel in response. by keratocytes. studies. Invest Ophthalmol. Y, Tanaka. Y (1998). gel by bovine corneal. Ophthalmol. to growth. when plated. factors. on. Vis Sci 33 : 1742-1755 Transforming. growth. fibroblasts. through. epithelial. cells on the. 42 : 174-179. epithelial. cell-derived. stimulator. of. Acta Med Kinki Univ 20 : 247-254 I, Petridou. at low density.. of embryonic. 819-829. — 14—. S (1996) Myofibroblasts. differentiate. Proc Natl Acad Sci USA 93 : 4219-4223. J, Funk S, Iruela-Arispe. SPARC in tissues. of growth. Vis Sci 39 : 699-704. Jpn J Ophthalmol. on the corneal. by keratocytes.. RB, Decker. R (1992) Effect. H, Otori T (1998) The effect of corneal. SK, Dewal HS, Dinh TT, Erenburg. 14. Sage H, Vernon. and. j Cell Physiol. of myofibroblasts.. gel contraction. fibroblasts. gape. of the myofibroblast. by human keratocytes.. T (1995) Biochemical. 13. Masur. proteins.. 144: 99-107. 11. Hibino T, Wada Y, Mishima. collagen. G, Thoft. M, Chew SJ, Thompson. differentiation. 12. Hibino. Morphology. vary in their ability. 5 1 promotes. collagen. HD (1994) Corneal. HD (1992) Radial. IM, Barry. 11: Role. KN, Davidson. lattice contraction. 10. Kurosaka. muscle. Vis Sci 36 : 809-819. contractile. of incisional. Ophthalmol. CAG (1994) Dependence. by fibroblasts.. J Cell Physiol. 9. Assouline. a -smooth. pp 69-111. TH, Broadley. of repair. factors.. R. Vis Sci 33 : 3271-3282. HV (1994). PD, McCulloch expression. Invest. keratotomy. Ophthalmol. disease,. J, Cavanagh. WM, Chen WT, Herman. KR, Chaves. 7 . Arora. of. R, Cavanagh. of cytoskeletal. and measurement. microscopy.. Radial. Invest. conjunctival. W, Essepian. process. Petroll. (1992). contraction. 6. Kenyon. HD (1995) Expression. WM, Garana. G, Thoft. 3 -24. wound healing. Invest Ophthalmol. GJ, Petroll. WM, Feng. in vivo confocal. Jester. pp. In : Smolin. Vis Sci 35 : 730-743. The wound. 5. Garana. stromal. PA, Lind. JV, Petroll. using. PA, Cavanagh. corneal. and limbus,. and Company,. In situ and in vitro organization. Ophthalmol 4 . Jester. cornea,. Little, Brown. WM, Barry. ( a -SM) actin during 3. Jester. of the conjunctiva,. ML (1989) Distribution. and adult. mice. J Histochem. of the calciumCytochem 37 :.
(17) 15. Stenner. D, Tracy. osteonectin, 16. Hirota. RP, Riggs. a major. S, Imakita. C, Nomura. protein. of mineralized. M, Kohri. S (1993). atherosclerotic. BL, Mann KG (1986) bone.. of osteopontin. : A possible. association. platelets. contain. and secrete. Proc Nati Acad Sci USA 83 : 6892-6896. K, Ito A, Morii E, Adachi. Expression. plaques. Human. S, Kim HM, Kitamura. messenger. RNA by. with calcification.. Y, Yutani. macrophages. Am J Pathol. in. 143 : 1003-. 1008 17. Latvala. T, Puolakkainen. (osteonectin). P, Vesaluoma. M, Tervo T (1996) Distribution. and wounded. feline cornea.. in normal. 18. Iruela-Arispe. ML, Vernon. RB, Wu H, Jaenisch. Mov-13 mice do not retain function.. Dev Dynamic. 19. Montesano. R, Orci. contraction. of SPARC. protein. Exp Eye Res 63 : 579-584. R, Sage EH (1996) Type I collagen-deficient. SPARC in the extracellular. matrix:. Implications. for. fibroblast. 207: 171-183. L (1988). by fibroblasts:. Transforming. Implications. growth. factor l3 stimulates. for wound. healing.. Proc. collagen-matrix. Nati Acad Sci USA 85 :. 4894-4897 20. Desmouliere. A, Geinoz A, Gabbiani. induces. muscle. a -smooth. quiescent. and growing. 21, Hayashi factor-. K, Frangieh. actin. cultured. F, Gabbiani. tissue. growth. expression. in granulation. fibroblasts.. J Cell Biol 122 : 103-111. G, Wolf G, Kenyon. )8 in wound healing. G (1993) Transforming. KR (1989) Expression. of vitamin-A-deficient. rat. corneas.. factor-. myofibroblasts. and. of transforming Invest. 1 in. growth. Ophthalmol. Vis Sci. 30 : 239-247 22. Reed MJ, Vernon collagen young. RB, Abrass. and SPARC,. T, Nakagawa. promotes. epithelial. fibronectin Physiol. migration. and epidermal. of cultured. growth. gels, by fibroblasts. from. 158: 169-179. T, Ohashi. M, Mishima. of collagen. of type I. Y, Watanabe rabbit. H, Otori factor. cornea. T (1990). on rabbit. K, Manabe. R (1983). Fibronectin. in situ. J Cell Biol 97 : 1653-1657 Differential. corneal. modes. epithelial. of action. migration.. J. of Cell. 145 : 549-554 CR Jr.,. Cohen S (1973) Proliferation. factor.. Exp Eye Res 15 : 361-366. growth 26. Brightwell. JR, Riddle SL, Eiferman. GS (1985) Biosynthetic corneas.. contraction. J Cell Physiol. S, Awata. 24. Nishida T, Nakamura. 25. Savage. and enhances. and aged donors.. 23. Nishida. IB, Sage EH (1994) TGF- a 1 induces the expression. Invest. human. Ophthalmol. of corneal. RA, Valenzuela. EGF accelerates. Vis Sci 26 : 105-110. epithelium. P, Barr PJ, healing. induced. by epidermal. Merryweather. of neodecadron-treated. JP,. Schultz primate.
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