修 士 学 位 論 文

修 士 学 位 論 文

題 名

内胚葉領域特異的遺伝子の異所的発現による

消化管上皮細胞分化への影響

福 田 公 子

塩 入 直 也

目次 １．謝辞 ··· 1 ２．要旨 ··· 2 ３．要旨（英文） ··· 4 ４．序論 ··· 6 ５．材料・方法 ··· 8 ６．結果 ··· 9 ７．考察 ··· 12 ８．図 ··· 14 ９．参考文献 ··· 28

1 １．謝辞 本修士論文は、筆者が首都大学東京大学院、理工学研究科生命科学専攻、博士前期課 程在学中に発生プログラム研究室において行った研究をまとめたものです。本研究に関 して終始ご指導鞭撻をいただきました福田公子准教授に深く感謝いたします。また副査 として研究計画や結果について有用な意見を頂きました久永真市教授、坂井貴臣准教授、 日頃から研究の遂行に必要な議論やゼミナールでのアドバイスをしていただきました 西駕秀俊客員教授、高鳥直士助教に心より感謝いたします。最後に、発生プログラム研 究室で日々共に過ごし支えてくれた同期と、すべての皆様に、心より感謝いたします。

2 ２．要旨 脊椎動物の消化管は口側から食道、胃、十二指腸、小腸、盲腸、大腸という機能、形 態の全く異なる器官からできている。それぞれの領域に特異的に発現する転写因子や酵 素などが多く同定されているものの、これらの器官の違いを生み出す分子機構の多くは、 まだ理解されていない。ヒトの消化管では、ある部分の消化管の上皮が違う部分の上皮 に分化する異形成が知られている。多くがそれをきっかけに癌形成を促すことから、そ の分子機構の解析が進んでいる。異形成の一つである腸上皮化生は胃の上皮が腸様に分 化する病気である。腸上皮化生を起こしている上皮では、胃上皮特異的転写因子である Sox2 の発現が減少し、腸上皮特異的転写因子である Cdx2 の発現が上昇するということ が報告されている。ニワトリ胚、及びマウス胚では器官形成よりも前に、Sox2、Cdx1,2 （ニワトリでは CdxA）がそれぞれ将来胃になる上皮、及び腸になる上皮で発現を開始 し、その後、器官形成、分化を通して胃、腸に発現し続ける。Sox2 や Cdx2 のノックア ウトマウスでは、それぞれ胃、腸の形成に影響が出るため、胃や腸の分化に必須な遺伝 子であると考えられている。また、私の研究室の先行研究で、cSox2 を発生初期の予定 腸上皮に、CdxA を発生初期の予定胃上皮に強制発現したところ、それぞれの上皮に発 現していた CdxA、 cSox2 の発現を抑制したことから、この２つの転写因子には相互抑 制作用があることが示唆されている。しかし、cSox2 や CdxA が胃、腸上皮の細胞分化 にどのように関わっているのかの詳細は明らかでない。そこで私は、cSox2 と CdxA を 異所的に持続的に強制発現した場合、その細胞分化にどのような影響を与えるのかを調 べることにした。 2 日胚を使い、cSox2 を予定腸上皮に、CdxA を予定胃上皮にエレクトロポレーション 法によって導入した。先行研究ではウイルス由来のプロモーター・エンハンサーの下流 にcSox2、CdxA を繋げたコンストラクトを導入し強制発現させたが、このコンストラク トの発現が維持されるのは 1～2 日である。そこで、Tol2-Transposon 配列でニワトリ β アクチンプロモーター及びcSox2 または CdxA を挟んだコンストラクト、そしてニワト リβ アクチンプロモーターに transposase を繋いだコンストラクトを同時に導入し、 cSox2 および CdxA 強制発現コンストラクトをゲノムに挿入し、これらの発現を長期的 に維持することを可能にした。cSox2、CdxA をそれぞれ強制発現させた胚は、胃・腸域 のマーカー遺伝子の発現が見られる 6、9、12 日胚まで発生させた。6、9、12 日胚をそ れぞれ固定し、各器官の凍結切片を作成した後、insitu hybridization 法でマーカー遺伝

子の mRNA を検出した。マーカー遺伝子には、cSox2 と CdxA に加えて、胃域で特異的 に発現する cSP(chicken spasmolytic polypeptide)と cGATA6、腸域で特異的に発現する cIFABP(chicken intestinal fatty acid binding protein)を用いた。

