薬物定量用電気化学検出HPLCの高感度化とその応用

序 論 薬 物 を タ ー ゲ ッ ト と し た 定 量 分 析 は ，創 薬 研 究 ，薬 効・薬 理 研 究 ，安 全 性 試 験 ，薬 物 動 態 研 究 な ど の 基 礎 研 究 か ら 医 薬 品 の 製 造 や 品 質 管 理 な ど の 製 薬 の 現 場 ，ヒ ト を 対 象 と し た 治 験 お よ び 治 療 薬 物 モ ニ タ リ ン グ な ど の 臨 床 研 究 に 至 る 広 範 な 研 究 領 域 に お い て 重 要 で あ る ． こ の よ う な 薬 学 領 域 に お け る 定 量 分 析 で は ，生 体 試 料 や 製 剤 の よ う に 様 々 な マ ト リ ッ ク ス を 含 む 試 料 を 対 象 と し て 取 り 扱 う こ と が 多 く ，夾 雑 物 と 測 定 対 象 物 質 を 分 離 す る 必 要 が あ る ．こ の た め ，信 頼 性 に 優 れ た 測 定 デ ー タ を 得 る た め の 定 量 分 析 法 と し て 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ HPLC） が 汎 用 さ れ て い る ．特 に ，固 定 相 に オ ク タ デ シ ル シ リ ル 化 シ リ カ ゲ ル（ ODS）カ ラ ム を 用 い た 吸 光 検 出 HPLC（ HPLC-UV）は 有 機 化 合 物 の 分 離 分 析 に 適 す る こ と か ら 薬 物 の 定 量 に 適 用 さ れ て お り ，製 薬 企 業 や 医 療 機 関 な ど の 様 々 な 施 設 に お い て HPLC-UV 装 置 が 多 く 導 入 さ れ て き た ．し か し ，HPLC-UV は ，分 析 対 象 に よ っ て は 感 度 や 特 異 性 が 充 分 で な い こ と が あ り ，薬 物 お よ び そ の 代 謝 物 の 網 羅 的 解 析 を 行 う 薬 物 動 態 研 究 ，あ る い は 薬 物 の 分 解 生 成 物 の 同 定 や そ の 生 成 経 路 を 探 査 す る 安 定 性 試 験 ，複 数 の 薬 物 が 投 与 さ れ て い る 患 者 の 治 療 薬 物 モ ニ タ リ ン グ へ の 適 用 が 困 難 な 場 合 が あ る ．近 年 ，こ れ ら に 対 し て 製 薬 企 業 で は 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー タ ン デ ム 質 量 分 析 法 （ LC-MS/MS） の 導 入 が 行 わ れ て い る ．LC-MS/MS は 選 択 性 が 高 く ，血 液 や 尿 中 の 薬 物 お よ び そ の 代 謝 物 を 分 析 す る 際 に 有 益 な 分 析 法 で あ る が ，装 置 が 大 型 ，初 期 導 入 費 と 維 持 費 が 高 額 ， 高 感 度 か つ 高 精 度 分 析 の た め に は 試 料 に 対 し て 充 分 な ク リ ー ン ア ッ プ 操 作 が 必 要 ，対 象 薬 物 に よ っ て は 誘 導 体 化 操 作 な ど の 前 処 理 方 法 が 煩 雑 で あ る 等 が 問 題 点 と し て 指 摘 さ れ る 場 合 が あ る ．そ の 他 の 高 感 度 HPLC と し て ，分 離 分 析 ，感 度 ，特 異 性 の 観 点 か ら 蛍 光 検 出 HPLC（ HPLC-FL），電 気 化 学 検 出 HPLC（ HPLC-ECD）な ど が ，薬 物 の 定 量 分 析 に 有 望 と 考 え ら れ る ． HPLC-ECD は ，酸 化 還 元 物 質 を 高 感 度 か つ 特 異 的 に 定 量 で き る 分 析 法 で あ り ，様 々 な 領 域 で 利 用 さ れ て い る ．さ ら に ，HPLC-ECD は ，低 価 格 で あ る う え に 分 析 装 置 自 体 の 小 型 化 を 図 る こ と が 容 易 で あ り ，広 範 な 研 究 機 関 お よ び 小 中 規 模 の 医 療 機 関 へ の 装 置 導 入 を 考 慮 し た 場 合 ， 非 常 に 有 利 で あ る ．

Table 1 Analytes detected by HPLC with amperometric detection.

Analyte or Analyte Class Working electrode Ref.

Aromatic amines Glassy carbon 1

Aromatic nitro compounds Glassy carbon 1

Ascorbic acid Pt 2

Bromide Ag 3

Catecholamines and other biogenic amines Glassy carbon 1, 4-7

Cyanide Ag 3, 8

Hydroquinones Glassy carbon 1

Iodide Glassy carbon 1, 9

Phenols Glassy carbon 1

Sulfide Ag 3

Sulfite Pt 10

Uric acid Glassy carbon 1

第 1 章 電 解 還 元 に よ る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC と 生 薬 へ の 混 入 監 視 の 実 践

1-1 緒 言

1993 年 に ベ ル ギ ー で ，痩 身 療 法 の た め に 生 薬 製 剤 を 摂 取 し た 多 数 の 女 性 に 急 速 に 進 行 す る 腎 不 全 が 起 こ り ， こ の 疾 患 は Chinese herbs nephropathy と 報 告 さ れ た [27-29]． そ の 後 ， 処 方 さ れ た 生 薬 製 剤 の 分 析 に よ っ て ， 原 因 は 誤 用 さ れ た Radix Aristolochiae Fangchi に 含 ま れ る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 で あ る と 報 告 さ れ た [30]．以 来 ，こ の 疾 患 は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 腎 症 と 称 さ れ る よ う に な っ た ．

ア リ ス ト ロ キ ア 酸 は ，フ ェ ナ ン ト レ ン 骨 格 を 持 つ 芳 香 族 カ ル ボ ン 酸 で あ り ， ウ マ ノ ス ズ ク サ 科 の 植 物 は ， Fig. 1-1 の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ｉ （ AA1, 8-methoxy-6-nitro-phenanthro-(3,4-d)-1,3-dioxolo-5-carboxylic acid）， ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ⅱ（ AA2, 6-nitro-phenanthro-(3,4-d)-1,3-dioxolo-5-carboxylic acid）な ど を 含 有 す る [31,32]． こ れ ら は ， 腎 毒 性 ， 発 が ん 性 ， 変 異 原 性 を 有 す る こ と が 知 ら れ て い る [33-35]． 動 物 実 験 で は ， 100 mg/kg ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 単 回 経 口 投 与 で 近 位 尿 細 管 壊 死 が [33]， 10 mg/kg ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 35 日 間 （ 週 5 日 ） 皮 下 投 与 で ， 近 位 尿 細 管 の 萎 縮 と 間 質 性 線 維 症 が 惹 起 し た と 報 告 さ れ て い る [36]．ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の LD50は ，Wistar 系 ラ ッ ト に お い て 56～ 203 mg/kg（ 経 口 ）で あ り [37]， そ の 標 的 臓 器 は 腎 臓 と 報 告 さ れ て い る [38]． 実 際 ， 問 題 の 生 薬 製 剤 中 に は ， 0.65±0.56 mg/g の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 が 含 有 さ れ て い た [30]． 日 本 で も ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 む 漢 方 薬 の 使 用 に よ る 被 害 が 報 告 さ れ て い る ．各 国 で は ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 む 生 薬 ，生 薬 製 剤 の 流 通 を 禁 止 す る た め に 厳 し い 規 制 を 設 け て い る が ，渡 航 先 で の 購 入 や イ ン タ ー ネ ッ ト 販 売 に よ る 個 人 輸 入 な ど が 要 因 と な り ，現 在 で も ア リ ス ト ロ キ ア 酸 腎 症 の 患 者 が 報 告 さ れ て い る [29,39,40]．

[24,55-57] は プ レ カ ラ ム あ る い は ポ ス ト カ ラ ム 方 式 の HPLC に 利 用 さ れ ，ppb レ ベ ル の ア ミ ノ 酸 の 高 感 度 分 析 に 応 用 さ れ て い る [57]．従 っ て ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 構 造 中 の ニ ト ロ 基 の 電 解 還 元 を 利 用 す れ ば ，感 度 と 特 異 性 に 優 れ た ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 検 出 が 可 能 で あ り ， す で に ，Sun ら は ，グ ラ フ ァ イ ト 電 極 を 作 用 電 極 と し た ボ ル タ ン メ ト リ ー に よ っ て ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 検 出 で き る こ と を 示 し た [41]． 電 気 化 学 検 出 の 電 解 反 応 と し て ， Fig. 1-2 の よ う な ニ ト ロ 基 の 還 元 反 応 が 想 定 さ れ る ． し か し な が ら ， Sun ら は AA1 と AA2 の 分 離 定 量 に は 至 っ て お ら ず [41]，AA1 と AA2 の HPLC-ECD を 用 い た 分 析 事 例 は ， 報 告 さ れ て い な い ． ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 混 入 監 視 を 目 的 と す る 場 合 ， AA1 と AA2 の 分 離 定 量 を 行 う 必 要 が あ り ， ま た 移 動 相 組 成 は 電 気 化 学 検 出 の 支 持 電 解 質 溶 液 を 兼 ね る の で ， 適 切 な 分 離 系 の 構 築 と 電 解 条 件 の 設 定 が AA1 と AA2 の 高 感 度 分 離 定 量 を 左 右 す る ． そ こ で ，本 研 究 で は ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 解 還 元 を 利 用 し ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 高 感 度 か つ 特 異 的 に 検 出 で き る HPLC-ECD を 構 築 し ， こ れ を 生 薬 へ の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 混 入 監 視 へ 応 用 す る こ と と し た ．

Fig. 1-2 Proposed electrochemical reduction of aristolochic acid II (AA2).

