序 文
メチシリン耐性黄色 ブ ド ウ 球 菌（methicillin- resistant
Staphylococcus aureus：以 下 MRSA と す る）は，メチシリンで代表される
β-ラクタム薬
（ペニシリン・セフェム系薬の総称） のほとんどの 抗菌薬に耐性を示す黄色ブドウ球菌である．健常 者の皮膚や口腔などに常在しているが，病原性は
ほとんどなく，通常の黄色ブドウ球菌となんら変 わりはない．しかし，術後患者や免疫抑制状態の 患者では，術創感染症，敗血症，あるいは MRSA 肝炎などを引き起こし，ショック症状や多臓器不 全を経て死亡する例も多く，本菌の蔓延は医療現 場で大きな問題となっている．MRSA は 1960 年 に初めて英国で分離され，その後全世界に広がっ た．国内でも 1980 年初期から全国に蔓延し，ほと んどすべての病院の院内感染菌として定着したと いわれている．院内感染の発症様式には，患者が
パルスフィールド核酸電気泳動法によるメチシリン耐性 黄色ブドウ球菌（MRSA）の分子疫学調査
1）兵庫県立大学環境人間学部，2）社会保険紀南綜合病院，3）堺市衛生研究所
北元 憲利
1）加藤 陽二
1）甘庶志帆乃
1）片井 敦雄
2）田中 智之
3）（平成 16 年 8 月 17 日受付）
（平成 16 年 12 月 3 日受理）
1990 年〜1994 年の間に，和歌山県内の同一病院の患者から分離されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌
（MRSA）103 検体，同時期，同病院の医療従事者から分離された 78 検体，および 2000 年に同病院で分 離された患者 52 検体の MRSA DNA を制限酵素Sma Iで切断後，パルスフィールド核酸電気泳動法に より，遺伝型の分類を行うとともに，分子疫学的解析を行った．その結果，20 種のタイプに分類するこ とができた．それぞれのタイプはさらに 1〜14 のサブタイプに分けられ，計 57 種のサブタイプとなり，
極めて多様性を示した．しかし，タイプ 1 は 1990 年〜1993 年の間，患者から常に分離され，半数以上を 占めたことから，同一病院内で繰り返し蔓延している院内感染原因菌株であることが示唆された．一方，
医療従事者の間ではタイプ 2 が多くを占めていたが，2000 年になると，患者の間でもタイプ 2 や 4 が多 くを占めるようになり，複雑性を示すようになった．また，同時期に患者および医療従事者に共通して 存在するタイプや，患者の間でのみ単発的に分離されるタイプも存在した．以上のことから，MRSA には，多少の変異を繰り返えしながらも比較的安定した菌株と，極めて多様性を示す菌株が混在して蔓 延していることが示唆された．また，院内感染には，内因感染，患者同士の交叉感染，あるいは医療従 事者と患者間での交叉感染など複数の要因が存在することが示唆された．
〔感染症誌 79：129〜137，2005〕
要 旨
別刷請求先：（〒670―0092）姫路市新在家本町 1 丁目 1―12
兵庫県立大学環境人間学部 北元 憲利
MRSA, pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）, molecular epidemiology, hospital infection Key words：
咽頭・鼻腔・皮膚などに保菌している微生物に よって感染が起きる内因感染（日和見感染）と，
他の患者，医療スタッフあるいは医療器材から感 染を受けて発症する外因感染（交叉感染）などが ある．
感染症の疫学は，保菌者や感染症の存在，流行 様式，感染経路などを調査し，病原微生物の同定 と株間の違いを明らかにして，疾病の予防に役立 てることを目的としている．従来からの微生物の 表現型に基づく同定識別法のほかに，最近では分 子生物学的な手法を導入して，より詳細な疫学的 解析ができるようになった．分子疫学において，
現時点で最も信頼のおける技術は，パルスフィー ルド核酸電気泳動法（pulsed-field gel electropho- resis：以下 PFGE とする）といわれており
1）〜4）， 近年，この PFGE が院内感染や食中毒の原因食品 の特定などに威力を発揮している
5）〜8）．この方法 は細菌のゲノムを制限酵素により切断し，pulsed- field profiles（PFP）により，遺伝学的に類似かど うかを比較・同定することができる
2）．
本 研 究 で は，PFGE を 用 い て，1990 年〜1993 年， および 2000 年において同一病院内の入院患者 か ら 分 離 さ れ た MRSA DNA の 型 別・分 類 を 行った．また，同時期に同病院の医療従事者より 分離した MRSA についても比較検討した． これら の関連性を調べることにより，MRSA の感染・存 在様式を解明するとともに院内感染予防に役立て ることを目的とした．
材料と方法
1．菌株および培養方法
和 歌 山 県 内 の A 病 院 で 1990 年〜1993 年 の 間 に，入院患者 98 名の膿，痰，血液，胸水，鼻，咽 頭，便，尿やチューブなどから分離された MRSA 103 検体，および 2000 年において同様に分離され た 52 検体を用いた．また，同県内の B〜G 病院の 患者から分離された 10 検体も用いた．一方，1990 年〜1994 年の間に 8 回にわたり A 病院の医師や 看護師など医療従事者 50 名の鼻腔から分離した MRSA 78 検体を用いた．総計 243 検体となった．