導入した cSox2 は導入 4 日後の 6 日胚では検出されたが、9、12 日胚では検出されな かった。この結果から Tol2 トランスポゾンシステムが機能しなかったために一過性の 強制発現となってしまったと考えられる。この一過性の cSox2 の強制発現によって、9、

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12 日胚の十二指腸、小腸上皮で異所的な胃マーカーの発現は誘導されず、腸マーカー の発現に変化は見られなかった。

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３．Summary

The vertebrate digestive tract is composed of the esophagus, stomach, small intestine,

caeca and large intestine along the antero-posterior axis. Many transcription factors and

enzymes which are expressed in each region have been identified, while the molecular

mechanism involved in organogenesis in digestive organs is not fully understood.

Despite of the strict spatial differentiation in each of the digestive organs, dysplasia, the

transformation of epithelium are found in humans and some mammals. For example, in

the gastric intestinal metaplasia, stomach epithelium is transformed into the epithelium

with resemblance to the small intestine. It is characterized by the appearance of goblet

cells and expression of intestinal cell markers such as Cdx2.

Also, it has been reported that stomach epithelium specific transcription factor Sox2

expression was decreased in there. Sox2 and Cdx2 are expressed in the stomach and

intestinal epithelium, respectively, from early stage of development before

organogenesis. Their expression in each epithelium is found even in the adult. Sox2 and

Cdx2 are required for differentiation of the stomach and intestine, because Sox2 or Cdx2

knockout mouse shows aberrant organogenesis of stomach or intestine, respectively. In

chicken CdxA, homologue of mouse Cdx1, not Cdx2 homologue CdxB is expressed in

the intestinal epithelium. Previous works in our laboratory, cSox2 were overexpressed in

presumptive intestinal epithelium and CdxA were overexpressed in presumptive

stomach epithelium at the early developmental stages. cSox2 in the caudal endoderm

suppresses CdxA, and also CdxA inhibits cSox2 expression in the rostral endoderm.

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It is unknown, however, whether its cellular differentiations were affected by cSox2 and

CdxA overexpression. In this study, to elucidate the function of cSox2 in the

gastrointestinal formation, I try to analyze the effect of long-term overexpression of

cSox2 in the intestinal epithelium.

cSox2 was introduced in the presumptive intestinal endoderm in the 2-days chicken

embryo by the electropotration. In the previous study, a cSox2 construct, that expression

is maintained for 1 to 2 days. In this study the construct with cSox2 located between two

Tol2-transposon elements were introduced with the transposase construct. Using these

constructs, cSox2 with chicken β-actin promoter will be inserted into the chicken

genome, and enable to maintain its expression over a long period. Embryos were

incubated by 6, 9, and 12 days after overexpression. Embryos were fixed and sectioned,

mRNAs of the marker genes of stomach and intestine were detected by in situ

hybridization. In addition to cSox2 and CdxA, cSP (chicken spasmolytic polypeptide)

and cGATA6 which expresses in stomach region, and cIFABP (chicken intestinal fatty

acid binding protein) which expresses in intestinal region were used as marker genes.

Ectopic expression of cSox2 was detected in 6-days embryos, but not in 9 and 12-days

embryos. This result suggests that the Tol2-system was not working. In the duodenum

and small intestine epithelium at 9 and 12-days embryos, expression of the marker