1-2 実 験 材 料 と 実 験 方 法

1-2-1 ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC

ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 解 還 元 に 基 づ く HPLC-ECD と し て Fig. 1-3 に 示 す シ ス テ ム を 構 築 し た ． デ ガ ッ サ ー （ LC-26A, BAS 製 ）， ポ ン プ （ 301M, フ ロ ム 製 ）， サ ン プ ル イ ン ジ ェ ク タ ー （ 7125, レ オ ダ イ ン 製 ）， マ イ ク ロ ボ ア カ ラ ム

ー ブ ン （ FT-1, BAS 製 ）， 電 気 化 学 検 出 器 （ LC-4C, BAS 製 ） を 用 い て 構 築 し た ．フ ロ ー 型 電 解 セ ル（ ラ ジ ア ル フ ロ ー セ ル ，BAS 製 ）の 作 用 電 極 は グ ラ ッ シ ー カ ー ボ ン（ 円 盤 型：直 径 6 mm），参 照 電 極 は Ag/AgCl，対 極 は ス テ ン レ ス を 用 い ，作 用 電 極 表 面 に お い て 電 極 還 元 反 応 で 生 じ る 還 元 電 流 を 電 気 化 学 検 出 器 に よ り 測 定 し ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 特 異 的 な 検 出 方 法 と し て 構 築 し た ． 移 動 相 は ， メ タ ノ ー ル -水 -リ ン 酸 （ 65:35:0.5, v/v/v）， カ ラ ム 温 度 は 40℃ ， 流 速 は 25 L/min， 試 料 注 入 量 は 5 L， 印 加 電 位 は -0.7 V vs. Ag/AgCl に 設 定 し た ．

Fig. 1-3 Block diagram of the HPLC -ECD system.

MP, Mobile phase, methanol-water-phosphoric acid (65:35:0.5, v/v/v); DG, degasser; P, pump; S, sample injector; column, microbore ODS column (Capcell

Pak UG-120, 150 x 1.0 mm i.d., 3 m); D, electrochemical detector,

electrochemical cell and potentiostat; R, recorder.

1-2-2 ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 吸 光 検 出 HPLC

日 局 16 改 正 の サ イ シ ン の 純 度 試 験（ AA1）に 準 拠 し た HPLC-UV は ，ポ ン プ（ L-6000, 日 立 製 作 所 製 ），ODS カ ラ ム（ Mightysil ODS, 150×4.6 mm i.d., 3

m, 関 東 化 学 製 ）， UV 検 出 器 （ L-4000, 日 立 製 作 所 製 ） を 用 い て 構 築 し た ．

移 動 相 に は 50 mmol/L NaH2PO4水 溶 液 － ア セ ト ニ ト リ ル（ 11:9, v/v），流 速 は

1.0 mL/min，試 料 注 入 量 は 20 L，カ ラ ム 温 度 は 25℃ ，測 定 波 長 は 400 nm に

設 定 し た ．

1-2-3 生 薬 お よ び HPLC 用 検 液 の 調 製 方 法

Aristolochiae Fangchi ）， モ ク ツ ウ （ Caulis Akebiae ）， モ ッ コ ウ （ Radix Aucklandiae） を 用 い た ． 本 研 究 で は ，サ イ シ ン の 純 度 試 験（ AA1）に 準 拠 し て HPLC 用 の 検 液 を 調 製 す る こ と と し た ． 日 局 16 改 正 ・ サ イ シ ン の 純 度 試 験 （ AA1） の 方 法 を 以 下 に 記 し た ． 「 純 度 試 験 ： ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ⅰ 本 品 の 粉 末 2.0 g を 正 確 に 量 り ， 薄 め た メ タ ノ ー ル （ 3→ 4） 50 mL を 加 え て 15 分 間 振 り 混 ぜ た 後 ， ろ 過 し ， ろ 液 を 試 料 溶 液 と す る ． 別 に 生 薬 純 度 試 験 用 ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ⅰ 1.0 mg を 正 確 に 量 り ， 薄 め た メ タ ノ ー ル （ 3→ 4） に 溶 か し ， 正 確 に 100 mL と す る ． こ の 液 1 mL を 正 確 に 量 り ， 薄 め た メ タ ノ ー ル （ 3→ 4） を 加 え て 正 確 に 25 mL と し 標 準 溶 液 と す る ．試 料 溶 液 お よ び 標 準 溶 液 20 L ず つ を 正 確 に と り ，次 の 条 件 で 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー <2.01>に よ り 試 験 を 行 う と き ，試 料 溶 液 に は 標 準 溶 液 の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ⅰ に 対 応 す る 保 持 時 間 に ピ ー ク を 認 め な い ．」 生 薬 中 の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 定 量 す る 場 合 ，内 標 準 法 が 有 用 と 考 え た ．そ こ で ， 内 標 準 物 質 （ IS） と し て 3,5-di-tert-buty1-1,2-benzoquinone（ DBBQ） を 用 い た 場 合 の HPLC 用 検 液 の 調 製 方 法 は ， 次 の 手 順 を 実 施 し た ． 各 々 の 生 薬 原 料 は ， 鋏 で 切 断 生 薬 に し た 後 に ミ ル を 用 い て 生 薬 末 と し た ． 各 生 薬 末 0.4 g を 精 密 に 量 り ， DBBQ（ IS） を 含 む 75vol%の メ タ ノ ー ル 溶 液 10 mL を 加 え て 15 分 間 振 り 混 ぜ ，試 料 溶 液 と し た ．試 料 溶 液 は ，孔 径 0.45 m の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー （ 13A， ク ラ ボ ウ 製 ） で ろ 過 を し て 検 液 と し た ． マ イ ク ロ シ リ ン ジ を 用 い て 検 液 5 L を HPLC に 注 入 し ， ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し た ． 試 料 溶 液 は ， 必 要 に 応 じ て DBBQ を 含 む メ タ ノ ー ル - 水 - リ ン 酸 （ 65:35:0.5, v/v/v） 混 液 で 適 宜 希 釈 し た ． 1-3 実 験 結 果 1-3-1 ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC 条 件 の 最 適 化

HPLC-ECD の 測 定 条 件 に お い て ， AA1 と AA2 を 特 異 的 か つ 高 感 度 に 検 出 で き る 印 加 電 位 を 選 定 す る た め に ハ イ ド ロ ダ イ ナ ミ ッ ク ボ ル タ モ グ ラ ム を

測 定 し た ． 5.0 g/mL の AA1 と AA2 の 標 準 溶 液 を HPLC-ECD に 注 入 し ， 各

の ピ ー ク 高 さ は 増 加 し た ． し か し ， ベ ー ス ラ イ ン ノ イ ズ レ ベ ル も 増 加 し た ． よ っ て ，シ グ ナ ル ／ ノ イ ズ 比（ S/N 比 ）が 最 も 良 好 で あ っ た -0.7 V vs. Ag/AgCl を 印 加 電 位 に 決 定 し た ．p-ニ ト ロ フ ェ ノ ー ル の 電 極 還 元 反 応 の メ カ ニ ズ ム を 考 慮 す る と ， -0.7 V vs. Ag/AgCl 付 近 で は ， 4 電 子 ・ 4 プ ロ ト ン が 関 与 す る 電 極 反 応 （ Fig. 1-2） が 進 行 し た と 考 え ら れ た ． つ ぎ に ， AA1 と AA2 を 良 好 に 分 離 す る た め に ， 移 動 相 中 の メ タ ノ ー ル と 水 の 組 成 比 お よ び 流 速 を 検 討 し た ．HPLC の 分 離 モ ー ド は ，ODS カ ラ ム を 用 い た 逆 相 分 配 で あ る の で ，移 動 相 中 の メ タ ノ ー ル の 割 合 を 大 き く す る と AA1 と AA2 の 保 持 時 間 が 短 く な り ， 各 々 の ピ ー ク が 近 接 し た ． ま た ， 流 速 を 速 く し た 場 合 も AA1 と AA2 の 保 持 時 間 が 短 く な り ，各 々 の ピ ー ク が 近 接 し た ． AA1 と AA2 の ピ ー ク の 分 離 と 測 定 時 間 を 考 慮 し た 結 果 ， 移 動 相 は メ タ ノ ー ル -水 -リ ン 酸 （ 65:35:0.5, v/v/v）， 流 速 は 25 L/min を 選 定 し た ． ま た ， カ ラ ム 温 度 は 40℃ に 設 定 し た ．

Fig. 1-4 Hydrodynamic voltammograms of aristolochic acids I and II.

HPLC conditions used were: column, microbore ODS column (Capcell Pak UG-120, 150 x 1.0 mm i.d., 3 m); column temperature, 40 ℃ ; mobile phase, methanol-water-phosphoric acid (65:35:0.5, v/v/v); flow rate, 25 L/min. A standard mixture (5 L) of aristolochic acids I (AA1) and II (AA2) was injected

1-3-2 ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ

最 適 化 し た HPLC 条 件 下 に お い て ，10.0 g/mL の AA1 と AA2 の 標 準 溶 液

を HPLC-ECD に 注 入 し ，ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し た ．Fig. 1-5 に 示 す よ う に ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に は ，AA2, AA1, DBBQ（ IS）の ピ ー ク が ，そ れ ぞ れ 10.6, 13.8, 20.2 min に 観 察 さ れ た ．AA2 と AA1 の ピ ー ク の 分 離 度 は 3.6，AA1 と DBBQ の ピ ー ク の 分 離 度 は 5.9 で あ り ，各 成 分 由 来 の ピ ー ク を 明 瞭 に 分 離 す る こ と が で き た ． Table 1-2 に は ，本 法 の 分 析 能 パ ラ メ ー タ と し て ，範 囲 ，直 線 性 ，併 行 精 度 ， 検 出 限 界 ， 定 量 限 界 を 示 し た ． AA1 と AA2 の ピ ー ク 高 さ は ， 10 ng/mL～ 50 g/mL の 範 囲 で 相 関 係 数 （ r） 0.997 以 上 の 良 い 直 線 性 を 示 し ， AA1 と AA2 の 検 出 限 界（ S/N = 3）は ，そ れ ぞ れ 3.4 ng/mL（ 17 pg on column）, 3.1 ng/mL

（ 16 pg on column）， で あ っ た ． 5.0 g/mL の AA1 と AA2 の 標 準 溶 液 に つ き

6 回 の 繰 り 返 し 測 定 を 行 っ た と こ ろ ，ピ ー ク 高 さ の RSD（ n = 6）は ，そ れ ぞ れ 2.2%, 2.3%で あ っ た ．

Fig. 1-5 Chromatograms of standard solution of AA1 and AA2 obtained by

HPLC-ECD.