菌の増殖には一般細菌用ハートインヒュージョン ブイヨン液体培地（日水製薬）を使用した．
2．Pulsed-Field Gel Electrophoresis（PFGE）
PFGE 法 は，CHEF（Contour-Clamped Homo- geneous Electric Field）を基本とする定法に従っ た
2）9）〜11）．試薬キットとして GenePath Group 2 お よび 6（BIO-RAD 社）を，制限酵素として，Sma I
（25units
!ml）を使用した
2）．電気泳動は 6V
!cm，
18.5 時間，Initial 15.3 sec，Final 34.9 sec（BIO- RAD，Genepath 電気泳動プログラム 5）の条件 で行った．対照として，DNA size standard である Lambda ladder を 泳 動 し た．ゲ ル は SYBER GreenI 液 （Molecular Probes 社，10,000 倍希釈） で 染色後，ルミノイメージアナライザー（LAS-1000 plus，FUJIFILM 社）にて観察した．
3．分類基準と一致率
Tenover ら の 分 類 基 準 に 従 い，分 離 菌 株 を PFGE パ タ ー ン，す な わ ち pulsed-field profiles
（PFP） により分類した
2）．また，菌株間の相違は一 致率（Dice Coefficient）を計算することにより，2 つの分離菌株において共有される DNA 断片の割 合を表した．この係数 F は，公式 F＝2Nxy
!（Nx＋
Ny）に従って計算した．Nx が分離菌株 X からの DNA 断 片 総 数，Ny は 分 離 菌 株 Y か ら の DNA 断片総数，Nxy は 2 つの分離菌株で同一のもので ある DNA 断片数を示す．この計算式より得られ た F 値が 1.0 に近いほど，それらの分離株は近縁 種であることを示す．
成 績
1．PFGE パターンによる分類
1990 年〜1993 年に A 病院の院内感染患者から 分離した菌株 103 検体，2000 年に同様に分離した 菌株 52 検体，B〜G 病院の患者 10 検体，および 1990 年〜1994 年に医療従事者から分離した菌株 78 検体，計 243 検体について PFGE を行った結 果，20 のタイプに分類することができた（Table 1） ． さらにサブタイプに分類したところ 57 種類の パターンを示す結果となった．主なタイプ（1a〜
6a）の PFGE パターンを Fig. 1 に，57 種のパター ン模式図を Fig. 2 に示した．
1）患者の場合
A 病院の患者より分離された 155 検体につい
てみると，1〜13 のタイプに分類することができ
Table 1 Distribution of PFGE types of 243 MRSA strains isolated from the patients and medical workers No. of Total strains
No. of strains in each type PeriodSourceHospital2019181716151413121110987654321 aaa―ba―baaaaaaa―baaaab―cadcbad―ncbaf―ledcbad―gcba 10311622124215612671990―1993PatientA 5241111134444710342000 78222113111249225581990―1994Medical staff 101111151990―1993PatientB―G 24311222114114211623234413248114371033122284No. of total strains
た （Table 1） ．さらに，タイプ 1 および 2 は，それ ぞれ a〜g の 7 サブタイプに，タイプ 3 は a，d，f および g の 4 サブタイプに，タイプ 4 は a〜d の 4 サブタイプに，タイプ 5 は a〜c の 3 サブタイプに 分類することができた．その他のタイプ 6〜13 は それぞれ 1〜2 つのサブタイプに分けることがで きた．また，DNA 切断パターンの一致率を求めた 結果，同一タイプ内での一致率は少なくとも 0.8 以上を示した．特にタイプの中で細分化されたサ ブタイプ，例えば，1a〜1c，2a〜2e，3a〜3c，およ び 4a〜4d の間では，それぞれのバンドの相違も 1〜3 本以内であり，一致率も 0.9 以上を示した．
1〜6 のタイプ間の比較（例えば，タイプ 1 とタイ プ 6 などの比較） では，その一致率は 0.6〜0.7 の範 囲であった．しかし，タイプ 1 とタイプ 7〜13 の 間，あるいはタイプ 7 とタイプ 13 などの比較で は，その一致率は低く，0.6 以下であった．一方，
B〜G 病院の患者 10 検体については，タイプ 1a が 5 検体，その他のタイプ（タイプ 19 および 20
Fig. 1 Main types（type 1―6）of PFGE patterns ofSmaI-digested genomic DNA of MRSA isolates . M：Lambda ladder.