6 ４．序論 消化管は内胚葉由来の上皮とそれを囲む中胚葉由来の間充織からなる。ニワトリ胚の 消化管は、原腸胚形成後にまず最も腹側に内胚葉がシート状に拡がり、袋状の構造を作 り始め、前方の内胚葉の先端からは前腸、後方の端からは後腸が形成される。前腸は後 方へ、後腸は前方へ伸びていき一本の管となる。このように初めは単純な管状の構造を した消化管だが、発生が進むにつれて機能、形態が全く異なる消化器官、付属器官が分 化し、それぞれの器官は消化、吸収に関する特異的な機能を持つ。ニワトリ胚初期内胚 葉では、各器官の予定域でそれぞれ特異的に発現する遺伝子が多数同定されている[1- 12]。この領域特異的遺伝子は孵卵1～1.5日胚頃に一斉に発現を開始し、この頃内胚葉が 領域化することが明らかになってきた。 これまでニワトリ胚の胃と腸の領域化には、内胚葉で領域特異的に発現する2つの転 写 因 子 が 重 要 で あ る こ と が 分 か っ て い る 。 転 写 因 子 cSox2 （ SRY-related HMG box-containing gene 2）は食道、胃内胚葉に発現し、その分化に重要である[13,15,16]。 一方、転写因子CdxA(caudal type homeobox A)は十二指腸、小腸、大腸内胚葉で発現し、 これら後方の器官の分化に重要な役割を果たしている[14]。マウスでは、胃内胚葉でSox2、 腸内胚葉でCdx1,2が、分化、器官形成を通してそれぞれ発現している[13,16,17,18]。そ れぞれの条件付きノックアウトマウスでは、上皮の分化や器官の形態が異常になったこ とから、これらの転写因子は器官形成に重要な役割を担っていると考えられている [16,19,20]。消化管の各器官の分化は厳密にコントロールされているが、何らかの影響 によって、ある部分の消化管上皮が別の部分の消化管上皮に分化してしまうことがある。 この状態は異形成と呼ばれ、食道上皮中に胃上皮が分化する異所性胃粘膜[21,22]、腸上 皮中に膵臓上皮が分化する異所性膵臓[23]などが知られている。異形成の一つである腸 上皮化生は、胃の上皮が腸様に分化する病気で、多くがそれをきっかけに癌形成を促す と言われている[24,25]。このとき、腸上皮化生が生じている胃上皮ではSox2の発現が減 少し、Cdx2の発現が上昇する[26,27,28]。これらのことを合わせると、胃と腸の領域は 発生期だけでなく、成体においても、それぞれの転写因子の働きによって維持されてい ることが考えられる。しかし、Sox2やCdx単独で胃上皮分化、腸上皮分化が起こるかど うかは分かっていない。 当研究室の先行研究で、ニワトリ胚1日胚を用いて、cSox2を予定腸上皮に、CdxAを予 定胃上皮に、それぞれ強制発現する実験を行った。強制発現の後1日培養すると、腸上 皮でのCdxAの発現と胃上皮でのcSox2の発現が減少していた。この結果からcSox2と CdxAには相互抑制作用があることが示唆された[29]。しかし、cSox2、CdxAを強制発現 させた部位が、その後の細胞分化にどのような影響を与えるかは調べられていない。本 研究では、異所的に発現させたcSox2、CdxAが、それぞれ異所的な胃上皮、腸上皮を誘 導しうるかを検討することにした。そこでTol2トランスポゾンシステムを用いて、cSox2 を2日胚の予定腸域に強制発現させ、9日胚、12日胚まで培養し、導入部位の組織切片を 作製し、切片insitu hybridization法でその部位における胃マーカー、腸マーカーのmRNA

7 の発現を調べた。十二指腸と小腸で調べた結果、どちらの上皮においても同時に導入し たGFPの発光は見られたものの、異所的なcSox2 mRNAの発現は検出されなかった。強 制発現させた胚を4日培養した6日胚では、ごく僅かに異所的なcSox2 mRNAが検出され たことから、Tol2トランスポゾンシステムがうまく働いていないことが考えられる。 cSox2を強制発現した9、12日胚の十二指腸、小腸では他の胃マーカーの異所的誘導も検 出されず、内在性の腸マーカーの発現にも変化は見られなかった。また、CdxAの胃域 での強制発現も試みたが、うまくいかなかった。