HPLC conditions used were: column, microbore ODS column (Capcell Pak

UG-120, 150 x 1.0 mm i.d., 3 m); column temperature, 40℃ ; mobile phase,

methanol-water-phosphoric acid (65:35:0.5, v/v/v); flow rate, 25 L/min.

Peaks: AA2, aristolochic acid II; AA1, aristolochic acid I; IS, DBBQ as an internal

standard. A standard mixture (5 L) of AA1 and AA2 was injected into

Table 1-2. Validation characteristics of the present HPLC -ECD for determining

AA1 and AA2.

Analyte Range (g/mL) Linearity (r ) Repeatability (% RSD, n = 6) Quantification limit (ng/mL) Detection limit (ng/mL) AA1 0.01 - 50 0.997 2.2 10 3.4 AA2 0.01 - 50 0.999 2.3 10 3.1 1-3-3 ボ ウ キ 中 の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 定 量 ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 す る ボ ウ キ を 試 料 と し ，本 法 の 生 薬 分 析 に お け る 有 用 性 と 実 用 性 に つ い て 明 ら か に す る こ と と し た ． 第 1 章（ 1-2-3）の 手 順 に 従 っ て ボ ウ キ の HPLC 用 検 液 を 調 製 し ，そ の 5 L

を HPLC-ECD に 注 入 し た と こ ろ ， Fig. 1-6A の ク ロ マ ト グ ラ ム が 得 ら れ た ． ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に AA1 と AA2 の ピ ー ク が 観 察 さ れ ，各 々 の ピ ー ク は ，ク ロ マ ト グ ラ ム 上 の 他 の Unknown ピ ー ク と 良 好 に 分 離 さ れ て い た ． DBBQ を IS と し た 内 標 準 法 で ，ボ ウ キ 中 の AA1 と AA2 を 定 量 し た ．Table 1-3 に 示 し

た 定 量 結 果 の 通 り ， ボ ウ キ 中 に は AA1 が 591.6 g/g， AA2 が 1412.2 g/g 含 有 さ れ て い た ．繰 り 返 し 測 定 を 行 っ て 室 内 再 現 精 度（ n = 5）を 評 価 し た と こ ろ ， RSD は 2.5%以 下 で あ り ， 添 加 回 収 試 験 （ n = 5） を 行 っ て 回 収 率 を 求 め た と こ ろ ， 98.7%以 上 で あ り ， そ の RSD は 2.0%以 下 と 良 好 な 結 果 を 得 た ． さ ら に ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の HPLC-ECD の 特 異 性 に つ い て ，日 局 16 改 正 の サ イ シ ン の 純 度 試 験 （ AA1） に 準 拠 し た HPLC-UV と の 対 比 に よ っ て 評 価 し た ． ボ ウ キ の HPLC 用 検 液 を HPLC-UV に 注 入 し て 得 た ク ロ マ ト グ ラ ム を

Fig. 1-6B に 示 し た ．Fig. 1-6A の ク ロ マ ト グ ラ ム と 比 較 し て ，AA1 と AA2 の

ピ ー ク の 近 傍 に 多 く の Unknown ピ ー ク が 観 察 さ れ た ． HPLC-ECD の 方 が ， AA1 と AA2 の 特 異 的 な 検 出 に 有 利 で あ る こ と が 分 か っ た ．

HPLC-UV に よ る AA1 と AA2 の 定 量 結 果 は ， AA1 が 602.6 g/g， AA2 が

Fig. 1-6 Chromatograms of Radix Aristolochiae Fangchi obtained by (A)

HPLC-ECD and (B) HPLC-UV in the Japanese Pharmacopoeia.

Peaks: AA2, aristolochic acid II; AA1, aristolochic acid I; IS, DBBQ as an internal standard. (A) HPLC-ECD conditions were as in Fig. 1 -5. (B) HPLC-UV conditions used were: column, ODS column (Mightysil ODS, 150 ×4.6 mm i.d., 3

m） ; column temperature, 25 ℃ ; mobile phase, 50 mmol/L NaH2PO4-acetonitrile

(11:9, v/v); flow rate, 1.0 mL/min. Test solution of Radix Aristolochiae

Fangchi (20 L) was injected into HPLC-UV.

Table 1-3 Contents of aristolochic acids I (AA1) and II (AA2) in Radix Aristolochiae Fangchi studied and recovered from these herbal medicines spiked

with AA1 and AA2 standards.

1-3-4 ア リ ス ト ロ キ ア 酸 含 有 に 注 意 を 要 す る 生 薬 へ の 混 入 監 視 の 実 践

1-3-4-1 サ イ シ ン へ の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 混 入 監 視

日 局 サ イ シ ン （ 細 辛 ） は ， ウ ス バ サ イ シ ン Asiasarum sieboldii F. Maekawa ま た は ケ イ リ ン サ イ シ ン Asiasarum heterotropoides F. Maekawa var. mandshuricum F. Maekawa（ Aristolochiaceae）の 根 お よ び 根 茎 で あ り ，こ れ に は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 は 含 有 さ れ な い ．し か し ，中 国 な ど で は ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 す る 可 能 性 の あ る 地 上 部 を 含 め た 全 草 が 生 薬 と し て 流 通 し て い る [42]．実 試 料 の 中 国 産 サ イ シ ン に お い て ア リ ス ト ロ キ ア 酸 含 有 の 有 無 の 確 認 に 本 法 が 適 用 可 能 か 検 討 し た ． 第 1 章（ 1-2-3）の 手 順 に 従 っ て サ イ シ ン の HPLC 用 検 液 を 調 製 し ，そ の 5 L を HPLC-ECD に 注 入 し て ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し た ． 得 ら れ た ク ロ マ ト

グ ラ ム を Fig. 1-7A に 示 し た ． ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に AA1 と AA2 の ピ ー ク が 観 察 さ れ た ．本 法 を サ イ シ ン 中 の AA1 と AA2 の 定 量 へ 応 用 し ，そ の 結 果 を

Table 1-4 に 示 し た ． サ イ シ ン 中 に は AA1 が 22.3 g/g， AA2 が 22.4 g/g 含 有 さ れ て い た ．繰 り 返 し 測 定 を 行 っ て 室 内 再 現 精 度（ n = 5）を 評 価 し た と こ ろ ， RSD は 2.4%以 下 で あ り ， 添 加 回 収 試 験 （ n = 5） を 行 っ て 回 収 率 を 求 め た と こ ろ ， 98.3%以 上 で あ り ， そ の RSD は 1.9%以 下 と 良 好 な 結 果 を 得 た ．

Fig. 1-7 Chromatograms of (A) Radix et Rhizoma Asari, (B) Caulis Akebiae,

and (C) Radix Aucklandiae obtained by HPLC-ECD.

Table 1-4 Contents of aristolochic acids I (AA1) and II (AA2) in Radix et Rhizoma Asari studied and recovered from these herbal medicines spiked with

AA1 and AA2 standards.

Analyte Content (n = 5) Recovery (n = 5) Amount (g/g) RSD (%) Added amount (g/g) Recovery (%) RSD (%) AA1 22.3 2.0 25 99.5 1.8 AA2 22.4 2.4 25 98.3 1.9 1-3-4-2 モ ク ツ ウ へ の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 混 入 監 視

日 局 モ ク ツ ウ（ 木 通 ）は ，ア ケ ビ Akebia quinata Decaisne ま た は ミ ツ バ ア ケ ビ Akebia trifoliata Koidzumi（ Lardizabalaceae）の つ る 性 の 茎 を ，横 切 り し た も の で あ り ，こ の 基 原 植 物 は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 し な い ．し か し ，中 国 で は ，木 通 と 記 載 さ れ て い て も 関 木 通 あ る い は 淮 木 通 が 用 い ら れ る こ と が あ る ． 関 木 通 の 基 原 植 物 は キ ダ チ ウ マ ノ ス ズ ク サ Aristolochia manshuriensis Kom ， 淮 木 通 の 基 原 植 物 は オ オ バ ウ マ ノ ス ズ ク サ Aristolochia kaempferi Willd.で あ り ， こ れ ら は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 す る [42]． 実 試 料 の 中 国 産 モ ク ツ ウ に お い て ア リ ス ト ロ キ ア 酸 含 有 の 有 無 の 確 認 に 本 法 が 適 用 可 能 か 検 討 し た ． モ ク ツ ウ の HPLC 用 検 液 を HPLC-ECD に 注 入 し ， 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 1-7B に 示 し た ． ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に は AA1 と AA2 の ピ ー ク は 観 察 さ れ な か っ た ． 1-3-4-3 モ ッ コ ウ へ の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 混 入 監 視

日 局 モ ッ コ ウ は ， Saussurea lappa Clarke（ Compositae） の 根 で あ り ， こ の 基 原 植 物 は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 し な い が ，中 国 な ど で は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 す る 青 木 香 （ ウ マ ノ ス ズ ク サ Aristolochia debilis Sieb. et Zucc.） が 木 香 と し て 用 い ら れ る こ と が あ る [42]．

Table 1-5 Detection limit of AA1 by various methods.

Method Column

(size, length x inter diameter)

Injection volume (L) Detection limit Ref. The present HPLC-ECD ODS (150 mm x 1.0 mm) 5 17 pg － HPLC-UV ODS (250 mm x 4.6 mm) 20 4.0 ng [43] LC-MS ODS (250 mm x 4.6 mm) 10 1.1 ng [44] LC-MS ODS (150 mm x 2.1 mm) 1 20 pg [45] LC-MS/MS ODS (50 mm x 2.1 mm) 0.5 5.0 pg [46] HPLC-FL ODS (250 mm x 4.6 mm) 20 220 pg [47]

CE-ECD Fused silica uncoated capillary

(400 mm x 25 m)

－a

13 ng/mL [58]

a Because the injection volume was not described in the literature, the detection limit of AA1 was shown as unit of concentration.