を含む）が，それぞれ 1 検体ずつ分離された（Ta- ble 1） ．
2）医療従事者の場合
1990 年〜1994 年の間， 医療従事者の鼻腔から分 離した菌株 78 検体を用いた場合，1〜3，9，10，
14〜18 の 10 タイプに分類することができた．さ らにタイプ 1 は 2 サブタイプに，タイプ 2 は 7 サ ブタイプに，タイプ 3 は 9 サブタイプに細分化す ることができた．その他のタイプ （9〜10，14〜18 タイプ）は 1〜2 つのサブタイプに分類された．
2．経時的にみた PFGE パターンの変換 1）1990 年〜1993 年の患者の場合
Table 2 に示すように，全分離菌株 103 検体中，
タイプ 1 は，76 検体（73.8％）を占めた．そのうち 1a だけをみると 67 検体（全体の 65.0％）を占めて いた．さらに，タイプ 1 は，1990 年〜1993 年の間，
常に分離されていた． 1990 年 11 月から 1991 年 11 月の間では，タイプ 1a が多く分離された．1992 年なると，タイプ 1a と近縁の 1b〜1d が分離され るようになり，1993 年では他のタイプ（1〜6）な ども分離されるようになってきた．同日に分離し た 5〜6 検体すべてがタイプ 1a を示した例もあっ た．検体を集中的に分離した 1992 年の 12 月にお いても，タイプ 1 が多くを占めていた．
2）2000 年の患者の場合
1990 年〜1993 年とは異なり，52 検体からは，タ イプ 1〜4， タイプ 9〜13 など，比較的多種の菌株 が分離された（Table 1，Table 2）．また，タイプ 1 に代わり，タイプ 2 やタイプ 4 が多く分離され るようになった．タイプ 2 は，24 検体（46.2％），
タ イ プ 4 は 12 検 体（23.1％）に 対 し，タ イ プ 1 は 4 検体（7.7％）にすぎなかった．同日に分離し た 4 検体がいずれも 13a タイプを示した例もあっ た．
3）医療従事者の場合（1990 年〜1994 年）
1990 年 12 月 か ら 1994 年 5 月 の 約 4 年 間 で 8 回， 医療従事者の鼻腔から分離した菌株 78 検体で は，タイプ 2 が多くを占め，36 検体 （46.2％） であっ た．こ の う ち 特 に サ ブ タ イ プ 2a が 25 検 体
（32.1％）を占めた．しかし，その他のタイプをみ ると，患者検体以上にサブタイプレベルで多様性
Fig.2SchematicPFGEpatternsoftypesofMRSAisolatesfrompatientsandmedicalstaff.