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５．材料・方法

ニワトリ胚

ニワトリ（Gallus gallus domesticus）の胚を実験に用いた。実験に必要な発生段階の

ニワトリ胚を得られるように、受精卵を38℃で培養した。発生段階は孵卵器での培養開 始からの日数で示した。

cSox2の強制発現実験

CAGGS-cSox2 コ ン ス ト ラ ク ト と CAGGS-EGFP コ ン ス ト ラ ク ト 、 及 び CAGGS -transposaseを用いた。CAGGS-cSox2とCAGGS-EGFPはそれぞれTol2トランスポゾン配 列によって挟まれており、CAGGS-transposaseと共に細胞に導入されることで、Tol2ト ランスポゾン配列に挟まれた部位が胚のゲノムに直接組み込まれる[30]。GAGGSはサイ トメガロウイルスエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターを繋げたプロモータ ーで、導入された細胞で強い発現を維持する[31]。 in ovo エレクトロポレーション 38℃の孵卵器で18-24時間培養した卵の気室側の殻を破り、卵黄の表面の胚が見える 程度に卵殻膜も破る。Tol2-CAGGS-cSox2またはTol2-CAGGS-CdxAをTol2-CAGGS-EGFP、 CAGGS-transposaseとともにそれぞれ2µg/mlの濃度となるようにTEに溶かし、1% Fast Greenを加えて調製したDNA溶液を、内胚葉の下層にキャピラリで注入した。タングス テン電極の陰極を胚の腹側下層に差し込み、胚の背側に陽極を被せるように配置した。 CUY21エレクトロポレーター（Bex, Co., Ltd.）で10Vのパルス電流を50msecで5回、 900msecごとに与えた。卵はスコッチテープで封をし、再び38℃で培養した。

切片 insitu hybridization（SISH）

必要な発生段階まで培養したニワトリ胚を、解剖し必要な部位の消化管を取り出し、 4%パラフォルムアルデヒドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶かした溶液で、4℃で 一晩固定した。30%スクロースに置換し、4℃で胚が完全に沈むまで待った。胚をOCT コンパウンド（Sakura Finetechnical Co., Ltd.）で型に包埋し、-80℃で凍結保存した。ク リオスタットで12µmの凍結切片を作製し、cDNAを元に精製したジゴキシゲニン（DIG） でラベルしたアンチセンスプローブに、抗DIG抗体を用いることでmRNAを検出した。

cGATA6、cSP[32]、cSox2[33]、CdxA [1 4] 、cIFABP（MRC Geneservice, Cambridge）の

9 ６．結果 内胚葉の領域特異的遺伝子の発現パターン 強制発現実験を行うにあたり、遺伝子が導入された消化管上皮の細胞分化への影響を 判断するため、胃域、腸域それぞれにおいて領域特異的に発現する遺伝子について検討 した。 まず、胃域ではcGATA6、cSPを候補に挙げた。GATA転写因子のサブファミリーであ るGATA4/5/6は内胚葉で発現することが知られており[34]、ニワトリ胚では前胃の内腔 上皮でcGATA4が発現し[34,35]、腺上皮でcGATA5が発現している[34,36]。また、cGATA6 は胃域で強く発現することが知られている[34]。cSP（chicken spasmolytic polypeptide） は粘膜産生細胞マーカーで、6.5日胚以降の胃内腔上皮で発現している[32,36]。本研究 においてはこれらのうちcGATA6、cSP、を胃マーカーとして用いた。

次に、腸域ではcIFABPとCdxAを候補に挙げた。ニワトリの小腸脂肪酸結合タンパク 質（chicken intestinal fatty acid binding protein: cIFABP）は、低分子でシステインが 豊富なタンパク質で、小腸上皮で発現する[37]。ホメオボックス遺伝子CdxAもまた小腸 上皮で発現している[14,37]。腸マーカーにはcIFABPとCdxAを用いることにした。

これらの胃マーカーと腸マーカーの発現を、正常胚の6、9、 12日胚の胃、十二指腸、 小腸それぞれの組織切片を作製し、in situ hybridization法で検出した（Fig.1,2）。胃域

では、cGATA6は9、12日胚で発現し（Fig.1D,G）、cSPとcSox2は6、9、12日胚で発現し ていた（Fig.1B,E,H,C,F,I）。cGATA6の発現は十二指腸域、小腸域でも見られたが、胃 域でより強く発現していた（Fig.1A,D,G,J,M,P,S,V,Y）。十二指腸域、小腸域では、cSP とcSox2の発現は検出されなかった（Fig.1K,L,N,O,Q,R,T,U,W,X,Z,AA）。CdxAは6、9、 12日胚の十二指腸域、小腸域で発現していた（Fig.2G,I,K,M,O,Q）。cIFABPは小腸域の 9、12日胚で発現し、十二指腸域では検出されなかった（Fig.2H,J,L,N,P,R）。胃域では、 これらCdxAとcIFABPの発現は見られなかった（Fig.2A-F）。従って本研究では、胃域 で発現するcGATA6とcSPを胃マーカー、腸域で発現するCdxAとcIFABPを腸マーカー として用いて、以下の実験を行った。