第 2 章 キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に よ る バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC と 血 中 の 薬 物 動 態 分 析 へ の 応 用

2-1 緒 言

我 が 国 で は バ ル プ ロ 酸 （ VPA, valproic acid,

Fig. 2-1） は ， 各 種 て ん か ん （ 小 発 作 ， 焦 点 発 作 ， 精 神 運 動 発 作 ， 混 合 発 作 ） お よ び 躁 病 ， 躁 う つ 病 に お け る 躁 状 態 の 治 療 な ど の 精 神 科 薬 物 療 法 に 幅 広 く 用 い ら れ る [64]． FDA で は ， 単 純 欠 神 発 作 ，複 雑 欠 神 発 作 ，双 極 性 障 害 Ⅰ 型（ BP-I）（ 躁 状 態 ，成 人 の み ）， 片 頭 痛 の 予 防 （ 成 人 の み ）， 双 極 性 障 害 Ⅱ 型 （ BP-II） お よ び 特 定 不 能 の 双 極 性 障 害 （ BP-NOS） に お け る 急 性 期 の 治 療 に 使 用 さ れ ， 成 人 ， 小 児 科 と も に BP-I, BP-II お よ び BP-NOS の 維 持 期 に も 使 用 さ れ る [65]． VPA に よ る 治 療 中 は ， 視 床 下 部 の 機 能 低 下 [66]， 肝 臓 で の イ ン ス リ ン 代 謝 の 阻 害 [67]， 膵 β 細 胞 の イ ン ス リ ン 分 泌 機 能 不 全 [68,69]，ま た 血 中 遊 離 脂 肪 酸（ FFA）の 上 昇 [70-72] が 生 じ る こ と が 報 告 さ れ て い る ．ま た ，VPA に 起 因 す る と 考 え ら れ て い る 体 重 増 加 お よ び 血 中 イ ン ス リ ン の 上 昇 が 起 こ る こ と か ら ，VPA を 用 い る 薬 物 療 法 は ，代 謝 お よ び 内 分 泌 障 害 を 伴 い ，肥 満 に な り や す い 傾 向 が あ る [73-76]． VPA の 副 作 用 の 機 序 ，代 謝 に つ い て は 様 々 な 報 告 が あ り ，見 解 が 異 な る 場 合 が あ る ． 例 え ば ， 糖 摂 取 時 の 血 中 VPA 濃 度 は 空 腹 時 VPA 濃 度 よ り 低 下 す る と い う 報 告 [77] と ， 血 中 濃 度 は 食 事 に よ り 影 響 を 受 け な い と い う 報 告 が あ る [78]． 代 謝 に つ い て も 同 様 で あ る ． VPA は い わ ゆ る 分 岐 脂 肪 酸 で あ る の で ，β 酸 化 を 受 け て 代 謝 さ れ る ．そ の 際 ，血 中 FFA の β 酸 化 を 阻 害 す る と い う 報 告 [79-81] と こ れ と は 逆 に 促 進 す る と い う 報 告 が あ る [82]． し か し ， 糖 尿 病 患 者 に お け る VPA と FFA の 相 互 作 用 に 関 す る 報 告 は な い ． こ れ ら の 報 告 を 考 慮 す る と ，VPA を 用 い る 薬 物 療 法 は ，糖 脂 質 代 謝 に 直 接 的 な 影 響 を 及 ぼ す 可 能 性 が あ る ．従 っ て ，VPA と 糖 脂 質 代 謝 の 相 互 作 用 に つ い て の 見 解 を 明 確 に す る た め に は ，血 中 VPA，FFA に 対 し て ，同 時 か つ 詳 細 な 体 内 動 態 が 把 握 で き る 分 析 法 が 必 要 で あ る ． 血 中 VPA 測 定 の 従 来 法 と し て ，HPLC-UV [83]，HPLC-FL [84]， LC-MS [85]， ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（ GC）[86,87] が あ る ．し か し ，VPA は 吸 光 特 性 を 持 た な い た め HPLC-UV お よ び HPLC-FL で 高 感 度 検 出 を す る た め に は プ レ カ ラ ム あ る い は ポ ス ト カ ラ ム 方 式 の 誘 導 体 化 操 作 が 必 要 で あ る ．ま た ，VPA は 揮 発 し に く い た め GC-FID に よ る 分 析 で は ，ト リ メ チ ル シ リ ル 化 剤 を 用 い た 誘 導 体 化 を 行 い ， VPA を メ チ ル エ ス テ ル 体 に し て か ら 分 析 す る 必 要 が あ る ． Fig. 2-1

さ ら に ，血 液 な ど の 生 体 試 料 分 析 の 際 に は ，分 析 装 置 の 汚 染 を 防 ぐ た め に 充 分 な ク リ ー ン ア ッ プ を 行 う 必 要 が あ り ，試 料 の 前 処 理 操 作 が 煩 雑 に な る 場 合 が 多 い ． 電 気 化 学 検 出 法 の 測 定 対 象 は 酸 化 還 元 物 質 で あ り ，分 岐 脂 肪 酸 で あ る VPA は ，電 極 不 活 性 物 質 で あ る ．従 っ て ，VPA を 直 接 酸 化 ま た は 還 元 し て 電 気 化 学 検 出 す る こ と は 困 難 で あ る ． 一 方 ， カ ル ボ ン 酸 の HPLC-ECD と し て ， 電 極 活 性 部 位 を 有 す る 誘 導 体 化 試 薬 を 用 い て プ レ カ ラ ム 誘 導 体 化 の 後 に 検 出 す る 方 法 [88,89] や パ ル ス ド ア ン ペ ロ メ ト リ ー 検 出 に よ る 方 法 [90] な ど が あ る が ，誘 導 体 化 を 含 め た 前 処 理 操 作 や 装 置 構 成 と そ の 取 り 扱 い 等 が 煩 雑 で あ る た め ， 薬 物 動 態 分 析 へ の 適 用 は 困 難 で あ る ． 1968 年 に 高 村 ら は ポ ー ラ ロ グ ラ フ ィ ー に よ っ て ，キ ノ ン の 電 解 還 元 時 に 微 量 の 酸 が 共 存 す る と 還 元 前 置 波 が 生 じ る こ と を 発 見 し [91]， こ れ を 発 端 に ， 1994 年 に 楠 ら は グ ラ ッ シ ー カ ー ボ ン 電 極 を 用 い た ボ ル タ ン メ ト リ ー に よ る 脂 肪 酸 の 電 気 化 学 的 定 量 法 を 開 発 し た [25,92]． キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ く 電 気 化 学 検 出 法 は ， 酸 へ の 特 異 性 が 高 く ， 高 感 度 検 出 が 可 能 で あ る ． そ こ で 本 研 究 で は ，Fig. 2-1 に 示 す よ う に カ ル ボ キ シ ル 基 を 有 す る VPA に つ い て も ，キ ノ ン の 還 元 前 置 波 を 利 用 し た 電 気 化 学 検 出 に よ る 酸 測 定 が で き る と 考 え ，生 体 試 料 分 析 の た め に 簡 便 な 前 処 理 方 法 と 特 異 性 の 高 い 方 法 の 確 立 を 意 図 し て ， VPA の 高 感 度 HPLC-ECD を 構 築 す る こ と と し た ． さ ら に ， 本 研 究 で は VPA の HPLC-ECD に よ る 薬 物 動 態 分 析 と と も に ， 血 中 FFA の 動 態 分 析 も で き れ ば ， 糖 脂 質 代 謝 調 節 を in vivo で 観 察 で き る 複 合 動 態 解 析 法 と し て 展 開 で き る と 考 え た ．そ こ で ，キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ く FFA の HPLC-ECD も 構 築 し た ．本 法 が ，血 中 VPA と FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル の 取 得 ， VPA の 薬 物 動 態 （ PK） パ ラ メ ー タ の 算 出 に 適 用 で き る こ と を 明 ら か に す る こ と と し た ． 2-2 キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ く 酸 測 定 キ ノ ン 化 合 物 は ，ポ ー ラ ロ グ ラ フ ィ ー の 分 野 で 早 く か ら 研 究 さ れ て き た 物 質 で あ り ，キ ノ ン － ハ イ ド ロ キ ノ ン 型 の 可 逆 的 電 極 反 応 に お け る 様 々 な 電 気 化 学 的 挙 動 が 明 ら か に さ れ て い る [93-95]． キ ノ ン 化 合 物 の ポ ー ラ ロ グ ラ ム を 種 々 の 溶 媒 中 で 測 定 す る と き ，一 般 に 明 瞭 な 還 元 波 が 観 察 さ れ ，波 形 ，波 高 な ど は キ ノ ン の 種 類 ，溶 媒 ，共 存 物 質 に よ り 変 化 す る こ と が 知 ら れ て い る [96]．

Fig. 2-2 Voltammograms of 4.0 mmol/L DBBQ in the (a) absence and (b)

presence of 2.0 mmol/L hydrochloric acid in ethanol -water (50:50, v/v) containing 50 mmol/L NaCl. PFC, Ag/AgCl, and Pt were used as working, reference, and counter electrodes, respectively. Scan rate was set at 10 mV/s. 2-3-2 バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC キ ノ ン の 還 元 前 置 波 を 活 用 し た 酸 測 定 を フ ロ ー 型 の 検 出 部 と し て HPLC に 組 み 込 む に は ，移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系 に キ ノ ン 試 薬 溶 液 を ポ ス ト カ ラ ム 方 式 で 合 流 さ せ る 2 流 路 系 の シ ス テ ム が 有 用 と 考 え た ．そ こ で ，Fig. 2-3 に 示 す よ う に ， デ ガ ッ サ ー （ DG-980-50, 日 本 分 光 製 ）， ポ ン プ （ 301 M， フ ロ ム 製 ）， サ ン プ ル イ ン ジ ェ ク タ ー （ 7725, レ オ ダ イ ン 製 ）， マ イ ク ロ ボ ア カ

ラ ム （ Develosil C30-UG-3, 250 mm×1.0 mm i.d., 3m, 野 村 化 学 製 ）， カ ラ ム

オ ー ブ ン （ CTO-10ASvp, 島 津 製 作 所 製 ）， 電 気 化 学 検 出 器 （ LC-4C, BAS 製 ） を 用 い て 構 築 し た ．

移 動 相 は ア セ ト ニ ト リ ル － 水 （ 70:30, v/v）， キ ノ ン 試 薬 溶 液 は 6 mmol/L

DBBQ と 20 mmol/L LiClO4を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル － 水（ 70:30, v/v）を 使 用 し

た ． カ ラ ム 温 度 は 30℃ ， 移 動 相 の 流 速 は 30 L/min， キ ノ ン 試 薬 溶 液 の 流 速

は 60 L/min， 印 加 電 位 は -0.15 V vs. Ag/AgCl， 試 料 注 入 量 は 5 L と し た ．

Fig. 2-3 Block diagram of the HPLC-ECD system.