Table 2 Change of PFGE types of MRSA strains isolated from the patients and medical workers during the period 1990 to 1994 and 2000
No. of strains in type Examind
strains Periods
（Year/Month）
Hospital Source
Others 6
5 4 3 2 1
2 7 9 1990/11―1991/ 2
A Patient
4 4 1991/ 3―1991/ 5
5 5 1991/ 6―1992/ 8
1 1
4 6 1991/ 9―1991/11
1 1
7 8 1991/12―1992/ 2
10 11
1992/ 3―1992/ 5
5 5 1992/ 6―1992/ 8
4 4 1992/ 9―1992/11
3 1 4 2 26 36
1992/12―1993/ 2
2 1
3 1993/ 3―1993/ 5
6 3
9 1993/ 6―1993/ 8
3 3
1993/ 9―1993/12
2 6 4 1 6 8 76 103
Sum
1 7
3 10 2 23 2000/ 1―2000/ 2
A Patient
1 2
1 11 2 17 2000/ 3―2000/ 4
6 3
3 12
2000/ 5―2000/ 6
8 0 0 12 4 24 4 52 Sum
1 1
5 7 1991/ 3―11
B―G Patient
1 2
3 1992/ 6
2 0 1 0 0 0 7 10 Sum
0 6
4 0 10 1990/12
A Medical staff
1 3
5 1 10 1991/ 4
4 0
5 1 10 / 8
1 3
4 2 10 1992/ 7
0 3
4 3 10 /12
0 1
5 3 9 1993/ 4
2 1
4 2 9 /10
4 0
5 1 10 1994/ 5
12 0 0 0 17 36 13 78
Sum
24 6 5 13 27 68 100 243
Total
を示した．
3．患者と医療従事者との関連性
患者と医療従事者に共通して存在するタイプ は，1〜3 の 3 タイプのみであった（Table 1）．患 者から分離された菌株はタイプ 1 が多いのに対 し， 医療従事者からはタイプ 2 が多く検出された．
しかし，1992 年の 12 月には，ほぼ同日に医療従事 者および患者から全く同じサブタイプの 1a ある いは 3a が検出された例もあった．同様に，1991 年 7 月には同じタイプの 1d が検出された例もみ
られた．
4．同一患者および同一医療従事者におけるタ イプの変換
Table 3 に示すように，6 人の患者 （No. 1〜6） か らは，同日，もしくは近い時期に痰と便のように 異なる部位から検体を分離したが，その菌株はす べて同じタイプ 1 を示した．同一患者 5 名（No.
1 および 7〜10） からは，採取時期を変え分離した が，全く同じタイプを示したのは 3 名であった．
一方，Table 4 に示すように，医療従事者 18 名か
Table 3 PFGE types of MRSA strains isolated from the same patients in different periods 1991
1990 Source No.
12.2 12.2 12.2 12.8 12.7 12.5 12.4 3.9 3.3 2.12 2.3 ＊
1a 1a 1a sputum 1
1h 1g stool
1a sputum
2
1a stool
1a sputum
3
1a stool
1a sputum
4
1a stool
1a sputum
5
1a stool
1e sputum
6
1g urine
1a 1a 1a
stool 7
2a 2a
stool 8
3a 1a stool
9
9a 3b
stool 10
＊month and day
Table 4 PFGE types of MRSA strains isolated from the same medical workers in different periods
1994 1993
1992 1991
1990 No.
5 10 4
12 7
8 4 12 ＊
2a 2a 2a 2a 1
2k 2b
2a 2
3o 3c 3k 3b
3
2g 2g 2d 4
8a 2h 2j
3b 5
3f 3j 2j
6
7 2h
7
1a 1a 8
2a 2a
9
2a 2a 10
2a 2a
11
2a 2a
12
2a 2a 13
8b 8b
14
3h 1h
15
2h 3h
16
8b 2i 17
2 8a 18
＊month
らは経時的に 2〜4 回，菌を分離したが，このうち 同じタイプあるいは関連のあるサブタイプが連続 して検出されたのは，11 名であった．
5．多剤耐性などとの関連性
多剤耐性をもつ菌株 36 検体についてタイプを
調べたところ， タイプ 1a やタイプ 2 に多いことが
わかった （Table 5） ．また，数は少ないが，強溶血
性を示す菌株は，2a および 6a に多い傾向がみら
Table 5 Relationship between PFGE types and phenotypic characteristics of MRSA isolates
No.of strains in type Examined
strains 1 2 3 4 6
a d c b a f e a f e c b a a
1 2 2 3 2
2 2 6 2 14 Multiple drug 36
resistant strains
6 1
1 1 3
1 Intense hemolytic 13
strains
れた．一方，膿，痰，血液，胸水，鼻，咽頭，便，
尿などの材料の違いによるタイプの特徴や傾向は 認められなかった．
考 察