強制発現実験に使用するコンストラクトの検討

序論で述べたcSox2とCdxAの異所的な強制発現実験を行った先行研究では、1日胚に、 ウイルス由来のプロモーター・エンハンサー領域の下流に、cSox2、CdxAをそれぞれ繋 い だ コ ン ス ト ラ ク ト （ pME18S-cSox2 (Ishii, unpublished) 、 pME18S-CdxA (Koike, unpublished)）をエレクトロポレーション法により内胚葉に導入し、異所的にcSox2、CdxA を強制発現させていた。このコンストラクトの発現が維持されるのは1日から2日のため、 導入遺伝子の異所的な発現を長期的に維持することはできない。そこで本研究では、

10 Tol2トランスポゾンシステムを用いた。このシステムでは、Tol2トランスポゾン配列で 挟んだ遺伝子を、転移酵素の働きによって直接ニワトリのゲノムに組み込むことができ る[30]。サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターを繋げ たCAGGSプロモーター[31]の下流に目的遺伝子（cSox2、CdxA、EGFP）を繋げ、Tol2 トランスポゾン配列で挟んだコンストラクトと、CAGGSプロモーターの下流に転移酵 素を繋げたコンストラクトを、エレクトロポレーション法で共導入することによって、 目的遺伝子がニワトリのゲノムに直接組み込まれることを期待した。このTol2トランス ポゾンシステムを用いることで、cSox2とCdxAの異所的発現を長期的に維持し続けるこ とが可能になると考え、以下の実験を行った。 小腸上皮におけるcSox2の強制発現実験（9、12日胚） 胃上皮で発現するcSox2を腸域で強制発現させ、その部位での細胞分化への影響を調 べるために、2日胚の予定腸域にTol2-CAGGS-cSox2とTol2-CAGGS-EGFPをinovoエレク トロポレーション法により共導入した。その後12日胚で胚を解剖して消化管を取り出し、 固定した。蛍光実体顕微鏡下で、小腸、十二指腸域にGFPの蛍光が見られたもののみ凍 結切片を作製した（Fig.3M,N）。 cSox2を強制発現させた12日胚の小腸の組織切片を調べた。GFPの蛍光が見られた細 胞にはcSox2も共導入されたと仮定し、その部位での腸マーカーと胃マーカーの発現を 切片 in situ hybridization法で調べた（Fig.3M,N 矢じり）。コントロールとしてEGFP

のみを強制発現させた胚の実験結果を比較提示した（Fig.3A,C,E,G,I,K）。6枚の隣接切 片のうち、cSox2とEGFPを共導入した胚（cSox2 OE胚）では、GFPの蛍光が見られた部 位でcSox2の異所的発現は見られなかった（Fig.3H）。また、腸マーカーCdxAおよび cIFABPの発現に変化は見られなかった（Fig.3J,L）。さらに同部位で胃マーカーの発現 を見ると、cSPはコントロール胚とcSox2 OE胚どちらにおいてもその発現は確認できな かった（Fig.3E,F）。cGATA6はコントロール胚とcSox2 OE胚の双方で、内在性の発現が 小腸上皮で観察されたが、強制発現による発現の変化は認められなかった（Fig,3C,D）。 同様に、2日胚にcSox2を導入し、7日間孵卵した9日胚の小腸の組織切片についても調 べた（Fig.4）。9日胚でも、cSox2 OE胚でGFPの蛍光が見られた部位で、異所的なcSox2 の発現は見られなかった（Fig.4H）。腸マーカーCdxAとcIFABPの発現に変化は見られ ず （ Fig.4I,J,K,L ） 、 胃 マ ー カ ー cGATA6 と cSP の 異 所 的 な 誘 導 も 見 ら れ な か っ た （Fig.4C,D,E,F）。 結果をまとめると、cSox2が異所的に導入されていると思われる小腸上皮では、導入 したはずのcSox2が検出されず、その部位での他の胃マーカーと腸マーカーの発現は変 化しなかった。