MP, Mobile phase; QS, quinone solution; DG, degasser; P1 and P2, pumps; S,

sample injector; column, reversed -phase C30 column (Develosil C30-UG-3, 250

mm x 1.0 mm i.d., 3 m); D, electrochemical detector, electrochemical cell and potentiostat; R, recorder. For the determination of VPA, an acetonitrile -water (70:30, v/v) mixture and one containing 6 mmol/L DBBQ and 20 mmol/L LiClO4 served as a MP and QS, respectively. For the determination of FFA, acetonitrile-ethanol (90:10, v/v) mixture and one containing 6 mmol/L DBBQ

and100 mmol/L LiClO4 served as a MP and QS, respectively.

2-3-3 遊 離 脂 肪 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC

FFA の 場 合 も ，移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系 に キ ノ ン 試 薬 溶 液 を ポ ス ト カ ラ ム 方 式 で 合 流 さ せ る 2 流 路 系 の シ ス テ ム を 構 築 し た ．

Fig. 2-3 と 同 様 に ，デ ガ ッ サ ー（ DG-980-50, 日 本 分 光 製 ），ポ ン プ（ 301 M，

フ ロ ム 製 ）， サ ン プ ル イ ン ジ ェ ク タ ー （ 7725, レ オ ダ イ ン 製 ）， マ イ ク ロ ボ ア

カ ラ ム （ Develosil C30-UG-3, 250 mm×1.0 mm i.d., 3m, 野 村 化 学 製 ）， カ ラ

製 ） を 用 い て 構 築 し た ．

フ ロ ー 型 電 解 セ ル（ ラ ジ ア ル フ ロ ー セ ル ，BAS 製 ）の 作 用 電 極 は グ ラ ッ シ ー カ ー ボ ン（ 円 盤 型：直 径 6 mm），参 照 電 極 は Ag/AgCl，対 極 は ス テ ン レ ス を 用 い た ．

移 動 相 は ア セ ト ニ ト リ ル － エ タ ノ ー ル （ 90:10, v/v）， キ ノ ン 試 薬 溶 液 は 6

mmol/L DBBQ と 100 mmol/L LiClO4 を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル － エ タ ノ ー ル

（ 90:10, v/v） を 使 用 し た ． カ ラ ム 温 度 は 30℃ ， 移 動 相 の 流 速 は 30 L/min，

キ ノ ン 試 薬 溶 液 の 流 速 は 60 L/min，印 加 電 位 は -0.09 V vs. Ag/AgCl，試 料 注

入 量 は 5 L と し た ．

2-3-4 実 験 動 物 と バ ル プ ロ 酸 ナ ト リ ウ ム 投 与

2-3-5 血 糖 値 の 測 定 方 法 血 液 約 50 L の う ち ， 5 L の 血 液 は ， 血 糖 自 己 測 定 （ SMBG） 用 の 血 糖 測 定 器（ グ ル コ カ ー ド GT-1641, ア ー ク レ イ 製 ）に よ る BG の 測 定 に 利 用 し た ． 2-3-6 血 中 バ ル プ ロ 酸 お よ び 遊 離 脂 肪 酸 測 定 の た め の 血 漿 試 料 の 前 処 理 方 法 各 種 ラ ッ ト か ら 採 取 し た 血 液 は ヘ パ リ ン で 処 理 を し ，遠 心 分 離（ 3000 r.p.m., 10 min） し て 血 漿 を 調 製 し た ． 血 中 VPA の 測 定 に は ，10 L の 血 漿 を 使 用 し た ． 血 漿 10 L に ， n-ノ ナ ン 酸 （ IS） を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル 0.1 mL を 加 え て 除 タ ン パ ク を 行 い ， 超 音 波 処 理 （ 1 min） と 遠 心 分 離 （ 1500 g, 10 min） を 行 っ た ． 得 ら れ た 上 清 を 孔 径 0.45 m の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー （ Ultrafree-MC, Bedford 製 ） で ろ 過 を し て 検 液 と し た ．マ イ ク ロ シ リ ン ジ を 用 い て 検 液 5 L を VPA の HPLC に 注 入 し ， ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し た ． 血 中 FFA の 測 定 に は ，別 の 10 L の 血 漿 を 使 用 し た ．血 漿 10 L に ，マ ル ガ リ ン 酸（ IS）を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル － エ タ ノ ー ル 混 液 ，エ ー テ ル を 加 え て ， FFA を エ ー テ ル 層 に 抽 出 し た ．エ ー テ ル に よ る 抽 出 操 作 は 3 回 繰 り 返 し 行 っ た ． エ ー テ ル 層 を 分 取 し ， エ バ ポ レ ー ト し た 残 渣 に ア セ ト ニ ト リ ル － エ タ ノ ー ル（ 90:10, v/v）混 液 40 L を 加 え ，FFA を 溶 解 さ せ た ．こ れ を 孔 径 0.45 m の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー（ Ultrafree-MC, Bedford 製 ）で ろ 過 を し て 検 液 と し た ． マ イ ク ロ シ リ ン ジ を 用 い て 検 液 5 L を FFA の HPLC に 注 入 し ， ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し た ． 2-4 実 験 結 果 2-4-1 バ ル プ ロ 酸 由 来 の キ ノ ン の 還 元 前 置 波

VPA の HPLC-ECD の 構 築 に 先 立 っ て ， キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に よ る VPA の 検 出 が 可 能 か ボ ル タ ン メ ト リ ー で 検 討 し た ．

= 0.998） を 示 し た ． こ の よ う な 電 解 液 の 組 成 に お け る DBBQ の 還 元 前 置 波 測 定 に よ っ て ， VPA の 定 量 が 可 能 で あ る こ と を 明 ら か に し た ．

HPLC-ECD の 検 出 部 と し て キ ノ ン の 還 元 前 置 波 測 定 を 活 用 す る 場 合 ，還 元 前 置 波 の 現 れ る 電 位 に 印 加 電 位 を 設 定 し て ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し ，還 元 電 流 を 計 測 す る こ と で 酸 の 定 量 が 可 能 と な る ．

Fig. 2-4 Voltammograms of 3 mmol/L DBBQ with (a) 0 mol/L (b) 50 mol/L (c) 75 mol/L (d) 100 mol/L (e) 150 mol/L valproic acid in ethanol -water

(80:20, v/v) containing 50 mmol/L LiClO4. PFC, Ag/AgCl, and Pt were used as

ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に VPA の ピ ー ク が 観 察 さ れ た ．-0.15 V vs. Ag/AgCl の と き に 最 大 の ピ ー ク 電 流 値 が 得 ら れ た ．印 加 電 位 を よ り 負 電 位 に す る と ピ ー ク 電 流 値 が 低 下 し た ． 従 っ て ， S/N 比 が 最 大 と な っ た -0.15 V vs. Ag/AgCl を VPA の ク ロ マ ト グ ラ ム 測 定 に お け る 印 加 電 位 と し て 決 定 し た ． キ ノ ン 試 薬 溶 液 の 流 速 に つ き ，保 持 時 間 と ピ ー ク 高 さ を 考 慮 し て 検 討 し た と こ ろ ， ピ ー ク 高 さ が 最 大 と な っ た 60 L/min を キ ノ ン 試 薬 溶 液 の 流 速 と し て 設 定 し た ．

Fig. 2-5 Hydrodynamic voltammogram of valproic acid.

HPLC conditions used were: column, Develosil C30 -UG-3 (250 mm×1.0 mm i.d., 3m); column temperature, 30 ℃ ; mobile phase, acetonitrile-water (70:30, v/v); quinone solution, acetonitrile-water (70:30, v/v) containing 6.0 mmol/L DBBQ and 20 mmol/L LiClO4; flow rate of mobile phase, 30 L/min; flow rate of quinone solution, 60 L/min. A standard mixture (5 L) of valproic acid was

2-4-3 バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ

Fig. 2-6 Chromatogram of (A) a standard VPA (7.2 g/mL) and (B) a normal rat plasma at 1 hr after VPA-Na administration subsequent to 16 hr fasting.

HPLC conditions used were: column, microbore C30 column (Develosil C30 -UG-3

(250 mm × 1.0 mm i.d., 3m); column temperature, 30 ℃ ; mobile phase,

acetonitrile-water (70:30, v/v); quinone solution, acetonitrile -water (70:30, v/v) containing 6.0 mmol/L DBBQ and 20 mmol/L LiClO4; flow rate of mobile phase,

30 L/min; flow rate of quinone solution, 60 L/min; applied potential, -0.15 V vs.

Ag/AgCl. Peaks: VPA, valproic acid; IS, n-nonanoic acid.

Table 2-1 Concentration of valproic acid in rat plasma after oral administration

of 150 mg/kg sodium valproate to normal rat and recovery from the plasma spiked with valproic acid standard.