タイプ 1 の菌株は， 採取年月日が異なるものの，
同一病院内で分離した菌株であるという点で，極 めて近縁度が高く，互いに疫学的関連の高い菌株 であると考えられた．医療従事者から分離された タイプ 2 も同様である．一方，散発的に分離され たタイプ 7〜20 の菌株はそれぞれ関連性の少ない 菌種である可能性が高い．このように多様性を示 す一方で，タイプ 1 のように同一あるいは関連の ある菌株が全検体の半数以上を占め，なおかつ数 年にわたり，常に分離されていることから，A 病院においては，同一の菌株あるいは限定された 同一種のクローン由来の菌株が数年間も連続的に 分布し， 繰り返し蔓延していたことが示唆された．
1989 年〜1991 年 に 愛 知 県 内 の 病 院 で 行 わ れ た MRSA 感染者の調査においても，多様の MRSA 菌株が存在する中で，少数の類似菌株が常に分離 されており，それらのクローンが院内感染を起こ し続けていたという報告がある
7）．1990 年〜1994 年，長崎のある病院で分離された菌株 113 株は 14 タイプ（サブタイプにすると 20 タイプ）に
12），ま た，1992 年〜1998 年，東京都内の病院で分離され た 129 株は 11 タイプ（サブタイプにすると 28 タ イプ） に
13）分類されたという報告がある．調べた検 体数に対するパターンの種類数やタイプ内で占め るサブタイプの割合などが，本実験の結果と類似 していた．また，主流となる菌株と多様性を示す 少数の菌株が存在している点も今回の結果と一致 していた．
一方，2000 年の傾向をみると，タイプ 2 および タイプ 4 が多く検出されたが，必ずしも安定した 菌株が分離されたわけではなく，多様性を示して いた．この間，経時的変換は調べていないが，時 間とともに同病院内でタイプの異なる菌株に置き 代わった可能性があり，より多様性・複雑化が進 んだものと考えられる．1998 年〜2000 年，東京都 内の病院で 100 検体について調べた報告では
14）， 数の差はあるものの，24 種もの多様な菌株が分離 されている．近年，多くの病院においても，この ような多様性・複雑化の傾向が進んでいるのかも しれない．MRSA は，腸管出血性大腸菌のように 遺伝的に多様性をもつ場合と
15）〜17），サルモネラの ように遺伝的に比較的安定して蔓延している場 合
18）とがあると考えられた．
院内感染が起こる要因として，様々な感染経路 が考えられる．患者の間でのみ，ほぼ同時期に分 離されたタイプ（5 や 6a など）は，主流のタイプ 1 とは異なるクローン由来の菌株と考えられる．
医療従事者からは，これらと近縁種と思われるタ イプは分離されていないことから，身近な患者同 士内の交叉感染が起こった可能性が高い．また，
タイプ 1〜6 以外の他の PFGE パターンを示す菌 株は，分離数も少なく，また同月・前月に分離さ れた菌株と比較しても関連性はなく，単発例であ ると考えられた．
一方，医療従事者が大きく関与し，患者との間
で交叉感染を起こしたという報告もある
7）10）19）．本
実験において，患者と医療従事者の間で共通して
分離されたタイプは，1〜3 の 3 タイプのみであっ
た．他の残りのタイプはすべて患者あるいは医療
従事者の一方から分離されたものであり，遺伝学
的関連性は低いことが分かった．両者からのタイ プが一致した時期も極めて限られていた． しかし，
少ないとはいえ，完全に一致するタイプが両者か らほぼ同日・同時期に分離された例もあることか ら，医療従事者が感染の伝播に何らかの形で関係 し，患者との間で交叉感染を起こした可能性も否 定できない．このように，院内感染には，単独感 染，患者同士の交叉感染，あるいは医療従事者と 患者間で起こる交叉感染，など複数の要因が存在 することが示唆された．
同一患者および同一医療従事者から経時的に菌 を分離して比較検討した結果，同じタイプが常に 分離されたケースがあった．菌が体内に入ると多 少の変異があるものの，遺伝型は変化しないケー スも示唆された．一方，タイプが異なるケースで は，菌株が変異したというより，体内に遺伝的関 連性の無い菌株がそれぞれ存在し，検査の際，そ のうちの 1 つが検出されたためとも考えられる．
多剤耐性をもつ菌株はタイプ 1a や 2 に多く認 められた．理由は不明だが，なんらかの関連性が あるのかもしれない．菌株間の関連性を調べる方 法として PFGE の他に，coagulase 型別，entero- toxin 型別，toxic shock syndrome toxin-1 産 生 性 などの表現型タイピング
12）13）や sequencing
20）21）な どがあるが，クローンの関連性を特定するには PFGE が最も有効であるとされている
1）〜3）．迅速 な調査に基づく疫学データを組織的に収集，解析 し，分子疫学的解析を real time に行うシステム
22）を構築することが感染源の特定，あるいは感染症 防止のために重要と考えられる．
文 献
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Molecular Epidemiology of Mechicillin-resistant
Staphylococcus aureus（MRSA）by Pulsed-Field Gel Electrophoresis
Noritoshi KITAMOTO
1），Yoji KATO
1），Shihono KANZYA
1）， Atsuo KATAI
2）＆ Tomoyuki TANAKA
3）1）School of Human Science and Environment, University of Hyogo,
2）Division of Laboratory Medicine, Kinan General Hospital,3）Sakai City Institute of Public Health