11 十二指腸上皮におけるcSox2の強制発現実験（9、12日胚） 次に、cSox2を強制発現させた12日胚の十二指腸の組織切片を調べた（Fig.5）。小腸 上皮の結果と同様に、cSox2 OE胚の蛍光が見られる部位で異所的なcSox2の発現が見ら れず（Fig.5H）、胃マーカーの異所的な発現は見られなかった（Fig.5C,D,E,F）。腸マ ーカーCdxAとcIFABPの発現にも変化は見られなかった（Fig.5I,J,K,L）。cSox2を強制発

現させた9日胚の十二指腸においても同様の結果となった（Fig.6）。cSox2 OE胚の蛍光 が見られる部位で異所的なcSox2の発現は検出されず（Fig.6H）、胃マーカーの発現は 見られず（Fig.6C,D,E,F）、腸マーカーの発現に変化は見られなかった（Fig.6I,J,K,L）。 この十二指腸上皮での強制発現実験の結果と、小腸上皮の結果を合わせて、エレクト ロポレーション法により導入されたcSox2が検出されなかったことから、cSox2コンスト ラクトであるTol2-CAGGS-cSox2が機能していないのではないかと考え、次の実験を行 った。 十二指腸域上皮におけるcSox2の強制発現実験（6日胚） 9、12日胚の小腸および十二指腸の上皮で、導入したcSox2の発現を検出することがで きなかった。そこで9日胚よりも発生段階の早い6日胚の腸上皮で、異所的に導入した cSox2の発現を検出できるかを調べた（Fig.7）。するとGFPの蛍光が見られた部位の隣 接切片で、cSox2の異所的な強制発現が検出された（Fig.7H）。しかし、このcSox2の発 現はそれほど強いものではなかった。次に、この隣接切片で胃マーカーと腸マーカーの 発現を調べた。すると、cSox2の発現が比較的強く見られた部位で、腸マーカーCdxAの 発現が減少していた（Fig.7H,J 矢じり）。他のマーカー遺伝子、cGATA6とcSP、cIFABP の発現に変化は見られなかった（Fig.7C,D,E,F,K,L）。この結果は、cSox2コンストラク トから転写されたmRNAが、少なくとも導入から4日後までは維持されていることを示 している。 以上の結果から、今回の実験ではTol2システムは働いておらず、予定腸域に異所的に 強制発現させたcSox2 mRNAは6日胚の十二指腸域では検出されるが、9、12日胚では十 二指腸域、腸域ともに検出することができなかった。cSox2を導入した9、12日胚の十二 指腸、小腸のGFPの蛍光が見られた部位で、腸マーカーCdxA、cIFABPの発現に変化は 見られず、胃マーカーcGATA6、cSPの異所的な発現誘導も見られなかった。

12 ７．考察 本研究では、小腸、十二指腸に異所的にcSox2を強制発現させ、6、9、12日胚まで孵 卵してその影響を調べた。その結果、6日胚ではcSox2の異所的な発現が検出されたが、 9、12日胚では検出されなかった。そしてcSox2が導入された腸域でのCdxAの発現は、十 二指腸、小腸でともに変化は見られなかった。 マウスの研究で、CAGGSプロモーターの下流にSox2とCdx2を繋げたコンストラクト を用いて、Sox2を腸域にCdx2を胃域に異所的に強制発現させ、その部位のSox2とCdx2 のタンパク質の局在について報告された。Cdx2の異所的な発現によって胃域のSox2の発 現は低下したが、Sox2の異所的な発現による腸域のCdx2の発現の減少は見られなかった [38]。また、腸域でSox2を発現するトランスジェニックマウスの十二指腸では、Sox2の 異所的な発現とともに内在性のCdx2が共発現していることが報告された[39]。そして異 所的なSox2の発現によってCdx2の発現は影響を受けないが、Cdx2の下流の遺伝子の発 現が著しく減少したことから、Sox2がCdx2の目的遺伝子への結合を減少させた可能性が 示唆された[39]。 今回の結果とマウスの報告にはいくつか違いがある。まず、6日胚でSox2がCdxAを抑 制したことである。マウスとニワトリではSox2とCdxの関係に違いがある可能性がある。 渡辺の研究で、ニワトリ胚ではSox2とCdxAに相互抑制作用があることが示されている が、マウスではCdx2はSox2を抑制するが、その逆はない[38,39]。CdxAの哺乳類のホモ ログはCdx1である。マウスでは、Sox2はCdx2を阻害しないが、Cdx1を阻害する可能性 がある。 また、今回の実験ではTol2トランスポゾンシステムが働かず、一過性の強制発現にな ってしまったと考えられる。Tol2トランスポゾンシステムによってcSox2がゲノムに組 み込まれているとすれば、12日胚でもcSox2の発現が検出できると考えられるからであ る。しかし、Tol2トランスポゾンシステムが機能しなかったとしても、強力なCAGGS プロモーターからの転写は誘導されるため、それによって細胞内に残っていたcSox2が6 日胚では検出されたが、その転写は12日胚では維持されていなかったものと考えた。な お、GFPタンパク質は長寿命なので、12日胚でも観察できたと考えられる。研究室の他 の実験で、同じTol2-CAGGS-EGFPとCAGGS-transposaseを神経冠細胞に共導入したとこ ろ、18日胚の神経冠細胞でのFGPの蛍光は今回よりもずっと強く、一つ一つの細胞が区 別できるほどだったため[40]、これも今回Tol2システムが働いていないことを裏付けて いる。マウスの報告で見られたCdx下流遺伝子の減少について、今回の実験でCdx下流 遺伝子の一つであるcIFABPの発現に変化が見られなかったのは、cSox2の持続的な強制 発現ができなかったためと思われる。 本研究ではcSox2を腸域で異所的に強制発現させ続けたときの細胞分化への影響を明 らかにすることを目的としたが、cSox2の長期的な発現は維持することができなかった。 しかし、導入から少なくとも4日間維持したcSox2の発現は十二指腸上皮、小腸上皮の腸