Repeatability (n = 5) Recovery (n = 5)

Concentration (g/mL) RSD (%) Spiked (g/mL) Recovery (%) RSD (%)

2-4-5 遊 離 脂 肪 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ 2-3-3 に 記 載 し た HPLC 条 件 下 で 測 定 し た FFA の ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 2-7A に 示 し た ． ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に ア ラ キ ド ン 酸 （ C20:4 ）， リ ノ ー ル 酸 （ C18:2），オ レ イ ン 酸（ C18:1），パ ル ミ チ ン 酸（ C16:0），マ ル ガ リ ン 酸（ C17:0， IS），ス テ ア リ ン 酸（ C18:0）の ピ ー ク は そ れ ぞ れ ，10.3, 11.9, 14.9, 15.8, 19.0, 23.3 min に 観 察 さ れ ，そ れ ぞ れ の ピ ー ク は 良 好 に 分 離 し て い る こ と を 確 認 し た ． FFA の 溶 出 挙 動 に つ い て ， 次 の よ う な こ と が 分 か っ た ． 飽 和 脂 肪 酸 は C16:0，C17:0，C18:0 の 順 に 溶 出 し ，炭 素 数 が 小 さ い 脂 肪 酸 が 早 く 溶 出 し た ． ま た ， C18:2， C18:1， C18:0 の 順 に 溶 出 し ， 炭 素 数 が 同 じ 場 合 ， 構 造 中 の 二 重 結 合 が 多 い 脂 肪 酸 が 早 く 溶 出 し た ．C18:1 の 方 が C16:0 よ り 先 に 溶 出 し た ． こ れ ら の 結 果 よ り ，こ の HPLC 条 件 に お け る FFA の 溶 出 挙 動 は ，脂 肪 酸 の 炭 素 数 と 構 造 中 の 二 重 結 合 の 数 が 関 係 し て い る と 考 え ら れ た ． ピ ー ク 高 さ は FFA 濃 度 と 比 例 関 係 を 示 し ，0.75～ 160 mol/L の 範 囲 で 相 関 係 数 （ r ） が 0.999 の 良 好 な 直 線 性 が 得 ら れ た ． ま た ， 30 mol/L の FFA 標 準 溶 液 に つ い て ，10 回 の 繰 り 返 し 測 定 を 行 っ た と こ ろ ，FFA の ピ ー ク 高 さ の RSD は 2.0%以 下 で あ っ た ． ア ラ キ ド ン 酸 ， リ ノ ー ル 酸 ， オ レ イ ン 酸 ， パ ル ミ チ ン 酸 ，ス テ ア リ ン 酸 の 検 出 限 界（ S/N = 3）は ，そ れ ぞ れ 0.23, 0.21, 0.18,

0.19, 0.22 mol/L（ そ れ ぞ れ 1.15, 1.05, 0.90, 0.95, 1.10 pmol on column ）で あ っ

Fig. 2-7 Chromatogram of (A) a standard FFA mixture of 30 mol/L of each FFA and (B) normal rat plasma after 16 hr fasting.

HPLC conditions used were: column, Develosil C30 -UG-3 (250 mm×1.0 mm i.d.,

3m); column temperature, 30 ℃ ; mobile phase, acetonitrile-ethanol (90:10, v/v);

quinone solution, acetonitrile-ethanol (90:10, v/v) containing 6.0 mmol/L DBBQ and 100 mmol/L LiClO4; flow rate of mobile phase, 30 L/min; flow rate of quinone solution, 60 L/min; applied potential, -0.09 V vs. Ag/AgCl. Peaks: a, arachidonic acid; b, linoleic acid; c, oleic acid; d, palmitic acid; e, margaric acid (IS); f, stearic acid.

Table 2-2 Concentrations of FFAs in rat plasma and recoveries from th e plasma

spiked with FFA standards.

Repeatability (n = 5) Recovery (n = 5) FFA Concentration (mol/L) RSD (%) Spiked (mol/L) Recovery (%) RSD (%) Arachidonic acid 10.7 2.9 10 93.1 2.0 Linoleic acid 138.5 2.3 140 95.8 0.99 Oleic acid 77.7 0.47 80 100 2.1 Palmitic acid 122.0 1.9 120 96.8 2.1 Stearic acid 55.3 2.6 60 96.4 0.58

2-4-7 バ ル プ ロ 酸 と 遊 離 脂 肪 酸 の 複 合 動 態 解 析 の 実 践

2-4-7-1 健 常 ラ ッ ト の 血 中 バ ル プ ロ 酸 と 遊 離 脂 肪 酸 の 動 態 分 析

高 血 糖 状 態 に お け る 血 中 VPA の 体 内 動 態 を 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル と し て 捉 え る に 先 立 ち ， ま ず は 健 常 ラ ッ ト に つ き ， VP-Na 投 与 後 の 血 中 VPA お よ び 血 中 FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 解 析 す る こ と と し た ．

健 常 ラ ッ ト に お け る BG， 血 中 VPA， 血 中 総 FFAs， 血 中 FFA 分 画 の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を Fig. 2-8（ A-D）に 示 し た ．こ こ で ，総 FFAs は 今 回 測 定 対 象 と し た FFA（ ア ラ キ ド ン 酸 ，リ ノ ー ル 酸 ，オ レ イ ン 酸 ，パ ル ミ チ ン 酸 ， ス テ ア リ ン 酸 ） の 総 濃 度 と す る ． BG は ，Fig. 2-8A の よ う に 5 時 間 に わ た っ て 約 50 mg/dL を 維 持 し て い た ． 血 中 VPA は ， Fig. 2-8B の よ う に ， 投 与 0.5 時 間 後 で 最 大 と な り ， そ の 後 は 減 少 し た ． 2 時 間 後 に は 約 30 g/mL を 維 持 し て い た ． 血 中 総 FFAs は ， Fig. 2-8C の よ う に ， 投 与 1～ 2 時 間 後 に わ ず か に 増 加 し た が ， そ の 後 徐 々 に 減 少 し ， 約 400 mol/L を 維 持 し て し た ． 血 中 FFA 分 画 の う ち リ ノ ー ル 酸 ，オ レ イ ン 酸 ，パ ル ミ チ ン 酸 ，ス テ ア リ ン 酸 の 濃 度 は ， Fig. 2-8D の よ う に ， 投 与 1～ 2 時 間 後 に わ ず か に 増 加 し ， そ の 後 徐 々 に 減 少 し た ．し か し ，ア ラ キ ド ン 酸 の 濃 度 は 投 与 前 後 に お い て ，ほ と ん ど 変 化 し な か っ た ． 2-4-7-2 マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト の 血 中 バ ル プ ロ 酸 と 遊 離 脂 肪 酸 の 動 態 分 析 健 常 時 の 高 血 糖 状 態 に お け る VPA の 薬 物 動 態 を 明 ら か に す る た め に ， マ ル ト ー ス を 一 定 時 間 毎 に 複 数 回 投 与 し た 健 常 ラ ッ ト に つ き ，VP-Na 投 与 後 の VPA お よ び FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 解 析 す る こ と と し た ． 二 糖 類 で あ る マ ル ト ー ス は ，小 腸 か ら 血 液 へ 移 行 す る 際 に 腸 内 の α グ ル コ シ ダ ー ゼ に よ り 加 水 分 解 を 受 け て グ ル コ ー ス に 代 謝 さ れ て 吸 収 さ れ る ．よ っ て ，グ ル コ ー ス に 比 べ て 最 大 BG に 達 す る ま で の 時 間 が 若 干 遅 く ，食 餌 摂 取 の 模 倣 お よ び 高 血 糖 状 態 の 維 持 の た め の モ デ ル 作 成 に 適 し て い る と 考 え た ．

化 し な か っ た ．

血 中 FFA 分 画 の う ち リ ノ ー ル 酸 ，オ レ イ ン 酸 ，パ ル ミ チ ン 酸 ，ス テ ア リ ン 酸 の 濃 度 は ， Fig. 2-8H の よ う に ， 投 与 2 時 間 後 に 若 干 の 低 下 が 観 察 さ れ た が ， ア ラ キ ド ン 酸 の 濃 度 は 投 与 前 後 に お い て ， あ ま り 変 化 し な か っ た ．

VP-Na を 投 与 せ ず に ， マ ル ト ー ス の み を 単 回 投 与 し た ラ ッ ト の BG， 血 中 総 FFAs，血 中 FFA 分 画 の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を Fig. 2-9（ A-C）に 示 し た ．Fig. 2-9A の マ ル ト ー ス 投 与 に よ る BG の 上 昇 に 伴 い ，Fig. 2-9B, Fig. 2-9C の 血 中 総 FFAs お よ び ア ラ キ ド ン 酸 を 除 く 血 中 FFA 分 画 は 低 下 し た ．そ の 後 ， BG が 低 下 し 定 常 状 態 に 回 復 す る に 伴 っ て ，血 中 総 FFAs お よ び ア ラ キ ド ン 酸 を 除 く 血 中 FFA 分 画 は 増 加 し た ．こ の よ う に ，VP-Na を 投 与 し な け れ ば ，糖 脂 質 代 謝 調 節 に よ っ て ， BG と 血 中 FFA の 負 の 相 関 が 観 察 さ れ た ． 2-4-7-3 糖 尿 病 ラ ッ ト の 血 中 バ ル プ ロ 酸 と 遊 離 脂 肪 酸 の 動 態 分 析 糖 尿 病 に 起 因 す る 高 血 糖 状 態 に お け る VPA の 薬 物 動 態 を 明 ら か に す る た め に ， 1 型 糖 尿 病 モ デ ル の ア ロ キ サ ン 糖 尿 病 ラ ッ ト に つ き ， VP-Na 投 与 後 の 血 中 VPA お よ び 血 中 FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 解 析 す る こ と と し た ．

糖 尿 病 ラ ッ ト に お け る BG， 血 中 VPA， 血 中 総 FFAs， 血 中 FFA 分 画 の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を Fig. 2-8（ I-L） に 示 し た ． BG は ，Fig. 2-8I の よ う に 5 時 間 に わ た っ て 約 450 mg/dL を 維 持 し て い た ． 健 常 ラ ッ ト の BG と 比 較 し て ， 約 9 倍 に 増 加 し て い た ． 血 中 VPA は ，Fig. 2-8J の よ う に ，投 与 0.5 時 間 後 で 最 大 と な っ た が ，Cma x は ，健 常 ラ ッ ト お よ び マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト と 比 較 し て 低 下 し た ．投 与 2 時 間 後 以 降 は 約 30 g/mL を 維 持 し て い た ．

血 中 総 FFAs は ，Fig. 2-8K の よ う に ，5 時 間 に わ た っ て 約 500 mol/L を 維

Fig. 2-8 Time-concentration profiles of mean ( ±SE) (A, E, I) BG, (B, F, J) VPA,

(C, G, K) total FFAs and (D, H, L) FFA in (A -D) normal rats, (E-H) 1.8 g/kg maltose ingested normal rats, and (I-L) diabetic rats, respectively,(n = 5 each), after oral administration of 150 mg/kg of VP -Na under fasting.

(C, G, K) Total FFAs means the sum of arachidonic, linoleic, oleic, palmitic, and stearic acids concentrations.

Fig. 2-9 Time-concentration profiles of mean ( ±SE) (A) BG, (B) total FFAs,

and (C) FFA in normal rats (n = 5 each) after oral administration of maltose (1.8 g/kg).

(B) Total FFAs means the sum of arachidonic, linoleic, oleic, palmitic, and stearic acids concentrations.

(C) FFAs: ■ , arachidonic acid; ◇ , linoleic acid; ◆ , oleic acid; □ , palmitic acid; △ , stearic acid.

各 ラ ッ ト 群 の PK パ ラ メ ー タ に 対 し ，Scheffe 法 に 基 づ い て 多 重 比 較 検 定 を 行 っ た ． 健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て 有 意 差 の あ っ た PK パ ラ メ ー タ に つ い て Fig. 2-10 に 示 し た ． 血 中 濃 度 － 時 間 曲 線 下 面 積（ AUC）は ，健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て ，マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト お よ び 糖 尿 病 ラ ッ ト で は ，有 意 に 低 下 し た（ Fig. 2-10A）．半 減 期（ t1/2）は ，健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て ，糖 尿 病 ラ ッ ト で は ，有 意 に 増 加 し て い た（ Fig. 2-10B）．分 布 容 積（ Vd）は ，健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て ，糖 尿 病 ラ ッ ト は 有 意 に 増 加 し た （ Fig. 2-10C）． 今 回 構 築 し た VPA の HPLC-ECD が ，PK パ ラ メ ー タ の 算 出 に 適 用 で き る こ と を 示 し た ．VPA の 有 効 治 療 血 中 濃 度 は 50～ 100 g/mL で あ り ，比 較 的 狭 い ． ま た ，消 失 半 減 期 が 短 く ，併 用 薬 ，剤 形 ，血 中 タ ン パ ク 結 合 率 の 変 化 に よ り 血 中 濃 度 が 顕 著 に 変 動 す る こ と か ら 治 療 薬 物 モ ニ タ リ ン グ の 対 象 と な っ て い る ．特 異 性 と 感 度 に 優 れ る 本 法 は ，治 療 薬 物 モ ニ タ リ ン グ を 実 施 す る た め の 分 析 法 と し て も 充 分 適 用 可 能 で あ る こ と が 分 か っ た ．

Table 2-3 Pharmacokinetic parameters of VPA after oral administration of 150

mg/kg VPA-Na to (N) normal, (M) maltose ingested normal, and (D) diabetic rats, respectively (n = 5 each). Parameter a N M b D Cma x（g/mL） 130.8 ±4.1 98.5 ±34.3 58.1 ±8.5 tma x（ hr） 0.5 ±0 0.5 ±0 0.5 ±0 AUC（ mg･hr/mL） 186.1 ±4.1 90.3 ±28.6 80.9 ±10.4 k el（ hr-1） 0.82 ±0.2 1.40 ±0.2 0.40 ±0 t 1 /2（ hr） 0.91 ±0.2 0.52 ±0.1 1.72 ±0.1 Vd（ mL） 259.1 ±45.8 356.4 ±120 1229 ±219 Cl（ mL/hr） 200.0 ±3.4 446.4 ±102 487.8 ±69.4 Values are mean ± standard error (SE).

a

Cma x, maximum drug concentration; tma x, maximum drug concentration time; AUC, area under the concentration -time curve for 5 hr; kel, elimination rate constant; t1/ 2, half-life period; Vd, distribution volume; Cl, clearance

b

Fig. 2-10 Effect of hyperglycemia on (A) AUC, (B) t1/ 2, and (C) Vd (±SE) of VPA in (N) normal, (M) maltose ingested normal, and (D) diabetic rats, respectively (n = 5 each).

Significant differences (* p < 0.05, ** p < 0.01) were determined by using one-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Scheffe’s method. Maltose (1.8 g/kg) was orally ingested by a normal rat every 1 hr after 16 hr fasting. 2-5 考 察 キ ノ ン の 還 元 前 置 波 を 利 用 し た VPA の HPLC-ECD の 感 度 を 評 価 す る た め に ， 本 法 の 検 出 限 界 を 既 報 の HPLC-UV [83], HPLC-FL [84], LC-MS [85], GC-FID [86] と 対 比 し た （ Table 2-4）． 本 法 は ， 他 の 分 析 法 と 比 較 し て 高 感 度 に VPA を 定 量 で き る こ と を 明 ら か に し た ． ま た ， HPLC-UV, HPLC-FL は VPA の 検 出 の た め に 誘 導 体 化 操 作 が 必 要 で あ る 上 に ，前 処 理 操 作 が 煩 雑 で あ る ．ま た ，LC-MS は 装 置 が 高 価 で あ り ，生 体 試 料 分 析 に お い て 精 度 に 優 れ た 方 法 と す る に は ，試 料 の ク リ ー ン ア ッ プ 操 作 等 に 高 い 分 析 技 術 が 要 求 さ れ る 場 合 が あ る ． 以 上 の こ と か ら ， 本 HPLC-ECD は ， 感 度 と 特 異 性 に 優 れ る 分 析 法 で あ る こ と を 示 し た ．ま た ，分 析 装 置 導 入 に お け る 価 格 面 を 考 慮 し た 場 合 ， 他 の VPA の 分 析 法 と 比 較 し て 有 利 で あ る と 考 え ら れ る ．

行 っ て い る ．こ れ に 対 し て ，本 法 は ，検 出 の た め の 誘 導 体 化 が 不 要 で あ る た め ， 生 体 試 料 分 析 が 比 較 的 簡 易 で あ る と 考 え ら れ る ． さ ら に ， 本 研 究 で は ， FFA の HPLC-ECD の 分 析 カ ラ ム に 内 径 1.0 mm の マ イ ク ロ ボ ア カ ラ ム を 活 用

し た ．キ ノ ン 試 薬 と し て ビ タ ミ ン K3を 用 い ，内 径 4.0 mm の コ ン ベ ン シ ョ ナ

ル カ ラ ム を 用 い た FFA の HPLC-ECD の 検 出 限 界 は ， 50 pmol on column で あ り [97]， 本 法 は 約 50 倍 の 高 感 度 化 を 達 成 で き た ．

以 上 の よ う に ， キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ く 酸 測 定 を 利 用 し た VPA お よ び FFA の HPLC-ECD は ， 感 度 と 特 異 性 に 優 れ る 分 析 法 で あ る こ と が 分 か っ た ．

Table 2-4 Detection limit of valproic acid by various methods.

Method Column

(size, length x inter diameter)

Injection volume (L) Detection limit (ng) Ref. The present HPLC-ECD C30 (150 mm x 1.0 mm) 5 0.53 － HPLC-UV ODS (250 mm x 4.6 mm) 50 5.0 [83] HPLC-FL ODS (250 mm x 4.0 mm) 10 0.87 [84] LC-MS ODS (100 mm x 4.6 mm) 5 1.5 [85] GC-FID Cyanopropylphenyldimethylsilo

る ． 健 常 人 と 比 較 し て ， 糖 尿 病 患 者 に お け る VPA の タ ン パ ク 結 合 率 は 低 下 し [101]， 血 中 VPA の 遊 離 型 の 割 合 は 増 加 す る [102]． ま た ， FFA と ア ル ブ ミ ン 間 の タ ン パ ク 結 合 に 関 し て ，次 の よ う な 報 告 が あ る ．健 常 人 と 比 較 し て ， 糖 尿 病 患 者 に お け る タ ン パ ク 結 合 型 の FFA は 増 加 す る [103,104]． ア ル ブ ミ ン の 結 合 部 位 に お い て VPA と FFA は 競 合 す る [105]． さ ら に ， 高 血 糖 状 態 お よ び 糖 尿 病 時 に お け る 血 中 ア ル ブ ミ ン の 糖 化 に よ っ て [106]， ア ル ブ ミ ン と 結 合 す る 薬 物 は ，そ の タ ン パ ク 結 合 が 阻 害 さ れ る [105]．VPA も ア ル ブ ミ ン と 結 合 す る 薬 物 の ひ と つ で あ る ．従 っ て ，高 血 糖 状 態 で は こ れ ら の メ カ ニ ズ ム の 寄 与 に よ っ て 遊 離 型 VPA が 増 加 し ， VPA の 代 謝 と 排 泄 が 促 進 さ れ る と 考 え ら れ て い る ．本 研 究 で は ，こ れ ら の 報 告 を 支 持 す る 結 果 を 高 血 糖 状 態 に お け る VPA の PK パ ラ メ ー タ の 変 化 と し て 捉 え る こ と が で き た と 思 わ れ る ． さ ら に ， 本 研 究 で 実 践 し た VPA と FFA の 複 合 動 態 解 析 で は ， マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト に お い て VP-Na の 投 与 に よ り FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル が 大 き く 異 な る こ と が 観 察 さ れ た ．す な わ ち ，VP-Na 未 投 与 で あ れ ば マ ル ト ー ス を 投 与 後 ， BG の 上 昇 に よ り 血 中 FFA が 低 下 し た が （ Fig. 2-9B）， VP-Na を 投 与 し た 場 合 ， マ ル ト ー ス の 投 与 前 後 に お い て 血 中 総 FFAs は ほ と ん ど 変 化 し な か っ た （ Fig. 2-8G）．

VPA と FFA の 相 互 作 用 に 関 し て ， 次 の よ う な 報 告 が あ る ． 血 中 VPA は ， FFA の β 酸 化 に 関 わ る 酵 素 に 対 し て 競 合 的 に 作 用 [77]， あ る い は FFA の β 酸 化 を 阻 害 す る [79-81]．ア ル ブ ミ ン に 結 合 し て い る VPA は ，血 中 FFA に よ っ て タ ン パ ク 結 合 部 位 か ら 置 換 さ れ る [107,108]．遊 離 型 の VPA は ，速 や か に β 酸 化 を 介 し て 代 謝 さ れ る [77]．従 っ て ，VP-Na を 投 与 し た マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト の BG 上 昇 に 伴 い 血 中 FFA が 変 化 し な か っ た の は ，VPA 共 存 に よ っ て FFA の β 酸 化 が 阻 害 を 受 け ， そ の 結 果 VPA が FFA に 比 べ て 優 先 的 に 代 謝 さ れ た た め と 考 え ら れ る ． 本 研 究 で 得 ら れ た 血 中 VPA， 血 中 FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル は ，こ れ ら の 報 告 を 支 持 す る 結 果 で あ り ，血 中 FFA に 比 べ て VPA が 優 先 的 に 代 謝 さ れ る こ と を 裏 付 け る も の と 思 わ れ る ．