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マーカーの発現に影響を与えないことが示唆された。今後、本研究の結果について、ま ずより多くの個体で検証する必要がある。そしてcSox2の長期的な発現を確実に維持で きるよう実験条件を整え、異所的なcSox2が長期的に維持された条件下で、細胞分化に 与える影響を調べたい。全ての実験で例数が少なく、insitu hybridizationの技術が未だ不

14 Figure 1 胃マーカー（cGATA6、cSP、cSox2）の発現パターン 6、9、12日胚の胃域、十二指腸域、小腸域それぞれの上皮での、胃マーカーの発現を 示す（A-AA）。横に並べた切片は、同一個体の隣接切片での結果を示している。胃域 では、cSPとcSox2が6日胚から、cGATA6は9日胚から発現していた（A-I）。cGATA6は6、 9、12日胚の十二指腸、小腸域で弱く発現している（J,M,P,S,V,Y）。cSPとcSox2は十二 指腸、小腸域では発現していなかった（K,L,N,O,Q,R,T,U,W,X,Z,AA）。n=2。Scale bar = 100µm。

cGATA6

cSP

cSox2

６

日胚

９日胚

１２

日胚

６

日胚

９日胚

１２

日胚

６

日胚

９日胚

１２

日胚

胃域

十二指腸域

小腸

域

16 Figure 2 腸マーカー（CdxA、IFABP）の発現パターン 6、9、12日胚の胃域、十二指腸域、小腸域それぞれの上皮での、腸マーカーの発現を 示す（A-AA）。同一発生段階および同一部位については、隣接切片での結果を示して いる。CdxAは6日胚の十二指腸、および小腸域で発現しており、9、12日胚でも発現し ていた（G,I,K,M,O,Q）。cIFABPは十二指腸上皮では発現しておらず、小腸上皮の9、 12日胚で発現していた（P,R）。胃域では腸マーカーの発現は見られなかった（A-F）。 なお、Fig.1とFig.2で示した切片は、6、9、12日胚の各部位の同一個体の隣接切片であ る。n=2。Scale bar = 100µm。

CdxA

cIFABP

６

日胚

９日胚

１２

日胚

６

日胚

９日胚

１２

日胚

６

日胚

９日胚

１２

日胚

胃域

十二指腸域

小腸

域

18 Figure 3 小腸上皮におけるcSox2の強制発現（12日胚） cSox2を強制発現させた12日胚の小腸の隣接切片を示した（A-L）。蛍光実体顕微鏡下 でGFPの蛍光が見られた部位の隣接切片を作製した（M,N 矢じり）。EGFPのみを強制 発現させたものをEGFP OE（A,C,E,G,I,K）とし、cSox2を強制発現させた胚をcSox2 OE とした（B,D,F,H,J,L）。n=2。Scale bar = 100µm。