以 上 の よ う な 複 合 動 態 解 析 に よ っ て ， VPA， FFA， BG を 計 測 で き ， VPA 投 与 後 5 時 間 に わ た っ て VPA， FFA， BG の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 得 ら れ る こ と を 示 し た ．

2-6 小 括 本 章 で は ， キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ く 酸 測 定 法 に よ り VPA を 電 気 化 学 的 に 検 出 で き る こ と を ボ ル タ ン メ ト リ ー で 明 ら か に し た ． 本 検 出 モ ー ド を HPLC の フ ロ ー 型 検 出 部 に 組 み 込 む た め に ， 移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系 に キ ノ ン 試 薬 溶 液 を ポ ス ト カ ラ ム 方 式 で 合 流 さ せ る 2 流 路 系 の HPLC-ECD を 構 築 し ， VPA の 分 離 分 析 法 と し て 確 立 し た ． 固 定 相 に は ト リ ア コ ン チ ル 基 （ C30） を 修 飾 し た シ リ カ 系 カ ラ ム を 用 い ， VPA と IS を 15 min 以 内 に 検 出 す る こ と が で き た ． 本 法 の 定 量 範 囲 は ， 0.36 ～ 14.4 g/mL で あ り ， 直 線 性 も 良 好 で あ っ た （ r = 0.999）． 血 中 VPA 測 定 を 行 う 上 で ，充 分 な 定 量 範 囲 と 感 度 を 有 す る こ と が 分 か っ た ．本 法 は ，HPLC-UV， HPLC-FL，LC-MS な ど の 他 法 と 比 較 し て ，誘 導 体 化 操 作 ，煩 雑 な 前 処 理 方 法 お よ び ク リ ー ン ア ッ プ 操 作 が 不 要 で あ り ，VPA を 特 異 的 に 検 出 で き る 利 点 が あ る こ と を 明 ら か に し た ． さ ら に ， 本 法 に よ る VP-Na 投 与 後 の ラ ッ ト 血 中 VPA の 薬 物 動 態 分 析 と 同 時 に 血 中 FFA と BG も 計 測 す る 複 合 動 態 解 析 へ の 適 用 を 検 討 し た ． そ こ で ， キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ く 酸 測 定 法 に よ る FFA の HPLC-ECD も 構 築 し た ． ア ラ キ ド ン 酸 ，リ ノ ー ル 酸 ，オ レ イ ン 酸 ，パ ル ミ チ ン 酸 ，ス テ ア リ ン 酸 と IS を 30 min 以 内 に 検 出 す る こ と が で き た ．本 法 の 定 量 範 囲 は ，0.75～ 160 mol/L で あ り ， 直 線 性 も 良 好 で あ っ た （ r = 0.999）． 血 中 FFA 測 定 を 行 う 上 で ， 充 分 な 定 量 範 囲 と 感 度 を 有 す る こ と が 分 か っ た ．

VPA お よ び FFA の HPLC-ECD お よ び SMBG 用 の 血 糖 測 定 器 を 用 い て ，健 常 ラ ッ ト ，マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト ，糖 尿 病 ラ ッ ト に つ い て ，血 中 VPA，血 中 総 FFAs，血 中 FFA 分 画 ，BG の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 し ，複 合 動 態

解 析 を 実 践 し た ．ラ ッ ト の 尾 静 脈 よ り 経 時 的 に 採 血 し た 約 50 L の 血 液 で 血

中 VPA， 血 中 FFA， BG を 計 測 で き ， VP-Na 投 与 後 5 時 間 に わ た っ て 詳 細 な 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 す る こ と が で き た ． 得 ら れ た VPA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル よ り ， PK パ ラ メ ー タ を 算 出 で き た ．

を 作 用 電 極 に 用 い た ボ ル タ ン メ ト リ ー [133,134] あ る い は HPLC-ECD [135-138] が 報 告 さ れ て い る ． し か し ， テ オ フ ィ リ ン の 電 解 酸 化 に は 作 用 電 極 の 電 位 窓 の 範 囲 で 比 較 的 高 い 電 位 を 印 加 す る 必 要 が あ る た め ，テ オ フ ィ リ ン の 代 謝 物 で あ る キ サ ン チ ン 誘 導 体 や 他 の 生 体 成 分 も 電 解 酸 化 で 検 出 さ れ る 上 に ，反 応 の 場 で あ る 作 用 電 極 表 面 の 劣 化 が 危 惧 さ れ る ．テ オ フ ィ リ ン を 選 択 的 に 検 出 す る た め に ，修 飾 電 極 あ る い は 酵 素 電 極 を 利 用 し た 方 法 が 開 発 さ れ て い る [139-148]． 修 飾 電 極 と し て は ， 単 層 ま た は 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ を 修 飾 し た グ ラ ッ シ ー カ ー ボ ン 電 極 ，あ る い は ポ リ メ チ レ ン グ リ ー ン を イ ン プ リ ン ト 高 分 子 膜 と し て 修 飾 し た グ ラ ッ シ ー カ ー ボ ン 電 極 が あ る [140-143]．一 方 ，酵 素 電 極 と し て は ，金 電 極 表 面 に 形 成 さ せ た ア ル キ ル チ オ ー ル の 自 己 組 織 化 単 分 子 膜 に テ オ フ ィ リ ン オ キ シ ダ ー ゼ を 固 定 し た 電 極 が あ る [144,145]．こ れ ら の 電 極 を 用 い た テ オ フ ィ リ ン の ボ ル タ ン メ ト リ ー は ， 製 剤 分 析 ，食 品 分 析 ，生 体 試 料 分 析 へ 応 用 さ れ て い る ．し か し ，製 剤 分 析 に は 約 10～ 100 mg の 製 剤 ， 食 品 分 析 で は 約 10 mL の 飲 料 が 試 料 と し て 使 用 さ れ て お り [140,141,145]，こ れ ら の 方 法 は 血 中 テ オ フ ィ リ ン 定 量 へ の 適 用 は 図 ら れ 難 い ．ま た ，生 体 試 料 分 析 で は 標 準 血 清 や 尿 に テ オ フ ィ リ ン を 添 加 し た 試 料 に つ い て 分 析 す る 事 例 が 多 く [146,147]， 薬 物 動 態 分 析 等 の 実 分 析 へ の 応 用 に は 至 っ て い な い ．ま た ，修 飾 電 極 や 酵 素 電 極 の 多 く は ，測 定 毎 に 実 験 者 が 作 製 し た も の で あ り ，電 極 の 入 手 や 適 正 な 維 持 管 理 の 点 か ら ，汎 用 性 の 点 で 有 益 な 分 析 法 と し て の 展 開 は 難 し い と 思 わ れ る ．

Fig. 3-1 Products and mechanism of the electrochemical oxidation of

ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 に よ る 塩 基 の 定 量 を HPLC-ECD へ 適 用 す る 場 合 ，酸 化 前 置 波 の 現 れ る 電 位 に 印 加 電 位 を 設 定 し て ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し ， 酸 化 電 流 を 測 定 す る こ と で 塩 基 の 定 量 が 可 能 と な る ．

Fig. 3-2 Voltammograms of 1.5 mmol/L trolox in the (a) absence and (b)

presence of 1.0 mmol/L theophylline in acetonitrile containing 20 mmol/L LiClO4.

PFC, Ag/AgCl, and Pt were used as working, reference, and counter electrodes, respectively. Scan rate was set at 20 mV/s.

Fig. 3-3 Products and mechanism of the electrochemical oxidation of trolox at

3-3 実 験 材 料 と 実 験 方 法 3-3-1 ト ロ ロ ッ ク ス の ボ ル タ ン メ ト リ ー 第 2 章（ 2-3-1）と 同 じ 構 成 の ボ ル タ ン メ ト リ ー 装 置 を 使 用 し た ．ト ロ ロ ッ ク ス を 含 む 支 持 電 解 質 溶 液 （ ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 ） に は ， 0.54 mmol/L ト ロ ロ ッ ク ス と 13 mmol/L 過 塩 素 酸 リ チ ウ ム を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル 溶 液 を 使 用 し た ． ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 に テ オ フ ィ リ ン を 溶 解 し て 測 定 溶 液 を 調 製 し ， そ の 20 mL を 電 解 セ ル に 加 え て ボ ル タ モ グ ラ ム を 測 定 し た ．走 査 速 度 は ，20 mV/s に 設 定 し た ． 3-3-2 テ オ フ ィ リ ン の 電 気 化 学 検 出 HPLC ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 を 活 用 し た 塩 基 測 定 を フ ロ ー 型 の 検 出 部 と し て HPLC に 組 み 込 む た め に ，移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系 に ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 を ポ ス ト カ ラ ム 方 式 で 合 流 さ せ る 2 流 路 系 の シ ス テ ム を 構 築 し た ． そ こ で ， Fig. 3-4 に 示 す よ う に ， デ ガ ッ サ ー （ DG-980-50, 日 本 分 光 製 ）， ポ ン プ （ 301 M, フ ロ ム 製 ）， サ ン プ ル イ ン ジ ェ ク タ ー （ 7725, レ オ ダ イ ン 製 ），

マ イ ク ロ ボ ア カ ラ ム （ Inertsil SIL 100A, 100 mm×1.0 mm i.d., 3 m， GL サ イ

Fig. 3-4 Block diagram of the HPLC-ECD system.

MP, Mobile phase; TS, trolox solution; DG, degasser; P1 and P2, pumps; S, sample

injector; column, normal-phase silica gel column (Inertsil SIL 100A, 100 mm x 1.0

mm i.d., 3 m); D, electrochemical detector, electrochemical cell and potentiostat;