１２日胚 小腸

IF

AB

P

CdxA

cSo

x2

cSP

cGA

TA6

EGF

P

cSox2 OE

EGFP OE

Ｃ

Ｄ

Ａ

Ｂ

Ｅ

Ｆ

Ｇ

Ｈ

Ｉ

Ｊ

Ｋ

Ｌ

Ｍ

Ｎ

EGFP

OE

cSox2

OE

20 Figure 4 小腸上皮における cSox2 の強制発現（9 日胚） cSox2を強制発現させた9日胚の小腸の隣接切片を示した（A-L）。蛍光実体顕微鏡下 でGFPの蛍光が見られた部位の隣接切片を作製した（M,N 矢じり）。EGFPのみを強制 発現させたものをEGFP OE（A,C,E,G,I,K）とし、cSox2を強制発現させた胚をcSox2 OEとした（B,D,F,H,J,L）。n=1。Scale bar = 100µm。

cIF

AB

P

CdxA

cSo

x2

cSP

cGA

TA6

EGF

P

cSox2 OE

EGFP OE

９日胚 小腸

Ｃ

Ｄ

Ａ

Ｂ

Ｅ

Ｆ

Ｇ

Ｈ

Ｍ

Ｎ

EGFP

OE

cSox2

OE

Ｉ

Ｊ

Ｋ

Ｌ

22 F i gu re 5 十二指腸上皮におけるcSox2の強制発現実験（12日胚） cSox2 を強制発現させた 12 日胚の十二指腸の隣接切片を示した（A-L）。蛍光実体顕 微鏡下で GFP の蛍光が見られた部位の隣接切片を作製した（M,N 矢じり）。EGFP のみ を強制発現させたものを EGFP OE（A,C,E,G,I,K）とし、cSox2 を強制発現させた胚を

１２日胚 十二指腸

cIF

AB

P

CdxA

cSo

x2

cSP

cGA

TA6

EGF

P

cSox2 OE

EGFP OE

Ｃ

Ｄ

Ａ

Ｂ

Ｅ

Ｆ

Ｇ

Ｈ

Ｍ

Ｎ

EGFP

OE

cSox2

OE

Ｉ

Ｊ

Ｋ

Ｌ

24 F i gu re 6 十二指腸上皮におけるcSox2の強制発現実験（9日胚） cSox2を強制発現させた9日胚の十二指腸の隣接切片を示した（A-L）。蛍光実体顕微 鏡下でGFPの蛍光が見られた部位の隣接切片を作製した（M,N 矢じり）。EGFPのみを 強制発現させたものをEGFP OE（A,C,E,G,I,K）とし、cSox2を強制発現させた胚をcSox2 OEとした（B,D,F,H,J,L）。n=2。Scale bar = 100µm。

cIF

AB

P

CdxA

cSo

x2

cSP

cGA

TA6

EGF

P

cSox2 OE

EGFP OE

９日胚 十二指腸

Ｃ

Ｄ

Ａ

Ｂ

Ｅ

Ｆ

Ｇ

Ｈ

Ｍ

Ｎ

EGFP

OE

cSox2

OE

Ｉ

Ｊ

Ｋ

Ｌ

26 Figure 7 十二指腸域上皮におけるcSox2の強制発現実験（6日胚） cSox2を強制発現させた6日胚の十二指腸の隣接切片を示した（A-L）。蛍光実体顕微 鏡下でGFPの蛍光が見られた部位の隣接切片を作製した（M,N 矢じり）。EGFPのみを 強制発現させたものをEGFP OE（A,C,E,G,I,K）とし、cSox2を強制発現させた胚をcSox2 OEとした（B,D,F,H,J,L）。cSox2 OE胚において、cSox2の異所的な発現が検出され（H）、 同部位でCdxAの発現が減少した（J）。n=1。Scale bar = 100µm。

cIF

AB

P

CdxA

cSo

x2

cSP

cGA

TA6

EGF

P

cSox2 OE

EGFP OE

６日胚 十二指腸域

Ｃ

Ｄ

Ａ

Ｂ

Ｅ

Ｆ

Ｇ

Ｈ

Ｍ

Ｎ

EGFP

OE

cSox2

OE

Ｉ

Ｊ

Ｋ

Ｌ

28

７．参考文献

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